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Immunology and Infection

Estudio simultáneo de la contratación de las subpoblaciones de monocitos bajo flujo In Vitro

Published: November 26, 2018 doi: 10.3791/58509
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 3
1Hematology service, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva, 2Department of Pathology and Immunology, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva, 3Department of Cell Physiology and Metabolism, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva

Summary

Aquí, presentamos un protocolo integrado que mide la subpoblación de monocito tráfico bajo flujo in vitro por el uso de marcadores de superficie específicos y microscopía de fluorescencia confocal. Este protocolo puede utilizarse para explorar medidas de reclutamiento secuencial así como a otros subtipos de leucocitos usando otros marcadores de superficie específicos del perfil.

Abstract

El reclutamiento de monocitos de la sangre a los tejidos periféricos específicos es fundamental para el proceso inflamatorio durante la lesión tisular, desarrollo de tumores y enfermedades autoinmunes. Esto se facilita a través de un proceso de captura de flujo libre en la superficie luminal de las células endoteliales activadas, seguido por su migración de adherencia y transendothelial (transmigración) a los tejidos subyacentes afectados. Sin embargo, no se entienden los mecanismos que soportan la contratación preferencial y contextual de las subpoblaciones de monocitos. Por lo tanto, hemos desarrollado un método que permite la contratación de las subpoblaciones de monocitos diferentes para visualizar y medir bajo flujo simultáneamente. Este método, basado en la proyección de imagen confocal Time-lapse, permite la distinción inequívoca entre adherentes y transmigrated monocitos. Aquí, describimos cómo se puede utilizar este método para estudiar simultáneamente la cascada de reclutamiento de monocitos pro-angiogénica y no angiogénico in vitro. Además, este método se puede ampliar para estudiar las distintas etapas de la contratación de un máximo de tres poblaciones de monocitos.

Introduction

Monocitos constituyen un componente fagocitario de la inmunidad innata que es esencial para la lucha contra patógenos, limpieza de los tejidos dañados, angiogénesis y la fisiopatología de muchas enfermedades incluyendo cáncer1,2,3 . Los monocitos son células derivadas de médula ósea, compuestas de subpoblaciones heterogéneas que circulan en la sangre pueden ser reclutadas en el sitio de la inflamación en tejido periférico a través de mecanismos moleculares específicos. Las cascadas de reclutamiento de monocitos, en cuanto a los leucocitos en general, implica diversos pasos incluyendo captura, rodar, gatear, detención, migración transendothelial (transmigración) y migración a través de la pared del vaso (la membrana del sótano y mural células)4. Estos pasos consisten principalmente en inflamación inducida por moléculas en la superficie luminal endotelial selectinas ligandos de glicoproteína, quimiocinas, moléculas de adhesión intercelular y junctional, y sus receptores en los leucocitos como ligandos de selectina y las integrinas. Vías de tráfico a través de las uniones celulares endoteliales (paracelular) o a través del cuerpo de la célula endotelial (transcelular) pueden utilizarse por los leucocitos para atravesar la barrera endotelial5. Mientras que los monocitos se han documentado históricamente a transmigrada a través de la ruta transcelular, se han propuesto posibles divergencias en su camino migratorio como monocitos ya no se consideran una población celular homogénea. Ahora resulta claro que la diversidad de monocitos puede ser definido por cada una de sus diferencias y similitudes, con respecto a su extravasación distintivo cascadas3,6. Por lo tanto, para discriminar claramente entre subpoblaciones de monocitos, es fundamental visualizar y fenotipo el comportamiento de cada una de estas subpoblaciones diferentes durante la contratación del proceso.

Monocitos de humano, cerdo, rata y ratón se subdivide en subpoblaciones fenotípicas con ciertas funciones adscrito y comportamientos migratorios específicos7,8,9. Por ejemplo, en los seres humanos, los monocitos pueden dividirse en tres subconjuntos basados en su superficial expresión de CD14, un correceptor para lipopolisacárido bacteriano y CD16, receptor Fc gamma III. Subpoblaciones de monocitos humanos incluyen CD14 clásico+CD16-, intermedio CD14+CD16+ y no clásica CD14dimCD16 células de+ 6,9. El CD14 clásico+CD16– monocitos fueron demostrados para ser principalmente inflamatorias mientras que la piscina de CD16+ monocitos encontraron colectivamente presentar TIE2 expresión proangiogénico función10. Constantemente, la estimulación de células endoteliales con las citoquinas inflamatorias tales como necrosis del tumor humano factor α (TNF) o la interleucina (IL-1) beta (inflamación convencional) sea suficiente para la completa captación de CD14 clásico+CD16 – monocitos. Sin embargo, son necesarias para provocar la transmigración de la CD16 acciones simultáneas de A factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y TNFα (inflamación impulsado por factores angiogénicos)+ piscina proangiogénico de monocitos3. Históricamente, el sistema tradicional de Transwell bajo condiciones estáticas, la cámara de flujo paralelo de la placa y las cámaras de flujo μ diapositiva se han utilizado para analizar cuantitativamente el reclutamiento de la población de un leucocito en un tiempo en vitro11 ,12,13. Mientras que estos protocolos se han validado, un método más robusto que permite el análisis simultáneo de varias subpoblaciones de monocitos se consideraría más perspicaz. Esas metodologías deben cuenta para múltiples interacciones y las diferentes frecuencias de cada población respectiva y también proporcionar una comprensión mecanicista de las similitudes y especificidades para las cascadas de reclutamiento que definen cada monocito subconjunto.

