Summary
نقدم هنا، بروتوكولا متكاملة أن تدابير الوحيدات يتدنى الاتجار تحت التدفق في المختبر باستخدام علامات محددة السطحية والأسفار [كنفوكل] مجهرية. يمكن استخدام هذا البروتوكول لاستكشاف خطوات التوظيف متتابعة، وكذلك فيما يتعلق بالشخصية الأخرى فرعية الكريات البيض باستخدام علامات السطحية محددة أخرى.
Abstract
تجنيد وحيدات من الدم إلى الأنسجة المحيطة المستهدفة حاسمة بالنسبة لعملية تحريضية أثناء إصابة نسيج والتنمية الأورام وأمراض المناعة الذاتية. هذا هو سهل من خلال عملية القبض من التدفق الحر على سطح لومينال لتنشيط خلايا بطانية، تليها هجرتها الالتصاق وترانسيندوثيليال (التهجير) في الأنسجة المتضررة الأساسية. ومع ذلك، الآليات التي تدعم توظيف الفئات السكانية الفرعية الوحيدات تفضيلية وتعتمد على السياق، هي لا تزال غير مفهومة تماما. ولذلك، قمنا بتطوير أسلوب التي تسمح بتجنيد الوحيدات مختلف الفئات السكانية الفرعية في نفس الوقت تصور وقياسها تحت التدفق. يسمح هذا الأسلوب، استناداً إلى الوقت الفاصل بين التصوير [كنفوكل]، لأن التمييز لا لبس فيه بين وحيدات ملتصقة وترانسميجراتيد. وهنا يصف لنا كيف يمكن استخدام هذا الأسلوب لدراسة سلسلة تجنيد وحيدات برو-الأوعية وغير الأوعية في المختبر في نفس الوقت. وعلاوة على ذلك، يمكن توسيع هذا الأسلوب لدراسة الخطوات المختلفة للتوظيف لتصل إلى الثلاث الوحيدات السكان.
Introduction
وحيدات تشكل عنصرا متجولة من الحصانة الفطرية التي لا غنى عنها لمكافحة ناقلات الأمراض، تنظيف الأنسجة التالفة، والأوعية، والفسيولوجيا المرضية للعديد من الأمراض بما فيها السرطان1،2،3 . هي وحيدات الخلايا المشتقة من نخاع العظم وتتألف من الفئات السكانية الفرعية غير المتجانسة التي تعمم في الدم ولكن يمكن تعيين إلى الموقع التهاب في الأنسجة المحيطية من خلال الآليات الجزيئية المحددة. وبصفة عامة، تورط الشلالات التوظيف من وحيدات، أما بالنسبة للكريات البيضاء خطوات مختلفة بما في ذلك التقاط، المتداول، والزحف، والاعتقال والهجرة ترانسيندوثيليال (التهجير) والهجرة من خلال جدار الوعاء (الغشاء ولوحة جدارية 4من الخلايا). هذه الخطوات تشمل أساسا الجزيئات الناجمة عن الالتهابات على سطح غشائي لومينال مثل سيليكتينس وبروتين سكري يغاندس، المستقطبات، وجزيئات الالتصاق بين الخلايا وهالة وعلى مستقبلات في الكريات البيضاء مثل سيليكتين يغاندس وإينتيجرينس. مسارات الاتجار أما الوصلات الخلية البطانية (باراسيلولار) أو من خلال هيئة الخلية البطانية (ترانسسيلولار) يمكن أن يستخدمها الكريات البيضاء لعبور حاجز غشائي5. بينما وحيدات وثقت تاريخيا ترانسميجراتي طريق ترانسسيلولار، وقد اقترحت الاختلافات المحتملة في مسار الهجرة على كما لم تعد تعتبر وحيدات خلية متجانسة سكان. الآن أصبح من الواضح أن التنوع الوحيدات يمكن تعريفها بواسطة كل من خلافاتها والقواسم المشتركة، وفيما يتعلق التسرب المميزة الشلالات3،6. ولذلك، كي لا لبس فيه تميز بين الفئات السكانية الفرعية الوحيدات، من الأهمية بمكان لتصور والنمط الظاهري سلوك كل من هذه الفئات السكانية الفرعية المختلفة أثناء التعيين عملية.
وحيدات من البشرية، والخنازير والجرذان والفأر كانت ينقسم إلى الفئات السكانية الفرعية المظهرية مع بعض المهام المنسوبة وسلوكيات محددة المهاجرة7،،من89. على سبيل المثال، في البشر، يمكن تقسيم وحيدات إلى ثلاث مجموعات فرعية استناداً إلى التعبير عنها السطحية CD14، التمييز عن lipopolysaccharide البكتيرية، و CD16، مستقبلات Fc-غاما الثالث. وتشمل الفئات السكانية الفرعية الوحيدات البشرية CD14 الكلاسيكية+CD16-، وسيطة CD14+CD16+ وغير الكلاسيكية CD14خافتCD16 الخلايا+ 6،9. CD14 الكلاسيكية+CD16 وحيدات– وعرضت أن تكون أساسا التحريضية في حين تجمع CD16+ وحيدات عثر جماعياً لتقديم TIE2 التعبير وبروانجيوجينيك الدالة10. دأبت، عامل تحفيز الخلية البطانية مع السيتوكينات الالتهابية مثل نخر الورم البشري α (تنف) أو انترلوكين (IL-1) بيتا (التهاب التقليدية) غير كافية لتشغيل كاملة تجنيد CD14 الكلاسيكية+CD16 – وحيدات. بيد الإجراءات المتزامنة بعامل نمو الأوعية الدموية غشائي (VEGF) و TNFα (التهاب الأوعية تحركها عوامل) مطلوبة لإثارة التهجير CD16+ تجمع بروانجيوجينيك وحيدات3. تاريخيا، استخدمت النظام التقليدي ترانسويل تحت ظروف ثابتة، وغرفة تدفق صفيحة متوازية، والدوائر تدفق μ-الشريحة لتحليل كمي تجنيد السكان الكريات البيض واحد وقت في المختبر11 ،،من1213. في حين قد تم التحقق من صحة هذه البروتوكولات، سينظر أسلوب أكثر قوة أن يسمح تحليل الفئات السكانية الفرعية الوحيدات متعددة متزامنة أكثر الثاقبة. يجب مراعاة التفاعلات متعددة وترددات مختلفة لكل سكان كل منها هذه المنهجيات وأيضا توفير فهم ميكانيكية لأوجه التشابه والخصوصيات للشلالات التجنيد التي تقوم بتعريف كل الوحيدات مجموعة فرعية.
