Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Samtidige undersøgelse af ansættelse af monocyt delpopulationer Under Flow In Vitro

Published: November 26, 2018 doi: 10.3791/58509
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 3
1Hematology service, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva, 2Department of Pathology and Immunology, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva, 3Department of Cell Physiology and Metabolism, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva

Summary

Vi præsenterer her, en integreret protokol, der måler monocyt delpopulation handel under flow in vitro-ved brug af specifikke overflade markører og konfokal Fluorescens mikroskopi. Denne protokol kan bruges til at udforske sekventielle rekruttering trin samt for at profilere andre leukocyt undertyper ved hjælp af andre specifikke overflade markører.

Abstract

Ansættelse af monocytter fra blodet til målrettede perifere væv er afgørende for den inflammatoriske proces under vævsskade, tumor udvikling og autoimmune sygdomme. Dette er lettet gennem en proces med opsamling fra frie strøm på den luminale overflade af aktiverede endotelceller, efterfulgt af deres vedhæftning og transendothelial migration (transmigration) i de underliggende berørte væv. Men de mekanismer, der understøtter de privilegerede og kontekst-afhængige rekruttering af monocyt delpopulationer er stadig ikke fuldt forstået. Derfor har vi udviklet en metode, der giver mulighed for ansættelse af forskellige monocyt delpopulationer samtidig visualiseret og målt under flow. Denne metode, baseret på time-lapse Konfokal billeddannelse, giver mulighed for en entydig skelnen mellem vedhængende og transmigrated monocytter. Her beskriver vi, hvordan denne metode kan bruges til at studere samtidigt rekruttering kaskade af pro-angiogene og ikke-angiogene monocytter in vitro. Denne metode kan endvidere udvides til at studere de forskellige trin i ansættelse af op til tre monocyt populationer.

Introduction

Monocytter udgør en fagocyterende komponent af medfødt immunitet, der er nødvendig til bekæmpelse af patogener, rydde op beskadiget væv, angiogenese og Patofysiologi af mange sygdomme herunder kræft1,2,3 . Monocytter er knoglemarv-afledte celler sammensat af heterogene delpopulationer, der cirkulerer i blodet, men kan ansættes til stedet for betændelse i perifere væv gennem specifikke molekylære mekanismer. Rekruttering kaskader af monocytter, som for leukocytter i almindelighed, implicerer forskellige trin herunder opsamling, rullende, kravle, anholdelse, transendothelial migration (transmigration) og migration gennem karvæggen (basalmembranen og vægmaleri celler)4. Disse trin involverer primært betændelse-induceret molekyler på i endothelial luminale overflade som selectins, glycoprotein ligander, kemokiner, intercellulære og junctional adhæsionsmolekyler, og deres receptorer på leukocytter såsom selectin ligander og integriner. Menneskehandel veje gennem enten i endothelial celle vejkryds (paracellular) eller i endothelial cellen kroppen (transcellular) kan bruges af leukocytter for at krydse endotel barriere5. Mens monocytter har historisk dokumenteret for at transmigrate gennem transcellular ruten, er potentielle forskelle i deres vandrende pathway blevet foreslået som monocytter er ikke længere betragtes som en homogen celle population. Nu bliver det klart, at monocyt mangfoldighed kan defineres af hver af deres forskelle og fællestræk, med hensyn til deres særprægede ekstravasation kaskader3,6. Derfor, for at forskelsbehandle utvetydigt monocyt delpopulationer, er det afgørende at visualisere og fænotype funktionsmåden for hver af disse forskellige delpopulationer under rekruttering proces.

Monocytter fra menneskelige, svin, rotter og mus blev opdelt i fænotypiske delpopulationer med visse tilskrives funktioner og specifikke vandrende adfærd7,8,9. For eksempel, hos mennesker, kan monocytter inddeles i tre undergrupper baseret på deres overflade udtryk af CD14, en coreceptor for bakteriel LPS og CD16, Fc-gamma receptor III. Humane monocyt delpopulationer omfatter klassisk CD14+CD16-, mellemliggende CD14+CD16+ og ikke-klassisk CD14dimCD16+ celler,6,9. Den klassiske CD14+CD16- monocytter blev vist sig at være primært inflammatoriske boer puljen af CD16+ monocytter fandtes kollektivt for at præsentere TIE2 udtryk og proangiogenic funktion10. Konsekvent, endotel celle stimulation med inflammatoriske cytokiner såsom menneskelige tumor nekrose faktor (TNF) α eller interleukin (IL-1) beta (konventionelle betændelse) er tilstrækkelig til at udløse den komplette rekruttering af klassisk CD14+CD16 - monocytter. Samtidige handlinger af vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) A og TNFα (angiogene faktorer-drevet betændelse) er dog forpligtet til at provokere CD16 transmigration+ proangiogenic pulje af monocytter3. Historisk, den traditionelle Transwell system under statiske betingelser, parallelle plade flow kammer og µ-slide flow kamre er blevet anvendt til kvantitativt analysere rekruttering af én leukocyt befolkning på et tidspunkt in vitro-11 ,12,13. Mens disse protokoller er blevet godkendt, betragtes en mere robust metode, der tillod en simultan analyse af flere monocyt delpopulationer mere indsigtsfulde. Sådanne metoder skal redegøre for flere interaktioner og de forskellige frekvenser af hver respektive befolkning og også give en mekanistisk forståelse af ligheder og forhold for rekruttering cascades, der definerer hver monocyt delmængde.