Aquí, presentamos un método basado en la proyección de imagen de Time-lapse de reclutamiento de monocitos bajo flujo que permite las cascadas migratorias de subpoblaciones de monocitos diferentes a estudiar simultáneamente mediante el uso de microscopia confocal. Este método integra ciertas características que imitan la inflamación endotelial de la célula, así como la hemodinámica de la circulación de monocitos en vénulas post-capilares, la principal situación de reclutamiento leucocitario en vivo. El método propuesto utiliza células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), que se generan a través de un protocolo bien establecido de aislamiento de cordón umbilical humano. Este recurso clínico tiene la ventaja de ser fácilmente disponibles como subproductos biológicos, mientras que también proporciona un rendimiento razonable de las células endoteliales que pueden ser aisladas de la vena umbilical. También utilizamos tintes fluorescentes y la inmunofluorescencia para distinguir entre los diferentes componentes celulares y la microscopia confocal para definir inequívocamente monocito posicionamiento (luminal y abluminal) con el tiempo. El protocolo que presentamos ha sido desarrollado para medir simultáneamente los niveles de la transmigración de las subpoblaciones de monocitos. Por otra parte, cabe señalar que esta metodología puede ampliarse para estudiar otras subpoblaciones de leucocitos y procesos de selección por medio de diferentes biomarcadores y etiquetado.

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Protocol

Materiales humanos fueron utilizados con el consentimiento informado de los donantes voluntarios y de acuerdo con el suizo comités de ética en investigación clínica.

1. aislamiento y congelación de Umbilical humano vena las células endoteliales (HUVEC)

  1. Añadir 5 mL de solución de recubrimiento a un matraz T75 (0,1 mg/mL G de colágeno y gelatina de 0.2% en tampón fosfato salino PBS a pH 7.4) durante 30 min a 37 ° C antes de iniciar el aislamiento de HUVEC.
  2. Limpiar el cordón con PBS, limpie con compresas estériles y colocarlo en un estéril 20 cm plato de Petri. Cortar los extremos del cordón con una tijera estéril.
  3. Identificar una sola vena grande y las dos pequeñas arterias. Suavemente, inserte una cánula con una llave de paso de tres vías que se le atribuye en las extremidades de la vena en los extremos del cable.
  4. Apriete el cable y la conexión de la cánula con una longitud de cable.
  5. Inundar el cable dos veces con 20 mL de Medio RPMI con 100 U/mL de penicilina, estreptomicina U/mL 100 y 250 ng/mL de anfotericina B para lavar las venas del cordón. Este proceso hace que la aparición de la cuerda más blanca y más clara. Vaciar la vena antes además de colagenasa recogiendo el RPMI con una jeringa en un extremo.
  6. Perfusión en la vena con 12 mL de 1 mg/mL colagenasa tipo I (0.22 μm filtrado).
  7. Cierre la llave de paso del cable termina e incubar el cable a 37 ° C durante 12 minutos.
  8. Masajee suavemente el cable para separar las células endoteliales de la luz de la vena.
  9. Tomar 30 mL de RPMI con 10% de suero fetal de becerro con una jeringa de 50 mL y conecte un extremo del cordón umbilical.
  10. Conecte una jeringa de 50 mL vacía al otro extremo del cordón umbilical
  11. Abra la llave de paso y perfusión la vena de un extremo mientras que recogiendo recíprocamente desde el otro extremo.
    Nota: La suspensión recogida contiene las células endoteliales.
  12. Centrifugar esta suspensión de células a 200 x g durante 5 minutos.
  13. Deseche el sobrenadante y resuspender el sedimento celular con 10 mL de medio completo de M199 (M199 suplementos que contengan 20% FCS, crecimiento de células endoteliales de 15 μg/mL 100 μg/mL heparina sódica, hidrocortisona μm 0.5, ácido L-ascórbico de 10 μg/mL, 100 U/mL de penicilina, 100 U/mL estreptomicina y 250 ng/mL anfotericina B).
  14. Retirar la solución de recubrimiento del frasco T75 y enjuague una vez con PBS.
  15. Semilla de las células recogidas de paso 1.13 en el matraz T75 y colóquelo en la incubadora a 37 ° C con 5% CO2.
  16. Al día siguiente, enjuagar el matraz 3 veces con el medio M199 completo para eliminar eritrocitos residuales y luego cambiar el medio cada 2 días hasta confluencia.
  17. En 80-90% de confluencia, lavar la monocapa HUVEC una vez con 5 mL de PBS y separar las células con 5 mL de tripsina 0,05% en 1 mM EDTA a 37 ° C por 5 minutos agregar 4 mL de M199 y 1 mL de FCS para detener la acción de la tripsina. Lave el matraz para separar HUVEC todos.
  18. Recoge una alícuota de 50 μl se utiliza para la tinción de VE-cadherina, PECAM-1 y gp38 y analizar mediante citometría de flujo para verificar pureza HUVEC.
  19. Recoger el resto de HUVEC de paso 1.18 en un tubo de 15 mL y centrifugar a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  20. Desechar el sobrenadante del paso 1.19, Resuspender el precipitado de células en solución (FCS que contiene 10% DMSO) para congelar a una densidad de 5 x 105 células/mL en criotubos y congelar a-80 ° C o en nitrógeno líquido hasta su utilización.
  21. Para comprobar la pureza HUVEC:
    1. Añadir 1 μl de anticuerpo anti-humana VE-cadherina-FITC, 1 μl de anticuerpo anti-humana PECAM1 PE y 1 μl de anticuerpo anti-humana Podoplanin-APC a la alícuota de 50 μl de HUVEC en paso 1.18.
    2. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
    3. Añada 100 μl de PBS y centrifugar a 400 x g durante 30 s.
    4. Deseche el sobrenadante y resuspender en 100 μl de PBS. Datos pueden ser adquiridos ahora por técnicas de citometría de flujo.
      Nota: HUVEC son positivos para VE-cadherina y PECAM-1 y negativos para Podoplanin.

2. HUVEC descongelación

Nota: Uso HUVEC en paso bajo para los experimentos (máximo 5 pasos).

  1. Capa un T75 frasco con 1 mL de la solución de recubrimiento a 37 ° C durante 30 minutos.
  2. Rápidamente descongelar HUVEC a 37 ° C por 2 min y resuspender las células en 10 mL de M199 completa.
  3. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante.
  4. Resuspender el precipitado de células en 10 mL de M199 completa.
  5. Transferir la suspensión de células en el frasco previamente revestido. Coloque el frasco en el incubador a 37 ° C con 5% CO2. Cambiar el medio de cultivo celular cada 2 días.