نقدم هنا، أسلوب يقوم على تصوير الوقت الفاصل بين تجنيد الوحيدات تحت التدفق الذي يسمح الشلالات الكثيرة الارتحال من الوحيدات مختلف الفئات السكانية الفرعية دراستها في نفس الوقت باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]. ويدمج هذا الأسلوب بعض الميزات الهامة التي تحاكي التهاب غشائي الخلايا، فضلا عن الهليوكبتر تعميم وحيدات في الأوردة الشعرية اللاحقة، المقر الرئيسي للتوظيف الكريات البيض في الحية. يستخدم الأسلوب المقترح الخلايا البطانية البشرية الوريد السري (هوفيك)، التي يتم إنشاؤها من خلال بروتوكول راسخة في معزل عن البشرية السرة الحبال. هذا المورد السريرية لديه ميزة كونها متاحة بسهولة كمنتج ثانوي بيولوجية، بينما أيضا توفير عائد معقول من الخلايا البطانية التي يمكن أن تكون معزولة من الوريد السري. كنا أيضا الأصباغ الفلورية والفلوره للتمييز بين مختلف مكونات الخلوية، والفحص المجهري [كنفوكل] لتعريف لا لبس فيه الوحيدات لتحديد المواقع (لومينال مقابل أبلومينال) مع مرور الوقت. وقد وضع بروتوكول المقدمة هنا للتدبير في نفس الوقت مستويات الهجرة من الفئات السكانية الفرعية الوحيدات. وعلاوة على ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه يمكن تمديد هذه المنهجية لدراسة الفئات السكانية الفرعية الكريات البيضاء وعمليات التوظيف الأخرى باستخدام المؤشرات الحيوية المختلفة ووضع العلامات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
واستخدمت المواد البشرية بموافقة مستنيرة من المانحين المتطوعين ووفقا "السويسرية لجان أخلاقيات" البحوث السريرية.
1-العزلة وتجميد السرة البشرية الوريد خلايا بطانية (هوفيك)
- إضافة 5 مل من محلول طلاء لقارورة T75 (0.1 مغ/مل الكولاجين ز والجيلاتين 0.2% في برنامج تلفزيوني المالحة الفوسفات مخزنة في درجة الحموضة 7.4) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل البدء في العزل هوفيك.
- تنظيف الحبل السري مع برنامج تلفزيوني والقضاء عليه مع يضغط العقيمة ووضعه في 20 سم معقمة طبق بيتري. قص نهايات الحبل السري مع مقص معقم.
- تحديد وريد كبير واحد واثنين من الشرايين الصغيرة. إدراج قنية بلطف مع محبس الحنفية الثلاثية إرفاقها إلى الأطراف الوريد في نهايات الحبل.
- شد الحبل والاتصال القنية بشدة بطول الأسلاك.
- نتخلل الحبل مرتين مع 20 مل من المتوسطة ربمي تحتوي على 100 يو/مليلتر البنسلين، ستربتوميسين U/mL 100 و 250 نانوغرام/مليلتر الامفوتريسين بان يغسل الأوردة الحبل. هذه العملية يجعل مظهر الحبل أكثر بياضا وأكثر وضوحاً. إفراغ هذا السياق قبل إضافة كولاجيناز بجمع ربمي مع حقنه في نهاية واحدة.
- نتخلل في السياق مع 12 مل نوع كولاجيناز 1 ملغ/مل أنا (0.22 تصفيتها ميكرومتر).
- إغلاق ينتهي محبس الحنفية في الحبل واحتضان الحبل في 37 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة.
- بلطف تدليك الحبل لفصل خلايا بطانية من التجويف الوريد.
- تأخذ 30 مل ربمي المحتوية على مصل العجل الجنين 10% مع حقنه 50 مل وتوصيله بأحد طرفي الحبل السري.
- الاتصال حقنه فارغة 50 مل بالطرف الآخر من الحبل السري
- فتح في محبس الحنفية ونتخلل في السياق من طرف واحد في حين جمع المقابل من الطرف الآخر.
ملاحظة: تعليق تجميع يحتوي على خلايا بطانية. - الطرد المركزي هذا تعليق خلية في 200 x ز لمدة 5 دقائق.
- تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية مع 10 مل متوسط M199 كاملة (M199 ملاحق تحتوي على 20 ٪ السفح، 15 نمو الخلايا البطانية ميكروغرام/مل، 100 ميكروغرام/مل الهيبارين الصوديوم، 0.5 ميكرومتر الهيدروكورتيزون، 10 ميكروغرام/ملليلتر "حمض" الأسكوربيك L، 100 يو/مليلتر البنسلين، 100 يو/مليلتر ستربتوميسين و 250 نانوغرام/مليلتر الامفوتريسين ب).
- إزالة الحل الطلاء من قارورة T75 وشطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
- بذور الخلايا التي يتم جمعها من الخطوة 1، 13 في قارورة T75 ووضعه في الحضانة عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2.
- وفي اليوم التالي شطف قارورة 3 مرات مع المتوسط M199 كاملة إزالة بقايا خلايا الدم الحمراء ثم قم بتغيير في المتوسط كل يومين حتى التقاء.
- في التقاء 80 – 90%، شطف المونولاير هوفيك مرة واحدة مع 5 مل من برنامج تلفزيوني وفصل الخلايا مع 5 مل التربسين 0.05% 1 مم يدتا في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 5 إضافة 4 مل من M199 و 1 مل من السفح لوقف عمل التربسين. مسح قارورة لفصل هوفيك كافة.
- جمع قاسمة 50 ميليلتر استخدامها لتلطيخ VE-كادهيرين، بيكم-1 و gp38، وتحليلها بالتدفق الخلوي للتحقق من النقاء هوفيك.
- جمع ما تبقى هوفيك من الخطوة 1.18 في أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 200 غ س لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تجاهل المادة طافية من الخطوة 1.19، ريسوسبيند بيليه الخلية في تجميد الحل (FCS التي تحتوي على 10% [دمس]) في كثافة 5 × 105 خلايا/مل في كريوتوبيس، وتجميد في-80 درجة مئوية أو في سائل النيتروجين حتى الاستخدام.
-
للتحقق من النقاء هوفيك:
- إضافة 1 ميليلتر من جسم الإنسان لمكافحة VE-كادهيرين-فيتك، 1 ميليلتر من جسم الإنسان لمكافحة PECAM1-PE و 1 ميليلتر من جسم الإنسان لمكافحة بودوبلانين-آسيا والمحيط الهادئ إلى قاسمة من 50 ميليلتر من هوفيك التي تم جمعها في الخطوة 1، 18.
- احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
- إضافة 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 30 ثانية.
- تجاهل المادة طافية وريسوسبيند في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني. يمكن الآن الحصول على البيانات بتقنيات قياس التدفق.
ملاحظة: هوفيك إيجابية لهاء-كادهيرين وبيكام-1، وسلبية بالنسبة بودوبلانين.
2-هوفيك إزالة الجليد
ملاحظة: استخدام هوفيك في ممر منخفض للتجارب (الممرات 5 كحد أقصى).
- معطف قارورة T75 مع 1 مل محلول طلاء عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- سرعة رفع التجميد عن هوفيك في 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة وريسوسبيند الخلايا في 10 مل M199 كاملة.
- الطرد المركزي الخلايا في 200 x ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل M199 كاملة.
- نقل تعليق خلية في قارورة المغلفة مسبقاً. مكان قارورة في الحضانة عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2. تغيير المتوسطة الثقافة خلية كل يومين.
3-هوفيك الثقافة في 0.4 μ-شريحة الدائرة
- قبل خمسة أيام قبل البدء التجربة، وتدفق معطف دوائر 0.4 μ-الشريحة مع 30 ميليلتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على الكولاجين 0.1 مغ/مل غ، 0.2 ٪ الجيلاتين في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- تغسل الدوائر مع 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
- فصل الخلايا من هوفيك المتلاقية 80-90% من قارورة T75.