Her præsenterer vi en metode baseret på de time-lapse billeddannelse af monocyt rekruttering under flow, som tillader den vandrende kaskader af forskellige monocyt delpopulationer undersøges samtidigt ved hjælp af Konfokal mikroskopi. Denne metode integrerer visse kritiske funktioner, der efterligner endotel celle betændelse samt Hæmodynamik af cirkulerende monocytter i post kapillær venules, den vigtigste placering af leukocyt ansættelse in vivo. Den foreslåede metode bruger menneskelige umbilical vene endothelial celler (HUVEC), der genereres gennem en veletableret protokol af isolation fra menneskelige umbilical snore. Denne kliniske ressource har fordelen at være nemt tilgængelig som et biologisk biprodukt, samtidig også giver et rimeligt udbytte i endothelial celler, der kan isoleres fra navlestrengen venen. Vi brugte også fluorescerende farvestoffer og immunfluorescens for at skelne mellem forskellige cellulære komponenter, og konfokal mikroskopi til utvetydigt definerer monocyt positionering (luminale vs abluminal) over tid. Protokollen præsenteres her er blevet udviklet til samtidig foranstaltning transmigration niveauer af monocyt delpopulationer. Desuden skal det bemærkes, at denne metode kan udvides til at studere andre leukocytter delpopulationer og rekrutteringsprocesser ved brug af forskellige biomarkører og mærkning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Menneskelige materialer blev brugt med informeret samtykke af frivillige donorer, og i den schweiziske etiske komitéer på klinisk forskning.

1. isolering og indefrysning af menneskelige Umbilical vene endotelceller (HUVEC)

  1. Tilsættes 5 mL belægning til T75 kolbe (0,1 mg/mL kollagen G og 0,2% gelatine i phosphat bufferet saltvand PBS på pH 7,4) i 30 minutter ved 37 ° C før indlede HUVEC isolation.
  2. Ren ledning med PBS, tør det med sterile kompresser og placere det i en steril 20 cm petriskål. Skær enderne af ledningen med en steril saks.
  3. Identificere de enkelt stor vene og de to små arterier. Isæt forsigtigt en kanyle med en tre-vejs stophane knyttet til det i vene ekstremiteterne i ledning ender.
  4. Stram ledningen og kanyle forbindelsen fast med en længde på wire.
  5. Perfuse ledningen to gange med 20 mL af RPMI medium indeholdende 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin og 250 ng/mL amphotericin B at vaske i ledningen vener. Denne proces gør udseendet af ledningen hvidere og klarere. Tømme vene før collagenase tilsætning ved at indsamle RPMI med en sprøjte i den ene ende.
  6. Perfuse vene med 12 mL af 1 mg/mL collagenase type jeg (0,22 µm-filtreret).
  7. Luk hanen på ledningen slutter og inkuberes ledningen ved 37 ° C i 12 min.
  8. Blidt massage i ledningen for at frigøre endotelceller fra blodåre lumen.
  9. Tage 30 mL af RPMI indeholdende 10% føtalt kalveserum med en 50 mL sprøjte og Tilslut den ene ende af navlestrengen.
  10. Tilsluttes anden enden af navlestrengen en tom 50 mL sprøjte
  11. Åbne hanen og perfuse vene fra den ene ende, mens indbygget samle fra anden enden.
    Bemærk: De indsamlede suspension indeholder endotelceller.
  12. Der centrifugeres denne cellesuspension ved 200 x g i 5 min.
  13. Supernatanten og resuspenderes celle med 10 mL af komplet M199 medium (M199 indeholdende 20% FCS, 15 µg/mL endotel cellevækst kosttilskud 100 µg/mL heparin natrium, 0,5 µM hydrocortison, 10 µg/mL L-ascorbinsyre, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin og 250 ng/mL amphotericin B).
  14. Fjerne belægning løsningen fra T75 kolben og skylles en gang med PBS.
  15. Frø cellerne indsamlet fra trin 1.13 i T75 kolbe og placere den i varmeskab ved 37 ° C med 5% CO2.
  16. Den næste dag, skyl kolben 3 gange med medium til fjerne resterende røde blodlegemer og derefter ændre medium hver 2 dage indtil sammenløbet af komplet M199.
  17. På 80-90% confluence, skyl HUVEC éncellelag gang med 5 mL PBS og frigør celler med 5 mL 0,05% trypsin i 1 mM EDTA ved 37 ° C i 5 min. tilføje 4 mL af M199 og 1 mL af FCS at stoppe handlingen trypsin. Skyl kolben for at frigøre alle HUVEC.
  18. Indsamle en alikvot af 50 µL bruges til farvning af VE-cadherin, PECAM-1 og gp38, og analysere ved flowcytometri at tjekke HUVEC renhed.
  19. Indsamle resten af HUVEC fra trin 1.18 i en 15 mL rør og centrifugeres ved 200 x g i 5 min ved stuetemperatur.
  20. Supernatanten fra trin 1.19, resuspenderes celle i frysning løsning (FCS indeholdende 10% DMSO) med en tæthed på 5 x 105 celler/mL i cryotubes og fryse ved-80 ° C eller i flydende nitrogen indtil brug.
  21. At tjekke HUVEC renhed:
    1. Tilføje 1 µL af antihumant VE-cadherin-FITC antistof, 1 µL-anti-humant PECAM1-PE antistof og 1 µL-anti-humant Podoplanin-APC antistof til alikvot af 50 µL af HUVEC indsamlet på trin 1.18.
    2. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min.
    3. Tilføj 100 µL af PBS, og der centrifugeres ved 400 x g i 30 s.
    4. Supernatanten og resuspend i 100 µL af PBS. Data kan nu erhverves af flow flowcytometri teknikker.
      Bemærk: HUVEC er positiv for VE-cadherin og PECAM-1, og negative for Podoplanin.

2. HUVEC afrimning

Bemærk: Brug HUVEC ved lav passage for eksperimenter (maksimalt 5 passager).

  1. Coat en T75 kolben med 1 mL af opløsningen belægning ved 37 ° C i 30 min.
  2. Hurtigt defreeze HUVEC ved 37 ° C i 2 min. og resuspend celler i 10 mL af komplet M199.
  3. Der centrifugeres celler på 200 x g ved stuetemperatur i 5 min, og supernatanten.
  4. Celle resuspenderes i 10 mL af komplet M199.
  5. Overføre cellesuspension i præ-coatede kolben. Kolben anbringes i varmeskab ved 37 ° C med 5% CO2. Ændre cellekulturmedium hver 2 dage.

