Summary
ここでは、単球 subpopulation の特定の表面マーカーと共焦点蛍光顕微鏡を用いて in vitro における流動場下における人身売買対策統合のプロトコルを提案する.このプロトコルは、他の特定の表面マーカーを使用して他の白血球のサブタイプをプロファイルとして順次募集手順同様を探索する使用できます。
Abstract
ターゲットの末梢組織に血液中から単球の採用は、組織の損傷、腫瘍の開発、自己免疫疾患の中に炎症性プロセスに不可欠です。これは、基になる影響を受ける組織に接着や内皮下移行 (輪廻) が続いて活性化の内皮細胞の管腔表面に自由な流れからのキャプチャのプロセスによって実現されます。ただし、単球サブポピュレーションの優遇とコンテキスト依存の募集をサポートするメカニズムはまだ完全に理解しました。そこで、同時に可視化し、流動場下における測定に異なる単球サブポピュレーションの採用を可能にする方法を開発しました。タイムラプス顕微鏡を用いたイメージング、に基づいて、このメソッドは明確な付着性と転生の球を区別することができます。ここでは、このメソッドを使用して、同時にプロ血管新生と血管新生の非単球の in vitro の募集カスケードを勉強する方法について述べる。さらに、このメソッドは、最大 3 つの単球集団のリクルートの別の手順を勉強する拡張できます。
Introduction
単球は、損傷した組織、血管新生、癌1,2,3 を含む多くの疾患の病態をクリーンアップする病原体と戦うために不可欠な免疫の貪食コンポーネントを構成します。.単球は骨髄由来細胞が血液中を循環するが、特定の分子機構を末梢組織における炎症のサイトに募集することができます異種の集団から成る。白血球は、単球の募集カスケードは一般に、キャプチャ、圧延、クロール、逮捕、内皮下浸潤 (輪廻)、血管壁 (基底膜と壁画を通じて移行などの異なる手順を関係づけるセル)4。これらの手順は主にセレクチンのリガンドなどの白血球に注目している、糖タンパク質リガンド、ケモカイン、細胞と接合部の接着分子、その受容体など、内皮細胞内腔で炎症誘起分子を含むインテグリンです。血管内皮細胞の接合点 (傍細胞) や内皮細胞体 (transcellular) を通じて人身取引の経路は、内皮バリア5を横断する白血球により使用できます。単球は歴史的に transcellular ルートを通じて霊界に記載されている、しながら、単球はもはや均質の細胞集団を考えられているように、渡り鳥の経路に潜在的な相違が提案されている.多様性単球ごとの相違点と共通点の定義することができます、彼らの独特の血管外漏出に対するカスケード3,6ことが明らかとなりつつあります。したがって、明確に、単球集団間差別するために可視化することが重要だし、募集中のこれらの異なる集団のそれぞれの行動の表現型を処理します。
人間から単球、ブタ、ラット、マウス特定の生得的機能と特定の渡り鳥動作7,8,9形質集団に分割されました。たとえば、ヒトでは、単球が細菌リポ多糖のコレセプター CD14、CD16、Fc γ レセプター III の表面表現に基づく 3 つのサブセットに分けることが。ひと単球のサブポピュレーションを含めるクラシック CD14+CD16-、CD14 を中間+CD16+と非古典的 CD14薄暗いCD16+細胞6,9。古典の CD14+CD16-単球は、主に炎症性であることを示したに対し CD16 のプール+単球は現在 TIE2 発現と血管新生関数10総称して発見されました。一貫して、人間の腫瘍の壊死などの炎症性サイトカインと内皮細胞刺激因子 (TNF) α やインターロイキン (il-1) ベータ (従来の炎症) は古典的な CD14 の完全な募集をトリガーするのに十分な+CD16-単球。ただし、血管内皮増殖因子 (VEGF) と tnf α (血管新生因子による炎症) の同時作用が、CD16 の輪廻を挑発する必要+単球3の血管新生プール。歴史的には、伝統的な Transwell 静的な条件、平行平板の流れ区域や μ スライド流室制度は、時間の in vitro11 で 1 つの末梢血白血球ポピュレーションの募集を定量的に解析に使用されています。 ,12,13。これらのプロトコルを検証しながら複数の単球サブポピュレーションの同時解析を許可より強固な方法がより洞察力があると見なされます。このような手法必要があります複数の対話および各それぞれの人口の異なる周波数のアカウントし、類似点と特異性のメカニズムの理解は、各単球を定義する募集カスケードサブセット。
同時に共焦点顕微鏡を用いた研究に異なる単球サブポピュレーションの渡り鳥のカスケードを可能にする流動場下における単球採用のタイムラプス イメージングに基づく方法を紹介します。このメソッドは、単球後毛細血管細静脈の循環の血行動態、白血球動員の生体内での主要な場所と同様に、血管内皮細胞炎症を模倣する特定の重要な機能を統合します。提案手法は、ひと臍帯からの分離の確立されたプロトコルを介して生成されるひと臍帯静脈血管内皮細胞 (新生活) を使用します。この臨床のリソースも臍静脈から分離でき、血管内皮細胞の合理的な利回りを提供しながら生物学的副産物として簡単に利用できるという利点があります。我々 も蛍光色素や蛍光を別の細胞成分と共焦点顕微鏡による単球の位置 (abluminal 対内腔) の明確な定義を区別する使用時間をかけて。ここで提示されたプロトコル開発した同時に測定する単球サブポピュレーションの転生レベル。また、他の白血球サブポピュレーションや採用プロセスを研究するこの方法を異なるバイオ マーカーおよびラベルの使用によって拡張できることに注意してください。
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Protocol
人間の材料は、ボランティア ドナーとスイス臨床研究倫理委員会に従ってインフォームド・コンセントと使用されました。
1. 分離と凍結ひと臍帯静脈血管内皮細胞 (株)
- 螢光分離を開始する前に、37 ° C で 30 分間 T75 フラスコ (0.1 mg/mL コラーゲン G とリン酸緩衝生理食塩水 pH 7.4 PBS で 0.2% のゼラチン) にコーティング溶液 5 mL を追加します。