- شطف هوفيك مع 5 مل من برنامج تلفزيوني، وفصل لهم مع 5 مل التربسين 0.05% في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- مسح وجمع تعليق خلية في M199 كاملة وحساب عدد الخلايا بالأسلوب الأكثر ملاءمة. الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 106 خلايا/مل وتوزيع 30 ميليلتر (الخلايا 30,000) كل دائرة.
- احتضان الخلايا في حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 ح 1.
- إضافة 150 ميليلتر من M199 كاملة لكل دائرة، وثقافة الخلايا لمدة 5 أيام في الحضانة عند 37 درجة مئوية و 5% أول أكسيد الكربون2. تغيير في المتوسط كل يومين.
4-هوفيك تلطيخ للمقايسة تجنيد الوحيدات تحت التدفق
- إعداد وضع العلامات المتوسط M199 1 ميكرومتر من كمفدا (5-تشلوروميثيلفلوريسسين اسيتات) والحارة في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل وسم الخلية.
- استعد "هوفيك يغسل" مرتين مع المتوسط M199 عند 37 درجة مئوية.
- استبدالها في المتوسط 30 ميليلتر من حرارة متوسطة وضع العلامات التي تحتوي على 1 ميكرومتر من كمفدا ووضع في الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 10 دقائق.
- أغسل مرة واحدة مع M199 كاملة واحتضان الخلايا مع M199 كاملة في الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: من المهم لإزالة جميع آثار مصل قبل إضافة الحل وضع العلامات، وإلا فإنه قد يغير هوفيك تلطيخ. - استبدال المتوسطة مع M199 كاملة تتضمن أما TNFα البشرية (500 U/mL) أو مزيج TNFα البشرية (500 U/mL) مع فيجفا البشرية (1 ميكروغرام/مل) ح 6 في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
5-عزل وحيدات عموم البشرية وتلطيخ للفئات السكانية الفرعية
- استخدام أما معطف بافي دم الإنسان مركزة، أو 20 مل من الدم البشري الطازج معزولة، جمعت في يوم التجربة في أنابيب vacutainer يدتا.
- تمييع الدم في برنامج تلفزيوني-1 مم يدتا (1:1)، و "الماصة؛" بلطف 20 مل الدم المخفف على رأس 20 مل من الكثافة المتدرجة وسائط الإعلام. الطرد المركزي في 400 x ز مدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تسارع بطيء ودون الفرامل.
- جمع خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (PBMC)-طبقة الصفائح الدموية (بين الكثافة المتدرجة وسائط الإعلام وطبقات البلازما) في أنبوب 50 مل جديدة تحتوي على 40 مل من برنامج تلفزيوني-1 مم يدتا. أعلى يصل إلى 50 مل مع برنامج تلفزيوني-1 مم يدتا.
- أجهزة الطرد المركزي في 200 x ز في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه الخلية مع 10 مل من المخزن المؤقت المصبوغة (برنامج تلفزيوني-1 مم يدتا المحتوية على 0.5% ألبومين المصل البقري جيش صرب البوسنة).
- أجهزة الطرد المركزي في 200 x ز في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية.
- كرر الخطوات من 5.5 و 5.6.
- ريسوسبيند بيليه الخلية مع 10 مل من تلطيخ المخزن المؤقت. تأخذ قاسمة 10 ميليلتر لحساب خلية.
- تحقق من السكان ببمك وعد الخلايا سريعاً مع سيتوميتير تدفق.
ملاحظة: ويمكن ملاحظة للسكان اللمفاويات والوحيدات المميزة (الشكل 1A). نتوقع من 50 مل دم البشري الطازج عن 50-100 × 106 ببمك. -
لتعيين CD14 + مقابل CD14-"ببمك" تحت التدفق:
- أغسل بيليه ثلاث مرات مع تدفق المخزن المؤقت (M199 المحتوية على 0.5% جيش صرب البوسنة) وريسوسبيند الخلايا وحيدات النوى في المخزن المؤقت للتدفق في 6 × 106 خلايا كل مل.
- جعل مختبرين من 200 ميليلتر لكل فحص. احتضان عند 37 درجة مئوية حتى 20 دقيقة قبل المقايسة.
- إضافة 5 ميليلتر لمكافحة--CD14-PE وهويشت 33342 بتركيز نهائي 2 ميكرومتر إلى كل قاسمة. خلط واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- الطرد المركزي قاسمة في 400 x ز لمدة 30 ثانية.
- تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع 200 ميليلتر من تدفق المخزن المؤقت.
-
لتعيين الفئات السكانية الفرعية الوحيدات تحت التدفق:
- عزل وحيدات مع مجموعة عموم عزلة الوحيدات وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
ملاحظة: بروتوكول العزل التالية 50 × 106 خلايا. يمكن تحجيمه للأعلى أو الأسفل طالما أنها ضمن توصيات الشركة المصنعة. - الطرد المركزي بتعليق ببمك في 200 x ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع 400 ميليلتر لتلطيخ المخزن المؤقت.
- إضافة 50 ميليلتر من مستقبلات Fc كاشف حظر و 50 ميليلتر من جسم "الوحيدات عموم" كوكتيل.
- احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
- إضافة 400 ميليلتر لتلطيخ المخزن المؤقت و 100 ميليلتر من الخرز المغناطيسي مترافق البيوتين المضادة الأجسام المضادة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- إضافة 2 مل من المخزن المؤقت المصبوغة واستخدام عمود LS أجهزة ماكينتوش مقترنة بمغناطيس.
- مكان العمود LS على المغناطيس وإضافة 1 مل من تلطيخ المخزن المؤقت. تجاهل في التدفق من خلال.
- تمرير تعليق ببمك في العمود وجمع تدفق واضحة على الرغم من أن تحتوي على عموم وحيدات في أنبوب 15 مل جديدة.
- إضافة المخزن المؤقت المصبوغة إلى أعلى يصل إلى 5 مل.
- تأخذ قاسمة والتحقق من جودة عزل الوحيدات مع سيتوميتير تدفق.
- تحديد عدد الوحيدات عموم.
ملاحظة: ويمكن ملاحظة فقط الوحيدات السكان (الشكل 1B). - الطرد المركزي ما تبقى وحيدات من الخطوة 5.11.11 في 200 x ز لمدة 5 دقائق.
- تجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل من تدفق المخزن المؤقت (M199 المحتوية على 0.5% جيش صرب البوسنة).
- كرر 5.11.13 إلى 5.11.14 مرتين للقضاء على أي أثر يدتا.
- عزل وحيدات مع مجموعة عموم عزلة الوحيدات وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- جعل التعليق الوحيدات في تدفق المخزن المؤقت (M199 مع جيش صرب البوسنة 0.5 ٪) في 6 × 106 خلايا/مل.
- جعل مختبرين من 200 ميليلتر من وحيدات لكل فحص التوظيف.
- الاحتفاظ قاسمة في 37 درجة مئوية في الحاضنة حتى 20 دقيقة قبل الحقن.
- إضافة 5 ميليلتر من الأجسام المضادة-CD16-PE وهويشت 33342 (النهائي 2 ميكرومتر) إلى كل قاسمة.