3. HUVEC kultur i 0,4 μ-Slide kammer

  1. Fem dage før du starter eksperimentet flow pels pre kamre i en 0,4 μ-dias med 30 µL af PBS, som indeholder 0,1 mg/mL kollagen G, 0,2% gelatine ved 37 ° C i 30 min.
  2. Vask kamre med 100 µL af PBS.
  3. Frigør cellerne fra en 80-90% sammenflydende HUVEC af en T75 kolbe.
  4. Skyl HUVEC med 5 mL PBS og frigøre dem med 5 mL 0,05% trypsin ved 37 ° C i 5 min.
  5. Skyl og indsamle cellesuspension i komplet M199 og tælle cellerne af den mest bekvemme metode. Der centrifugeres ved 200 x g i 5 min ved stuetemperatur.
  6. Resuspenderes celle på 106 celler/mL og distribuere 30 µL (30.000 celler) pr. kammer.
  7. Inkuber celler i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 for 1 h.
  8. Tilføj 150 µL af komplette M199 til hvert kammer og kultur cellerne i 5 dage i varmeskab ved 37 ° C og 5% CO2. Ændre medium hver 2 dage.

4. HUVEC farvning for monocyt rekruttering Assay Under Flow

  1. Forberede den mærkning medium foretaget af M199 og 1 µM af CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetat) og varm det ved 37 ° C i 5 min før celle mærkning.
  2. Vask HUVEC to gange med M199 medium varmes ved 37 ° C.
  3. Udskift mediet med 30 µL af varmede mærkning medium indeholdende 1 µM af CMFDA og placere i varmeskab ved 37 ° C og 5% CO2 til 10 min.
  4. Vask en gang med komplet M199 og inkuberes celler med komplet M199 i varmeskab ved 37 ° C og 5% CO2 i 30 min.
    Bemærk: Det er vigtigt at fjerne alle spor af serum før tilsætning af den mærkning løsning, ellers kan det ændre HUVEC farvning.
  5. Udskift mediet med komplet M199 indeholdende enten menneskelige TNFα (500 U/mL) eller en blanding af menneskelige TNFα (500 U/mL) med menneskelige VEGFA (1 µg/mL) i 6 timer i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.

5. isolering af menneskelige Pan monocytter og farvning af delpopulationer

  1. Brug enten en buffy coat af koncentreret humant blod, eller 20 mL frisk isolerede menneskeblod, indsamlet på dagen af forsøget i EDTA vacutainer rør.
  2. Fortynde blodet i PBS-1 mM EDTA (1:1) og 20 mL af det fortyndede blod på toppen af 20 mL tæthed gradient media pipetteres forsigtigt. Der centrifugeres ved 400 x g i 30 min. ved stuetemperatur med langsom acceleration og uden bremse.
  3. Indsamle perifert blod mononukleære celler (PBMC)-trombocyttal lag (mellem tæthed gradient medier og plasma lag) ind i en ny 50 mL rør indeholdende 40 mL PBS - 1 mM EDTA. Top op til 50 mL med PBS - 1 mM EDTA.
  4. Der centrifugeres ved 200 x g ved stuetemperatur i 5 min. supernatanten.
  5. Resuspenderes celle med 10 mL af farvning buffer (PBS - 1 mM EDTA indeholdende 0,5% bovint serumalbumin BSA).
  6. Der centrifugeres ved 200 x g ved stuetemperatur i 5 min. supernatanten.
  7. Gentag trin 5.5 og 5.6.
  8. Resuspenderes celle med 10 mL af farvning buffer. Tage en alikvot af 10 µL til en celletal.
  9. Kontrollere PBMC befolkninger og tælle celler hurtigt med et flow Flowcytometret.
    Bemærk: De karakteristiske lymfocyt og monocyt befolkninger kan observeres (figur 1A). 50 ml af frisk blod forventer om 50-100 x 106 PBMC.
  10. Til ansættelse af CD14 + versus CD14-PBMC under flow:
    1. Vaske pellet tre gange med flow buffer (M199 indeholdende 0,5% BSA) og resuspend mononukleære celler i flow buffer på 6 x 106 celler pr. mL.
    2. Gøre delprøver af 200 µL til hvert assay. Der inkuberes ved 37 ° C indtil 20 min før analysen.
    3. Tilføj 5 µL af anti-CD14-PE og Hoechst 33342 i en endelig koncentration på 2 µM til hver delprøve. Blandes og inkuberes ved 37 ° C i 10 min.
    4. Centrifugeres alikvot på 400 x g for 30 s.
    5. Supernatanten og resuspenderes med 200 µL af flow buffer.
  11. Til ansættelse af monocyt delpopulationer under flow:
    1. Isolere monocytter med en pan monocyt isolering kit ifølge producentens anvisninger.
      Bemærk: Følgende isolation protokol er for 50 x 106 celler. Det kan skaleres op eller ned, så længe det er inden for fabrikantens anbefalinger.
    2. Der centrifugeres PBMC suspension på 200 x g ved stuetemperatur i 5 min.
    3. Supernatanten og resuspenderes med 400 µL af farvning buffer.
    4. Tilsæt 50 µL af Fc-receptor blokerende reagens og 50 µL af Pan monocyt antistof cocktail.
    5. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min.
    6. Tilføj 400 µL af farvning buffer og 100 µL af magnetiske perler konjugerede anti-biotin antistof. Inkuber ved stuetemperatur i 15 min.
    7. Der tilsættes 2 mL af farvning buffer og bruge en MACS LS kolonne kombineret med en magnet.
    8. Placer kolonnen LS på magnet og tilsættes 1 mL af farvning buffer. Kassér gennemstrømnings.
    9. Passere PBMC suspension i kolonnen og indsamle klare strømmen, selvom der indeholder pan monocytter i en ny 15 mL tube.
    10. Tilføje farvning bufferen til toppen op til 5 mL.
    11. Tage en alikvot og kontrollere kvaliteten af monocyt isolation med en flow Flowcytometret.
    12. Bestemme pan monocyt count.
      Bemærk: Kun monocyt befolkning kan observeres (figur 1B).
    13. Der centrifugeres resten af monocytter fra trin 5.11.11 på 200 x g i 5 min.
    14. Supernatanten.
    15. Resuspenderes celle i 5 mL af flow buffer (M199 indeholdende 0,5% BSA).
    16. Gentag 5.11.13 til 5.11.14 to gange for at fjerne ethvert spor af EDTA.
  12. Gøre monocyt suspension i flow buffer (M199 med 0,5% BSA) på 6 x 106 celler/mL.
  13. Gøre delprøver af 200 µL af monocytter for hver ansættelse assay.
  14. Holde alikvot ved 37 ° C i inkubatoren indtil 20 min før injektion.
  15. Tilføj 5 µL af anti-CD16-PE antistof og Hoechst 33342 (2 µM endelige) til hver delprøve.
  16. Blandes og inkuberes ved 37 ° C i 10 min.
  17. Centrifugeres alikvot på 400 x g for 30 s.
  18. Supernatanten og resuspenderes med 250 µL af flow buffer.
  19. Tilføj 30 µL af monocyt suspension i et kammer i diaset for at tjene til angivelse af parametrene erhvervelse på Konfokal mikroskop.
  20. Holde delprøver af monocyt suspension fra trin 5,18 ved 37 ° C.
    Bemærk: Denne suspension er klar til at blive injiceret i flow-system.

6. forberedelse af det Fluidic System

  1. Sikre, at cellen inkubator for billeddannelse indstillet på 37 ° C.
    Bemærk: Et diagram over flow-system er vist i figur 2.
  2. Samle slanger del I: indsætte en Luer stik han til den ene ende af et stykke silikone slanger (8 cm lang og 3 mm tyk) og Tilslut anden enden til en rækkemotor Luer injektion sæt. Tilsluttes et stykke silikone slanger (40 cm og 3 mm tyk) det sidstnævnte Luer stik i den ene ende.
    Bemærk: En 3-vejs hane tilsluttet en 5 mL sprøjte kan eventuelt indsættes mellem i-line Luer injektion sæt og silikone slanger for eventuel luft boble fjernes.
  3. Samle slanger del II: Tilslut en 20 mL sprøjte til den ene ende af en længde på silikone slanger (1 m lang og 3 mm tyk). Indsæt en Luer stik mand til anden enden af slangen.
  4. Connect, del I og del II slangen ved at indsætte Luer stik hanner til en kvindelig Luer lock kobling (figur 2A).
  5. Sætte den frie ende af silikoneslanger i reservoiret indeholder flow buffer (M199 + 0,5% BSA) varmes ved 37 ° C.
  6. Træk stemplet af 20 mL sprøjten udfylde slanger med flow buffer.
  7. Placer sprøjten på pumpen og sikre den.
  8. Sæt pumpen i trække tilstand (i modsætning til at indgyde) og angive strømningshastigheden.
  9. Bestemme strømningshastigheden ifølge IBIDI slide anvendes ved hjælp af følgende formel:
    Equation
    Bemærk: Slide faktor er afhængig af IBIDI slide bruges til forsøget. For µ-dias jeg0,4 Luer lock bruges i dette eksempel, dias faktor er 131,6. Bestemt dias faktorer, se selskab hjemmeside14. Flow buffer viskositet er 0.0072 dyn.s/cm2. Shear stress på de post kapillær venules handler om 0,5 dyn/cm2.
  10. Tilslut dias (figur 2B):
    1. Klemme silikoneslanger omkring den kvindelige Luer Lock kobling og afbryde de to Luer stik hanner fra koblingen.
    2. Forbinde dem til reservoirerne i det dias, der indeholder stimuleret HUVEC og fyld med medium. Undgå luftbobler under dette trin.
    3. Tage klemmerne og sikre, at forbindelsen ikke er utæt.
  11. Placer slide under mikroskop for time-lapse imaging og starte pumpen.

7. time-lapse billeddannelse af monocyt rekruttering Under Flow af konfokalmikroskopi

  1. Bruge en 40 x mål (Se Tabel af materialer) til billedbehandling.
  2. Aktivere 405 nm (blå monocyt kerner), 488 nm (grøn endotelceller) og 561 nm (rødt CD16 + delmængde) lasere.
  3. Bruge den afdeling, der indeholder monocytter for at angive parametrene erhvervelse.
    Bemærk: For at opdage både ikke-transmigrated og transmigrated monocytter, er pinhole og intensiteten af laser 405 nm sat højt. Således, ikke-transmigrated monocytter er lidt synlige i basal planen. Dog kun transmigrated monocytter præsentere en unstained området omkring kernen svarende til den nye plads nedenunder endotelceller.
  4. Sted i salen skal erhverves under mikroskop.
  5. Vælg 3 felter af synspunkter i 1 cm radius for multi-position Konfokal billeddannelse.
  6. Definere den basale og de apikale sider i endothelial celler
  7. Angive en z-stakken til 10-12 µm vifte (0,5 µm trin). Køre en time-lapse erhvervelse hver 1 min.
  8. Efter 3 min af imaging, injicere 200 µL af monocyt suspension (6 x 106 celler/mL) via i-line Luer injektion port.
    Bemærk: Hurtigt monocytter vises i det apikale brændplanet, overholde og starte transmigration (transit fra den apikale til basal planen).
  9. Billede i mindst 30 min. Når først færdig, stoppe imaging og standsning af gennemstroemningen. Klemme slange for at afbryde dem på diaset.
  10. Fix diaset med 4% PARAFORMALDEHYD ved 4 ° C i 10 min.
  11. Vaske dias med PBS og gemme diaset ved 4 ° C for yderligere analyse hvis nødvendigt.

8. analysere Data med ImageJ

  1. Tæl antallet af samlede vedhængende monocytter i hvert felt. Bestemme celletal pr. mm2.
  2. Tæl transmigrated monocytter, der er til stede i basal planen nedenunder endotelceller og identificeret ved tilstedeværelsen af et sort hul (i den grønne kanal) omkring kernen.
  3. Opdele Greven af transmigrated leukocytter af det samlede antal vedhængende leukocytter. Transmigration sats er præsenteret som en procentdel af vedhængende monocytter.
  4. For illustration, kan den apikale og basal siderne påvises samtidig til at illustrere hændelser i hver af disse endotel rum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fastlæggelse af status for HUVEC aktivering induceret af TNFα

Bio-aktiviteten af inflammatorisk cytokin TNFα kan variere alt efter partiet og genopfyldning af frysning-optøning cyklus. Det er vigtigt at kontrollere aktivisering statussen af HUVEC med TNFα behandling. Dette kunne udføres af farvning parallelt nogle prøver af sammenflydende HUVEC for inflammatorisk induktion af selectins, ICAM-1 og VCAM-115,16,17. En lettere og enklere måde hen til indskrive aktivisering statussen af HUVEC efter TNFα behandling er de morfologiske ændringer vises i endothelial celler under inflammatorisk stress. Som vist i figur 3, aflang HUVEC efter 6-h ved tilstedeværelse af TNFα i forhold til unstimulated celler. Lignende brudforlængelse er observeret, når HUVECs er stimuleret af en blanding af TNFα og VEGFA. Optagelse aktivisering statussen af HUVEC er vigtig, da de endelige resultater af transmigration af monocytter vil afhænge af kvaliteten i endothelial celle aktivering.

Monocyt transmigration gør en karakteristisk seponering i endothelial celler

For at studere monocyt transmigration under flow, brugte vi konfokalmikroskopi med endotelceller farvede i grøn med CMFDA og kerner af isolerede monocytter farvet i blå med celle-gennemtrængelige Hoechst 33342 farvestoffet (figur 4). Den time-lapse Konfokal imaging lov visualisering af monocytter på apikale flyet, hvor deres fænotype kunne være vurderet (figur 4A-C, supplerende Movie 1). Overflytter celler gennemgår transmigration flyttet til intercellulære rum svarende til celle-celle vejkryds, før de forsvandt fra det apikale plan og dukkede op i basal flyet. De transmigrated celler præsenteret et sort hul omkring kernen svarende til monocyt figurer. Denne figur konstant ændres under monocyt migration nedenunder endotelceller (figur 4A-C, supplerende film 2-3). Denne dynamiske sort hul lavet af monocyt kroppen nedenunder i endothelial celler, og monocyt positionering, tilladt til entydig identifikation af transmigrated celler. Kvantitering af monocyt rekruttering over tid viste monocyt vedhæftning efterfulgt af transmigration (figur 4D-E). Selvom leukocytter kan extravasate gennem både transcellular og paracellular ruter, kunne vi kun iagttage paracellular transmigration under flow med denne metode. Dette er i overensstemmelse med vores tidligere observationer3,11,18,19.

Angiogene faktor drevet betændelse fremmer transmigration af CD16 + monocytter

Ved hjælp af denne metode, analyseret vi transmigration af menneskelige proangiogenic versus ikke-angiogene monocytter gennem en endotel éncellelag stimuleres af inflammatorisk cytokin TNFα alene eller i kombination med angiogene faktor VEGFA. Menneskelige proangiogenic monocytter kan identificeres ved ekspression af CD16 eller TIE2 på deres overflade. Her, blev anti-CD16-PE antistof brugt til at skelne mellem pro - og ikke-angiogene monocytter. Som vist i figur 5A-B (supplerende film 4-5), transmigration sats af CD16+ monocytter var lav, når endotelceller blev stimuleret med TNFα kun. Denne sats steg imidlertid når endotelceller blev stimuleret samtidig med TNFα og VEGFA (figur 5 c-E, supplerende film 6-7). Transmigration sats af ikke-angiogene monocytter blev tilsvarende højt under begge betændelsestilstande. For begge celle delpopulationer opstod transmigration udelukkende gennem ruten paracellular. Denne metode giver derfor mulighed for transmigration færdigheder af forskellige monocytic befolkninger skal undersøges samtidigt.

Renheden af monocytter påvirker transmigration effektivitet

Perifert blod mononukleære celler er sammensat af T-celler, B-celler, NK-celler og monocytter. Metoden monocyt isolation anvendes her kræver udtynding af de andre leukocyt befolkninger fra PBMC. For at forstå hvordan manglen på monocyt renhed påvirker resultaterne, vi brugte PBMC og farvet for pan-monocytter med en anti-CD14-PE antistof før du udfører rekruttering analysen under flow. Som vist i figur 6, induceret HUVEC stimulation med TNFα eller TNFα + VEGFA transmigration kun monocyt befolkning. De andre leukocytter sammensat af T-celler, B-celler og NK celler transmigrate ikke under TNFα eller TNFα + VEGFA. Faktisk er blevet dokumenteret, at disse leukocytter har brug for andre signaler for transmigration. Således, en ineffektiv isolationen af monocytter vil føre til en undervurdering af monocyt transmigration, hvor de andre leukocytter ville være tælles som monocytter. Dette vil føre til en forkert resultat på monocyt transmigration, som følge af kontaminering af monocyt befolkning med andre leukocytter.