3. HUVEC cultura en 0,4 μ diapositiva cámara

  1. Cinco días antes de comenzar el experimento de flujo, la capa de las cámaras de una diapositiva de 0,4 μ con 30 μl de PBS con un 0.1 mg/mL de colágeno G, gelatina 0,2% a 37 ° C por 30 min.
  2. Lavar las cámaras con 100 μl de PBS.
  3. Separar las células de un 80-90% HUVEC confluentes de un frasco de T75.
  4. Enjuague HUVEC con 5 mL de PBS y separar con 5 mL de tripsina 0,05% a 37 ° C durante 5 minutos.
  5. Lavar y recoger la suspensión celular en M199 completa y contar las celdas por el método más conveniente. Centrifugue a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  6. Resuspender el precipitado de células 106 células/ml y distribuir 30 μl (30.000 células) por cámara.
  7. Incubar las células en una incubadora a 37 ° C con 5% CO2 para 1 h.
  8. Añadir 150 μL de M199 completa a cada cámara y de la cultura las células 5 días en la incubadora a 37 ° C y 5% CO2. Cambiar el medio cada 2 días.

4. HUVEC tinción para análisis de reclutamiento de monocitos bajo flujo

  1. Prepare el soporte de etiquetado de M199 y 1 μm de CMFDA (Diacetato de 5-chloromethylfluorescein) y caliente a 37 ° C durante 5 minutos antes de la célula etiquetado.
  2. HUVEC lavar dos veces con medio M199 calentado a 37 ° C.
  3. Reemplazar el medio con 30 μl de medio etiquetado calentado con 1 μm de CMFDA y colocar en la incubadora a 37 ° C y 5% CO2 durante 10 minutos.
  4. Lavar una vez con M199 completa e incubar las células con M199 completa en la incubadora a 37 ° C y 5% CO2 durante 30 minutos.
    Nota: Es importante eliminar todos los rastros de suero antes de la adición de la solución de etiquetado, de lo contrario puede alterar HUVEC tinción.
  5. Reemplazar el medio con M199 completa que contiene o TNFα humano (500 U/mL) o una mezcla de TNFα humano (500 U/mL) con humano VEGFA (1 μg/mL) durante 6 h en una incubadora a 37 ° C y 5% CO2.

5. aislamiento de monocitos humanos Pan y tinción de las subpoblaciones

  1. Use una capa buffy de la sangre humana concentrada, o 20 mL de sangre humana recién aislado, recogido en el día del experimento en tubos vacutainer con EDTA.
  2. Diluir la sangre en PBS-1 mM EDTA (1:1) y pipetar suavemente 20 mL de la sangre diluida en 20 mL de medio de gradiente de densidad. Centrifugar a 400 x g durante 30 min a temperatura ambiente con una aceleración lenta y sin freno.
  3. Recoger las células mononucleares de sangre periférica (PBMC)-capa de plaquetas (entre medio de gradiente de densidad y capas de plasma) en un nuevo tubo de 50 mL que contiene 40 mL de PBS - 1 mM EDTA. Superior a 50 mL con PBS - 1 mM EDTA.
  4. Centrifugue a 200 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos eliminar el sobrenadante.
  5. Resuspender el pellet celular con 10 mL de tampón de tinción (PBS - 1 mM EDTA con 0.5% albúmina de suero bovino BSA).
  6. Centrifugue a 200 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos eliminar el sobrenadante.
  7. Repita los pasos 5.5 y 5.6.
  8. Resuspender el pellet celular con 10 mL de tampón de tinción. Tomar una alícuota de 10 μl de una cuenta de célula.
  9. Controlar las poblaciones de PBMC y contar las células rápidamente con un citómetro de flujo.
    Nota: Las poblaciones de linfocitos y monocitos característica pueden observarse (figura 1A). De 50 mL de sangre humana fresca esperar sobre 50-100 x 106 PBMC.
  10. Para la contratación de CD14 + versus CD14-PBMC bajo flujo:
    1. Lavar el precipitado tres veces con tampón de flujo (M199 con 0,5% BSA) y resuspender las células mononucleares en el búfer de flujo en 6 x 106 células / mL.
    2. Hacer alícuotas de 200 μL para cada ensayo. Incubar a 37 ° C hasta 20 min antes del ensayo.
    3. Añadir 5 μl de anti-CD14-PE y Hoechst 33342 a una concentración final de 2 μm a cada alícuota. Mezcla e incubar a 37 ° C durante 10 minutos.
    4. Centrifugue la alícuota a 400 x g durante 30 s.
    5. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado con 200 μL de tampón de flujo.
  11. Para la contratación de las subpoblaciones de monocitos bajo flujo:
    1. Aislamiento de monocitos con un kit de aislamiento de monocitos de pan según las instrucciones del fabricante.
      Nota: El siguiente protocolo de aislamiento es de 50 x 106 células. Se pueden escalar hacia arriba o abajo siempre y cuando sea dentro de las recomendaciones del fabricante.
    2. Centrifugue la suspensión PBMC a 200 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos.
    3. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado con 400 μL de tampón de tinción.
    4. Añadir 50 μl de reactivo de bloqueo de los receptores Fc y 50 μl de anticuerpo monocito Pan cóctel.
    5. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
    6. Añadir 400 μL de coloración buffer y 100 μl de anticuerpo anti-biotina conjugado de bolas magnéticas. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
    7. Añadir 2 mL de tampón de tinción y utilizar una columna de LS MACS juntada con un imán.
    8. Coloque la columna de LS en el imán y añade 1 mL de tampón de tinción. Deseche el flujo a través.
    9. Pasar la suspensión PBMC en la columna y recoger el flujo claro aunque conteniendo pan monocitos en un nuevo tubo de 15 mL.
    10. Añadir el tampón de tinción para completar hasta 5 mL.
    11. Tomar una alícuota y comprobar la calidad del aislamiento de monocitos con un citómetro de flujo.
    12. Determinar el recuento de monocitos de pan.
      Nota: Población de monocitos sólo puede observarse (Figura 1B).
    13. Centrifugue el resto de los monocitos del paso 5.11.11 a 200 x g durante 5 minutos.
    14. Deseche el sobrenadante.
    15. Resuspender el precipitado de células en 5 mL de tampón de flujo (M199 con 0,5% BSA).
    16. Repita 5.11.13 al 5.11.14 dos veces para eliminar cualquier rastro de EDTA.
  12. Que suspensión de monocitos en flujo tampón (M199 con 0,5% BSA) 6 x 106 células/ml.
  13. Hacer alícuotas de 200 μL de monocitos para cada ensayo de reclutamiento.
  14. Mantener la alícuota a 37 ° C en la incubadora hasta 20 minutos antes de la inyección.
  15. Añadir 5 μl de anticuerpo anti-CD16-PE y Hoechst 33342 (final de 2 μm) a cada alícuota.
  16. Mezcla e incubar a 37 ° C durante 10 minutos.
  17. Centrifugue la alícuota a 400 x g durante 30 s.
  18. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado con 250 μl de tampón de flujo.
  19. Añadir 30 μl de la suspensión de monocitos en un compartimiento de la diapositiva para fijar los parámetros de adquisición en el microscopio confocal.
  20. Mantener las alícuotas de la suspensión del monocito de paso 5.18 a 37 ° C.
    Nota: Esta suspensión está lista para ser inyectado en el sistema de flujo.

6. preparación del sistema fluídico

  1. Asegúrese de que la incubadora de la célula para la proyección de imagen a 37 ° C.
    Nota: En la figura 2muestra un diagrama del sistema de flujo.
  2. Montar la parte de tubería I: Introduzca un macho del conector Luer a un extremo de un pedazo de tubo de silicona (8 cm largo y 3 mm de espesor) y conecte el otro extremo a un sistema de inyección en línea Luer. Conecte el segundo conector Luer a un pedazo de tubo de silicona (40 cm y 3 mm de espesor) en un extremo.
    Nota: Opcionalmente, un grifo de 3 vías conectado a una jeringa de 5 mL puede ser insertado entre el sistema de inyección Luer en línea y la silicona en tubo para la eliminación de burbujas de aire eventual.
  3. Montar la segunda parte de la tubería: Conecte una jeringa de 20 mL a un extremo de una longitud de tubo de silicona (1 m de largo y 3 mm de espesor). Inserte un macho del conector Luer en el otro extremo de la tubería.
  4. Conectar la parte I y parte tubo II mediante la inserción de los varones de conector Luer para un acople hembra de la cerradura de Luer (figura 2A).
  5. Coloque el extremo libre del tubo de silicona en el depósito que contiene el tampón de flujo (M199 + 0,5% BSA) calentado a 37 ° C.
  6. Tire el émbolo de la jeringa de 20 mL para llenar el tubo con tampón de flujo.
  7. Coloque la jeringa en la bomba y fijarlo.
  8. Coloque la bomba en retirar el modo (como opuesto a infundir) y especificar la velocidad de flujo.
  9. Determinar la velocidad de flujo según la diapositiva IBIDI utilizada mediante la siguiente fórmula:
    Equation
    Nota: El factor de deslizamiento es dependiente en la diapositiva IBIDI utilizada para el experimento. De la diapositiva de μ I0.4 Luer lock usado en este ejemplo, el factor de deslizamiento es 131.6. Para factores específicos diapositiva, vea el sitio web de empresa14. La viscosidad del tampón de flujo es dyn.s/cm 0.00722. Tensión de esquileo en las vénulas post capilares es 0,5 dyn/cm2.
  10. Conexión de la diapositiva (figura 2B):
    1. Sujete el tubo de silicona alrededor de la hembra Luer Lock acoplador y los dos machos de conector Luer Desconecte el acoplador.
    2. Conecte a los embalses de la diapositiva que contiene estimula HUVEC y llenar con medio. Evitar las burbujas de aire durante este paso.
    3. Quite las abrazaderas y asegurar que la conexión no tiene pérdidas.
  11. Coloque el portaobjetos en el microscopio de proyección de imagen de Time-lapse y arranque la bomba.

7. Time-lapse proyección de imagen de reclutamiento de monocitos bajo flujo por Microscopía Confocal

  1. Utilice un objetivo de 40 x (véase Tabla de materiales) para la proyección de imagen.
  2. Activar el 405 nm (azul monocitos núcleos), 488 nm (verdes células endoteliales) y 561 nm (rojo CD16 + subconjunto) láseres.
  3. Utilice la cámara que contiene a los monocitos para establecer los parámetros de adquisición.
    Nota: Para detectar los monocitos no transmigrated y transmigrated, el agujero de alfiler y la intensidad del láser 405 nm se encuentran alta. Por lo tanto, los monocitos no transmigrated son ligeramente visibles en el plan básico. Sin embargo solamente transmigrated monocitos presentan una superficie sin manchas alrededor del núcleo correspondiente al espacio ocupado por debajo de las células endoteliales.
  4. Coloque la cámara a ser adquiridos bajo el microscopio.
  5. Elija 3 campos de opiniones dentro de radio 1 cm para la proyección de imagen confocal de múltiples posiciones.
  6. Definir la basal y las partes apicales de las células endoteliales
  7. Establecer una pila de z al rango 10 – 12 μm (paso de 0.5 μm). Ejecute un time-lapse adquisición cada 1 minuto.
  8. Después de 3 minutos de la proyección de imagen, inyectar 200 μL de suspensión de monocitos (6 x 106 células/mL) a través del puerto de inyección en línea Luer.
    Nota: Rápidamente monocitos aparecen en el plano focal apical, se adhieren y empezar la transmigración (tránsito de la apical al basal plan).
  9. Imagen de al menos 30 minutos. Una vez terminado, deje la proyección de imagen y detener el flujo. Abrazadera de la tubería para desconectar de la diapositiva.
  10. Fijar la corredera con paraformaldehído al 4% a 4 ° C durante 10 minutos.
  11. Lavar el portaobjetos con PBS y guardar la diapositiva a 4 ° C para su análisis posterior si es necesario.

8. analizar los datos con ImageJ

  1. Contar el número de monocitos adherentes total en cada campo. Determinar el número de células por mm2.
  2. Cuenta transmigrated monocitos que están presentes en el plan básico por debajo de las células endoteliales e identificado por la presencia de un agujero negro (en el canal verde) alrededor del núcleo.
  3. Dividir la cuenta de leucocitos transmigrated por el número total de leucocitos adherentes. La tasa de transmigración se presenta como un porcentaje de monocitos adherentes.
  4. Para la ilustración, el apical y basales laterales pueden mostrar simultáneamente para ilustrar los acontecimientos que ocurren en cada uno de estos compartimentos endoteliales.

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Representative Results

Determinar el estado de activación de HUVEC inducida por el TNFα

La bio-actividad de las citoquinas inflamatorias TNFα puede variar según el lote y la reposición del ciclo de congelación-descongelación. Es importante comprobar el estado de activación de HUVEC con tratamiento de TNFα. Esto podría realizarse mediante tinción en paralelo algunas muestras de HUVEC confluente para la inducción inflamatoria de selectinas, ICAM-1 y VCAM-115,16,17. Una manera más fácil y más simple para comprobar el estado de activación de HUVEC después del tratamiento del TNFα es el cambio morfológico de células endoteliales bajo estrés inflamatorio. Como se muestra en la figura 3, HUVEC alargar después de 6 h en presencia de TNFα en comparación con las células sin estimular. Alargamiento similar se observa cuando HUVECs son estimulados por una mezcla de TNFα y VEGFA. Registrar el estado de activación de HUVEC es importante como los resultados finales de la transmigración de los monocitos dependerá de la calidad de la activación de células endoteliales.

Transmigración de monocito hace una discontinuación característico en las células endoteliales

Para estudiar la transmigración monocitos bajo flujo, utilizamos microscopía confocal con células endoteliales teñidas en verde con CMFDA y los núcleos de aislado monocitos teñidos en azul con el colorante Hoechst 33342 permeable a la célula (figura 4). La proyección de imagen confocal Time-lapse permite la visualización de los monocitos en el plano apical, donde su fenotipo podría ser evaluado (Figura 4A-C, suplemento 1 de la película). Migración de las células que experimentan la transmigración se trasladó al espacio intercelular correspondiente a las ensambladuras de la célula antes de que desaparecieron desde el plano apical y aparecieron en el plano basal. Las células transmigrated presentan un agujero negro alrededor del núcleo correspondiente a las formas de monocitos. Esta forma cambiada constantemente durante la migración de monocitos por debajo de las células endoteliales (Figura 4A-C, películas suplementario 2-3). Esta dinámica agujero negro por el cuerpo de monocitos por debajo de las células endoteliales y el posicionamiento del monocito, permitió la identificación inequívoca de células transmigrated. Cuantificación de reclutamiento de monocitos con el tiempo demostró la adherencia de monocitos seguida de transmigración (figura 4-E). Aunque pueden extravasate leucocitos a través de rutas el transcelular y la paracelular, sólo pudimos observar la transmigración paracelular bajo flujo con este método. Esto es consistente con nuestras observaciones anteriores3,11,18,19.

Factor angiogénico por inflamación promueve la transmigración de CD16 + monocitos

Mediante este método, se analizó la transmigración de proangiogénico humana versus no-angiogenic monocitos a través de una monocapa endotelial estimulado por las citoquinas inflamatorias TNFα solo o en combinación con el factor angiogénico VEGFA. Monocitos humanos proangiogénico pueden identificarse por la expresión de CD16 o TIE2 en su superficie. Aquí, anticuerpo anti-CD16-PE fue utilizado para discriminar entre pro y no angiogénico monocitos. Como se muestra en la figura 5A-B (suplemento películas 4-5), la tasa de transmigración de CD16+ monocitos era baja cuando las células endoteliales fueron estimuladas con TNFα sólo. Sin embargo, esta tasa aumenta cuando las células endoteliales se estimularon simultáneamente con TNFα y VEGFA (figura 5-E, películas complementaria 6-7). La tasa de transmigración de monocitos no angiogénico fue igualmente alta en ambas condiciones inflamatorias. Para ambas subpoblaciones de células, la transmigración se produjo exclusivamente a través de la ruta paracelular. Este método permite por lo tanto las aptitudes de transmigración de diferentes poblaciones monocytic a ser investigados simultáneamente.

La pureza de los monocitos afecta a la eficacia de la transmigración

Las células mononucleares de sangre periférica se componen de células T, células B, células NK y monocitos. El método de aislamiento de monocitos aquí requiere el agotamiento de las otras poblaciones de leucocitos de PBMC. Para entender cómo la falta de pureza de los monocitos afecta los resultados, se utilizan PBMCs y teñido para pan-monocitos con un anticuerpo anti-CD14-PE antes de realizar el ensayo de reclutamiento bajo flujo. Como se muestra en la figura 6, estimulación de HUVEC con TNFα o TNFα + VEGFA inducida por la transmigración de sólo la población de monocitos. Los otros leucocitos componen de células T, células B y las células NK no transmigrada TNFα o TNFα + VEGFA. De hecho, se ha documentado que estos leucocitos tienen otras señales de transmigración. Así, un ineficiente aislamiento de monocitos dará lugar a una subestimación de la transmigración de los monocitos, como los otros leucocitos contará como monocitos. Esto conduciría a un resultado erróneo en la transmigración del monocito, debido a la contaminación de la población de monocitos con otros leucocitos.

Figure 1
Figura 1: Perfil de los monocitos aislados mediante citometría de flujo. (A) análisis de la morfología de PBMC antes de depleción linfocítica. El tamaño (forward scatter: FSC) y nivel de detalle (dispersión lateral: SSC) de la sangre periférica células mononucleares fueron determinadas por citometría de flujo. (B) el tamaño y granularidad de monocitos aislados se determinaron mediante citometría de flujo después de la depleción linfocítica. Un eficiente aislamiento de monocitos muestra un agotamiento total de la población de linfocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: diagrama del sistema neumático de. (A) Descripción esquemática del sistema de perfusión antes y después de la conexión de la diapositiva y el montaje de la bomba de jeringa. (B) diagrama del proceso de conectar la diapositiva con el tubo con abrazaderas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: comprobación de la activación eficaz de las células endoteliales. La activación de HUVEC por estímulos inflamatorios se comprobó mediante el análisis de la forma de la célula mediante microscopía de contraste de fase. Después de 6 horas de tratamiento, HUVEC presentan una morfología alargada al ser estimulados con TNFα (500 U/mL) o una mezcla de TNFα (500 U/mL) + VEGFA (1 μg/mL) en comparación con las células sin estimular. Este cambio morfológico de HUVEC tras el estímulo inflamatorio es un indicador de fácil detección de la activación de la célula, que debe garantizarse para el análisis del flujo. Barra de escala = 120 μm haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: identificación de los monocitos transmigrated por microscopia confocal. (A) diagrama de transmigración de monocitos con el esperado vistas en planos apicales y basals. Los núcleos de monocitos teñidos con Hoechst 33342 se representan en azul, y las formas teóricas de monocitos se representan con líneas punteadas alrededor de los núcleos. En la vista basal, aparecen los monocitos planos transmigrated a ocupar un espacio por debajo de la célula endotelial. Este espacio aparece como un agujero negro que rodea el núcleo del monocito en imágenes confocales. (B) localización de un monocito antes y después de la transmigración. Se muestran las vistas ortogonales, y se observa la aparición de un agujero negro (delineado con la línea discontinua blanca) después de la migración de monocitos en el compartimiento endotelial abluminal. Una flecha roja indica la posición de un monocito antes de transmigración y la punta de flecha blanca indica la misma célula después de la transmigración. Las vistas ortogonales muestran que el monocito transmigrated está por debajo de la célula endotelial. Barra de escala = 40 μm. (C) lapso de tiempo secuencias de imágenes (de 0 a 20 minutos) de tiempo extra de reclutamiento de monocitos. Se muestran las vistas apicales y basales. Las secuencias completas pueden verse en suplementario películas 1, 2 y 3. Cuadrados rojos destacan un monocito transmigrated con un núcleo azul. El agujero negro correspondiente al plano cuerpo de monocitos por debajo de la célula endotelial está delineado por una línea amarilla discontinua. Barra de escala = 40 μm. (D) cuantificación de la adhesión de monocitos a estimulado por el TNFα versus sin estimular HUVEC con el tiempo. (E) cuantificación de la tasa de transmigración de monocitos con el tiempo. N = 3 réplicas biológicas. Los datos se presentan como media ± D.E. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: investigación simultánea de la transmigración de las subpoblaciones de monocitos bajo flujo de. Secuencias de lapso de tiempo de imagen (A) (de 0 a 20 min) del reclutamiento de monocitos proangiogénico (CD16+) y monocitos no angiogénico en el tiempo a través de HUVEC activado por el TNFα. Barra de escala = 40 μm; se muestran las vistas apicales y basales. Las secuencias completas pueden verse en suplementario Movie 4 para apical y suplementario Movie 5 opiniones basal. (B) cuantificación de la transmigración de los monocitos humanos proangiogénico (HPMo: CD16 +) y no angiogénico humana monocitos (HNMo) a través de una monocapa HUVEC activado por el TNFα. N = 4 réplicas biológicas, los datos se presentan como media ± D.E. * p < 0.05; Prueba de Mann-Whitney. (C) imagen Time-lapse secuencias (de 0 a 20 min) del reclutamiento de monocitos proangiogénico y no angiogénico horas extras a través de HUVEC TNFα + VEGFA activado. Barra de escala = 40 μm; se muestran las vistas apicales y basales. Las secuencias completas pueden verse en 6 película suplementario para apical y suplementario película 7 opiniones basal. (D) cuantificación de la transmigración de los monocitos humanos proangiogénico (HPMo: CD16 +) y los monocitos humanos no angiogénico (HNMo: CD16-) a través de la monocapa HUVEC TNFα + VEGFA activado. N = 4 réplicas biológicas, los datos se presentan como media ± D.E. * p < 0.05; Prueba de Mann-Whitney. (E) localización de CD16+ monocitos antes (10 minutos) y después de la transmigración (15 min) a través de HUVEC TNFα + VEGFA estimulado. Se muestran las vistas ortogonales. Barra de escala = 40 μm haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Investigación simultánea de la transmigración de CD14 + versus CD14 - PBMC bajo flujo. (A) adhesión de CD14+versus CD14– PBMC a HUVEC TNFα activado bajo flujo. (B) adhesión de CD14+versus CD14– PBMC a HUVEC TNFα + VEGFA activado bajo flujo. Transmigración (C) tasa (%) de CD14+versus CD14– PBMC con HUVEC TNFα activado bajo flujo. Transmigración (D) tarifa (%) de CD14+versus CD14– PBMC con HUVEC TNFα + VEGFA activado bajo flujo. Datos son medias ± D.E. de N = 4 réplicas biológicas. * p < 0.05; Prueba de Mann-Whitney. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Suplementario 1 película: vista en el plano apical de reclutamiento de monocitos pan bajo flujo de. Vista ampliada del reclutamiento de monocitos pan bajo flujo en el plano apical. HUVEC fueron manchados con CMFDA y los núcleos de monocitos eran vivir-teñidos con Hoechst 33342. Barra de escala = 50 μm haga clic aquí para descargar este archivo.

Suplementario Movie 2: ver en el plano basal de reclutamiento de monocitos pan bajo flujo de. Vista ampliada del reclutamiento de monocitos pan bajo flujo en el plano basal. HUVEC fueron manchados con CMFDA y los núcleos de monocitos eran vivir-teñidos con Hoechst 33342. Barra de escala = 50 μm haga clic aquí para descargar este archivo.

Complementaria 3 película: proyección máxima z-pilas de reclutamiento de monocitos pan bajo flujo de. Vista ampliada del reclutamiento de monocitos pan bajo flujo como se muestra en suplementario películas 1 y 2. HUVEC fueron manchados con CMFDA y los núcleos de monocitos eran vivir-teñidos con Hoechst 33342. Barra de escala = 50 μm haga clic aquí para descargar este archivo.

Adicional 4 de la película: vista en el plano apical de la contratación de las subpoblaciones de monocitos a TNFα-activado HUVEC. Vista en el plano apical de la contratación simultánea de las subpoblaciones de monocitos bajo flujo se expandió a HUVEC TNFα activado bajo flujo. HUVEC fueron manchados con CMFDA y los núcleos de monocitos eran vivir-teñidos con Hoechst 33342. Subpoblaciones de monocitos humanos proangiogénico fueron identificadas por la superficial expresión de CD16. Barra de escala = 30 μm. haga clic aquí para descargar este archivo.

Suplementario película 5: vista en el plano basal de la contratación de las subpoblaciones de monocitos a TNFα-activado HUVEC. Vista ampliada, en el plano basal de la contratación simultánea de las subpoblaciones de monocitos bajo flujo a HUVEC TNFα activado bajo flujo. HUVEC fueron manchados con CMFDA y los núcleos de monocitos eran vivir-teñidos con Hoechst 33342. La subpoblación de monocitos (HPMo) proangiogénico humana fue identificada por la superficial expresión de CD16. Barra de escala = 30 μm. haga clic aquí para descargar este archivo.

Suplementario película 6: vista en el plano apical de la contratación de las subpoblaciones de monocitos a TNFα+ HUVEC VEGFA activa. Vista ampliada, en el plano apical, de la contratación simultánea de las subpoblaciones de monocitos bajo flujo a HUVEC TNFα + VEGFA activado bajo flujo. HUVEC fueron manchados con CMFDA y los núcleos de monocitos eran vivir-teñidos con Hoechst 33342. La subpoblación de monocitos humanos proangiogénico fue identificada por la superficial expresión de CD16. Barra de escala = 30 μm haga clic aquí para descargar este archivo.

Suplementario película 7: ver en el plano basal de la contratación de las subpoblaciones de monocitos a TNFα+ HUVEC VEGFA activa. Vista ampliada, en el plano basal de la contratación simultánea de las subpoblaciones de monocitos bajo flujo a HUVEC TNFα + VEGFA activado bajo flujo. HUVEC fueron manchados con CMFDA y los núcleos de monocitos eran vivir-teñidos con Hoechst 33342. La subpoblación de monocitos (HPMo) proangiogénico humana fue identificada por la superficial expresión de CD16. Barra de escala = 30 μm haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Aquí, Divulgamos un método que detalla un estudio de cómo transmigrada subpoblaciones de monocitos a través de la monocapa de endotelio inflamada. Utiliza el método discutido microscopia confocal en vez de microscopia de contraste de fase, que también se utiliza para el estudio de reclutamiento de monocitos bajo flujo3,11,19. Una ventaja importante del uso de la microscopia confocal para Time-lapse de imágenes es la capacidad de discriminar claramente entre la transmigración y la fuerte adhesión de monocitos. Aunque el método basado en la microscopía de contraste de fase también es robusto, requiere conocimientos para evitar mezclar células transmigrated y fuertemente adherente. En este caso, es necesario establecer criterios para el análisis con el fin de hacer una clara diferencia entre estos dos Estados de la cascada de reclutamiento de monocitos. Además, también es importante realizar un análisis de punto final mediante microscopía confocal para confirmar las tendencias mundiales observadas por el microscopio de contraste de fase. Así, el uso directo de la microscopia confocal para investigar reclutamiento de monocitos bajo flujo proporciona resultados claros sobre el estado real de transmigración de monocitos capturados.

Uno de los principales cuellos de botella en la ejecución de reclutamiento leucocitario ensayos de bajo flujo y utilizando un microscopio de contraste de fase es el tiempo para realizar el análisis y seguimiento de las células individuales de captura a transmigración a través de la ensambladura de la célula. Automatización de este análisis es posible pero difícil de realizar debido a las similitudes de contraste de fase entre monocitos transmigrated y rastreros. Aquí mostramos utilizando microscopía confocal que transmigración monocitos fue acompañada por una interrupción de coloración en el plano basal, correspondiente a la forma de los monocitos transmigrated debajo de HUVEC endotelial de la célula. Esta posición fue confirmada por la proyección ortogonal. La transición de la localización de monocitos se produjo exclusivamente entre las ensambladuras de la célula indicativas de una transmigración paracelular. Esto es consistente con los datos anteriores, que demostraron bajo flujo en vitro, monocitos transmigrada exclusivamente a través de la ruta paracelular con HUVEC3,18. Para complementar el método propuesto aquí, es posible utilizar no-bloqueo anticuerpos contra proteínas junctional como VE-cadherina, mermeladas o PECAM1 para imagen de los sitios potenciales de transmigración de monocitos (paracelular y transcelular). Hemos confirmado que las formas negras que rodean los núcleos de monocitos son una característica robusta de transmigrated células y un evento simple que puede ser detectable por el software. Aunque una célula manual sistema de conteo se demuestra aquí, la formación de la forma negro alrededor del núcleo del leucocito es un criterio que podría utilizarse para definir la transmigración leucocitaria en análisis automatizado, ahorrando mucho tiempo. Actualmente estamos trabajando en el desarrollo de una aplicación automatizada para dicho análisis.

Fluorescencia y microscopía confocal fueron utilizados previamente en el estudio de reclutamiento leucocitario. Sin embargo, no fueron utilizados para investigar la contratación de diversas subpoblaciones simultáneamente. Aquí proponemos una modalidad de uso de microscopía confocal para el estudio de la contratación de subtipos de leucocitos simultáneamente en el mismo microambiente. Mostramos que la microscopia confocal puede utilizarse para investigar simultáneamente el comportamiento migratorio de subpoblaciones de monocitos diferentes. Como ejemplo, hemos utilizado expresión de CD16 para discriminar entre monocitos proangiogénico y no angiogénico para estudiar la capacidad de la transmigración de las dos subpoblaciones en diferentes contextos inflamatorios. Consistente con nuestra reciente publicación, mediante el uso de la modalidad de microscopía confocal, hemos demostrado que la tasa de transmigración de CD16+ monocitos fue menor cuando la monocapa de células endoteliales fue estimulada sólo por TNFα3. Sin embargo, la combinación de TNFα y VEGFA condujo a un aumento en la transmigración de proangiogénico monocitos. La tasa de la transmigración era semejantemente alta para no angiogénico CD16 monocitos– en ambas condiciones inflamatorias. Previamente demostramos que el monocito tinción con los anticuerpos anti-CD16 no mostró efectos significativos sobre la transmigración, esto confirma por el análisis de monocitos sin etiqueta después del ensayo de transmigración, utilizando microscopía confocal3. Sin embargo, para nuevos subtipos de leucocitos o anticuerpos utilizados para marcarlos, el efecto etiquetado debe evaluarse. Usando este método, hasta tres distintas poblaciones de leucocitos pueden ser simultáneamente estudiadas. Esto podría ser las subpoblaciones que son tipos de la célula inmune funcionalmente distintas o similares. Aunque el foco aquí está en transmigración del monocito, otras medidas de su contratación pueden analizarse por este método, incluido el comportamiento de la célula antes de transmigración, como captura y direccionalidad campo-ciudad. Eventos la transmigración como retención abluminal y transmigración inversa también pueden ser investigados para las poblaciones de leucocitos diferentes, como una extensión de este método. Una limitación es la mala detección de la mancha en el canal far-red en proyección de imagen de Time-lapse, así como un excedente de las señales de fluorescencia que reducen la resolución z-stack. Esto se relaciona principalmente con el instrumento utilizado para la proyección de imagen confocal. El uso de la deconvolución de la imagen eventualmente podría ayudar a mejorar la calidad de imagen y permite más análisis de las etapas del reclutamiento del leucocito.

Para estudiar el reclutamiento leucocitario en condiciones óptimas, es importante comprobar el estado de activación de la monocapa de células endoteliales. De hecho, una deficiente activación de células endoteliales conduce a una reducción global en la adhesión de monocitos y transmigración. Activación de la célula endotelial puede comprobarse analizando el nivel de expresión de moléculas de adhesión en la superficie de la célula endotelial como ICAM1 y VCAM1. El nivel de estas adherencia moléculas deben ser aumentadas en comparación con las células endoteliales sin estimular. Si no es un cambio perceptible en estas moléculas de adhesión endotelial, la HUVEC cultivada se puede considerar como no activado. Evaluar el nivel de expresión de moléculas de adhesión puede constituir un buen control cuantitativo entre diferentes experimentos utilizando el mismo lote de HUVEC. Sin embargo, el nivel de expresión de estas moléculas de adhesión puede también variar entre diferentes cultivo primario de células endoteliales limitando la consideración de un umbral global de ICAM1 o VCAM1. El cambio en la forma de las células endoteliales macrovasculares como HUVEC es también un buen indicador de su activación. Este último cambio en el fenotipo permite una evaluación rápida y cualitativa de la activación de HUVEC. Sin embargo, el análisis de moléculas de adhesión puede ser una opción mejor para las células microvasculares que no muestran cambio de forma importante tras la activación con citoquinas inflamatorias.

Estudios mecanísticos, controles negativos relevantes de transmigración de monocitos pueden realizarse usando los anticuerpos contra moléculas de adhesión endotelial como ICAM1, VCAM1 o en la superficie del leucocito como asociada a la función del leucocito antígeno (LFA) -1. El uso de un control negativo relevante es esencial para tal estudio mecanístico en monocitos que expresan receptores de Fc en su superficie celular. La pureza de los monocitos después de aislamiento también es importante, para evitar la contaminación por otras poblaciones de leucocitos y una subestimación de la tasa de transmigración de monocitos. Otro parámetro importante es la temperatura que necesita para establecerse en 37 ° C durante todos los ensayos para asegurar que todas las observaciones experimentales son relevantes y por consiguiente a humanos en vivo de la célula trata.

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Disclosures

Los autores tienen intereses financieros que compiten.

Acknowledgments

Agradecemos Dr. Paul Bradfield manuscrito lectura y retroalimentación. A. S. recibió apoyo financiero de la Sir Jules espina beneficencia ultramar Trust reg.,

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Culture Flasks 75 cm2 TPP 90076 Routine culture of isolated HUVEC
µ-Slide VI 0.4 IBIDI 80606
Centrifuge Tubes 15 mL TPP 191015
Centrifuge Tubes 50 mL TPP 191050
Collagen G Biochrom L 7213 For coating of cell culture flasks
Gelatin Sigma-Aldrich 1393 For coating of cell culture flasks
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8537
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8662
RPMI-1640 Medium Sigma-Aldrich R8758
3-Way Stopcocks BIO-RAD 7328103
penicillin 10,000 μ/mL streptomycine 10,000 μg/mL fungizone 25 μ/mL AMIMED 4-02F00-H
Collagenase type 1 Worthington LS004216
Medium 199 1x avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes GIBCO 22340020
Bovine Albumin Fraction V ThermoFisher 15260037
Endothelial Cell Growth Supplement, 150 mg Millipore 02-102
Heparin Sodium Sigma-Aldrich H3149RT
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H6909
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A 4544
EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O APPLICHEM A2937.0500
CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC Miltenyi Biotech 130-100-713 AB_2655150
CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE Miltenyi Biotech 130-110-807 AB_2657280
Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC Miltenyi Biotech 130-107-016 AB_2653263
BD Accuri C6 Plus BD Bioscience
µ-Slide I Luer IBIDI 80176
CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) ThermoFisher C2925
Recombinant human TNFα Peprotech 300-01A
Recombinant human VEGFA Peprotech 100-20
NE-1000 Programmable Syringe Pump KF Technology NE-1000
Ficoll Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02
Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE Miltenyi Biotech 130-110-519 AB_2655051
Pan Monocyte Isolation Kit, human Miltenyi Biotech 130-096-537
Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE Miltenyi Biotech 130-106-762 AB_2655403
LS columns Miltenyi Biotech 130-042-401
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotech 130-090-976
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate ThermoFisher H1399
Silicone tubing IBIDI 10841
Elbow Luer Connector IBIDI 10802
Female Luer Lock Coupler IBIDI 10823
Luer Lock Connector Female IBIDI 10825
In-line Luer Injection Port IBIDI 10820
Ar1 confocal microscope Nikon
40x objective Nikon 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm
ImageJ Software NIH

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References

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Ropraz, P., Imhof, B. A., Matthes, T., Wehrle-Haller, B., Sidibé, A. Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58509, doi:10.3791/58509 (2018).

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