- خلط واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- الطرد المركزي قاسمة في 400 x ز لمدة 30 ثانية.
- تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع 250 ميليلتر من تدفق المخزن المؤقت.
- إضافة 30 ميليلتر من تعليق الوحيدات في غرفة واحدة للشريحة للعمل لتعيين المعلمات الحصول على المجهر [كنفوكل].
- تبقى مختبرين لتعليق الوحيدات من الخطوة 5.18 عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: هذا التعليق على استعداد لتكون مدخلة في نظام التدفق.
6-إعداد نظام فلويديك
- التأكد من أن الخلية الحاضنة للتصوير في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: ويرد في الشكل 2رسم تخطيطي لنظام تدفق. - تجميع أنابيب الجزء الأول: إدراج من الذكور موصل اللوير إلى واحدة من نهاية قطعة من السيليكون الأنابيب (8 سم طويلة و 3 مم) وتوصيل الطرف الآخر إلى مجموعة حقن اللوير في خط. قم بتوصيل موصل اللوير الأخير قطعة من السيليكون الأنابيب (40 سم و 3 مم) في نهاية واحدة.
ملاحظة: بشكل اختياري، يمكن إدراج حنفية 3-طريقة متصلاً بحقنه 5 مل بين مجموعة حقن اللوير في خط وسيليكون أنابيب لإزالة فقاعة هواء في نهاية المطاف. - تجميع أنابيب الجزء الثاني: الاتصال محقنة 20 مل بنهاية واحدة لطول أنابيب سيليكون (طول 1 متر وسمكه 3 مم). إدراج الذكور موصل اللوير إلى الطرف الآخر من الأنبوب.
- توصيل الجزء الأول والجزء الثاني الأنابيب عن طريق إدراج الذكور موصل نظام إلى قفل اللوير الإناث مقرنة (الشكل 2A).
- وضعت نهاية الأنبوب سيليكون مجاناً في الخزان الذي يحتوي على تدفق المخزن المؤقت (M199 + 0.5% جيش صرب البوسنة) ارتفعت درجة حرارة عند 37 درجة مئوية.
- اسحب المكبس محقنة 20 مل لملء الأنبوب مع تدفق المخزن المؤقت.
- ضع المحاقن في المضخة وتأمينه.
- تعيين المضخة في سحب الوضع (في مقابل لبث) وتحديد معدل التدفق.
- تحديد معدل التدفق وفقا للشريحة عبدي المستخدمة باستخدام الصيغة التالية:
ملاحظة: عامل الشريحة فيعتمد على الشريحة عبدي المستخدمة للتجربة. Μ-الشريحة أنا0.4 قفل اللوير المستخدمة في هذا المثال، عامل الشريحة هو 131.6. لعوامل شريحة معينة، راجع موقع الشركة14. تدفق اللزوجة المخزن المؤقت هو 0.0072 dyn.s/cm2. إجهاد القص في الأوردة الشعرية اللاحقة عن 0.5 داين/سم2. -
توصيل الشريحة (الشكل 2):
- المشبك أنابيب سيليكون حول "مقرنة قفل اللوير" الإناث وقطع الذكور موصل اللوير اثنين المقرنة.
- قم بتوصيلها بخزانات الشريحة التي تحتوي على حفز هوفيك والتعبئة مع المتوسطة. تجنب فقاعات الهواء أثناء هذه الخطوة.
- الإقلاع المشابك والتأكد من أن الاتصال هو عدم حدوث أي تسرب.
- ضع الشريحة تحت المجهر للتصوير بمرور الوقت وبدء تشغيل المضخة.
7-الوقت الفاصل بين التصوير لتجنيد الوحيدات تحت التدفق بالفحص المجهري [كنفوكل]
- استخدم هدفا 40 x (انظر الجدول للمواد) للتصوير.
- تنشيط في 405 نانومتر (نواة الوحيدات الأزرق)، 488 نانومتر (خلايا بطانية الخضراء) وأشعة الليزر نانومتر (الأحمر CD16 + فرعية) 561.
- استخدام الدائرة التي تحتوي على وحيدات لتعيين معلمات اقتناء.
ملاحظة: للكشف عن وحيدات غير ترانسميجراتيد وترانسميجراتيد، يتم تعيين في الثقب وكثافة نانومتر الليزر 405 عالية. وهكذا، وحيدات ترانسميجراتيد غير مرئية قليلاً في خطة القاعدية. وحيدات ترانسميجراتيد فقط ولكن يقدم مجالاً أونستينيد حول نواة المقابلة للمساحة الجديدة المحتلة تحت خلايا بطانية. - مكان الدائرة يتم الحصول عليها تحت المجهر.
- اختر الحقول 3 وجهات النظر داخل دائرة نصف قطرها 1 سم لتصوير موقف متعدد [كنفوكل].
- تعريف القاعدية وعلى جانبي قمي خلايا بطانية
- تعيين z-كومة إلى نطاق 10-12 ميكرومتر (0.5 ميكرومتر الخطوة). قم بتشغيل عملية شراء الوقت الفاصل بين كل 1 دقيقة.
- بعد 3 دقائق من التصوير، حقن 200 ميليلتر من تعليق الوحيدات (6 × 106 خلايا/مل) من خلال منفذ الحقن اللوير في الخط.
ملاحظة: سرعة وحيدات تظهر في المستوى البؤري قمي والانضمام وبدء الهجرة الداخلية (المرور العابر من قمي بخطة القاعدية). - الصورة لمدة 30 دقيقة على الأقل. وبمجرد الانتهاء من إيقاف التصوير ووقف التدفق. المشبك الأنابيب إلى قطع الاتصال بها من الشريحة.
- إصلاح الشريحة مع بارافورمالدهيد 4% عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- تغسل الشريحة ببرنامج تلفزيوني وتخزين الشريحة عند 4 درجة مئوية لمزيد من التحليل إذا لزم الأمر.
8-تحليل البيانات مع إيماجيج
- حساب عدد مجموع وحيدات ملتصقة في كل حقل. تحديد عدد الخلايا كل مم2.
- عد وحيدات ترانسميجراتيد التي موجودة في الخطة القاعدية تحت خلايا بطانية والمحددة بوجود ثقب أسود (في قناة الأخضر) حول النواة.
- تقسيم عدد الكريات البيضاء ترانسميجراتيد بالعدد الإجمالي للكريات البيضاء ملتصقة. ويرد معدل الهجرة الخارجية كنسبة مئوية من وحيدات ملتصقة.
- للتوضيح، الجانبين القاعدية وقمي يمكن سيظهر في نفس الوقت لتوضيح الأحداث التي وقعت في كل من هذه الأقسام بطانية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحديد حالة التنشيط هوفيك الناجمة عن TNFα
يمكن أن تختلف بيو-نشاط سيتوكين التحريضية TNFα وفقا للدفعة والإحلال لذوبان تجميد دورة. من المهم التحقق من حالة التنشيط هوفيك مع العلاج TNFα. وهذا يمكن أن يؤديها في تلطيخ بالتوازي مع بعض العينات من هوفيك المتلاقية لتحريض التهاب سيليكتينس والمتكاملة-1 VCAM-115،16،17. أسهل وأبسط طريقة التحقق من حالة التنشيط هوفيك بعد العلاج TNFα هو التغيير المورفولوجي المعروضة بواسطة خلايا بطانية تحت الضغط التحريضية. كما هو موضح في الشكل 3، تمديد هوفيك بعد 6-ح حضور TNFα مقارنة بالخلايا أونستيمولاتيد. ويلاحظ استطالة مماثلة عندما يتم تحفيز هوفيكس بمزيج من TNFα وفيجفا. تسجيل حالة التنشيط هوفيك مهم إذ أن النتائج النهائية للتهجير وحيدات سيعتمد على نوعية غشائي خلية التنشيط.