Figure 1
Figur 1: profilering af isolerede monocytter ved flowcytometri. (A) analyse af morfologi af PBMC før lymfocyt udtynding. Størrelse (forward scatter: FSC) og nøjagtighed (side scatter: SSC) af perifert blod mononukleære celler blev bestemt ved flowcytometri. (B) størrelse og detaljeringsgrad af isolerede monocytter blev bestemt ved flowcytometri efter lymfocyt udtynding. En effektiv isolering af monocytter viser en fuldstændig udtømning af lymfocyt befolkning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Diagram af det fluidic system. (A) skematisk oversigt over perfusion systemet før og efter tilslutning af dias og montering på sprøjten pumpe. (B) Diagram af processen med at forbinde diaset med slangen ved hjælp af klemmer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: kontrol den effektive aktivering i endothelial celler. Aktivering af HUVEC af inflammatoriske stimuli blev kontrolleret ved at analysere den celle figur ved hjælp af fase kontrast mikroskopi. Efter 6 timers behandling, HUVEC præsentere et aflangt morfologi når stimuleret med TNFα (500 U/mL) eller en blanding af TNFα (500 U/mL) + VEGFA (1 µg/mL) i forhold til unstimulated celler. Denne morfologiske forandringer af HUVEC efter den inflammatoriske stimulation er let at opdage indikator for celle aktivering, som bør sikres for flow-analysen. Skalalinjen = 120 µm venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: identifikation af de transmigrated monocytter af konfokalmikroskopi. (A) Diagram over monocyt transmigration med de forventede visninger på apikale og basal fly. Kerner af monocytter farves med Hoechst 33342 er afbildet i blå, og de teoretiske udformninger af monocytter er afbildet med stiplede linjer omkring atomkerner. I visningen basal er de transmigrated flade monocytter vist at indtage en plads nedenunder endotel celle. Denne plads vises som et sort hul omkring monocyt kernen på Konfokal billeder. (B) lokalisering af en monocyt før og efter transmigration. Visningerne ortogonale vises, og udseende af et sort hul (afgrænset med den hvide stiplede linje) kan observeres efter monocyt migration til i endothelial abluminal rum. En rød pilespids angiver placeringen af en monocyt før transmigration og hvide pilespidsen viser den samme celle efter transmigration. Visningerne ortogonale viser, at den transmigrated monocyt nedenunder i endothelial cellen. Skalalinjen = 40 µm. (C) Time-lapse billedsekvenser (fra 0 til 20 min) monocyt rekruttering overarbejde. Visningerne apikale og basal er vist. De fulde sekvenser kan ses i supplerende film 1, 2 og 3. Røde firkanter fremhæve en transmigrated monocyt med en blå kerne. Det sorte hul svarende til selve flad monocyt nedenunder i endothelial cellen er afgrænset af en stiplet gule linje. Skalalinjen = 40 µm. (D) kvantificering af monocyt vedhæftning til TNFα-stimuleret versus unstimulated HUVEC over tid. (E) kvantificering af monocyt transmigration sats over tid. N = 3 biologiske replikater. Data præsenteres som gennemsnit ± SD venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: samtidige undersøgelse af monocyt delpopulationer under flow transmigration. (A) Time-lapse billedsekvenser (fra 0 til 20 min) af ansættelse af proangiogenic monocytter (CD16+) og ikke-angiogene monocytter over tid gennem TNFα-aktiveret HUVEC. Skalalinjen = 40 µm; visningerne apikale og basal er vist. De fulde sekvenser kan ses i supplerende Movie 4 for apikale og supplerende film 5 for basal synspunkter. (B) kvantitering af transmigration af menneskelige proangiogenic monocytter (HPMo: CD16 +) og menneskelige ikke-angiogene monocytter (HNMo) gennem en TNFα-aktiveret HUVEC éncellelag. N = 4 biologiske replikater, data præsenteres som gennemsnit ± SD * p < 0,05; Mann-Whitney test. (C) Time-lapse billed sekvenser (fra 0 til 20 min) af ansættelse af proangiogenic og ikke-angiogene monocytter overarbejde gennem TNFα + VEGFA-aktiveret HUVEC. Skalalinjen = 40 µm; visningerne apikale og basal er vist. De fulde sekvenser kan ses i supplerende film 6 for apikale og supplerende Movie 7 for basal synspunkter. (D) kvantitering af transmigration af menneskelige proangiogenic monocytter (HPMo: CD16 +) og menneskelige ikke-angiogene monocytter (HNMo: CD16-) gennem TNFα + VEGFA-aktiveret HUVEC éncellelag. N = 4 biologiske replikater, data præsenteres som gennemsnit ± SD * p < 0,05; Mann-Whitney test. (E) lokalisering af CD16+ monocytter før (10 min) og efter (15 min) transmigration gennem TNFα + VEGFA-stimuleret HUVEC. Visningerne ortogonale er vist. Skalalinjen = 40 µm venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Samtidige undersøgelse af transmigration af CD14 + versus CD14 - PBMC under flow. (A) vedhæftning af CD14+versus CD14- PBMC til TNFα-aktiveret HUVEC under flow. (B) vedhæftning af CD14+versus CD14- PBMC til TNFα + VEGFA-aktiveret HUVEC under flow. (C) Transmigration Vurder (%) af CD14+versus CD14- PBMC gennem TNFα-aktiveret HUVEC under flow. (D) Transmigration Vurder (%) af CD14+versus CD14- PBMC gennem TNFα + VEGFA-aktiveret HUVEC under flow. Data er gennemsnit ± SD N = 4 biologiske replikater. * p < 0,05; Mann-Whitney test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende Movie 1: Se på det apikale flyet af pan-monocyt rekruttering under flow. Udvidet visning af ansættelse af pan monocyt under flow på den apikale fly. HUVEC var farves med CMFDA og kerner af monocytter blev live-farves med Hoechst 33342. Skalalinjen = 50 µm venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende Movie 2: Se på pan-monocyt rekruttering under flow basal flyet. Udvidet visning af ansættelse af pan monocyt under flow på basal flyet. HUVEC var farves med CMFDA og kerner af monocytter blev live-farves med Hoechst 33342. Skalalinjen = 50 µm venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende Movie 3: maksimal projektion af z-stakke af pan-monocyt rekruttering under flow. Udvidet visning af ansættelse af pan monocyt under flow som vist i supplerende film 1 og 2. HUVEC var farves med CMFDA og kerner af monocytter blev live-farves med Hoechst 33342. Skalalinjen = 50 µm venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende Movie 4: Se på det apikale flyet af ansættelse af monocyt delpopulationer at TNFα-aktiveret HUVEC. Udvidet visning på den apikale fly af den samtidige rekruttering af monocyt delpopulationer under flow til TNFα-aktiveret HUVEC under flow. HUVEC var farves med CMFDA og kerner af monocytter blev live-farves med Hoechst 33342. Menneskelige proangiogenic monocyt delpopulationer blev identificeret af den overflade udtryk for CD16. Skalalinjen = 30 µm. venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende Movie 5: Se på rekrutteringen af monocyt delpopulationer at TNF basal flyetα-aktiveret HUVEC. Udvidede visning på basal plan, den samtidige rekruttering af monocyt delpopulationer under flow til TNFα-aktiveret HUVEC under flow. HUVEC var farves med CMFDA og kerner af monocytter blev live-farves med Hoechst 33342. Den menneskelige proangiogenic monocyt (HPMo) af de delpopulationer blev identificeret af den overflade udtryk for CD16. Skalalinjen = 30 µm. venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende film 6: Se på det apikale flyet af ansættelse af monocyt delpopulationer at TNFα+ VEGFA-aktiveret HUVEC. Udvidede visning, på apikale plan, den samtidige rekruttering af monocyt delpopulationer under flow til TNFα + VEGFA-aktiveret HUVEC under flow. HUVEC var farves med CMFDA og kerner af monocytter blev live-farves med Hoechst 33342. Menneskelige proangiogenic monocyt delpopulation blev identificeret af den overflade udtryk for CD16. Skalalinjen = 30 µm venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende Movie 7: Se på rekrutteringen af monocyt delpopulationer at TNF basal flyetα+ VEGFA-aktiveret HUVEC. Udvidede visning på basal plan, den samtidige rekruttering af monocyt delpopulationer under flow til TNFα + VEGFA-aktiveret HUVEC under flow. HUVEC var farves med CMFDA og kerner af monocytter blev live-farves med Hoechst 33342. Den menneskelige proangiogenic monocyt (HPMo) af de delpopulationer blev identificeret af den overflade udtryk for CD16. Skalalinjen = 30 µm venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her rapporterer vi en metode beskriver en undersøgelse af hvordan monocyt delpopulationer transmigrate gennem den betændte endotel éncellelag. Den omtalte metode brugt Konfokal mikroskopi i stedet for fasekonstrastmikroskopi, som også bruges til at studere monocyt rekruttering under flow3,11,19. En væsentlig fordel ved hjælp af Konfokal mikroskopi for time-lapse imaging er evnen til at utvetydigt forskelsbehandle transmigration og stærk vedhæftning af monocytter. Selvom fase-kontrast mikroskopi-baseret metode er også robust, kræver det ekspertise for at undgå at blande transmigrated celler og kraftigt klæbende celler. I dette tilfælde er man nødt til at indføre strenge kriterier for analyse for at gøre en klar forskel mellem disse to stater af monocyt rekruttering kaskade. Derudover er det også vigtigt at udføre et slutpunkt analyse af Konfokal mikroskopi for at bekræfte de globale tendenser observeret af fase-kontrast mikroskopi. Således giver direkte brug af Konfokal mikroskopi til at undersøge monocyt rekruttering under flow klare resultater på den faktiske transmigration status af erobrede monocytter.