- PBS のコードをきれいに、滅菌湿布を拭き、滅菌 20 cm シャーレに配置。滅菌ハサミでコードの端をカットします。
- 単一の大きい静脈と 2 つの小動脈を特定します。優しくコード両端静脈下肢にそれに付す三方活栓でカニューレを挿入します。
- コードとワイヤーの長さとしっかりとカニューレの接続を締めます。
- 100 U/mL ペニシリン、100 U/mL ストレプトマイシン 250 ng/mL コードの静脈を洗うアムホテリシン B を含む RPMI 培地 20 mL で 2 回コードを灌流します。このプロセスは、コードの外観をより白くより明確になります。コラゲナーゼ加算の前に静脈を空には、一方の端に注射器で、RPMI を収集します。
- 1 mg/mL コラゲナーゼ型の 12 ml 静脈灌流私 (0.22 μ m フィルター)。
- すぐコードで活栓を終了し、12 分の 37 ° C でコードを孵化させなさい。
- 静脈腔から血管内皮細胞をデタッチするのにはコードを優しくマッサージします。
- 50 mL の注射器で 10% 牛胎児血清を含む RPMI 30 mL をとり、臍帯の一方の端に接続します。
- 臍帯のもう一方の端に空 50 mL 注射器を接続します。
- 活栓を開き、もう一方の端から相互を集めながら端から端まで静脈を灌流します。
注:収集した懸濁液には、内皮細胞が含まれています。 - 200 x gで 5 分でこの細胞懸濁液を遠心します。
- 上澄みを廃棄し、10 ml の完全 M199 培地 (20% の FCS を含む、15 μ g/ミリリットルで内皮細胞増殖サプリメント M199、100 μ g/mL のヘパリン ナトリウム、0.5 μ M のヒドロコルチゾン、10 μ G/ml L-アスコルビン酸、100 U/mL ペニシリン、100 U/mL の細胞ペレットを再懸濁しますストレプトマイシンと 250 ng/mL アムホテリシン B)。
- T75 フラスコからコーティング ソリューションを削除し、PBS で 1 回洗浄します。
- 種子セル T75 フラスコに 1.13 のステップから収集し、5% CO2と 37 ° C でインキュベーターで置きます。
- 次の日は、残留の赤い血液細胞を削除しの変更媒体合流点まで 2 日おきに完全 M199 培地で 3 回フラスコをすすいでください。
- 80-90% の合流点で 5 mL の PBS と一度血管内皮膜を洗浄、5 ml の M199 5 分追加 4 mL、1 mL のトリプシンのアクションを停止する FCS の 37 ° C で 1 mM EDTA で 0.05% トリプシンの細胞を切り離します。すべての血管内皮をデタッチするフラスコをフラッシュします。
- VE カドヘリン PECAM 1、gp38、汚損に使用して、血管内皮の純度を確認するフローサイトメトリーによる分析に 50 μ L の因数を収集します。
- 室温で 5 分間 200 x g で 15 mL の管および遠心分離機のステップ 1.18 から新生活の残りの部分を収集します。
- ステップ 1.19 から上澄みを廃棄、cryotubes で 5 × 105セル/ml の密度で凍結溶液 (10 %dmso を含む FCS) で細胞ペレットを再懸濁します、-80 ° c または液体窒素を使用するまで凍結します。
-
螢光純度を確認: する
- 1.18 のステップで収集した螢光を 50 μ l 添加の因数に抗ポドプラニン APC 抗体の 1 μ L、1 μ L 抗ひと PECAM1 PE 抗体の抗ひと VE カドヘリン FITC 抗体の 1 μ L を追加します。
- 10 分間室温でインキュベートします。
- 400 x g 30 で 100 μ L の PBS と遠心分離機を追加 s。
- 上澄みを廃棄し、100 μ L の PBS に再懸濁します。データは流れ cytometry 技術で今すぐ取得できます。
注:新生活はポドプラニンの陰陽である VE カドヘリンの PECAM-1 です。
2. 血管内皮が霜取り
注:(最大 5 通路) の実験のための低い通路では、血管内皮を使用します。
- 30 分の 37 ° C でコーティング溶液 1 mL と T75 フラスコをコートします。
- 2 分の 37 ° C で新生活を defreeze かつ完全な M199 の 10 mL の細胞を再懸濁します。
- 200 x gで 5 分間室温で細胞を遠心分離し、上澄みを廃棄します。
- 完全な M199 の 10 mL の細胞ペレットを再懸濁します。
- プレコート フラスコ細胞懸濁液を転送します。5% CO2と 37 ° C でインキュベーターでフラスコを配置します。2 日ごとに細胞培養培地を変更します。
3. 新生活文化 0.4 μ スライド室
- 流れの実験を開始する前に 5 日間は、0.1 mg/mL コラーゲン G、30 分の 37 ° C で 0.2% のゼラチンを含んでいる PBS の 30 μ L で 0.4 μ-スライドの部屋事前コートします。
- 100 μ L の PBS とチャンバーを洗います。
- T75 フラスコの 80-90% コンフルエント新生活から細胞をデタッチします。
- 5 mL の PBS で新生活を洗い、5 ml の 5 分の 37 ° C で 0.05% トリプシンの切断します。
- フラッシュし完全な M199 に細胞懸濁液を収集し、最も便利な方法でセルをカウントします。室温で 5 分間 200 × gで遠心分離機します。
- 106セル/ml 細胞ペレットを再懸濁し、商工会議所あたり 30 μ L (30,000 細胞) を配布します。
- 1 h の 5% CO2と 37 ° C でインキュベーターでセルを孵化させなさい。
- 各商工会議所に完全な M199 の 150 μ L を追加し、37 ° C、5% CO2でインキュベーターで 5 日間培養します。2 日ごとに媒体を変更します。
4. 新生活流動場下における単球採用試金のための汚損
- M199 と 1 μ M CMFDA (5 chloromethylfluorescein ・ ジアセテート) の作られたラベルのメディアの準備し、細胞ラベリング前に 5 分の 37 ° C に温めてください。