التهجير الوحيدات يجعل من وقف مميزة في خلايا بطانية
دراسة التهجير الوحيدات تحت التدفق، استخدمنا مجهرية [كنفوكل] مع خلايا بطانية الملون باللون الأخضر مع كمفدا ونواة معزولة وحيدات الملون باللون الأزرق مع صبغ هويشت 33342 نفاذية الخلية (الشكل 4). الوقت الفاصل بين التصوير [كنفوكل] يسمح تقييم تصور وحيدات في الطائرة قمي، حيث يمكن أن تكون على النمط الظاهري (الشكل 4A-ج، تكميلية فيلم 1). نقل الخلايا المهاجرة تمر التهجير إلى المسافة بين الخلايا المقابلة لتقاطعات خلية خلية قبل أن اختفى من الطائرة قمي وظهرت في الطائرة القاعدية. تعرض الخلايا ترانسميجراتيد ثقب أسود حول نواة تناظر الأشكال الوحيدات. هذا الشكل يتغير باستمرار خلال الهجرة الوحيدات تحت خلايا بطانية (الشكل 4A-ج، "أفلام تكميلية" 2-3). يسمح هذا الثقب الأسود الدينامية التي تبذلها الهيئة الوحيدات تحت خلايا بطانية، وتحديد المواقع الوحيدات، لتحديد الخلايا ترانسميجراتيد لا لبس فيه. كوانتيتيشن تجنيد الوحيدات مع مرور الوقت أظهر الالتصاق الوحيدات متبوعاً بالتهجير (الشكل 4-E). على الرغم من أن يمكن اكسترافاساتي الكريات البيضاء من خلال طرق ترانسسيلولار وباراسيلولار على السواء، ويمكن فقط نلاحظ التهجير باراسيلولار تحت تدفق مع هذا الأسلوب. وهذا يتسق مع جهودنا السابقة الملاحظات3،11،،من1819.
عامل الأوعية مدفوعة التهاب يشجع الهجرة الداخلية من CD16 + وحيدات
باستخدام هذا الأسلوب، قمنا بتحليل الهجرة الداخلية من بروانجيوجينيك البشرية مقابل وحيدات غير الأوعية عن طريق أحادي الطبقة غشائي تحفزها سيتوكين التحريضية TNFα وحدها أو في تركيبة مع عامل الأوعية فيجفا. يمكن تحديد وحيدات بروانجيوجينيك البشرية من خلال التعبير عن CD16 أو TIE2 على سطحها. هنا، كان تستخدم الأجسام المضادة-CD16-PE للتمييز بين وحيدات للمحترفين وغير الأوعية. كما هو موضح في الشكل 5 ألف-ب (4-5 أفلام تكميلية)، معدل الهجرة الداخلية CD16+ وحيدات كان منخفضا عند حفز خلايا بطانية مع TNFα فقط. ومع ذلك، زاد هذا المعدل عند حفز خلايا بطانية في وقت واحد مع TNFα وفيجفا (الشكل 5أفلام تكميلية-E، 6-7). كان معدل الهجرة الداخلية وحيدات غير الأوعية عالية وبالمثل تحت كل الظروف الملتهبة. لكل الفئات السكانية الفرعية في الخلية، حدث التهجير حصرا من خلال الطريق باراسيلولار. ولذلك يسمح هذا الأسلوب لاستعدادات الهجرة الداخلية للسكان مونوسيتيك مختلفة التحقيق في نفس الوقت.
نقاء وحيدات يؤثر على كفاءة التهجير
تتكون خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى من خلايا T وخلايا ب وخلايا ناغورني كاراباخ ووحيدات. طريقة العزل الوحيدات المستخدمة هنا يتطلب استنزاف غيرهم من السكان الكريات البيض من ببمك. لفهم كيف يؤثر عدم نقاء الوحيدات على النتائج، استخدمنا ببمكس والملون لعموم-وحيدات مع جسم المضادة-CD14-PE قبل إجراء المقايسة التوظيف تحت التدفق. كما هو موضح في الشكل 6، تحفيز هوفيك TNFα أو TNFα + فيجفا الناجمة عن الهجرة الداخلية للسكان الوحيدات فقط. الكريات البيضاء الأخرى مكونة من خلايا تي، لا ترانسميجراتي ب الخلايا والخلايا ناغورني كاراباخ تحت TNFα أو TNFα + فيجفا. وفي الواقع، قد وثقت أن هذه الكريات البيضاء بحاجة إلى إشارات أخرى للتهجير. وهكذا، عدم كفاءة عزل وحيدات سيؤدي إلى التقليل التهجير الوحيدات، كما الكريات البيضاء الأخرى سوف تحسب وحيدات. سيؤدي هذا إلى نتيجة خاطئة على التهجير الوحيدات، نتيجة لتلوث السكان الوحيدات مع الكريات البيضاء الأخرى.
رقم 1: التنميط من وحيدات معزولة بالتدفق الخلوي- (أ) تحليل مورفولوجية PBMC قبل نضوب اللمفاويات. الحجم (المبعثر إلى الأمام: منتدى التعاون الأمني) وتقسيمات (مبعثر الجانب: SSC) من الدم المحيطي حددت الخلايا وحيدات النوى بالتدفق الخلوي. (ب) حجم وتقسيمات وحيدات معزولة يحددها التدفق الخلوي بعد نضوب اللمفاويات. ويبين كفاءة عزل وحيدات استنفاد كامل السكان اللمفاويات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الرسم التخطيطي للنظام فلويديك. (أ) نظرة عامة التخطيطي نظام التروية قبل وبعد اتصال الشريحة والمتصاعدة على مضخة الحقن. (ب) الرسم التخطيطي لعملية ربط الشريحة مع الأنابيب استخدام المشابك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: التحقق من تفعيل كفاءة خلايا بطانية. تم فحص تفعيل هوفيك من المحفزات التحريضية من خلال تحليل الشكل الخلية باستخدام الطوري. بعد 6 ساعات من العلاج، يقدم هوفيك مورفولوجيا ممدود عند حفز مع TNFα (500 U/mL) أو مزيج TNFα (500 U/mL) + فيجفا (1 ميكروغرام/مل) بالمقارنة مع الخلايا أونستيمولاتيد. هذا التغيير المورفولوجية من هوفيك بعد تنشيط التحريضية مؤشرا سهلة الكشف من تنشيط الخلية، التي ينبغي أن تكفل لتحليل تدفق. شريط المقياس = 120 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تحديد وحيدات ترانسميجراتيد بالفحص المجهري [كنفوكل]- (أ) رسم تخطيطي للتهجير الوحيدات مع آراء المتوقع على الطائرات قمي والقاعدية. يصور نواة وحيدات ملطخة هويشت 33342 باللون الأزرق، ويصور الأشكال النظري وحيدات مع خطوط متقطعة حول الأنوية. ويرى القاعدية، ترد وحيدات شقة ترانسميجراتيد لتشغل مساحة أسفل الخلية البطانية. يظهر هذا الفضاء كثقب أسود المحيطة بنواة الوحيدات على الصور [كنفوكل]. (ب) ترجمة الوحيدات قبل وبعد الهجرة. وترد آراء متعامد، ويمكن ملاحظة ظهور ثقب أسود (محددة بخط متقطع الأبيض) بعد الهجرة الوحيدات إلى حجرة أبلومينال بطانية. على رأس سهم أحمر يشير إلى موضع الوحيدات قبل التهجير ورأس السهم الأبيض يشير إلى نفس الخلية بعد التهجير. وتبين آراء متعامد أن الوحيدات ترانسميجراتيد أسفل الخلية البطانية. شريط المقياس = 40 ميكرومتر. (ج) الوقت الفاصل بين تسلسلات الصورة (من 0 إلى 20 دقيقة) للعمل الإضافي تجنيد الوحيدات. وترد آراء قمي والقاعدية. يمكن تبينه في تسلسل كامل تكميلية الأفلام 1، 2 و 3. مربعات حمراء تبرز الوحيدات ترانسميجراتيد بنواة أزرق. ثقب أسود المقابلة للجسم مسطح من الوحيدات أسفل الخلية البطانية هو مرسوم بخط أصفر متقطع. شريط المقياس = 40 ميكرومتر. (د) القياس الكمي للالتصاق الوحيدات لحفز TNFα مقابل unstimulated هوفيك على مر الزمن. (ﻫ) التحديد الكمي لمعدل الهجرة الداخلية الوحيدات على مر الزمن. N = 3 replicates البيولوجية. وترد البيانات يعني ± التنمية المستدامة الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: التحقيق المتزامن للتهجير من الفئات السكانية الفرعية الوحيدات تحت التدفق. تسلسل الصور الوقت الفاصل بين (أ) (من 0 إلى 20 دقيقة) على تجنيد وحيدات بروانجيوجينيك (CD16+) وغير الأوعية وحيدات على مر الزمن من خلال تنشيط TNFα هوفيك. شريط المقياس = 40 ميكرومتر؛ وترد آراء قمي والقاعدية. يمكن رؤية التسلسل الكامل في تكميلية الفيلم 4 قمي و تكميلية الفيلم 5 لوجهات النظر القاعدية. (ب) كوانتيتاتيون للتهجير وحيدات بروانجيوجينيك البشرية (هبمو: CD16 +) ووحيدات الأوعية غير البشرية (هنمو) عن طريق أحادي الطبقة هوفيك TNFα المنشط. N = 4 replicates البيولوجية، وترد البيانات يعني ± التنمية المستدامة * p < 0.05؛ اختبار مان-ويتني. (ج) صورة الوقت الفاصل بين متواليات (من 0 إلى 20 دقيقة) على تجنيد وحيدات بروانجيوجينيك والأوعية غير العمل الإضافي من خلال تنشيط TNFα + فيجفا هوفيك. شريط المقياس = 40 ميكرومتر؛ وترد آراء قمي والقاعدية. يمكن رؤية التسلسل الكامل في تكميلية الفيلم 6 قمي و تكميلية فيلم 7 لوجهات النظر القاعدية. (د) كوانتيتيشن من التهجير وحيدات بروانجيوجينيك البشرية (هبمو: CD16 +) ووحيدات البشرية غير الأوعية (هنمو: CD16-) من خلال تنشيط TNFα + فيجفا هوفيك أحادي الطبقة. N = 4 replicates البيولوجية، وترد البيانات يعني ± التنمية المستدامة * p < 0.05؛ اختبار مان-ويتني. (ﻫ) وحيدات التعريب CD16+ قبل (10 دقيقة) وبعد التهجير (15 دقيقة) من خلال حفز TNFα + فيجفا هوفيك. وترد آراء متعامد. شريط المقياس = 40 ميكرومتر الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6: التحقيق المتزامن للتهجير من CD14 + مقابل CD14-"ببمك" تحت التدفق. التصاق CD14 (A)+مقابل CD14– ببمك لتنشيط TNFα هوفيك تحت تدفق. (ب) انضمام CD14+مقابل CD14– ببمك إلى هوفيك TNFα + فيجفا المنشط تحت التدفق. التهجير (ج) معدل (٪) من CD14+مقابل CD14– ببمك من خلال تنشيط TNFα هوفيك تحت تدفق. التهجير (د) معدل (٪) من CD14+مقابل CD14– ببمك عن طريق هوفيك TNFα + فيجفا المنشط تحت التدفق. تكون البيانات يعني ± التنمية المستدامة N = 4 replicates البيولوجية. * ف < 0.05؛ اختبار مان-ويتني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تكميلية الفيلم 1: عرض على الطائرة قمي تجنيد الوحيدات عموم تحت التدفق. عرض موسع لتجنيد الوحيدات عموم تحت التدفق في الطائرة قمي. كانت ملطخة هوفيك كمفدا، ونواة وحيدات العيش-ملطخة هويشت 33342. شريط المقياس = 50 ميكرون اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية الفيلم 2: عرض على الطائرة القاعدية لتجنيد الوحيدات عموم تحت التدفق. عرض موسع لتجنيد الوحيدات عموم تحت التدفق في الطائرة القاعدية. كانت ملطخة هوفيك كمفدا، ونواة وحيدات العيش-ملطخة هويشت 33342. شريط المقياس = 50 ميكرون اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية الفيلم 3: الإسقاط القصوى من z-رزمة تجنيد الوحيدات عموم تحت التدفق. عرض موسع لتجنيد الوحيدات عموم تحت التدفق كما هو موضح في تكميلية أفلام 1 و 2. كانت ملطخة هوفيك كمفدا، ونواة وحيدات العيش-ملطخة هويشت 33342. شريط المقياس = 50 ميكرون اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية الفيلم 4: عرض على الطائرة قمي التجنيد للفئات السكانية الفرعية الوحيدات إلى تنفα-تنشيط هوفيك. توسيع العرض في الطائرة قمي تجنيد الوحيدات الفئات السكانية الفرعية تحت التدفق المتزامن هوفيك TNFα المنشط تحت التدفق. كانت ملطخة هوفيك كمفدا، ونواة وحيدات العيش-ملطخة هويشت 33342. وحددت بروانجيوجينيك البشرية الوحيدات الفئات السكانية الفرعية تعبير السطحية CD16. شريط المقياس = 30 ميكرومتر. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية الفيلم 5: عرض على الطائرة القاعدية لتوظيف الفئات السكانية الفرعية الوحيدات إلى تنفα-تنشيط هوفيك. عرض موسعة، في الطائرة القاعدية، تجنيد الوحيدات الفئات السكانية الفرعية تحت التدفق إلى هوفيك TNFα المنشط تحت التدفق المتزامن. كانت ملطخة هوفيك كمفدا، ونواة وحيدات العيش-ملطخة هويشت 33342. وحددت تعبير السطحية CD16 يتدنى الوحيدات (هبمو) بروانجيوجينيك البشرية. شريط المقياس = 30 ميكرومتر. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية الفيلم 6: عرض على الطائرة قمي التجنيد للفئات السكانية الفرعية الوحيدات إلى تنفα+ هوفيك المنشط فيجفا. عرض موسعة، في الطائرة قمي، تجنيد الوحيدات الفئات السكانية الفرعية تحت التدفق إلى هوفيك TNFα + فيجفا المنشط تحت التدفق المتزامن. كانت ملطخة هوفيك كمفدا، ونواة وحيدات العيش-ملطخة هويشت 33342. وحددت تعبير السطحية CD16 يتدنى الوحيدات بروانجيوجينيك البشرية. شريط المقياس = 30 ميكرون اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية الفيلم 7: عرض على الطائرة القاعدية لتوظيف الفئات السكانية الفرعية الوحيدات إلى تنفα+ هوفيك المنشط فيجفا. عرض موسعة، في الطائرة القاعدية، تجنيد الوحيدات الفئات السكانية الفرعية تحت التدفق إلى هوفيك TNFα + فيجفا المنشط تحت التدفق المتزامن. كانت ملطخة هوفيك كمفدا، ونواة وحيدات العيش-ملطخة هويشت 33342. وحددت تعبير السطحية CD16 يتدنى الوحيدات (هبمو) بروانجيوجينيك البشرية. شريط المقياس = 30 ميكرون اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، نحن تقرير أسلوب التفصيل دراسة كيف ترانسميجراتي الوحيدات الفئات السكانية الفرعية من خلال المونولاير بطانية ملتهبة. ويستخدم أسلوب بحث مجهرية [كنفوكل] بدلاً من الفحص المجهري المرحلة عالي التباين، الذي يستخدم أيضا لدراسة تجنيد الوحيدات تحت تدفق3،،من1119. ميزة واحدة كبرى لاستخدام الفحص المجهري [كنفوكل] لتصوير مرور الزمن هو القدرة على تميز لا لبس فيه بين التهجير والتصاق قوية من وحيدات. على الرغم من أن الأسلوب القائم على الفحص المجهري مرحلة التباين أيضا قوية، فإنه يتطلب خبرة تفاديا للخلط بين ترانسميجراتيد الخلايا والخلايا ملتصقة بشدة. وفي هذه الحالة، يحتاج المرء وضع معايير صارمة للتحليل بغية فرقا واضحا بين هاتين الدولتين من تتالي تجنيد الوحيدات. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم أيضا إجراء تحليل نقطة نهاية بالفحص المجهري [كنفوكل] بغية تأكيد الاتجاهات العالمية التي لاحظها مجهرية المرحلة عالي التباين. وهكذا، يوفر الاستخدام المباشر للفحص المجهري [كنفوكل] للتحقيق في تجنيد الوحيدات تحت تدفق نتائج واضحة في حالة التهجير الفعلي من أسر وحيدات.
واحدة من العقبات الرئيسية في تنفيذ التعيين الكريات البيض فحوصات تحت تدفق واستخدام مجهر تباين مرحلة هو الوقت الذي يقضيه لإجراء التحليل وتتبع الخلايا المفردة من التقاط للتهجير من خلال تقاطع خلية خلية. التشغيل الآلي لمثل هذا التحليل ممكن ولكن من الصعب القيام بسبب التباين المرحلة أوجه التشابه بين وحيدات الزحف وترانسميجراتيد. هنا نعرض باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل] أن التهجير الوحيدات ورافق وقف غشائي خلية تلطيخ في الطائرة القاعدية المقابلة على شكل وحيدات ترانسميجراتيد تحت هوفيك. وأكد هذا الموضع إسقاط متعامد. حدث انتقال التعريب الوحيدات حصرا بين تقاطعات خلية خلية يدل التهجير باراسيلولار. وهذا يتسق مع بياناتنا السابقة، التي أظهرت أن تحت التدفق في الأنابيب، وحيدات ترانسميجراتي حصرا من خلال مسار باراسيلولار مع هوفيك3،18. لإكمال الطريقة المقترحة هنا، من الممكن استخدام الأجسام المضادة غير مؤمن ضد البروتينات هالة مثل هاء-كادهيرين، والمربيات، أو PECAM1 من أجل صورة المواقع المحتملة للتهجير الوحيدات (باراسيلولار مقابل ترانسسيلولار). وقد أكدنا أن الأشكال السوداء المحيطة بنواة الوحيدات هي سمة قوية من الخلايا ترانسميجراتيد وحدثاً بسيطة التي قد تكون يمكن كشفها بواسطة البرنامج. على الرغم من أن خلية يدوي عد النظام يتجلى هنا، هو تشكيل الشكل الأسود حول نواة الكريات البيض معياراً يمكن استخدامها لتعريف التهجير الكريات البيض في التحليل الآلي، مما يوفر الكثير من الوقت. نحن نعمل حاليا على تطوير تطبيق الآلي لمثل هذا التحليل.
الأسفار والفحص المجهري [كنفوكل] استخدمت سابقا في دراسة توظيف الكريات البيض. بيد أنها استخدمت لا للتحقيق في التوظيف لمختلف الفئات السكانية الفرعية في نفس الوقت. ونقترح هنا طريقة استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] لدراسة توظيف الأنواع الفرعية الكريات البيض في وقت واحد في المكروية نفسها. نعرض هذا الفحص المجهري [كنفوكل] يمكن استخدامها للتحقيق في سلوك المهاجرة من الوحيدات مختلف الفئات السكانية الفرعية في نفس الوقت. على سبيل مثال، قد استخدمنا التعبير CD16 لتميز بين وحيدات بروانجيوجينيك وغير الأوعية من أجل دراسة قدرة التهجير الجمهرات الفرعية اثنين في مختلف السياقات التحريضية. تمشيا مع نشر مؤخرا لدينا، باستخدام أسلوب الفحص المجهري [كنفوكل]، أظهرنا أن معدل الهجرة الداخلية CD16+ وحيدات كان أقل عند حفز أحادي الطبقة غشائي خلية فقط بواسطة TNFα3. ومع ذلك، المزيج من TNFα وفيجفا أدى إلى زيادة في الهجرة الداخلية وحيدات بروانجيوجينيك. التهجير ومعدل مرتفع على نحو مماثل للأوعية غير CD16 وحيدات– تحت كل الظروف الملتهبة. ونحن سابقا أظهرت أن تلطيخ الوحيدات مع الأجسام المضادة-CD16 لم يقدم أي تأثير كبير على التهجير، تؤكد هذا بتحليل وحيدات غير مسمى بعد الفحص التهجير، باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]3. ومع ذلك، للأنواع الفرعية الكريات البيض جديدة أو الأجسام المضادة التي تستخدم لوضع علامة عليها، أثر وضع العلامات يحتاج إلى تقييم. باستخدام هذا الأسلوب، ما يصل إلى ثلاث فئات سكانية مختلفة من الكريات البيضاء يمكن في نفس الوقت دراسة. وهذا يمكن أن تكون الفئات السكانية الفرعية التي أنواع الخلايا المناعية متميزة وظيفيا أو ما شابه ذلك. على الرغم من أن التركيز هنا ينصب على التهجير الوحيدات، يمكن أيضا أن تحلل خطوات أخرى لتجنيدهم بهذا الأسلوب، بما في ذلك سلوك الخلية قبل الهجرة، مثل التقاط، واتجاه الهجرة. يمكن أيضا التحقيق أحداث ما بعد الهجرة مثل الاحتفاظ أبلومينال والهجرة العكسية للسكان الكريات البيض المختلفة، كامتداد لهذا الأسلوب. حد واحد هو الكشف عن الفقراء من تلطيخ في قناة استعملنا في الوقت الفاصل بين التصوير، فضلا عن انتقال بعض الإشارات الأسفار التي تقلل من القرار z-المكدس. هذا وقد تتصل أساسا بالوسيلة المستخدمة لتصوير [كنفوكل]. يمكن أن يساعد استخدام deconvolution صورة في نهاية المطاف تحسين جودة الصورة، وإتاحة المزيد من التحليل للخطوات المختلفة لتوظيف الكريات البيض.