En af de største flaskehalse i udførelse leukocyt rekruttering-undersøgelser under flow og ved hjælp af et fasekontrast mikroskop er tid, der bruges til at udføre analysen og spore individuelle celler fra fange til transmigration gennem celle-celle. Automatisering af sådanne analyser er mulige, men svære at udføre på grund af fase-kontrast ligheder mellem kravlende og transmigrated monocytter. Her viser vi ved hjælp af Konfokal mikroskopi, monocyt transmigration var ledsaget af en afbrydelse i endothelial celle farvning i basal flyet svarer til formen af de transmigrated monocytter nedenunder HUVEC. Denne placering blev bekræftet af refleksanordningens projektion. Overgangen af monocyt lokalisering opstod udelukkende mellem celle-celle vejkryds vejledende af en paracellular transmigration. Dette er i overensstemmelse med vores tidligere data, som viste, at under flow in vitro monocytter transmigrate udelukkende gennem paracellular rute med HUVEC3,18. Som supplement til den foreslåede metode her, er det muligt at anvende ikke-blokerende antistoffer mod junctional proteiner som VE-cadherin, syltetøj eller PECAM1 for at billede af potentielle lokaliteter af monocyt transmigration (paracellular vs transcellular). Vi har bekræftet, at de sorte figurer omkring monocyt kerner er en robust karakteristiske for transmigrated celler og en enkel begivenhed, der må kunne påvises af software. Selv om en manuel celle optælling system er vist her, er sorte form dannelsen omkring leukocyt kernen et kriterium, der kunne bruges til at definere leukocyt transmigration i automatiseret analyse, hvilket sparer en masse tid. Vi arbejder i øjeblikket på at udvikle en automatiseret program for en sådan analyse.

Fluorescens og konfokal mikroskopi blev tidligere brugt i studiet af leukocyt rekruttering. Men de blev ikke brugt til at undersøge ansættelse af forskellige delpopulationer samtidigt. Her foreslår vi en modalitet for at bruge Konfokal mikroskopi til at studere ansættelse af leukocyt undertyper samtidig i de samme mikromiljø. Vi viser, at Fluorescens mikroskopi kan bruges til at undersøge samtidig vandrende adfærd af forskellige monocyt delpopulationer. Som et eksempel, har vi brugt CD16 udtryk til at skelne mellem proangiogenic og ikke-angiogene monocytter for at studere transmigration kapacitet af de to delpopulationer i forskellige inflammatoriske sammenhænge. Overensstemmelse med vores seneste publikation ved hjælp af konfokalmikroskopi modalitet, vi har vist, at transmigration sats af CD16+ monocytter blev lavere, når i endothelial celle éncellelag blev stimuleret kun af TNFα3. Men kombinationen af TNFα og VEGFA førte til en stigning i transmigration af proangiogenic monocytter. Transmigration var tilsvarende høj for ikke-angiogene CD16- monocytter under begge betændelsestilstande. Vi har tidligere vist, at monocyt farvning med anti-CD16 antistof ikke frembyder nogen væsentlig virkning på transmigration, bekræfter dette ved analysen af umærket monocytter efter transmigration assay, ved hjælp af konfokalmikroskopi3. Men for nye leukocyt undertyper eller antistoffer bruges til at markere dem, mærkning virkningen skal vurderes. Brug denne metode, kan op til tre forskellige populationer af leukocytter samtidig undersøges. Dette kunne være delpopulationer, der er funktionelt adskilt eller lignende immun celletyper. Selv om fokus her er på monocyt transmigration, kan andre trin i deres rekruttering også analyseres ved denne metode, herunder celle adfærd før transmigration, som fange, og migrational retningslinier. Efter transmigration begivenheder såsom abluminal opbevaring og omvendt transmigration kan også undersøges for forskellige leukocyt populationer, som en forlængelse af denne metode. En begrænsning er dårlig påvisning af farvning i den far-red kanal i time-lapse imaging, samt nogle overspill af fluorescens signaler, der reducerer z-stakken opløsning. Dette var primært relateret til instrumentet anvendes til Konfokal billeddannelse. Hjælp af billedet deconvolution kunne i sidste ende at forbedre billedkvaliteten og tillade yderligere analyse af de forskellige trin i leukocyt rekruttering.

For at studere leukocyt rekruttering under optimale forhold, er det vigtigt at kontrollere aktivisering statussen i endothelial celle éncellelag. Faktisk, en mangelfuld aktivering i endothelial celler fører til en global nedbringelse monocyt vedhæftning og transmigration. Endotel celle aktivering kan kontrolleres ved at analysere udtryk niveau af adhæsionsmolekyler på endotel cellens overflade som ICAM1 og VCAM1. Niveauet for disse vedhæftning molekyler skal øges i forhold til unstimulated endotelceller. Hvis ingen ændring kan spores i disse endotelial adhæsionsmolekyler, den kulturperler HUVEC kan betragtes som ikke er aktiveret. Vurdere udtryk af adhæsionsmolekyler kan udgøre en god kvantitativ kontrol mellem forskellige forsøg med den samme batch af HUVEC. Men udtryk niveauet af disse adhæsionsmolekyler kan også varierer mellem forskellige primære kultur i endothelial celler begrænse overvejelserne om en global grænse på ICAM1 eller VCAM1. Ændringen i form af makrovaskulære endotelceller som HUVEC er også en god indikator for deres aktivering. Denne sidstnævnte skift i fænotype giver mulighed for en hurtig og kvalitativ vurdering af HUVEC aktivering. Men analysen af adhæsionsmolekyler kan være et bedre valg for mikrovaskulære celler, der ikke viser større form-ændring ved aktivering med inflammatoriske cytokiner.

Mekanistiske undersøgelser, kan relevante negative kontroller af monocyt transmigration udføres ved hjælp af antistoffer mod endotelial adhæsionsmolekyler såsom ICAM1, VCAM1 eller på leukocyt overflade som leukocyt funktion-associerede Antigen (LFA) -1. Brugen af en negativ kontrol er afgørende for sådanne Mekanismestudier i monocytter som de udtrykker Fc-receptorer på deres celle overflader. Renheden af monocytter efter isolation er også vigtigt, for at undgå forurening af andre leukocyt befolkninger og en undervurdering af satsen for monocyt transmigration. En anden afgørende parameter er den temperatur, som skal være indstillet på 37 ° C for alle assays for at sikre alle eksperimentelle observationer er relevante og oversætte i overensstemmelse hermed til menneskelige i vivo celle handel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Paul Bradfield for manuskript læsning og feedbacks. A. S. modtaget økonomisk støtte fra Sir Jules Thorn velgørende oversøiske Trust Reg.,

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Culture Flasks 75 cm2 TPP 90076 Routine culture of isolated HUVEC
µ-Slide VI 0.4 IBIDI 80606
Centrifuge Tubes 15 mL TPP 191015
Centrifuge Tubes 50 mL TPP 191050
Collagen G Biochrom L 7213 For coating of cell culture flasks
Gelatin Sigma-Aldrich 1393 For coating of cell culture flasks
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8537
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8662
RPMI-1640 Medium Sigma-Aldrich R8758
3-Way Stopcocks BIO-RAD 7328103
penicillin 10,000 μ/mL streptomycine 10,000 μg/mL fungizone 25 μ/mL AMIMED 4-02F00-H
Collagenase type 1 Worthington LS004216
Medium 199 1x avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes GIBCO 22340020
Bovine Albumin Fraction V ThermoFisher 15260037
Endothelial Cell Growth Supplement, 150 mg Millipore 02-102
Heparin Sodium Sigma-Aldrich H3149RT
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H6909
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A 4544
EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O APPLICHEM A2937.0500
CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC Miltenyi Biotech 130-100-713 AB_2655150
CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE Miltenyi Biotech 130-110-807 AB_2657280
Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC Miltenyi Biotech 130-107-016 AB_2653263
BD Accuri C6 Plus BD Bioscience
µ-Slide I Luer IBIDI 80176
CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) ThermoFisher C2925
Recombinant human TNFα Peprotech 300-01A
Recombinant human VEGFA Peprotech 100-20
NE-1000 Programmable Syringe Pump KF Technology NE-1000
Ficoll Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02
Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE Miltenyi Biotech 130-110-519 AB_2655051
Pan Monocyte Isolation Kit, human Miltenyi Biotech 130-096-537
Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE Miltenyi Biotech 130-106-762 AB_2655403
LS columns Miltenyi Biotech 130-042-401
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotech 130-090-976
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate ThermoFisher H1399
Silicone tubing IBIDI 10841
Elbow Luer Connector IBIDI 10802
Female Luer Lock Coupler IBIDI 10823
Luer Lock Connector Female IBIDI 10825
In-line Luer Injection Port IBIDI 10820
Ar1 confocal microscope Nikon
40x objective Nikon 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm
ImageJ Software NIH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells. Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).
  2. De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).
  3. Sidibe, A., et al. Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours. Nature Communications. 9 (1), 355 (2018).
  4. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  5. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
  6. Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).
  7. Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).
  8. Chamorro, S., et al. In vitro differentiation of porcine blood CD163− and CD163+ monocytes into functional dendritic cells. Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).
  9. Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood. Blood. 74 (7), (1989).
  10. Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
  11. Bradfield, P. F., et al. JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation. Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).
  12. Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation. Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).
  13. Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha. Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).
  14. ibidi GmbH. Shear Stress and Shear Rates for ibidi µ-Slides - Based on Numerical Calculations. , (2014).
  15. Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
  16. Yang, C. -R., Hsieh, S. -L., Ho, F. -M., Lin, W. -W. Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression. Journal of Immunology. 174 (3), Baltimore, Md. 1647-1656 (2005).
  17. Wong, D., Dorovini-Zis, K. Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture. Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).
  18. Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
  19. Bradfield, P. F., et al. Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques. PLoS One. 11 (7), e0159679 (2016).

Tags

Immunologi og infektion sag 141 leukocyt handel monocyt rekruttering betændelse timelapse imaging Konfokal mikroskopi vedhæftning transmigration monocyt delpopulationer kemokiner integriner adhæsionsmolekyler
Samtidige undersøgelse af ansættelse af monocyt delpopulationer Under Flow In Vitro
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ropraz, P., Imhof, B. A., Matthes,… More

Ropraz, P., Imhof, B. A., Matthes, T., Wehrle-Haller, B., Sidibé, A. Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58509, doi:10.3791/58509 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter