Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מחקר בו זמנית של הגיוס של מונוציט Subpopulations תחת זרימה במבחנה

Published: November 26, 2018 doi: 10.3791/58509
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 3
1Hematology service, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva, 2Department of Pathology and Immunology, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva, 3Department of Cell Physiology and Metabolism, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול משולב המודד מונוציט subpopulation סחר תחת זרימה במבחנה באמצעות סמני פני שטח מסוים, מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור את השלבים רציפים גיוס גם לגבי פרופיל אחרים יחוברו ליקוציט באמצעות סמנים אחרים משטח מסוים.

Abstract

הגיוס של monocytes מהדם לרקמות היקפיים יישוב הינה קריטית תהליך דלקתי במהלך פגיעה ברקמות, התפתחות גידולים ומחלות אוטואימוניות. זה נהיה בתהליך של לכידת זרימה חופשית על גבי המשטח luminal של תאי אנדותל מופעל, ואחריו להגירתם אדהזיה ו- transendothelial (גלגול) לתוך הרקמה הבסיסית המושפעת. עם זאת, המנגנון תומכים בגיוס מועדף, תלויי-ההקשר מונוציט subpopulations עדיין לא לגמרי מובנים. לכן, פיתחנו שיטה המאפשרת הגיוס של subpopulations מונוציט שונים בו זמנית מדמיין, שנמדד תחת זרימה. שיטה זו, המבוססת על הדמיה קונאפוקלית זמן לשגות, מאפשר ההבחנה ברורה וחד משמעית בין חסיד, שמדמו ומונוציטים. כאן, אנו נתאר כיצד ניתן להשתמש בשיטה זו ללמוד בו זמנית את המפל גיוס של pro-אנגיוגנזה, הלא-אנגיוגנזה ומונוציטים במבחנה. יתר על כן, שיטה זו ניתן להרחיב ללמוד את שלבי הגיוס של עד שלוש אוכלוסיות מונוציט שונים.

Introduction

ומונוציטים מהווים מרכיב phagocytic של מולדת חסינות זה חיוני בלחימה פתוגנים, מנקה את רקמות שנפגעו אנגיוגנזה, הפתופיזיולוגיה של מחלות רבות, כולל סרטן1,2,3 . ומונוציטים הם תאים הנגזרות מח העצם מורכב subpopulations הטרוגנית במחזור הדם, אבל יכול להיות גויסו לאתר של דלקת ברקמות היקפיים באמצעות מנגנונים מולקולריים ספציפיים. למפל גיוס של monocytes, באשר לויקוציטים מרמז באופן כללי, שלבים שונים כולל לכידת, גלגול, זחילה, מעצר, transendothelial ההעברה (גלגול) העברה דרך הקיר כלי (קרום המרתף, ציור קיר תאים)4. שלבים אלה כוללות בעיקר דלקת-induced מולקולות על פני אנדותל luminal כגון selectins, ליגנדים גליקופרוטאין, נוגדנים, מולקולות אדהזיה המערכת, מהחיבור שלהם רצפטורים על לויקוציטים כגון בחירת שמלות ליגנדים אינטגרינים. סחר מסלולים דרך גם את תאי אנדותל צמתים (paracellular) או דרך הגוף תא אנדותל (transcellular) ניתן על ידי לויקוציטים לחצות את המכשול אנדותל5. בעוד ומונוציטים היסטורית תועדו כדי transmigrate דרך המסלול transcellular, פערים פוטנציאליים במסלול הנדידה שלהם הוצעו כפי ומונוציטים כבר לא נחשבים אוכלוסיה הומוגנית התא. עכשיו כעת ברור כי גיוון מונוציט יכולה להיות מוגדרת על ידי כל אחד של ההבדלים שלהם מכנה משותף, ביחס extravasation הייחודי שלהם מפלי3,6. לכן, על מנת חד משמעית מתלבטים מונוציט subpopulations, זה חיוני כדי להמחיש ולעבד פנוטיפ ההתנהגות של כל אלה subpopulations שונים במהלך הגיוס.

ומונוציטים מן האדם, חזיר, החולדה, העכבר היו המתפרשות לתוך subpopulations פנוטיפי עם פונקציות ייחסה של התנהגויות ספציפיות נודדות-7,-8,-9מסוימים. לדוגמה, בבני אדם, ומונוציטים ניתן לחלק שלוש קבוצות משנה המבוסס על שלהם ביטוי פני השטח של CD14, coreceptor עבור ליפופוליסכריד חיידקי, CD16, הקולטן Fc-גמא השלישי. מונוציט האנושי subpopulations כוללים CD14 קלאסית+CD16-, ביניים CD14+CD16+ וקלאסי CD14עמוםCD16+ תאים6,9. CD14 הקלאסית+CD16– ומונוציטים הוכחו להיות בעיקר דלקתיות ואילו הבריכה של CD16+ ומונוציטים נמצאו באופן קולקטיבי להציג TIE2 proangiogenic וביטוי פונקציה10. באופן עקבי, תאי אנדותל גירוי עם ציטוקינים דלקתיים כגון גידול אנושי נמק פקטור (TNF) α או אינטרלוקין (IL-1) בטא (דלקת קונבנציונלי) מספיקה לעורר גיוס מלא של קלאסית CD14+CD16 – ומונוציטים. לעומת זאת, נדרשות פעולות בו-זמניות של כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF) A ו TNFα (דלקת מונחה גורמי אנגיוגנזה) לעורר גלגול של CD16+ proangiogenic בריכה של monocytes3. מבחינה היסטורית, שימשו את המערכת Transwell המסורתית תחת תנאים סטטיים תא זרימה לוחית מקבילים, התאים זרימה ממוצע שקופית לנתח באופן כמותי את גיוס ליקוציט אחד האוכלוסייה בגיל זמן במבחנה11 12, ,13. בעוד יש פרוטוקולים אלה מאומתים, שיטה עמידים יותר כי מותר ניתוח בו זמנית של מספר מונוציט subpopulations ייחשב נבונה יותר. מתודולוגיות כזה חייב חשבון עבור אינטראקציות מרובות, התדרים שונות של כל האוכלוסייה בהתאמה ולספק גם הבנה מכניסטית של דמיון ושל specificities למפל גיוס המגדירים כל מונוציט משנה.

כאן, אנו מציגים שיטה המבוססת על ההדמיה בצילום מואץ של הגיוס מונוציט תחת זרימה אשר מאפשר את מפלי נודדות מונוציט שונים subpopulations שילמדו בו זמנית על-ידי שימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו משלבת תכונות מסוימות קריטיות לחקות דלקת תא אנדותל, כמו גם את ספיקת הדם של מחזורי ומונוציטים ב venules נימי פוסט, המיקום המרכזי של גיוס ליקוציט ויוו. השיטה המוצעת משתמשת יפתור אנדותל תאים (HUVEC), אשר נוצרות באמצעות פרוטוקול ומבוססת של בידוד מן האדם חוטי חבל הטבור. משאב קליני זה יש את היתרון של להיות זמין בקלות היא מוצר לוואי ביולוגיות, בעוד גם מתן תשואה סבירה של תאי אנדותל שניתן שבודד וריד הטבור. השתמשנו גם צבעי פלורסנט, immunofluorescence להבחין בין מרכיבי התא השונים, מיקרוסקופיה קונפוקלית חד משמעית להגדיר מונוציט מיצוב (luminal לעומת abluminal) לאורך זמן. פרוטוקול המובאת כאן פותחה כדי למדוד בו זמנית את רמות גלגול מונוציט subpopulations. יתר על כן, יש לציין כי מתודולוגיה זו ניתן להרחיב את לימוד אחרים לויקוציטים subpopulations, תהליכי גיוס על ידי שימוש סמנים ביולוגיים שונים וסימון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

חומרים אנושיים שימשו עם הסכמה מדעת של התורמים המתנדבים ועל פי ועדות האתיקה השוויצרי על מחקר קליני.

1. בידוד וקופא של חבל הטבור האנושי הווריד תאי אנדותל (HUVEC)

  1. הוסף 5 מ של ציפוי פתרון בקבוקון T75 (0.1 מ"ג/מ"ל קולגן G ו- 0.2% ג'לטין ב- PBS מלוחים פוספט באגירה מלאה ב- pH 7.4) במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני ביצוע בידוד HUVEC.
  2. לנקות את החבל עם PBS, לנגב את זה עם קומפרסים סטרילי, מניחים אותה ס מ 20 עקר פטרי. חותכים את הקצוות של החוט עם מספריים סטרילי.
  3. לזהות את הווריד גדולה אחת, שני העורקים קטן. הכנס בעדינות את הצינורית עם צימוד-כיוונית מצורף אל הגפיים וריד בקצוות הכבל.
  4. להדק את הכבל וחיבור בצינורית בחוזקה עם אורך של חוט.
  5. Perfuse כבל פעמיים עם 20 מ של RPMI בינוני המכיל 100 פניצילין U/mL, סטרפטומיצין U/mL 100, 250 ננוגרם למ"ל המפוטריצין לרחוץ את ורידים חבל הטבור. תהליך זה הופך את המראה של החוט לבן וברורה. רוקן את הווריד לפני חיבור collagenase על ידי איסוף של RPMI עם מזרק בקצה אחד.
  6. Perfuse את הווריד 12 מ של 1 מ"ג/מ"ל collagenase סוג אני (0.22 מיקרומטר-מסוננים).
  7. סגור צימוד-החוט מסתיים, דגירה החוט ב 37 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות.
  8. לעסות בעדינות את הכבל כדי לנתק תאי אנדותל של לומן לווריד.
  9. לקחת 30 מ של RPMI המכיל 10% עגל עוברית סרום עם מזרק 50 מ ל וחבר אותו בקצה אחד של הטבור.
  10. להתחבר עם מזרק ריק 50 מל הקצה השני של הטבור
  11. פתח את צימוד, perfuse את הווריד מקצה אחד תוך איסוף קישור הדדי בצד השני.
    הערה: המתלה שנאספו מכיל תאי אנדותל.
  12. Centrifuge ההשעייה תא ב x 200 גרם במשך 5 דקות.
  13. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא עם 10 מ"ל של מדיום M199 מלאה (M199 תוספי מזון המכיל 20% FCS, µg/mL 15 תא אנדותל הצמיחה, 100 µg/mL הפארין נתרן, 0.5 מיקרומטר הידרוקורטיזון, µg 10/מ"ל חומצה אסקורבית L, פניצילין U/mL 100, 100 U/mL סטרפטומיצין, שהוא גוסס ng/mL 250 ב').
  14. הסר את הפתרון ציפוי הבקבוקון T75 ולשטוף פעם עם PBS.
  15. הזרע התאים שנאספו משלב 1.13 לתוך הבקבוק T75 ולמקם אותו בחממה ב 37 ° C עם 5% CO2.
  16. למחרת, לשטוף את הבקבוק 3 פעמים עם המדיום M199 מלאה כדי להסיר את שאריות תאי דם אדומים, ומשנים את המדיום כל יומיים עד למפגש.
  17. ב- 80-90% הנהרות, לשטוף את טפט HUVEC פעם אחת עם 5 מ של PBS ולנתק את התאים עם 5 מ של טריפסין 0.05% ב- 1 מ מ EDTA ב 37 ° C עבור 5 דק להוסיף 4 מ של M199 ו- 1 מ"ל של FCS להפסיק את הפעולה טריפסין. לרוקן את הבקבוק כדי לנתק כל HUVEC.
  18. אוספים של aliquot של µL 50 לשמש עבור צביעת VE-קדהרין, PECAM-1, gp38, ולנתח על ידי cytometry זרימה כדי לבדוק את טוהר HUVEC.
  19. לאסוף את שארית HUVEC שלב 1.18 צינור 15 מ"ל, צנטריפוגה-200 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  20. למחוק את תגובת שיקוע מהשלב 1.19 resuspend בגדר תא קפואים פתרון (FCS המכיל 10% דימתיל סולפוקסיד)-צפיפות של 5 x 105 תאים/מ ל cryotubes, להקפיא ב-80 מעלות צלזיוס או חנקן נוזלי עד השימוש.
  21. כדי לבדוק את טוהר HUVEC:
    1. להוסיף aliquot של 50 µL של HUVEC שנאספו בשלב 1.18 µL 1 של נוגדנים נגד VE-קדהרין-FITC, 1 µL של נוגדנים נגד PECAM1-PE ו- µL 1 של נוגדנים נגד Podoplanin-APC.
    2. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
    3. להוסיף 100 µL של PBS, צנטריפוגה ב x 400 גרם ל 30 s.
    4. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend ב µL 100 ל- PBS. ניתן כעת לרכוש נתונים באמצעות טכניקות cytometry זרימה.
      הערה: HUVEC הן חיוביות VE-קדהרין ו- PECAM-1, וגם שליליות עבור Podoplanin.

2. HUVEC מפשירה

הערה: להשתמש HUVEC נמוכה מעבר לניסויים (מקסימום 5 קטעים).

  1. מעיל בקבוקון T75 עם 1 מ"ל של הפתרון ציפוי ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  2. במהירות defreeze HUVEC ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, resuspend התאים 10 מ"ל של M199 מלאה.
  3. Centrifuge התאים ב x 200 גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.
  4. Resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של M199 מלאה.
  5. העברת התליה תא בתוך הבקבוק מצופים מראש. מקם את הבקבוקון בחממה ב 37 ° C עם 5% CO2. לשנות את המדיום תרבות תא כל יומיים.

3. HUVEC תרבות בתא ממוצע שקופית 0.4

  1. חמישה ימים לפני תחילת הניסוי זרימה, מעיל מראש לאהלי ממוצע 0.4-שקופית עם 30 µL של PBS המכיל קולגן 0.1 מ"ג/מ"ל G, 0.2% ג'לטין ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  2. לשטוף את החדרים עם µL 100 ל- PBS.
  3. ניתוק תאים מן HUVEC confluent 80-90% של בקבוקון T75.
  4. לשטוף HUVEC עם 5 מ של PBS ולנתק אותם עם 5 מ של 0.05% טריפסין ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
  5. ריקון לאסוף התליה תא ב M199 מלאה, לספור את התאים בשיטה הנוחה ביותר. צנטריפוגה ב x 200 גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. Resuspend בגדר תא-106 תאים למ"ל ולהפיץ 30 µL (תאים 30,000) לכל תא.
  7. דגירה התאים בתוך אינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2 לשעה.
  8. להוסיף 150 µL של M199 שלם אחד, התרבות התאים במשך 5 ימים בחממה ב CO 37 ° C ו- 5%2. לשנות את המדיום כל יומיים.

4. HUVEC מכתים עבור מונוציט Assay גיוס תחת זרימה

  1. להכין המדיום תיוג M199 ו 1 מיקרומטר של CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate), לחמם את זה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות לפני תא תיוג.
  2. HUVEC לשטוף פעמיים עם M199 בינוני חימם ב 37 º C.
  3. החלף את המדיום µL 30 ומחוממת בינוני תיוג המכיל 1 מיקרומטר של CMFDA ומניחים לתוך החממה-CO של 37 ° C ו- 5%-2 למשך 10 דקות.
  4. לשטוף פעם עם M199 מלאה, דגירה התאים עם M199 מלאה בחממה ב CO של 37 ° C ו- 5%-2 למשך 30 דקות.
    הערה: זה חשוב להסיר כל עקבות של סרום לפני חיבור של הפתרון תיוג, אחרת זה עשוי לשנות HUVEC מכתים.
  5. להחליף את המדיום עם M199 מלאה המכילה גם TNFα אנושי (500 U/mL) או שילוב של TNFα אנושי (500 U/mL) עם VEGFA האנושית (1 µg/mL) עבור 6-אייץ ' באינקובטור 37 ° C ו- 5% CO2.

5. בידוד של פן אנושי ומונוציטים ו צביעה של Subpopulations

  1. השתמש מעיל באפי של דם אנושי מרוכז או 20 מ"ל של דם אנושי טרי מבודד, שנאספו ביום של הניסוי EDTA האגירה צינורות.
  2. לדלל את הדם ב- PBS-1 מ מ EDTA (1:1), פיפטה בעדינות 20 מיליליטר דם מדולל mL 20 של מדיה הדרגתיות צפיפות. צנטריפוגה ב x 400 g למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם האצה איטית וללא בלמים.
  3. לאסוף תא תאי דם היקפיים (PBMC)-שכבה טסית דם (בין מדיה הדרגתיות צפיפות פלזמה שכבות) לתוך צינור 50 מ ל חדש המכיל 40 מ"ל של PBS - 1 מ מ EDTA. למעלה עד 50 מ עם PBS - 1 מ מ EDTA.
  4. צנטריפוגה ב x 200 גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.
  5. Resuspend בגדר תא עם 10 מ"ל של מאגר מכתימים (PBS - 1 מ מ EDTA המכילה 0.5% אלבומין שור BSA).
  6. צנטריפוגה ב x 200 גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.
  7. חזור על שלבים 5.5 ו- 5.6.
  8. Resuspend בגדר תא עם 10 מ"ל של צביעת מאגר. קח של aliquot של µL 10 עבור ספירת תאים.
  9. בדוק PBMC אוכלוסיות, לספור תאים במהירות עם cytometer זרימה.
    הערה: האוכלוסיות לימפוציט, מונוציט האופיינית יכול להיות שנצפו (איור 1 א'). מ- 50 מ של דם טרי מצפה על 50-100 x 106 PBMC.
  10. עבור הגיוס של CD14 + נגד CD14-PBMC תחת זרימה:
    1. לשטוף בגדר שלוש פעמים עם מאגר זרימה (M199 המכילה 0.5% BSA), resuspend תאי תאי זרימה מאגר-תאי6 6 x 10 מ"ל.
    2. להפוך aliquots של µL 200 עבור כל וזמינותו. דגירה ב 37 ° C עד 20 דקות לפני וזמינותו.
    3. להוסיף 5 µL של אנטי-CD14-PE Hoechst 33342-ריכוז סופי של 2 מיקרומטר כל aliquot. לערבב, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    4. Centrifuge את aliquot ב x 400 גרם ל 30 s.
    5. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר עם 200 µL זרימה המאגר.
  11. עבור הגיוס של מונוציט subpopulations תחת זרימה:
    1. לבודד ומונוציטים עם ערכת בידוד מונוציט פאן בהתאם להוראות היצרן.
      הערה: פרוטוקול בידוד הבאים הוא עבור 50 x 106 תאים. זה וניתן לשנותם למעלה או למטה כל עוד הוא נמצא המלצות היצרן.
    2. Centrifuge את המתלים PBMC ב x 200 גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    3. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר עם µL 400 של צביעת מאגר.
    4. הוסף µL 50 של ריאגנט חסימת קולטן Fc ו- 50 µL של פאן מונוציט נוגדן קוקטייל.
    5. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
    6. הוסף µL 400 של צביעת מאגר של 100 µL של נוגדן אנטי ביוטין מצומדת beads מגנטי. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
    7. להוסיף 2 מ של מאגר מוכתמים, להשתמש בעמודה MACS LS בשילוב עם מגנט.
    8. במקום העמודה LS על המגנט ולהוסיף 1 מ"ל של צביעת מאגר. למחוק את הזרימה דרך.
    9. להעביר את המתלים PBMC בעמודה ולאסוף את זרימת ברור למרות המכיל פאן ומונוציטים בשפופרת 15 mL החדש.
    10. להוסיף למאגר מכתימים להתעלות עד 5 מ.
    11. קח aliquot, לבדוק את טיב הבידוד מונוציט עם cytometer זרימה.
    12. לקבוע את הרוזן מונוציט פאן.
      הערה: רק מונוציט אוכלוסייה יכול להיות שנצפו (איור 1B).
    13. Centrifuge את שארית ומונוציטים מהשלב 5.11.11 ב x 200 גרם במשך 5 דקות.
    14. למחוק את תגובת שיקוע.
    15. Resuspend בגדר תא ב 5 מ של מאגר זרימה (M199 המכילה 0.5% BSA).
    16. חזור על 5.11.13 כדי 5.11.14 פעמיים כדי לחסל את עקבות של EDTA.
  12. להפוך את מונוציט ההשעיה בזרם המאגר (M199 עם 0.5% BSA) ב 6 x 106 תאים/מ ל....
  13. להפוך aliquots של µL 200 של monocytes עבור כל שיטת גיוס.
  14. לשמור את aliquot ב 37 מעלות צלזיוס בחממה עד 20 דקות לפני ההזרקה.
  15. להוסיף 5 µL של נוגדן anti-CD16-PE ו Hoechst 33342 (סופי 2 מיקרומטר) כל aliquot.
  16. לערבב, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  17. Centrifuge את aliquot ב x 400 גרם ל 30 s.
  18. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר עם 250 µL זרימה המאגר.
  19. להוסיף 30 µL של ההשעיה מונוציט בתא אחד של השקופית לשרת עבור הגדרת הפרמטרים רכישה מיקרוסקופ קונפוקלי.
  20. למנוע את aliquots של השעיה מונוציט שלב 5.18 ב 37 º C.
    הערה: ההשעייה הוא מוכן להיות מוזרק ב מערכת הזרימה.

6. הכנה של מערכת Fluidic

  1. להבטיח כי החממה תא עבור ההדמיה להגדיר ב- 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: דיאגרמה של מערכת הזרימה מוצג באיור2.
  2. להרכיב את החלק אבובים i: להוסיף זכר מחבר סכינים סטריליים בקצה אחד של פיסת סיליקון אבובים (8 ס מ ארוך ו- 3 מ מ עבה) וחבר את הקצה השני ערכה זריקת סכינים סטריליים בשורה. חבר את מחבר סכינים סטריליים האחרון פיסת סיליקון אבובים (40 ס מ, בעובי 3 מ מ) בקצה אחד.
    הערה: באופן אופציונלי, ברז 3-way מחובר מזרק 5 מ ל יכול להיות מוכנס בין ערכת זריקת סכינים סטריליים בשורה של סיליקון אבובים להסרת בועות אוויר בסופו של דבר.
  3. להרכיב את החלק אבובים II: להתחבר מזרק 20 מ"ל קצה אחד של אורך של סיליקון אבובים (1 מ', בעובי 3 מ מ). הכנס את מחבר סכינים סטריליים זכר הקצה השני של הצנרת.
  4. לחבר חלק ואני חלק II אבובים על-ידי הוספת הזכרים מחבר סכינים סטריליים כדי במפצל נעל זכוכית הנשי (איור 2 א).
  5. לשים סוף לאורך צינור סיליקון חינם במאגר המכיל מאגר זרימה (M199 + 0.5% BSA) להתחמם ב 37 º C.
  6. משוך על הבוכנה של המזרק 20 מ למלא את הצנרור עם מאגר זרימה.
  7. מניחים את המזרק על המשאבה ואבטח אותו.
  8. הגדר את המשאבה ב לסגת מצב (בניגוד כדי להשרות) וציין את קצב הזרימה.
  9. לקבוע את קצב הזרימה על פי השקופית IBIDI בשימוש על-ידי שימוש בנוסחה הבאה:
    Equation
    הערה: הגורם שקופיות הוא תלוי השקופית IBIDI המשמש את הניסוי. עבור השקופית ממוצע אני0.4 נעל זכוכית המשמש בדוגמה זו, הגורם שקופיות הוא 131.6. עבור שקופיות ספציפיות גורמים, ראה את אתר האינטרנט של החברה14. צמיגות מאגר הזרימה היא 0.0072 dyn.s/cm2. מאמץ גזירה-venules פוסט-נימי הוא על רמות דינ/cm 0.52.
  10. לחבר את השקופית (איור 2B):
    1. מלחציים לאורך צינור סיליקון מסביב מחבר נקבה נעל זכוכית, נתק הזכרים מחבר שני סכינים סטריליים של מחבר.
    2. לחבר אותם המאגרים של השקופית המכילה מגורה HUVEC ומילוי בינונית. להימנע בועות אוויר במהלך שלב זה.
    3. . תוריד את התפסים ולהבטיח כי הקשר לא דולף.
  11. מקם את השקופית מתחת למיקרוסקופ עבור הדמיה בצילום מואץ ולהתחיל את המשאבה.

7. זמן לשגות הדמיה של גיוס מונוציט תחת זרימה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. השתמש מטרה 40 x (ראה טבלה של חומרים) עבור הדמיה.
  2. להפעיל את 405 ננומטר (גרעינים מונוציט כחול), 488 ננומטר (תאי אנדותל ירוק), לייזרים nm (אדום CD16 + ערכה) 561.
  3. השתמש את התא המכיל את ומונוציטים כדי להגדיר את הפרמטרים רכישה.
    הערה: כדי לזהות ומונוציטים שאינם שמדמו והן שמדמו, חריר ואת עוצמת ננומטר לייזר 405 מוגדרים גבוהה. לפיכך, שאינם שמדמו ומונוציטים גלויים מעט בתכנית הבזליים. עם זאת רק שמדמו ומונוציטים להציג שטח מוכתם מסביב לגרעין המתאים שטח חדש הכבוש מתחת תאי אנדותל.
  4. מקם את התא כדי לרכוש תחת המיקרוסקופ.
  5. בחר 3 השדות של תצוגות ברדיוס 1 ס מ עבור הדמיה קונאפוקלית במקומות מרובים.
  6. להגדיר את הבסיס ואת הצדדים הפסגה של תאי אנדותל
  7. הגדר z-מחסנית הטווח 10 – 12 מיקרומטר (0.5 מיקרומטר שלב). הפעל רכישת זמן לשגות כל 1 דקות.
  8. לאחר 3 דקות הדמיה, להזריק µL 200 מונוציט השעיה (6 x 106 תאים/mL) דרך היציאה זריקת סכינים סטריליים בשורה.
    הערה: במהירות ומונוציטים מופיעים בתוך המטוס מוקד הפסגה, לדבוק ולהתחיל גלגול (תחבורה מן הפסגה לתוכנית הבסיס).
  9. תמונת לפחות 30 דקות. לאחר סיום, תפסיק הדמיה, לעצור את הזרימה. תהדק את הצנרת כדי לנתק אותם מתוך השקופית.
  10. לתקן את השקופית עם 4% paraformaldehyde ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  11. לשטוף את השקופית הכוללת PBS ולאחסן את השקופית ב 4 ° C לצורך ניתוח נוסף במידת הצורך.

8. לנתח את הנתונים עם ImageJ

  1. לספור את מספר הכולל ומונוציטים חסיד בכל שדה. לקבוע את ספירת התאים לכל מ מ2.
  2. נחשב שמדמו ומונוציטים נוכח התוכנית הבסיס מתחת תאי אנדותל ובלתי מזוהה על ידי הנוכחות של חור שחור (בערוץ ירוק) מסביב לגרעין.
  3. לחלק את הספירה של לויקוציטים שמדמו על ידי המספר הכולל של לויקוציטים חסיד. שיעור גלגול מוצג כאחוז ומונוציטים חסיד.
  4. להמחשה, הפסגה, הצדדים הבזליים ניתן להציג בו-זמנית כדי להמחיש את האירועים המתרחשים בכל אלה תאי אנדותל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

קביעת מצב הפעלה HUVEC שנגזרות TNFα

הביו-פעילות ציטוקינים דלקתיים TNFα יכול להשתנות לפי את אצוות גודש של מחזור מפשיר לקפוא. חשוב לבדוק את מצב ההפעלה של HUVEC עם טיפול TNFα. זה יכול להתבצע על ידי צביעת במקביל דוגמאות HUVEC confluent עבור אינדוקציה דלקתיות של selectins, ICAM-1 VCAM-115,16,17. דרך קלים ופשוטים כדי לבדוק את מצב ההפעלה של HUVEC לאחר הטיפול TNFα היא שינוי מורפולוגי המוצג על-ידי תאי אנדותל בלחץ דלקתיות. כפי שמוצג באיור3, HUVEC להאריך לאחר 6-h בנוכחות TNFα לעומת תאים unstimulated. התארכות דומה נצפית כאשר HUVECs הם גירוי על ידי שילוב של TNFα VEGFA. מקליט את מצב ההפעלה של HUVEC חשוב כמו התוצאות הסופיות של גלגול של monocytes תלויות האיכות של הפעלת תאי אנדותל.

מונוציט גלגול עושה הפסקת האופיינית בתאי האנדותל

ללמוד מונוציט גלגול תחת זרימה, השתמשנו מיקרוסקופיה קונפוקלית עם תאי אנדותל מוכתם בירוק עם CMFDA, את הגרעינים של מבודדים ומונוציטים צבעונית בצבע כחול עם תא-חדיר לצבוע Hoechst 33342 (איור 4). ההדמיה קונאפוקלית זמן לשגות אפשרה החזיית ומונוציטים על המטוס הפסגה, איפה פנוטיפ שלהם יכול להיות מוערך (איור 4A-C, 1 סרט משלימה). העברת תאים שעברו גלגול להתגורר בשטח המערכת המתאים צמתי תא-תא לפני שהם נעלמו מהמטוס הפסגה הופיע ב מישור הבסיס. התאים transmigrated הציג חור שחור מסביב לגרעין המתאימים לצורות מונוציט. צורה זו כל הזמן השתנתה במהלך ההעברה מונוציט מתחת תאי אנדותל (איור 4A-C, משלימה סרטים 2-3). חור שחור דינמי שנעשו על ידי הגוף מונוציט מתחת תאי אנדותל, והצגת מונוציט, מותרת לצורך זיהוי ברורה וחד משמעית של תאים שמדמו. כימות של הגיוס מונוציט לאורך זמן הראה אדהזיה מונוציט ואחריה גלגול (איור 4D-E). למרות לויקוציטים יכול בורחת דרך מסלולים transcellular והן paracellular, אנחנו יכולים רק להבחין גלגול paracellular תחת זרימה בשיטה זו. . זה עקבי עם שלנו הקודם תצפיות3,11,18,19.

אנגיוגנזה גורם מונע דלקת מקדם גלגול של CD16 + ומונוציטים

באמצעות שיטה זו, ניתחנו את גלגול של proangiogenic האנושי לעומת הלא-אנגיוגנזה ומונוציטים דרך אנדותל חד שכבתי מגורה על ידי ציטוקינים דלקתיים TNFα לבד או בשילוב עם הגורם האנגיוגנזה VEGFA. ומונוציטים proangiogenic האנושי יכול להיות מזוהה על-ידי הביטוי של CD16 או TIE2 על פני השטח שלהם. . הנה, נוגדן anti-CD16-PE שימש להפלות בין פרו - ו הלא-אנגיוגנזה ומונוציטים. כפי שמוצג באיור 5A-B (סרטים משלימה 4-5), שיעור גלגול של CD16+ ומונוציטים היה נמוך כאשר תאי אנדותל היו מגורה עם TNFα בלבד. עם זאת, קצב זה גדל כאשר תאי אנדותל היו מגורה בו-זמנית עם TNFα, VEGFA (איור 5C-E, משלימה סרטים 6-7). שיעור גלגול של הלא-אנגיוגנזה ומונוציטים היה גבוה באופן דומה תחת שני תנאים דלקתיים. עבור שני subpopulations תא, גלגול אירעה באופן בלעדי דרך המסלול paracellular. שיטה זו מאפשרת לכן כשרונותיהם גלגול של אוכלוסיות שונות monocytic להיחקר בו זמנית.

טוהר ומונוציטים משפיע על יעילות גלגול

תאי תאי הדם ההיקפיים מורכבים של תאי T, תאים B, תאי NK, ומונוציטים. שיטת בידוד מונוציט המשמשת כאן דורש דלדול של האוכלוסיות ליקוציט אחרים מן PBMC. כדי להבין איך חוסר טוהר מונוציט משפיעה על התוצאות, אנו נעשה שימוש PBMCs, מוכתם פאן-ומונוציטים עם נוגדן anti-CD14-PE לפני ביצוע וזמינותו גיוס תחת זרימה. כפי שמוצג באיור 6, גירוי HUVEC עם TNFα או TNFα + VEGFA המושרה גלגול מאוכלוסיית מונוציט בלבד. לויקוציטים אחרים מורכב של תאי T, תאי B ותאי NK לא transmigrate תחת TNFα או TNFα + VEGFA. אכן, זה תועד לויקוציטים אלה צריכים אותות אחרים עבור גלגול. לפיכך, בידוד לא יעיל של monocytes יוביל underestimation של גלגול מונוציט, כפי ניתן לספור את לויקוציטים אחרים ומונוציטים. זה יוביל לתוצאה שגוי על גלגול מונוציט, עקב הזיהום של האוכלוסייה מונוציט עם לויקוציטים אחרים.