دراسة الكريات البيض التوظيف تحت الظروف المثلى، من المهم للتحقق من حالة التنشيط أحادي الطبقة غشائي خلية. في الواقع، تنشيط خلايا بطانية ناقص يؤدي إلى انخفاض عالمية في التصاق الوحيدات والتهجير. يمكن التحقق من تنشيط الخلية البطانية عن طريق تحليل مستوى التعبير من جزيئات الالتصاق على سطح الخلية البطانية مثل ICAM1 و VCAM1. مستوى التصاق هذه الجزيئات يجب زيادة بالمقارنة مع خلايا البطانية أونستيمولاتيد. إذا كان أي تغيير يمكن اكتشافها في هذه الجزيئات التصاق بطانية، يمكن اعتبار هوفيك مثقف لا المنشط. تقييم مستوى التعبير جزيئات الالتصاق يمكن أن يشكل عنصر تحكم كمية جيدة بين تجارب مختلفة باستخدام نفس الدفعة من هوفيك. ومع ذلك، يمكن أيضا أن تختلف مستوى التعبير هذه الجزيئات الالتصاق بين الثقافة الأولية مختلفة من خلايا بطانية قصر النظر في عتبة العالمية من ICAM1 أو VCAM1. التغيير في الشكل ماكروفاسكولار الخلايا غشائي مثل هوفيك أيضا مؤشر جيد على التنشيط. يسمح هذا التغيير الأخير في النمط الظاهري تقييم السريع والنوعي للتنشيط هوفيك. ومع ذلك، قد يكون تحليل جزيئات الالتصاق خياراً أفضل لخلايا ميكروفاسكولار التي لا تظهر تغير شكل رئيسي عند التنشيط مع السيتوكينات الالتهابية.
الدراسات الميكانيكية، يمكن تنفيذ الضوابط السلبية ذات الصلة من التهجير الوحيدات باستخدام الأجسام المضادة ضد جزيئات الالتصاق غشائي مثل ICAM1، VCAM1، أو على سطح الكريات البيض مثل المرتبطة بوظيفة الكريات البيض مستضد (وكيل)-1. استخدام عنصر تحكم السلبية ذات الصلة أمر ضروري لمثل هذه الدراسة الميكانيكية في وحيدات كما يعربون عن مستقبلات Fc على سطوح الخلايا بها. نقاء وحيدات بعد عزلة مهم أيضا، لتفادي التلوث بغيرهم من السكان الكريات البيض والتقليل من معدل الهجرة الوحيدات. المعلمة حاسم آخر هو درجة الحرارة، التي تحتاج إلى تعيين في 37 درجة مئوية لكل فحوصات من أجل ضمان جميع الملاحظات التجريبية ذات الصلة وترجمة عليه البشرية في فيفو خلية الاتجار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
المؤلفين قد لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
ونحن نشكر الدكتور بول برادفيلد لقراءة المخطوط والتغذية المرتدة. أ. س. تلقت دعما ماليا من "السير جول شوكة الخيرية الأجنبية الثقة reg."،
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture Flasks 75 cm2 | TPP | 90076 | Routine culture of isolated HUVEC |
| µ-Slide VI 0.4 | IBIDI | 80606 | |
| Centrifuge Tubes 15 mL | TPP | 191015 | |
| Centrifuge Tubes 50 mL | TPP | 191050 | |
| Collagen G | Biochrom | L 7213 | For coating of cell culture flasks |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | 1393 | For coating of cell culture flasks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 3-Way Stopcocks | BIO-RAD | 7328103 | |
| penicillin 10,000 μ/mL streptomycine 10,000 μg/mL fungizone 25 μ/mL | AMIMED | 4-02F00-H | |
| Collagenase type 1 | Worthington | LS004216 | |
| Medium 199 1x avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes | GIBCO | 22340020 | |
| Bovine Albumin Fraction V | ThermoFisher | 15260037 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement, 150 mg | Millipore | 02-102 | |
| Heparin Sodium | Sigma-Aldrich | H3149RT | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H6909 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A 4544 | |
| EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O | APPLICHEM | A2937.0500 | |
| CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC | Miltenyi Biotech | 130-100-713 | AB_2655150 |
| CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-807 | AB_2657280 |
| Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC | Miltenyi Biotech | 130-107-016 | AB_2653263 |
| BD Accuri C6 Plus | BD Bioscience | ||
| µ-Slide I Luer | IBIDI | 80176 | |
| CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | ThermoFisher | C2925 | |
| Recombinant human TNFα | Peprotech | 300-01A | |
| Recombinant human VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
| NE-1000 Programmable Syringe Pump | KF Technology | NE-1000 | |
| Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-519 | AB_2655051 |
| Pan Monocyte Isolation Kit, human | Miltenyi Biotech | 130-096-537 | |
| Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE | Miltenyi Biotech | 130-106-762 | AB_2655403 |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | ThermoFisher | H1399 | |
| Silicone tubing | IBIDI | 10841 | |
| Elbow Luer Connector | IBIDI | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | IBIDI | 10823 | |
| Luer Lock Connector Female | IBIDI | 10825 | |
| In-line Luer Injection Port | IBIDI | 10820 | |
| Ar1 confocal microscope | Nikon | ||
| 40x objective | Nikon | 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm | |
| ImageJ Software | NIH |
References
- Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells. Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).
- De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).
- Sidibe, A., et al. Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours. Nature Communications. 9 (1), 355 (2018).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).
- Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).
- Chamorro, S., et al. In vitro differentiation of porcine blood CD163− and CD163+ monocytes into functional dendritic cells. Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).
- Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood. Blood. 74 (7), (1989).
- Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
- Bradfield, P. F., et al. JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation. Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).
- Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation. Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).
- Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha. Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).
- ibidi GmbH. Shear Stress and Shear Rates for ibidi µ-Slides - Based on Numerical Calculations. , (2014).
- Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Yang, C. -R., Hsieh, S. -L., Ho, F. -M., Lin, W. -W. Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression. Journal of Immunology. 174 (3), Baltimore, Md. 1647-1656 (2005).
- Wong, D., Dorovini-Zis, K. Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture. Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).
- Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
- Bradfield, P. F., et al. Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques. PLoS One. 11 (7), e0159679 (2016).