- 37 ° C で暖められた M199 培地で 2 回洗う新生活
- 温めたラベリング培 CMFDA の 1 μ M の 30 μ L で媒体を交換し、37 ° C、5% CO2で 10 分間定温器に配置します。
- 完全な M199 で 1 回洗浄し、30 分の 37 ° C、5% CO2でインキュベーターで完全な M199 とセルを孵化させなさい。
注:ラベリング溶液添加前に血清中のすべてのトレースを削除することが重要だ、それ以外の場合それは螢光染色を変更可能性があります。 - いずれかの人間の tnf α を含む完全な M199 と媒体を交換 (500 U/mL) または人間の tnf α のミックス (500 U/mL) 人間 VEGFA と (1 μ g/mL) 37 ° C、5% CO2でインキュベーターで 6 時間。
5. 分離人間パン単球のサブポピュレーションの染色
- 集中して人間の血のバフィー コートまたは EDTA バキュテナー管実験の日に収集された新鮮単離の人間血 20 mL を使用します。
- PBS 1 mM EDTA (1:1) で血液を希釈し、優しく密度勾配メディアの 20 mL の上に希釈血液の 20 mL のピペットします。遅い加速とブレーキなしの室温で 30 分間 400 × gで遠心分離機します。
- 末梢血単核球 (PBMC) の収集-40 mL の PBS-1 mm EDTA を含む新しい 50 mL チューブに (密度勾配メディアとプラズマ層) の間の血小板層。最大 50 mL の PBS-1 mM EDTA をトップします。
- 室温で 200 x gで 5 分間遠心上清を破棄します。
- 10 mL の染色バッファー (PBS-1 mM EDTA の 0.5% ウシ血清アルブミン BSA を含む) と細胞ペレットを再懸濁します。
- 室温で 200 x gで 5 分間遠心上清を破棄します。
- 5.5、5.6 の手順を繰り返します。
- 10 ml のバッファーを染色の細胞ペレットを再懸濁します。細胞数の 10 μ L の因数を取る。
- PBMC 集団を確認し、流れの cytometer で急激にセルをカウントします。
注:特徴的なリンパ球と単球の集団は、(図 1 a) を観察できます。について期待して新鮮な人間の血の 50 mL から 50-100 × 106 PBMC。 -
Cd14対CD14-PBMC 流動下での募集のため。
- フロー バッファーの 3 回餌を洗浄 (M199 0.5 %bsa を含む) と 1 mL あたり 6 x 10 の6セルでフロー バッファーの単核細胞を再懸濁します。
- 200 μ L 各試金のための因数を作る。アッセイの前に 20 分までは、37 ° C で孵化させなさい。
- 抗 CD14 PE のヘキスト 33342 2 μ M の最終濃度 5 μ L をそれぞれ因数に追加します。混合し、37 ° c 10 分間加温します。
- 400 x g 30 で因数を遠心分離機 s。
- 上澄みを廃棄し、フロー バッファーの 200 μ L でペレットを再懸濁します。
-
流動場下における単球サブポピュレーションの募集:
- 製造元の指示に従ってパン単球分離キットで単球を分離します。
注:次の隔離のプロトコルは、50 x 10 の6セルです。それ拡張できます上下に製造元の推奨事項内にある限り。 - 200 x gで 5 分間室温の PBMC 懸濁液を遠心します。
- 上澄みを廃棄し、バッファーを染色の 400 μ L でペレットを再懸濁します。
- Fc 受容体ブロック試薬を 50 μ l 添加とパン単球抗体カクテルの 50 μ L を追加します。
- 10 分間室温でインキュベートします。
- 染色バッファーと磁気ビーズ共役反ビオチン抗体の 100 μ L の 400 μ L を追加します。15 分間室温でインキュベートします。
- 2 mL の染色バッファーを追加し、磁石と相まって MAC LS 列を使用します。
- 磁石で LS 列を置き、染色バッファーの 1 つの mL を追加します。流れを破棄します。
- 列の PBMC の懸濁液を渡すし、新しい 15 mL チューブにパンの単球を含む、明確なフローを収集します。
- 5 mL をトップに染色バッファーを追加します。
- 硫酸を取るし、流れの cytometer による単球の分離の品質をチェックします。
- パン単球数を決定します。
注:単球の人口だけが見られる(図 1 b)。 - 200 x gで 5 分でステップ 5.11.11 から単球の残りの部分を遠心します。
- 上清を捨てます。
- 5 mL のフロー バッファーで細胞ペレットを再懸濁します (M199 0.5 %bsa を含む)。
- 5.11.13 に 5.11.14 EDTA の痕跡を除去するために 2 回を繰り返します。
- 製造元の指示に従ってパン単球分離キットで単球を分離します。
- 単球の懸濁液は流れ、6 x 106セル/ml (0.5 %bsa を用いた M199) をバッファーします。
- 各募集の試金のための単球 200 μ L の因数を作る。
- インキュベーターの 37 ° C で 20 分注入前に、まではろを維持します。
- 各因数に抗 CD16 PE 抗体とヘキスト 33342 (最終 2 μ M) の 5 μ L を追加します。
- 混合し、37 ° c 10 分間加温します。
- 400 x g 30 で因数を遠心分離機 s。
- 上澄みを廃棄し、フロー バッファーの 250 μ L でペレットを再懸濁します。
- 共焦点顕微鏡のアクイジション ・ パラメーターを設定するためにスライドの 1 つの区域で単球懸濁液 30 μ L を追加します。
- 37 ° C で 5.18 ステップから単球懸濁液の因数を維持します。
注:この懸濁液は流れシステムで注入されます。
6. 流体システムの準備
- 37 ° C で設定用セル インキュベーターは、します。
注:流システムの図は、図 2にとおりです。 - チューブ部 i: 組み立てルアーロック コネクタ オス シリコーン チューブ (8 cm 長く、3 mm 厚) の部分の 1 つの端を挿入し、ラインにルアー インジェクション セットにもう一方の端を接続します。シリコーン チューブ (40 cm、厚さ 3 mm) の部分に後者のルアーロック コネクタを接続 1 つ終わり。
注:必要に応じて、ラインにルアー注入セットと最終的な空気泡除去のためチューブ シリコン 5 mL 注射器に接続されている 3 ウェイ タップを挿入できます。 - チューブ ii を組み立てる: シリコーン チューブ (長さ 1 m、厚さ 3 mm) の長さの 1 つの端に 20 mL 注射器を接続します。ルアーロック コネクタ オス管のもう一方の端を挿入します。
- 接続部 I および II 管をルアー コネクタ男性女性ルアー ロック カプラー (図 2 a) を挿入することによって部。
- 37 ° C で暖められたフロー バッファー (M199 + 0.5 %bsa) を含む貯水池側のシリコン チューブを入れ
- フロー バッファーとチューブに合わせて 20 mL シリンジのプランジャーを引きます。
- ポンプの注射器に置き、固定します。
- ポンプの設定でモードを撤回するではなく吹き込む) と流量を指定します。
- 次の数式を使用して、使用する IBIDI スライドによると流量を決定します。
注: スライド率は実験用 IBIDI スライドに依存しています。Μ-スライドの私0.4この例では、スライドの要素で使用されているロックが 131.6。特定のスライドの要因、会社ウェブサイト14を参照してください。フロー バッファー粘度は 0.0072 dyn.s/cm2です。後毛細血管細静脈のせん断応力は約 0.5 の dyn/cm2です。 -
スライド (図 2 b) に接続します。
- 女性のルアーロック ロック カプラー周りのシリコン チューブをクランプ、カプラーから 2 つのルアーロック コネクタ男性を外します。
- 刺激血管内皮と培地での塗りつぶしを含むスライドの貯水池にそれらを接続します。このステップの間に空気の泡を避けるため。
- クランプ離陸し、接続が漏れていないことを確認します。
- タイムラプス イメージングのための顕微鏡下でスライドしポンプを起動します。
7 共焦点顕微鏡による流動場下における単球採用のタイムラプス イメージング
- 40 x 目的を使用して (材料の表を参照) 用。
- 405 をアクティブに nm (青単球核)、488 nm (緑内皮細胞)、561 nm (赤 CD16 + サブセット) のレーザー。
- アクイジション ・ パラメーターを設定するのには単球を含む商工会議所を使用します。
注:非転生し、転生の両方の球を検出するためには、ピンホールとレーザ 405 nm の強さが高に設定されます。したがって、非転生の単球は少し根元の計画に表示されます。しか転生単球は内皮細胞下に新しい領域に対応する核周辺の無染色を提示します。 - 顕微鏡下で取得するチャンバーを配置します。
- マルチ ポジション共焦点イメージングのため 1 cm 半径内のビューの 3 つのフィールドを選択します。
- 基底と内皮細胞の頂端側を定義します。
- Z スタックを 10-12 μ m 範囲 (0.5 μ m ステップ) に設定します。1 分毎時間経過の取得を実行します。
- イメージングの 3 分後にラインにルアー注入ポートを介して単球懸濁液 (6 x 106セル/mL) の 200 μ L を注入します。
注:急速に単球が付着、輪廻 (基底の計画に頂端からトランジット) を開始に頂面上に表示されます。 - 少なくとも 30 分のイメージです。終わったら、画像を停止し、流れを止めます。スライドからそれらを切断するチューブをクランプします。
- 10 分の 4 ° C で 4% パラホルムアルデヒドでスライドを固定します。
- PBS でスライドを洗浄し、さらなる分析の必要な場合は 4 ° C でスライドを保存します。
8. ImageJ によるデータを分析します。
- 各フィールドの合計付着性単球の数を数えます。Mm2あたりの細胞数を決定します。
- 転生の単球が内皮細胞下に基底の計画に存在し、核の周り (グリーン チャンネル) でブラック ホールの存在によって識別されたをカウントします。
- 付着性白血球の総数によって転生白血球の数を分割します。移住率は付着性単球の割合として表示されます。
- 図では、ための樹状突起と基底の側面のこれらの内皮細胞コンパートメントのそれぞれで発生するイベントを説明するために同時に表示できます。
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Representative Results
Tnf α によって誘導される血管内皮活性化の状態の判断
炎症性サイトカイン tnf α の生物活性は、バッチと凍結融解サイクルの補充によって異なります。Tnf α の治療と血管内皮のライセンス認証の状態をチェックすることが重要です。これは、並列に注目している、icam-1 および VCAM 115,16,17の炎症の誘導の合流の螢光のいくつかのサンプルの汚損によって実行でした。Tnf α の治療は血管内皮細胞炎症性ストレスによって表示形態変化後血管内皮のライセンス認証の状態を確認する簡単でシンプルな方法。図 3に示すとおり、螢光を物質の細胞と比較して tnf α 存在下で 6 時間後細長い。比較は、tnf α と VEGFA のミックスによって刺激されるような伸長が観察されます。新生活の活発化の状態を記録は、単球の輪廻の最終結果、血管内皮細胞の活性化の品質に依存しているので重要です。
単球輪廻内皮細胞に特徴的な中止になります
流動場下における単球輪廻を研究、血管内皮細胞の CMFDA と分離された単球細胞膜透過性のヘキスト 33342 色素 (図 4) を青色に染色の核と緑のステンド グラスと共焦点顕微鏡を使用しました。タイムラプス顕微鏡を用いたイメージングは、その表現ができる、頂面で単球の可視化評価 (図 4 a-C は、補足的な映画 1) 許可。輪廻転生を受けて移行細胞は頂面から姿を消した、基底面内登場前に細胞間の接合に対応する細胞間のスペースに移動。Transmigrated の細胞は、単球の形状に対応する核のまわりブラック ホールを発表しました。この図形は、常に下に血管内皮細胞 (図 4 a-C、補足映画 2-3) 単球移行中に変更します。血管内皮細胞と単球の位置の下に単球体によって作られたこのダイナミック ブラック ホールは転生セルの明白な識別の許可。時間の経過とともに単球採用の定量は、輪廻転生 (図 4-E) 続いて単球接着を示した。白血球は、transcellular と傍細胞の両方のルートを extravasate することができますがだけ流れ下傍細胞輪廻を観察するこの方法でこと。これは、私たち以前の観測3,11,18,の19と一致。
炎症を駆動される血管新生因子促進 CD16 + 単球の輪廻
このメソッドを使用して、人間の血管新生対非血管新生単球による内皮単分子膜刺激による炎症性サイトカイン tnf α 単独で、または血管新生因子 VEGFA との組み合わせでの輪廻転生を行った。人間の血管新生の単球は、表面に CD16 または TIE2 の式によって識別できます。ここでは、抗 CD16 PE 抗体はプロと非新生単球の間で区別する使用されました。図 5 aB (補足映画 4-5)、CD16 の移住率に示すように+単球が低い内皮細胞のみ tnf α と刺激を受けました。ただし、この率は、血管内皮細胞は、tnf α と VEGFA (図 5-E、補足的な映画 6 7) 同時に刺激したときに増加しました。非血管新生単球の移住率が高かった同様に両方の炎症性条件の下で。両方の細胞の亜集団の輪廻は傍細胞経路を通じてのみ発生しました。したがって、このメソッドは、同時に調査が異なる単球性集団の輪廻適性のできます。
単球の純度輪廻の効率に影響を与える
末梢血単核細胞は、T 細胞、B 細胞、NK 細胞、単球で構成されます。ここで使用される単球分離法には、PBMC から他の白血球ポピュレーションの枯渇が必要です。単球純度の欠如が結果に与える影響を理解するには、私たちは PBMCs を使用し、流下募集分析を実行する前に抗 CD14 PE 抗体単球のパンのステンド グラスします。図 6に示すとおり、tnf α や tnf α + VEGFA による螢光刺激は単球の人口だけの輪廻を誘発しました。他の白血球から成る T 細胞、B 細胞と NK 細胞は tnf α や tnf α + VEGFA の下輪廻転生しません。確かに、これらの白血球が輪廻の他の信号を必要があることが記載されています。したがって、他の白血球は、単球としてカウントは、単球の非効率的な分離、単球輪廻の過小評価に します。これは単球の輪廻転生、他の白血球の単球人口の汚染のために誤った結果に 。
図 1: フローサイトメトリーを用いた孤立した単球のプロファイリングします。(A) リンパ球枯渇前に PBMC の形態の分析。サイズ (前方散乱: FSC) と粒度 (側方散乱: SSC) フローサイトメトリーによる末梢血単核細胞を求めた。(B) サイズと孤立した単球の粒度はリンパ球枯渇後フローサイトメトリーによって決定されました。単球の効率的な分離は、リンパ球の人口の完全な枯渇を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 流体システムのダイアグラム。(A) スライドとシリンジ ポンプの取り付けの接続前後の灌流システムの概要。(B) 図クランプを使用するチューブとスライドを結合するプロセス。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 内皮細胞の効率的な活性化をチェックします。炎症刺激による血管内皮の活性化は、位相差顕微鏡を用いた細胞の形態を分析することによって調べた。治療の 6 時間後血管内皮は tnf α で刺激すると細長い形態を提示 (500 U/mL) や tnf α のミックス (500 U/mL) + VEGFA (1 μ g/mL) が物質の細胞と比較して。炎症性刺激血管内皮のこの形態の変化は、流れの試金のために確保されなければならない細胞の活性化の検出が簡単な指標です。スケール バー 120 μ m =この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 共焦点顕微鏡を用いた transmigrated 単球の識別。(A) 図樹状突起と基底面で期待される景色を単球輪廻。ヘキスト 33342 で染色単球の核が青で描かれているし、原子核の周りの破線で単球の理論的な図形が描かれています。基底表示 transmigrated フラット単球が内皮細胞下にスペースを占有する表示されます。この領域は、周囲の共焦点画像を単球核ブラック ホールとして表示されます。輪廻の前後に単球の局在化 (B)。直交ビューの表示、および内皮 abluminal コンパートメントへの単球移行後 (白の点線で区切られた) ブラック ホールの姿を観察できます。赤矢印が輪廻の前に球の位置を示すし、白い矢印が輪廻の後同じセルを示します。直交ビューは、transmigrated 単球が内皮細胞の下にあることを示します。スケール バー = 40 μ m。 (C) タイムラプス映像シーケンス (0 から 20 分) 単球募集残業。樹状突起と基底のビューが表示されます。完全シーケンスは、補足的な映画 1、2 および 3の見ることができます。赤い四角形は、青い核 transmigrated 単球を強調表示します。内皮細胞下に単球の平ボディに対応するブラック ホールは、黄色の破線で区切られます。スケール バー = 40 μ m。 (D) における単球接着とtnf α 刺激の定量化些細螢光時間をかけて。単球移住率の定量化を時間をかけて (E)。N = 3 の生物的複製。データは、平均 ± 標準偏差として表示されますこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 流動場下における単球サブポピュレーションの輪廻の同時調査。単球の血管新生の募集 (20 分 0) から (A) タイムラプス映像シーケンス (CD16+) と時間をかけて tnf α 活性化血管内皮を介して非血管新生単球。スケール バー = 40 μ m;樹状突起と基底のビューが表示されます。完全シーケンスは補足の映画 4で見ることができる根尖部と基底ビューの補足の映画 5 。(B) 人間の血管新生単球の輪廻の定量 (HPMo: CD16 +) と tnf α 活性化血管内皮膜を通して人間の非血管新生単球 (HNMo)。N = 4 の生物的複製、平均 ± 標準偏差でデータを提示 * p < 0.05;マンホイットニー検定。(0 から 20 分) 残業 tnf α + VEGFA 活性化血管内皮を介して血管新生と血管新生の非単球の採用のシーケンスを (C) タイムラプス映像。スケール バー = 40 μ m;樹状突起と基底のビューが表示されます。完全シーケンスを見ることができる補足の映画 6頂、補足の映画 7基底ビュー。(D) 人間の血管新生単球の輪廻の定量 (HPMo: CD16 +) と人間の非血管新生単球 (HNMo: CD16-) tnf α + VEGFA 活性化血管内皮膜を介して。N = 4 の生物的複製、平均 ± 標準偏差でデータを提示 * p < 0.05;マンホイットニー検定。(E) (10 分) 前にローカリゼーションの CD16+単球と tnf α + VEGFA 刺激血管内皮を介して (15 分) 転生後。直交ビューが表示されます。スケール バー 40 μ m =この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: cd14対CD14-PBMC 流動下での輪廻の同時調査。(A) CD14 接着+対CD14-流動場下における tnf α 活性化血管内皮に PBMC。(B) 接着の CD14+対CD14-を流動場下における tnf α + VEGFA アクティブ螢光 PBMC。(C) 輪廻率 (%) CD14+対CD14-流動場下における tnf α 活性化血管内皮を介して PBMC。(D) 輪廻率 (%) CD14+対CD14-流動場下における tnf α + VEGFA 活性化血管内皮を介して PBMC。データは、平均 ± 標準偏差 N 4 生物をレプリケートします。* p < 0.05;マンホイットニー検定。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足映画 1: パン単球の流れの下で採用の頂面に表示します。頂面流下パン単球の採用を拡大。CMFDA 螢光染色し、単球の核は、ヘキスト 33342 でライブ-染色されました。スケールバー = 50 μ mこのファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
補足映画 2: パン単球の流れの下で採用の基底の平面のビュー 。基底面の流れの下でパン単球の採用を拡大。CMFDA 螢光染色し、単球の核は、ヘキスト 33342 でライブ-染色されました。スケールバー = 50 μ mこのファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
補足映画 3: パン単球の流れの下で採用の z スタックの最大投影します。補足ムービー 1 と 2で示すように、フローの下パン単球の採用を拡大。CMFDA 螢光染色し、単球の核は、ヘキスト 33342 でライブ-染色されました。スケールバー = 50 μ mこのファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
補足映画 4: tnf 単球サブポピュレーションの募集の頂面ビューα-螢光を活性化します。流動場下における tnf α 活性化血管内皮に流れ球サブポピュレーションの同時募集の頂面ビューを拡大しました。CMFDA 螢光染色し、単球の核は、ヘキスト 33342 でライブ-染色されました。人間の血管新生単球サブポピュレーションは CD16 の表面の式によって識別されました。スケール バー = 30 μ m.ファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください。
補足の映画 5: tnf 単球サブポピュレーションの募集の基底の平面で表示α-螢光を活性化します。拡大図は、単球サブポピュレーション流動場下における tnf α 活性化血管内皮への流れの同時募集の基底の平面で。CMFDA 螢光染色し、単球の核は、ヘキスト 33342 でライブ-染色されました。人間の血管新生の単球 (HPMo) の亜種は CD16 の発現によって識別されます。スケール バー = 30 μ m.ファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください。
補足映画 6: tnf 単球サブポピュレーションの募集の頂面ビューα+ VEGFA 活性化血管内皮。拡大図は、単球サブポピュレーションを流動場下における tnf α + VEGFA アクティブ螢光流の同時募集の頂面で。CMFDA 螢光染色し、単球の核は、ヘキスト 33342 でライブ-染色されました。人間の血管新生単球 subpopulation は CD16 の発現によって識別されます。スケール バー 30 μ m =このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
補足の映画 7: tnf 単球サブポピュレーションの募集の基底の平面で表示α+ VEGFA 活性化血管内皮。拡大図は、単球サブポピュレーションを流動場下における tnf α + VEGFA アクティブ螢光流の同時募集の基底の平面で。CMFDA 螢光染色し、単球の核は、ヘキスト 33342 でライブ-染色されました。人間の血管新生の単球 (HPMo) の亜種は CD16 の発現によって識別されます。スケール バー 30 μ m =このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
単球サブポピュレーションが炎症血管内皮膜を通して生まれ変わる方法の研究を詳述した手法を報告する.議論の方法は、位相差顕微鏡検査、また、単球の流れ3,11,19の下で採用を検討するものです代わりに共焦点顕微鏡を使用しました。タイムラプス イメージング用共焦点顕微鏡を使用しての主な利点の 1 つは、輪廻と単球の接着力が強力との間を明確に判別する能力です。位相差顕微鏡ベース方法は堅牢なも、転生の細胞と強く付着細胞との混同を避けるために専門知識が必要です。この場合、1 つは単球採用カスケードのこれらの 2 つの状態間の明確な違いを作るために分析のための厳格な基準を確立する必要があります。また、位相差顕微鏡で観察する世界の動向を確認するために、共焦点顕微鏡によるエンドポイント解析を行うことが重要ですも。したがって、単球の流れの下で採用を検討する共焦点顕微鏡の直接使用は、キャプチャされた単球の実際輪廻状態で明確な結果を提供します。
白血球動員を実行の主要なボトルネックの 1 つは流れの下で試金分析を実行し、キャプチャから細胞の接合を介して輪廻する個々 のセルを追跡する時間を過ごしたは位相差顕微鏡を使用して.このような分析の自動化は、可能ですが、クロールと転生の球間の位相差の類似のために行うことは困難です。ここで紹介は共焦点顕微鏡を用いた単球輪廻が血管内皮細胞が血管内皮下に transmigrated 単球の形状に対応する基底の平面に染色の廃止に伴っていた。この位置は、直交射影によって確認されました。傍細胞輪廻を示す細胞接合間で排他的に単球の局在化の移行が発生しました。これは、ことを示した流動場下における in vitro における単球が血管内皮3,18傍細胞経路を介して排他的生まれ変わる当社の以前のデータと一致。ここでは、手法を補完するために、単球輪廻 (transcellular 対傍細胞) の潜在的なサイトを描くために VE カドヘリン、込み合い、または PECAM1 などの付着蛋白に対する抗体を非ブロッキングを使用することは。単球の核を取り巻く黒い図形が転生セルおよびソフトウェアによって検出可能なことができる単純なイベントの強力な特性であるを確認しました。手動細胞カウント システムは、ここで示されても、白血球の核の周りの黒の形の形成は自動解析して, このように多くの時間を節約で白血球の輪廻を定義する使用できる基準です。このような分析の自動化されたアプリケーションの開発に取り組んでいます。
蛍光と共焦点顕微鏡は、白血球動員の研究で以前使用されました。しかし、彼らは異なる母集団の募集を同時に調査する使用されませんでした。ここで共焦点顕微鏡を使用して同時に同じ微小環境における白血球サブタイプの採用を研究する方法を提案する.同時に異なる単球サブポピュレーションの渡り鳥の行動を調査するため、共焦点顕微鏡を使用ことができますを紹介します。例として、炎症性の異なる 2 つの集団の移住能力を研究するために血管新生と血管新生以外の球を区別する CD16 式を使いました。共焦点顕微鏡のモダリティを使用して、私たちの最近の出版物で一貫したあることを示した CD16 の移住率+単球が血管内皮細胞単層は、tnf α3のみによって刺激されたとき低かった。しかし、tnf α と VEGFA の組み合わせは単球の血管新生の輪廻の増加につながった。移住率が高かった同様に非血管新生 CD16 両方の炎症性条件の下で-単球。我々 は以前に単球は抗 CD16 抗体染色では、輪廻転生に重大な影響は提示しなかった後を確認するこのラベル単球の解析による輪廻アッセイ共焦点顕微鏡3を使用しています。ただし、新しい白血球サブタイプの抗体は、それらをマークするために使用、ラベリングの効果を評価する必要があります。このメソッドを使用すると、白血球の 3 つの異なる集団まで同時に学べる。これは、機能的に異なるまたは類似の免疫細胞の種類の集団かもしれません。ここでの焦点は、単球輪廻には、その募集の他のステップも取り込んで回遊方向性など、輪廻転生する前にセルの動作を含む、このメソッドによって分析できます。Abluminal 保持など逆輪廻後輪廻のイベントは、このメソッドの拡張機能として異なる白血球ポピュレーションの調べることが。1 つの制限は、タイムラプス イメージングだけでなく、z の解像度を減らす蛍光信号のいくつかのあふれ遠チャネルで染色の検出が困難です。これは主に共焦点イメージングのための器具に関連しました。画像デコンボリューション法の使用は、画像品質を改善し白血球動員の別の手順の分析を進める最終的に助けることができます。
白血球の最適な条件の下で採用を検討するには、単層の内皮細胞の活性化状態を確認することが重要です。確かに、内皮細胞の欠損の活性化は、単球接着と輪廻の地球規模の削減に します。血管内皮細胞の活性化は、ICAM1 など VCAM1 内皮細胞表面に接着分子の発現レベルを分析することによって確認できます。これらの接着分子を増やす必要があります些細の内皮細胞と比較してのレベルです。培養血管内皮を考えることができるこれらの内皮細胞の接着分子に変更しない場合、活性化しません。接着分子の発現レベルを評価すると、新生活の同じバッチを使用してさまざまな実験の間良好な定量制御が構成できます。ただし、これらの接着分子の発現レベルは、プライマリ文化 ICAM1 や VCAM1 のグローバルしきい値の考慮を限定する内皮細胞の間異なります。新生活などの血管内皮細胞の形の変化もその活性化の良い指標です。この後者の表現型の変化により血管内皮活性化の迅速かつ定性的な評価です。ただし、接着分子の解析では、炎症性サイトカインの活性化時に主要な形状変化を表示しない微小血管の細胞のより良い選択肢があります。
機構学 VCAM1 ICAM1 や白血球表面など白血球機能関連抗原 (LFA)-1 の内皮細胞の接着分子抗体を用いた単球輪廻の関連のネガティブ コントロールを実行できます。関連する否定的な制御の使用は、セル表面の Fc 受容体を表現しており単球でこのような解明のため不可欠です。単球分離後の純度も他の白血球ポピュレーション ・単球輪廻のレートの過小評価による汚染を避けるために、重要です。もう一つの重要なパラメーターは、すべての実験的観測が関連することを確認するためにすべての試金のための 37 ° C に設定してそれに応じてにひと生体内で細胞が人身売買を翻訳する必要がある温度です。
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Disclosures
著者は競合する金融興味を持ってないです。
Acknowledgments
博士ポール ブラッドは、原稿を読むとフィードバックを感謝いたします。A. S. デマンドレギュレーター サー ジュールとげ慈善海外信用、財政支援を受けてください。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture Flasks 75 cm2 | TPP | 90076 | Routine culture of isolated HUVEC |
| µ-Slide VI 0.4 | IBIDI | 80606 | |
| Centrifuge Tubes 15 mL | TPP | 191015 | |
| Centrifuge Tubes 50 mL | TPP | 191050 | |
| Collagen G | Biochrom | L 7213 | For coating of cell culture flasks |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | 1393 | For coating of cell culture flasks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 3-Way Stopcocks | BIO-RAD | 7328103 | |
| penicillin 10,000 μ/mL streptomycine 10,000 μg/mL fungizone 25 μ/mL | AMIMED | 4-02F00-H | |
| Collagenase type 1 | Worthington | LS004216 | |
| Medium 199 1x avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes | GIBCO | 22340020 | |
| Bovine Albumin Fraction V | ThermoFisher | 15260037 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement, 150 mg | Millipore | 02-102 | |
| Heparin Sodium | Sigma-Aldrich | H3149RT | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H6909 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A 4544 | |
| EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O | APPLICHEM | A2937.0500 | |
| CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC | Miltenyi Biotech | 130-100-713 | AB_2655150 |
| CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-807 | AB_2657280 |
| Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC | Miltenyi Biotech | 130-107-016 | AB_2653263 |
| BD Accuri C6 Plus | BD Bioscience | ||
| µ-Slide I Luer | IBIDI | 80176 | |
| CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | ThermoFisher | C2925 | |
| Recombinant human TNFα | Peprotech | 300-01A | |
| Recombinant human VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
| NE-1000 Programmable Syringe Pump | KF Technology | NE-1000 | |
| Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-519 | AB_2655051 |
| Pan Monocyte Isolation Kit, human | Miltenyi Biotech | 130-096-537 | |
| Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE | Miltenyi Biotech | 130-106-762 | AB_2655403 |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | ThermoFisher | H1399 | |
| Silicone tubing | IBIDI | 10841 | |
| Elbow Luer Connector | IBIDI | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | IBIDI | 10823 | |
| Luer Lock Connector Female | IBIDI | 10825 | |
| In-line Luer Injection Port | IBIDI | 10820 | |
| Ar1 confocal microscope | Nikon | ||
| 40x objective | Nikon | 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm | |
| ImageJ Software | NIH |
References
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