Figure 1
איור 1: בניית פרופיל של monocytes מבודדים על ידי cytometry זרימה. (א) ניתוח של המורפולוגיה של PBMC לפני דלדול לימפוציטים. הגודל (פיזור קדימה: FSC) ואת צפיפות (לצד פיזור: האס) של דם היקפיים תאי תאי נקבעו על ידי cytometry זרימה. (B) גודל ואת צפיפות הרשת של monocytes מבודד נקבעו על ידי cytometry זרימה לאחר דלדול לימפוציטים. בידוד יעיל של monocytes מראה של דלדול מלא של אוכלוסיית לימפוציטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: דיאגרמה של מערכת fluidic. (א) סקירה סכמטי של מערכת זלוף לפני ואחרי חיבור של שקופיות, התקנה משאבת מזרק. דיאגרמה (B) של התהליך של חיבור השקופית עם הצנרת באמצעות מלחציים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: בדיקת ההפעלה יעיל של תאי אנדותל. ההפעלה של HUVEC על ידי גירוי דלקתי שנבדקה על ידי ניתוח צורת התא באמצעות מיקרוסקופ לעומת זאת שלב. אחרי 6 שעות של טיפול HUVEC להציג מורפולוגיה מוארך אחרי גירוי עם TNFα (500 U/mL) או שילוב של TNFα (500 U/mL) + VEGFA (1 µg/mL) לעומת תאים unstimulated. זה שינוי מורפולוגי של HUVEC בעקבות גירוי דלקתי הוא מחוון קל לזהות של ההפעלה התא, אשר צריך להבטיח שמפות עבור זרימת וזמינותו. סרגל קנה מידה = מיקרומטר 120 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: זיהוי של ומונוציטים transmigrated על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית- (א) דיאגרמה של גלגול מונוציט עם הדעות הצפוי על הפסגה של הבסיס מטוסים. הגרעינים של monocytes מוכתם Hoechst 33342 מתוארים בצבע כחול, הצורות תיאורטי של monocytes מתוארים עם קווים מקווקווים את גרעין האטום. בתצוגת הבזליים, transmigrated ומונוציטים שטוח מוצגים כדי לכבוש את החלל מתחת תא אנדותל. בשטח זה נראה כמו חור שחור המקיף את הגרעין מונוציט בתמונות קונפוקלי. (B) לוקליזציה של מונוציט לפני ואחרי גלגול. התצוגות אורתוגונלית מוצגים, המראה של חור שחור (מאפשרת הקו המקווקו לבן) יכול להיות שנצפו לאחר הגירה מונוציט תא אנדותל abluminal. לצורת ראש חץ אדום מציין את המיקום של מונוציט לפני גלגול ומציין ראש החץ הלבן לאותו התא, גם לאחר גלגול. התצוגות אורתוגונלית להציג זו מונוציט transmigrated מתחת תא אנדותל. סרגל קנה מידה = 40 µm. (ג) זמן לשגות רצפי תמונות (בין 0 ל- 20 דקות) מונוציט גיוס נוספות. התצוגות הפסגה, הבסיס מוצגים. הרצף המלא ניתן לראות סרטים משלימה1, 2 ו- 3. ריבועים אדומים להדגיש את מונוציט transmigrated בעלי גרעין בלו. החור השחור המתאים אל גוף שטוח מונוציט מתחת תא אנדותל תחום באמצעות קו מקווקו צהוב. סרגל קנה מידה = 40 µm. (D) כימות מונוציט הדבקה על גירוי TNFα לעומת unstimulated HUVEC לאורך זמן. (E) כימות של שיעור גלגול מונוציט לאורך זמן. N = 3 משכפל ביולוגי. הנתונים מוצגים כמו זאת אומרת ± ש אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: חקירה סימולטני של גלגול של מונוציט subpopulations תחת זרימה. רצפי תמונות בצילום מואץ (A) (בין 0 ל- 20 דקות) של הגיוס של proangiogenic ומונוציטים (CD16+) ומונוציטים הלא-אנגיוגנזה לאורך זמן באמצעות HUVEC מופעל TNFα. סרגל קנה מידה = 40 µm; התצוגות הפסגה, הבסיס מוצגים. הרצף המלא ניתן לראות 4 הסרט משלים עבור הפסגה ו 5 הסרט משלים עבור תצוגות הבזליים. (B) כימות של גלגול של אדם proangiogenic ומונוציטים (HPMo: CD16 +) ומונוציטים האנושית הלא-אנגיוגנזה (HNMo) דרך טפט HUVEC מופעל TNFα. N = 4 משכפל ביולוגי, הנתונים מוצגים כמו זאת אומרת ± ש * 0.05 < p; מבחן מאן-ויטני. (ג) תמונות בצילום מואץ רצפים (בין 0 ל- 20 דקות) של הגיוס של proangiogenic ושאינם-אנגיוגנזה ומונוציטים שעות נוספות דרך מופעל TNFα + VEGFA HUVEC. סרגל קנה מידה = 40 µm; התצוגות הפסגה, הבסיס מוצגים. הרצף המלא ניתן לראות 6 הסרט משלים עבור הפסגה ו 7 הסרט משלים עבור תצוגות הבזליים. (ד) כימות של גלגול של אדם proangiogenic ומונוציטים (HPMo: CD16 +) ומונוציטים האנושית הלא-אנגיוגנזה (HNMo: CD16-) דרך חד שכבתי מופעל TNFα + VEGFA HUVEC. N = 4 משכפל ביולוגי, הנתונים מוצגים כמו זאת אומרת ± ש * 0.05 < p; מבחן מאן-ויטני. (E) לוקליזציה של CD16+ ומונוציטים לפני (10 דקות), לאחר גלגול (15 דקות) באמצעות גירוי TNFα + VEGFA HUVEC. התצוגות אורתוגונלית מוצגים. סרגל קנה מידה = 40 µm אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: חקירה סימולטני של גלגול של CD14 + נגד CD14 - PBMC תחת זרימה. (א) אדהזיה של CD14+לעומת CD14– PBMC כדי HUVEC מופעל TNFα תחת זרימה. (B) אדהזיה CD14+לעומת CD14– PBMC כדי מופעל TNFα + VEGFA HUVEC תחת זרימה. (ג) גלגול לדרג (%) של CD14+לעומת CD14– PBMC דרך HUVEC מופעל TNFα תחת זרימה. (ד) גלגול לדרג (%) של CD14+לעומת CD14– PBMC דרך מופעל TNFα + VEGFA HUVEC תחת זרימה. הנתונים הם זאת אומרת ± ש N = 4 משכפל ביולוגי. * p < 0.05; מבחן מאן-ויטני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

משלימה סרט 1: מבט על המטוס הפסגה של פאן-מונוציט הגיוס תחת זרימה. תצוגה מורחבת של הגיוס של פאן מונוציט תחת זרימה על המטוס הפסגה. HUVEC היו מוכתמים CMFDA והיו הגרעינים של monocytes לחיות-מוכתם Hoechst 33342. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

משלימה את הסרט 2: תצוגה על המטוס הבזליים של פאן-מונוציט הגיוס תחת זרימה. תצוגה מורחבת של הגיוס של פאן מונוציט תחת זרימה על המטוס הבזליים. HUVEC היו מוכתמים CMFDA והיו הגרעינים של monocytes לחיות-מוכתם Hoechst 33342. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

משלימה הסרט 3: הקרנה מקסימלי של z-ערימות של פאן-מונוציט הגיוס תחת זרימה. תצוגה מורחבת של הגיוס של פאן מונוציט תחת זרימה כפי שמוצג משלימה סרטים 1 ו- 2. HUVEC היו מוכתמים CMFDA והיו הגרעינים של monocytes לחיות-מוכתם Hoechst 33342. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

משלימה סרט 4: תצוגה על המטוס הפסגה של הגיוס של מונוציט subpopulations כדי TNFα-הפעלת HUVEC. תצוגה על המטוס הפסגה של הגיוס בו זמנית של מונוציט subpopulations תחת זרם מורחבת כדי מופעל TNFα HUVEC תחת זרימה. HUVEC היו מוכתמים CMFDA והיו הגרעינים של monocytes לחיות-מוכתם Hoechst 33342. Proangiogenic האנושי מונוציט subpopulations אותרו על-ידי הביטוי פני שטח של CD16. סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

5 הסרט משלים: תצוגה על המטוס הבזליים של הגיוס של מונוציט subpopulations כדי TNFα-הפעלת HUVEC. תצוגה מורחבת, על מישור הבסיס, גיוס סימולטני של מונוציט subpopulations תחת זרימת מופעל TNFα HUVEC תחת זרימה. HUVEC היו מוכתמים CMFDA והיו הגרעינים של monocytes לחיות-מוכתם Hoechst 33342. Subpopulation מונוציט (HPMo) proangiogenic האנושית זוהה על ידי הביטוי פני שטח של CD16. סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

משלימה סרט 6: תצוגה על המטוס הפסגה של הגיוס של מונוציט subpopulations כדי TNFα+ הופעל-VEGFA HUVEC. תצוגה מורחבת, על המטוס הפסגה, של גיוס סימולטני של מונוציט subpopulations תחת זרימת מופעל TNFα + VEGFA HUVEC תחת זרימה. HUVEC היו מוכתמים CMFDA והיו הגרעינים של monocytes לחיות-מוכתם Hoechst 33342. Subpopulation מונוציט proangiogenic האנושי זוהה על ידי הביטוי פני שטח של CD16. סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

משלימה את הסרט 7: תצוגה על המטוס הבזליים של הגיוס של מונוציט subpopulations כדי TNFα+ הופעל-VEGFA HUVEC. תצוגה מורחבת, על מישור הבסיס, גיוס סימולטני של מונוציט subpopulations תחת זרימת מופעל TNFα + VEGFA HUVEC תחת זרימה. HUVEC היו מוכתמים CMFDA והיו הגרעינים של monocytes לחיות-מוכתם Hoechst 33342. Subpopulation מונוציט (HPMo) proangiogenic האנושית זוהה על ידי הביטוי פני שטח של CD16. סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מדווחים על שיטה המפרט מחקר של מה מונוציט subpopulations transmigrate דרך טפט אנדותל מודלק. השיטה דנו להשתמש מיקרוסקופיה קונפוקלית במקום שלב-ניגודיות מיקרוסקופ, אשר משמש גם ללמוד מונוציט גיוס תחת זרימה3,11,19. אחד היתרונות של שימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית עבור הדמיה בצילום מואץ היא היכולת חד משמעית להפלות בין גלגול והצמדות חזקה ומונוציטים. על פי השיטה מבוסס מיקרוסקופיה שלב-ניגודיות היא גם חזקים, זה דורש מומחיות כדי למנוע ערבוב שמדמו תאים ותאים חריפה חסיד. במקרה זה, צריך לקבוע קריטריונים מחמירים לניתוח על מנת להפוך הבדל ברור בין שתי מדינות אלה של המפל גיוס מונוציט. בנוסף, חשוב גם לבצע ניתוח נקודת הקצה על-ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לאשר מגמות כלליות שנצפה על ידי מיקרוסקופ שלב-ניגודיות. לפיכך, השימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית לחקור מונוציט גיוס תחת זרם ישיר מספק תוצאות ברורות על המצב בפועל גלגול של monocytes שנתפסו.

לאחד צווארי בקבוק העיקריים בביצוע גיוס ליקוציט מבחני תחת זרימה, שימוש במיקרוסקופ ניגוד שלב הוא הזמן בילה לבצע הניתוח ולעקוב אחר תאים בודדים של הלכידה כדי גלגול דרך צומת תא-תא. אוטומציה של ניתוח כזה הוא אפשרי אבל קשה לבצע עקב ניגוד שלב הדמיון בין ומונוציטים ו שמדמו. הנה אנחנו מראים על-ידי שימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית מונוציט גלגול לוותה הפסקת של תא אנדותל מכתים במטוס הבזליים התואם לצורה של ומונוציטים transmigrated מתחת HUVEC. המיקום הזה אושר ע י התחזית orthogonal. המעבר של לוקליזציה מונוציט אירעה באופן בלעדי בין צמתי תא-תא מעידה על גילגול נשמות paracellular. . זה עקבי עם הנתונים הקודמים שלנו, אשר הראו כי תחת זרימה במבחנה, ומונוציטים transmigrate באופן בלעדי דרך כביש paracellular עם3,HUVEC18. כדי להשלים את השיטה המוצעת כאן, זה אפשרי להשתמש ללא חסימה נוגדנים נגד חלבונים מהחיבור כגון VE-קדהרין, ריבות או PECAM1 כדי לדמיין את האתרים פוטנציאלי של גלגול מונוציט (paracellular לעומת transcellular). יש לנו אישר כי הצורות שחור סביב האטום מונוציט הם מאפיין חזקים של תאים שמדמו, אירוע פשוט אשר ניתן לזיהוי על-ידי תוכנה. למרות תא ידני כולל מערכת המודגמות כאן, היווצרות צורה שחורה מסביב לגרעין ליקוציט הוא קריטריון שיכול לשמש להגדרת ליקוציט גלגול בניתוח אוטומטיות, ובכך לחסוך זמן רב. אנחנו כרגע עובדים על פיתוח יישום אוטומטית לניתוח כזה.

קרינה פלואורסצנטית, מיקרוסקופיה קונפוקלית שימשו בעבר במחקר של ליקוציט גיוס. עם זאת, הם לא היו רגילים כדי לחקור את גיוס subpopulations שונים בו זמנית. כאן אנו מציעים מודאליות השימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית ללמוד הגיוס של תת ליקוציט במקביל microenvironment אותו. אנו מראים שמיקרוסקופיה קונפוקלית הזה יכול לשמש כדי לחקור את התנהגויות הנדידה של subpopulations מונוציט שונים בו זמנית. לדוגמה, השתמשנו CD16 ביטוי להפלות בין ומונוציטים proangiogenic ושאינם-אנגיוגנזה במטרה ללמוד את קיבולת גלגול של subpopulations שני בהקשרים דלקתיים שונים. בקנה אחד עם הפרסום האחרונה שלנו, באמצעות את המודאליות מיקרוסקופיה קונפוקלית, אנחנו הראו כי שיעור גלגול של CD16+ ומונוציטים היה נמוך כאשר טפט תא אנדותל זורז רק על ידי TNFα3. עם זאת, השילוב של TNFα VEGFA הוביל לעלייה גלגול של proangiogenic ומונוציטים. שיעור גלגול היה גבוה באופן דומה עבור הלא-אנגיוגנזה CD16– ומונוציטים תחת שני תנאים דלקתיים. אנחנו בעבר הראו כי מונוציט מכתים עם נוגדן anti-CD16 לא הביאה כל השפעה משמעותית על גילגול נשמות, אישור זה על ידי הניתוח של monocytes ללא תווית לאחר גלגול וזמינותו, באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית3. עם זאת, עבור סוגי ליקוציט חדש או נוגדנים נהגו לסמן אותם, האפקט תיוג צריך להיות מוערך. באמצעות שיטה זו, עד שלוש אוכלוסיות שונות של לויקוציטים יכול להיות בו זמנית למד. זה יכול להיות subpopulations כי הם סוגי תאים חיסוניים נפרדים פונקציונלית או דומה. למרות הדגש כאן הוא על גלגול מונוציט, צעדים אחרים של הגיוס שלהם יכול גם להיות מנותח בשיטה זו, לרבות בהתנהגות התא לפני גלגול, כגון לכידה, כיוון migrational. גלגול שלאחר אירועים כגון שימור abluminal של גלגול לאחור יכול גם ייחקרו לאוכלוסיות שונות ליקוציט, כהרחבה של שיטה זו. מגבלה אחת היא זיהוי המסכן ההכתמה בערוץ מרחיקת אדום הדמיה בצילום מואץ, כמו גם כמה overspill של האותות פלורסצנטיות להפחית את הרזולוציה z-מחסנית. זה היה קשור בעיקר כלי המשמש הדמיה קונפוקלי. השימוש של התמונה deconvolution יעזור בסופו של דבר כדי לשפר את איכות התמונה ולאפשר ניתוח של השלבים השונים של גיוס ליקוציט עוד יותר.

ללמוד ליקוציט גיוס בתנאים אופטימליים, חשוב לבדוק את מצב ההפעלה של טפט תאי אנדותל. אכן, הפעלה לקוי של תאי אנדותל מוביל לירידה הגלובלית מונוציט אדהזיה, גלגול. הפעלת תאי אנדותל ניתן לבדוק על ידי ניתוח את רמת הביטוי של מולקולות אדהזיה על פני השטח של תאי אנדותל כגון ICAM1 ו- VCAM1. הרמה של אלה אדהזיה מולקולות חייב להיות מוגברת בהשוואה לתאי אנדותל unstimulated. אם אין שינוי לזיהוי של מולקולות אדהזיה אנדותל אלה, HUVEC תרבותי יכול להיחשב לא הופעל. הערכת רמת הביטוי של מולקולות אדהזיה יכולים להוות פקד כמותיים טוב בין ניסויים שונים באמצעות מאותה אצווה של HUVEC. עם זאת, רמת הביטוי של מולקולות אדהזיה אלה יכול גם להשתנות בין תרבות אחרת העיקרי של תאי אנדותל הגבלת שיקול דעתה של סף הכללית של ICAM1 או VCAM1. לשינוי צורה של תאי אנדותל macrovascular כגון HUVEC מהווה אינדיקטור טוב של ההפעלה שלהם. השינוי האחרון בפנוטיפ מאפשר הערכה איכותית ומהירה של הפעלת HUVEC. אולם, הניתוח של מולקולות אדהזיה עשוי להיות בחירה טובה יותר עבור תאים microvascular לא להראות צורה-שינוי משמעותי בעת ההפעלה עם ציטוקינים דלקתיים.

ללימודים מכניסטית, פקדים שלילי הרלוונטיים של גילגול נשמות מונוציט יכול להתבצע באמצעות נוגדנים נגד מולקולות אדהזיה אנדותל כגון ICAM1, VCAM1 או במשטח ליקוציט כגון ליקוציט פונקציה-הקשורים אנטיגן (LFA)-1. השימוש של פקד שלילי רלוונטי חיוני למחקר כזה מכניסטית ב ומונוציטים כפי שהן מבטאות Fc-קולטנים על משטחים התא שלהם. טוהר ומונוציטים לאחר בידוד הוא גם חשוב, על מנת למנוע זיהום על ידי אוכלוסיות ליקוציט אחרים של underestimation של קצב מונוציט גלגול. פרמטר קריטי נוסף הוא הטמפרטורה, אשר צריך להגדיר ב 37 ° C עבור כל מבחני על מנת להבטיח את שכל התצפיות ניסיוני הרלוונטיים, לתרגם בהתאם ל האנושי ויוו תא סחר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים ד ר פול Bradfield על כתב היד הקריאה ואת המשוב. א ס קיבלו תמיכה כספית מארגון אדוני ג'ולס ת'ורן צדקה בחו ל לבטוח רג,

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Culture Flasks 75 cm2 TPP 90076 Routine culture of isolated HUVEC
µ-Slide VI 0.4 IBIDI 80606
Centrifuge Tubes 15 mL TPP 191015
Centrifuge Tubes 50 mL TPP 191050
Collagen G Biochrom L 7213 For coating of cell culture flasks
Gelatin Sigma-Aldrich 1393 For coating of cell culture flasks
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8537
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8662
RPMI-1640 Medium Sigma-Aldrich R8758
3-Way Stopcocks BIO-RAD 7328103
penicillin 10,000 μ/mL streptomycine 10,000 μg/mL fungizone 25 μ/mL AMIMED 4-02F00-H
Collagenase type 1 Worthington LS004216
Medium 199 1x avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes GIBCO 22340020
Bovine Albumin Fraction V ThermoFisher 15260037
Endothelial Cell Growth Supplement, 150 mg Millipore 02-102
Heparin Sodium Sigma-Aldrich H3149RT
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H6909
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A 4544
EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O APPLICHEM A2937.0500
CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC Miltenyi Biotech 130-100-713 AB_2655150
CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE Miltenyi Biotech 130-110-807 AB_2657280
Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC Miltenyi Biotech 130-107-016 AB_2653263
BD Accuri C6 Plus BD Bioscience
µ-Slide I Luer IBIDI 80176
CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) ThermoFisher C2925
Recombinant human TNFα Peprotech 300-01A
Recombinant human VEGFA Peprotech 100-20
NE-1000 Programmable Syringe Pump KF Technology NE-1000
Ficoll Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02
Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE Miltenyi Biotech 130-110-519 AB_2655051
Pan Monocyte Isolation Kit, human Miltenyi Biotech 130-096-537
Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE Miltenyi Biotech 130-106-762 AB_2655403
LS columns Miltenyi Biotech 130-042-401
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotech 130-090-976
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate ThermoFisher H1399
Silicone tubing IBIDI 10841
Elbow Luer Connector IBIDI 10802
Female Luer Lock Coupler IBIDI 10823
Luer Lock Connector Female IBIDI 10825
In-line Luer Injection Port IBIDI 10820
Ar1 confocal microscope Nikon
40x objective Nikon 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm
ImageJ Software NIH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells. Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).
  2. De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).
  3. Sidibe, A., et al. Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours. Nature Communications. 9 (1), 355 (2018).
  4. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  5. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
  6. Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).
  7. Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).
  8. Chamorro, S., et al. In vitro differentiation of porcine blood CD163− and CD163+ monocytes into functional dendritic cells. Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).
  9. Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood. Blood. 74 (7), (1989).
  10. Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
  11. Bradfield, P. F., et al. JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation. Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).
  12. Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation. Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).
  13. Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha. Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).
  14. ibidi GmbH. Shear Stress and Shear Rates for ibidi µ-Slides - Based on Numerical Calculations. , (2014).
  15. Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
  16. Yang, C. -R., Hsieh, S. -L., Ho, F. -M., Lin, W. -W. Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression. Journal of Immunology. 174 (3), Baltimore, Md. 1647-1656 (2005).
  17. Wong, D., Dorovini-Zis, K. Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture. Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).
  18. Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
  19. Bradfield, P. F., et al. Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques. PLoS One. 11 (7), e0159679 (2016).

Tags

אימונולוגיה זיהום גיליון 141 ליקוציט הסחר מונוציט גיוס דלקת מיקרוסקופ קונפוקלי הדמיה timelapse הדבקות גילגול נשמות מונוציט subpopulations נוגדנים אינטגרינים מולקולות אדהזיה
מחקר בו זמנית של הגיוס של מונוציט Subpopulations תחת זרימה במבחנה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ropraz, P., Imhof, B. A., Matthes,… More

Ropraz, P., Imhof, B. A., Matthes, T., Wehrle-Haller, B., Sidibé, A. Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58509, doi:10.3791/58509 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter