Cryosectioning simultanée de plusieurs cerveaux de rongeurs

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à geler et l’article de tissus cérébraux de plusieurs animaux comme une alternative de gagner du temps aux cerveaux unique de transformation. Cela réduit la variabilité coloration en immunohistochimie et réduit d’imagerie et de temps cryosectioning.

Abstract

L’histologie et l’immunohistochimie sont des méthodes de routine d’analyse afin de visualiser l’anatomie microscopique et de localiser des protéines dans les tissus biologiques. En neurosciences, comme une pléthore d’autres domaines scientifiques, ces techniques sont utilisées. Immunohistochemistry peut être fait sur le tissu de diapositives montées ou sections flottantes. Préparation des échantillons montés sur glissière est un processus intensif de temps. Le protocole suivant pour une technique, appelée le Megabrain, réduit le temps nécessaire aux tissus du cerveau cryosection et Mont jusqu'à 90 % en combinant plusieurs cerveaux en un seul bloc congelé. En outre, cette technique réduit la variabilité observée entre tours, dans une vaste étude histochimique de coloration. La technique actuelle a été optimisée pour l’utilisation de tissus cérébraux de rongeurs dans les analyses immunohistochimique en aval ; Toutefois, il peut être appliqué à différents champs scientifiques qui utilisent cryosectioning.

Introduction

Nous présentons ici le protocole pour une nouvelle méthode, que nous appelons Megabrain, mis au point pour cryosection plusieurs rongeurs brains simultanément de méthodes immunohistochimiques en aval. Un Megabrain permet la production de diapositives individuelles contenant des tissus de plusieurs animaux. Cette technique a été optimisée pour des coupes coronales de 9 hémisphères de rat adulte ou 5 adultes cerveau complet, en même temps. Par conséquent, cette technique est plus applicable dans les études immunohistochimiques grand ou autres analyses effectuées sur les tissus cérébraux monté sur glissière d’une importante cohorte d’animaux.

Immunohistochemistry implique l’utilisation d’anticorps spécifiques dirigés contre les protéines d’intérêt de comprendre et de caractériser leur expression et les changements cellulaires dans des tissus spécifiques^1,2,3. L’utilisation de l’immunohistochimie est répandue dans la recherche en neurosciences, entre autres disciplines scientifiques, en aidant à la compréhension moléculaire et cellulaire du cerveau⁴. Des études à grande échelle impliquant de nombreux animaux et sections du cerveau peuvent être les ressources et le temps intensif. Par conséquent, il y a une justification aux multiples facettes du développement de la Megabrain : pour réduire le temps passé à cryosectioning, de montage et de coloration des tissus, lors de l’utilisation par conséquent moins réactifs. En outre, la possibilité de rationaliser le processus et tacher les cerveaux multiples dans le même tour contribue à alléger la variabilité entre les lots, une limitation de l’immunohistochimie³de coloration. En outre, un Megabrain de sectionnement est une alternative de gain de temps au sectionnement des cerveaux de rongeurs congelés individuels et permet une comparaison rapide des tissus entre animaux ou même des groupes de traitement par des techniques de microscopie.

Protocol

La technique de Megabrain a été optimisée à l’aide de cerveaux ensemble et hemisected de mâles adultes du souris C57Bl6⁵et jeunes rats Sprague-Dawley rats Sprague-Dawley adultes qui ont été perfusé avec 1 x une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) suivie de transcardially par 4 % de paraformaldéhyde⁶. Des résultats similaires pouvant être effectuées dans les autres souches de souris et de rats, chez les deux sexes et à des âges différents. L’étude pour générer des données pour ce manuscrit utilisé de jeunes rats Sprague-Dawley et a été approuvé par le Comité de l’utilisation et le soin des animaux institutionnels Université de l’Arizona, et les animaux de laboratoire ont été pris en charge selon le Guide pour les soins et l’utilisation de laboratoire Animaux⁷.

1. Cryoprotection des cerveaux perfusé

1. Suivant transcardial réussie perfusion⁶, recueillir le cerveau complet^6,8 , provenant d’animaux et fixer en plaçant dans un flacon de 25 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant 24 h.
   ATTENTION : Paraformaldéhyde est un fixateur de tissu toxiques ; manipuler avec précaution. Transférer le paraformaldéhyde dans un conteneur à déchets spécifiquement marqué qui identifie sa concentration et volume à l’intérieur d’une hotte chimique et ensuite stocker dans le placard jusqu'à ce qu’éliminé par la sécurité des substances chimiques ou bien de déchets chimiques de personnel qualifié.
2. Après 24h, sous une hotte, supprimer cervelle de paraformaldéhyde à 4 % à l’aide d’une spatule. Transférer le cerveau dans un flacon de 20 mL environ de solution de saccharose de 15 % dans 1 x Tris salin (SCT) jusqu'à ce que le cerveau coule au fond de la cuvette (environ 24h).
3. Suite à cela, transférer le cerveau dans un flacon de 20 mL environ de solution de sucrose à 30 % en 1 x TBS, jusqu'à ce que le cerveau coule au fond de la cuvette (environ 24 à 48 h).

2. cerveau gel

1. Placer un bécher de verre de 500 mL sur un lit de glace dans un bac à glaçons. Verser 300 – 400 mL de l’isopentane (2 méthyl-butane) dans le bol de verre.
2. Laissez la température de l’isopentane rejoindre entre-45 ° C et -50 ° C. Suivre de près et maintenir cette température avec un thermomètre, gardant constante tout au long de la procédure. S’assurer que les lectures de température sont prises du milieu de la solution et ne pas en touchant le bas ou le côté du bécher.
3. Sur la table de travail, remplir un jetable enrobage moule (voir la liste des matériaux) environ 1/2 plein de température de coupe optimale (OCT ; voir Table des matières) composé. S’assurer qu’il n’y ait aucune bulle d’air dans l’OPO. S’il y a les bulles d’air, les enlever avec une spatule ou une aiguille.
4. Retirer le premier cerveau dans le flacon de 30 % de saccharose avec une spatule. À ce stade, soit geler tout de cerveaux ou hemisect, selon la conception de l’étude.
   1. Pour hemisected cerveaux, utiliser une lame de rasoir Neuve pour faire une coupe nette à travers le tissu pour séparer les hémisphères. Si ne pas nécessaire pour l’étude, retirer le cervelet et les bulbes olfactifs à ce stade. Si le cervelet est nécessaire pour l’étude, il est conseillé de couper une zone plate à l’extrémité postérieure du cerveau afin d’aider le cerveau à debout directement dans le moule. Si l’étude nécessite seulement des tissus d’une région localisée, une matrice de cerveau rongeurs permet de bloquer le cerveau selon des coordonnées connues.
5. Donner le cerveau numérique système de nommage. Dessiner un diagramme tel qu’illustré à la Figure 1. Écrire le numéro du premier cerveau à placer dans le moule Megabrain en position 2, laissant la position 1 comme un espace vide pour faciliter l’identification rapide de l’orientation dans laquelle les cerveaux ont été gelés.
6. À l’aide de forceps émoussé ou pince à épiler, ramasser le cerveau pour être placé en position 1. Orienter le cerveau avec le côté à couper première vers le haut. Inférieure du cerveau dans l’OPO à l’emplacement approprié, à l’aide de la pince à épiler pour ajuster sa position jusqu'à ce qu’il se tient indépendamment.
7. Répétez les étapes 2,3 et 2,5 pour les cerveaux/hémisphères restants devaient être gelés en positions 3 – 10. Évitez de placer des cerveaux/hémisphères dans une disposition symétrique.
8. Revoir toutes les 9 cerveaux dans le moule Megabrain. Une fois que les cerveaux sont debout indépendamment, debout et correctement orienté dans l’OPO (comme illustré à la Figure 2 b), ajouter plus de OCT au moule (jusqu'à ce que la partie supérieure du cerveau sont couverts). Encore une fois, s’assurer qu’il n’y ait aucune bulle d’air visible dans l’OPO.
9. Utiliser la pince pour tenir le coin du moule, assurant que la pince pas devenir partiellement submergée dans l’OPO (Figure 3 a). En prenant soin de maintenir le niveau de moule, abaissez le moule dans l’isopentane (-45 ° C à-50 ° C) afin que le fond troisième de la moule est submergé. Tenez-la ici pour permettre à toutes les bulles dans l’OPO à monter à la surface et éloigner les tissus (Figure 3 b).
10. Après 30 s, moins le moule entière dans l’isopentane et la libération de la pince, laissant le Megabrain submergé pendant au moins 3 min (Figure 3). S’assurer que ce moule est maintenue à niveau, donc cerveau reste debout et à égale distance (Figure 3D).
11. Après 3 min, utiliser la pince pour enlever le moule contenant la gelée, OCT incorporé cerveaux (Figure 3E) de l’isopentane.
12. Immédiatement, envelopper le moule et son contenu en papier d’aluminium et l’étiquette avec le nombre d’animaux ou d’identification Megabrain. Toucher le Megabrain congelé aussi parcimonieusement que possible pour éviter la fonte du tissu.
13. Cette Megabrain maintenant peut être transféré dans un congélateur à-20 ° C et stockée pendant au moins 24 h.
    NOTE : Protocole peut être suspendue ici et le Megabrain peut être stocké congelés jusqu'à ce que cryosectioning a lieu.

3. préparer le Megabrain pour la coupe sur le Cryostat

1. Régler la température du cabinet le cryostat à-19 ° C. Veillez à ce que cette température est atteinte avant de continuer. Tout au long de la section, assurez-vous que la température reste entre-18 ° C et -20 ° C.
2. Prendre la Megabrain du congélateur-20 ° C et placez-le dans le cryostat. Aussi, placez un mandrin des dimensions taille appropriée et deux pinceaux à pointe fine dans le cryostat. Laisser le Megabrain tant le mandrin dans le cryostat pendant au moins 15 minutes à la température du cryostat.
3. Convenablement les diapositives étiquette avec le numéro d’identification Megabrain et le numéro de la diapositive. Poser ces diapositives sur une lame plus chaude (35 à 45 ° C).
4. Déballer le Megabrain de la feuille d’aluminium. Utilisez une lame de rasoir pour couper verticalement les coins du moule pour permettre un retrait facile du bloc de OCT du moule (Figure 4 a).
5. Répartir une fine couche (environ 3 mm d’épaisseur) de OCT sur le mandrin.
6. Rapidement, avec un contact minimal entre les doigts et l’outil OPO, placez le Megabrain sur le mandrin, dans le sens désiré. Grande pince utilisable également pour cette étape afin de minimiser le dégel. Avant le début de l’article, laissez le Megabrain monté le mandrin dans le sens du cryostat pendant 15 à 20 min permettre l’OPO à geler complètement.
7. Une fois que la couche de base de OCT a gelé, appliquez une couche épaisse de 2 mm OCT autour des côtés de la Megabrain et laissez cela couler le long des côtés sur le mandrin. Ceci permet de garantir la Megabrain au mandrin. Encore une fois, avant de continuer, laissez le mandrin Megabrain monté dans le cryostat pendant 15 à 20 min permettre l’OPO à geler.
8. Utilisez une lame de rasoir pour retirer tout excédent OCT les côtés ou le fond du mandrin (Figure 4 b).

4. Cryosectioning le Megabrain

1. Avant de commencer, assurez-vous qu’un bécher contenant au moins 20 mL de PBS 1 x est accessible.
2. Positionner le mandrin, monté avec le Megabrain, dans la tête du mandrin sur le cryostat (Figure 4 b).
3. Définissez le cryostat à couper à l’épaisseur désirée. La méthodologie actuelle a été optimisée pour 10 µm à 50 µm sections.
4. Tailler l’OPO et tissus selon les besoins pour atteindre la région désirée de cerveau pour prélèvement tissulaire (Figure 4).
5. Lorsque vous êtes prêt à recueillir des tissus, abaissez la plaque anti-roll jusqu'à ce qu’elle repose sur la scène et tournez la poignée de cryostat à prendre une seule section. Soulevez lentement la plaque anti-roll, en prenant soin que le coupes Megabrain n’est pas fixé à la plaque anti-roll et ne tombe pas hors de la scène Figure 4).
6. Utilisez les pinceaux pour le dérouler la mèche de Megabrain jusqu'à ce qu’il est posé à plat sur la scène du cryostat (Figure 5 a). (Le cas échéant, tenir l’OPO avec les pinceaux pour éviter de rouler à plat).
7. Retirer la glissière de lame plus chaud et planer la diapositive, face imprimée vers le bas, sur le tronçon de Megabrain sur la scène lui permettant du coller à la diapositive.
8. Rapidement une goûte de PBS 1 x à chaque section de tissu sur la lame et ne permettent pas à sécher jusqu'à ce qu’ils ont été fait avec plats (voir étape 4,9).
9. Utilisez un pinceau à pointe fin trempé dans du PBS 1 x à brosser toutes les bulles dans les tissus et déplier le tissu, donc c’est bien à plat sur la lame (Figure 5 b). Prendre soin de ne pas changer la position des sections cerveau et perdent ainsi la position relative des autres sections de tissu. Manipuler les tissus avec soin pour éviter les déchirures. Garder des sections de cerveau des bords de la diapositive, comme espace périphérique est requis pour l’application de stylo PAP dans certains protocoles de coloration et lamelle couvre-objet.
10. Placer la lame sur la diapositive plus chaud et sec, pendant 45 min. au besoin, pour empêcher la poussière de se déposer sur le tissu de la couverture. Une fois sec, conserver les diapositives d’à-80 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.

Representative Results

Un résultat positif à cette procédure est le tissu qui se trouve à plat sur la diapositive, sans bulles ni les larmes, dans le sens où ils ont été gelés. Des sections de tissu sont équidistants apart et facilement identifiable en raison du bon placement du cerveau dans l’OPO et bonne notation tel que démontré dans la Figure 1. En supposant que le tissu cérébral ont été recueilli auprès des animaux du même âge, et que le tissu a été correctement aligné dans l’OPO, sections recueillies sur une diapositive doivent représenter un plan coronal similaire, permettant la comparaison des régions du cerveau entre les animaux. Pourvu que le tissu a gelé, avec gel minime artefact, coloration H & E réalisables pour évaluer la qualité de cryoprotection⁹. Immunohistochemistry peut être effectué comme démontré avec la coloration illustré à la Figure 6.

Figure 1 : Schéma représentatif d’une disposition suggérée de Megabrain. Cela montre la notation de position des tissus provenant d’animaux différents 9. Le système de numération est conçu comme l’a démontré ; Cependant, n’importe quel système de numérotation peut être utilisé. « X » est représentatif de l’espace vide destiné à montrer clairement l’orientation dans laquelle le tissu a été gelé. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : incorrectement et correctement positionné cerveaux à mold. (A) hémisphères mal alignés en octobre par le haut et le côté du cerveau. (B) hémisphères du cerveau bien alignées en octobre par le haut et le côté. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : étapes de cerveau gel. Megabrain (A) avant d’être immergé dans l’isopentane-45 ° C. Megabrain (B) lorsqu’il est submergé dans l’isopentane. (C) Megabrain complètement submergée dans l’isopentane. (D) Megabrain avant d’être ramenée dans l’isopentane, démontrant que les cerveaux devrait rester debout et équidistants entre eux au cours de ce processus. (E) A gelé Megabrain dans un moule d’encastrement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : cle en coupant une Megabrain. (A) Megabrain retiré d’enrobage moule au cryostat. (B) Chuck monté avec Megabrain. (C) garnis de Megabrain. (D) Megabrain l’article sur la scène du cryostat. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : pré- et post-montée Megabrain section. (A) congelé Megabrain section (40 µm) sur la scène du cryostat. (B) lame de verre monté avec des tissus Megabrain. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : immunohistochimie d’une lame de Megabrain colorées avec Iba1. (A) tissus prélevés sur un uniforme coloration entre différents cerveaux dans une étude, indique Megbrain. (B) x 20 photos microscopiques provenant de la région de cortex somatosensoriel baril champ (S1BF) de chaque cerveau monté, montrant conforme ionisé molécule liant le calcium adaptateur 1 (Iba1) la coloration des cellules microgliales entre cerveaux. Echelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Il devrait être considéré au cours de cette procédure que la température de la Megabrain et ses environs doit être constamment surveillée pour éviter la décongélation et la recongélation des tissus. Le cerveau seulement s’éliminent du congélateur-20 ° C vers le haut à 3 fois comme chaque fois qu’il est touché et gauche dans le cryostat, avec une température plus chaude fluctuant, le tissu dégèle et regèle, causant une gelée comme texture et tissu anormal intégrité¹⁰. Par conséquent, il est optimal pour couper le Megabrain tout à la fois.

Cryoprotection et fixation du tissu sont les parties essentielles de ce protocole pour minimiser la formation de cristaux de glace, réduire la croissance microbienne externe et arrêter les réactions enzymatiques, préservant ainsi l' intégrité de tissu¹⁰. Si le cerveau n’est pas cryoprotected avec saccharose, puis l’eau dans les tissus peut former des cristaux de glace pendant le processus de congélation, déchiqueter les tissus et causer des trous de forme. Alors que nous vous suggérons de dilutions successives du saccharose au SCT, cerveau peut être placé directement dans 30 % de saccharose pendant une période prolongée (48-72 heures) atteindre la cryoprotection similaire. Toutefois, il est fortement recommandé que les solutions de saccharose sont faites avec les directives du SCT. Variations telles que l’utilisation de PBS ou eau entraînera cryoprotection pauvre du Megabrain et tissu de mauvaise qualité. Tache de hématoxyline et éosine (H & E) peut être utilisé pour évaluer la qualité de la cryoprotection et gel conséquente artefact¹¹. Tissu de bonne qualité (troué minime) est essentiel dans des études histologiques comme les trous peuvent perturber la liaison des anticorps mais aussi réduire l’intégrité des tissus de cellules avec des processus fines qui peuvent influer sur l’analyse de certaines taches. Éviter placement symétrique des cerveaux, car ceci peut causer la confusion en essayant d’identifier l’animal d'où chaque cerveau a été obtenue.

La technique actuelle a été optimisée pour les sections coronaires ; Toutefois, il peut facilement être adapté aux coupes sagittales et transversales. Ces modifications coupe exigera une variation appropriée du placement de cerveau en étapes 2,5 à 2,7. Il est à noter que ces adaptations peuvent réduire le nombre de cerveaux pouvant s’intégrer dans un moule d’encastrement.

Une modification de clé de cette technique est l’espace vide au poste numéro 1 (tel qu’illustré à la Figure 1). Cet espace est conçu pour permettre d’identifier facilement l’orientation de Megabrain et par conséquent identifier l’animal associé à chaque cerveau.

Cette technique a été modifiée pour permettre le tissu d’un plus grand nombre d’animaux à être gelés et couper en même temps dans le Megabrain. La taille du cerveau rongeur est tributaire de sexe, âge et espèces connexes ; le nombre de cerveaux qui rentrent dans le moule peut varier. Il est déconseillé de séparer les différents âges, sexes ou des groupes de traitement en Megabrains séparé. Bien que cela peut assurer l’uniformité de la taille, il peut aussi augmenter partialité et subjectivité lors d’imagerie et d’analyse. En outre, il y a un écart inévitable entre les diapositives en immunohistochimie dans n’importe quel protocole, qui pourrait mener à une incohérence coloration entre les groupes d’âge/sexe.

Un mandrin rectangulaire, plus grande et a été utilisé, en lieu et place d’une circulaire, qui a fourni un soutien accru derrière le Megabrain.

Comme la moule et son contenu ont été d’un plus grand volume que celle d’un cerveau du singulier dans un moule OCT, davantage de temps était tenu de geler le cerveau dans l’isopentane. Par essais et erreurs, un laps de temps que prévu le gel de bonne qualité (3,5 minutes) a été déterminé. Le Megabrain peut être laissé dans l’isopentane plus longtemps ; Toutefois, la température doit rester de l’ordre de-45 ° C à-50 ° C pour éviter la fissuration du OCT.

Comme il existe de nombreux morceaux de tissu sur la diapositive Megabrain, il est possible que le tissu peut sécher et deviennent par conséquent plus fragile durant les étapes de brossage. Pour lutter contre ce problème, une goutte de PBS devrait être mises sur chaque section de cerveau individuel pour le garder humide jusqu'à ce qu’il est brossé sur.

La technique de hemisecting le cerveau, pour une étude dans laquelle ce paramètre est requis est essentiel à l’obtention de bons résultats. Quand hemisecting le cerveau, il est important que cette dichotomie est fait précisément pour assurer que toutes les régions du cerveau sont intactes avec l’hémisphère correct. Si le cervelet ou les bulbes olfactifs ne sont pas pertinents à l’étude, ils peuvent être révoqués. Suppression de ce tissu « excès » réduit la quantité de tissu qui devra être coupé lorsque cryosectioning. Enlever le cervelet permet le cerveau à se lever plus facilement dans l’OPO avant la congélation.

Tout en étant balayé dehors, garder les coupes de tissus loin du bord de la diapositive. Cela laisse place à une ligne de plume PAP, une barrière hydrophobe, d’entourer le tissu, qui est une exigence de certains protocoles d’immunohistochemistry. En outre, l’espace est nécessaire pour la lamelle.

Si l’hémisphère/cerveau tombe ou s’incline au cours de la Megabrain de congélation, les sections ne seront pas coplanaire. Un résultat similaire peut survenir si un cerveau est plus grand que les autres dans un seul Megabrain. Pour y remédier, plusieurs diapositives peuvent être sélectionnées sur la tache où le brain(s) en question est à l’endroit approprié de l’intérêt.

Une des limites de cette technique sont que, comme tous les tissus est gelé dans un bloc de OCT ; Si il y a une erreur technique, comme un mauvais geler due à une mauvaise température, les tissus de plusieurs animaux seront touchés (5-9 les cerveaux animaux au lieu de seulement 1). Il s’agit davantage d’un problème lorsque vous utilisez le cerveau complet et pas les sections de hemisected, car l’hémisphère restant peut être congelé et sectionné séparément pour obtenir les sections souhaitées.

Une autre limite de cette méthode est que lorsque vous ajustez le cryostat pour couper le Megabrain, une approche plus adaptée doit être prise. C’est à cause de tous les cerveaux sont des angles légèrement différents les uns des autres, alors que ce n’est pas un problème quand un cerveau singulièrement congelé de sectionnement. Les effets de ceci peuvent être minimisés en gel en veillant à ce cerveau est droite et d’une taille similaire.

L’un des plus grands avantages d’à l’aide de cette technique au cours de la congélation des cerveaux singulièrement, c’est qu’il raccourcit le temps total passé de congélation et la cervelle de coupe jusqu'à 90 %, si 9 sont réduits au même rythme que le 1 cerveau. L’autre avantage majeur de cette technique est qu’il permet un plus petit nombre de diapositives qui contiennent des tissus des animaux nécessaires à colorer. Cela augmente la fiabilité et l’uniformité de coloration immunohistochimique, puisque toutes les lames sont colorées dans le même tour. Il peut y avoir incompatibilité entre lames marquées dans le même temps, mais un Megabrain peut permettre plusieurs cerveaux d’étude d’être représenté sur une seule diapositive, ainsi réduisant la variabilité et en augmentant la validité de l’analyse. Avoir une coloration uniforme est un avantage majeur dans toute étude histologique et une grande importance d’utiliser cette technique. Enfin, moins diapositives encourent également réduire les coûts d’approvisionnement.

Cette technique peut être facilement modifiée pour coupes sagittales de découpage d’un cerveau de rongeur. Il pourrait aussi être adapté à cryosectioning les tissus provenant de différents modèles animaux et différents types de tissus, tels que des échantillons de muscle ou le foie. Adaptations du Protocole devait être faite, y compris l’optimisation de la quantité de solutions utilisées, taille de la lame/scène cryostat et le volume du moule encastrement.

Cette technique pourrait également être adaptée aux techniques de flottants, où le protocole reste le même jusqu'à l’étape 4.6. À cette étape, cerveaux devraient être séparés et levé dans les puits de la plaque séparée à colorer. Redoublez de prudence devra veiller à ne pas confondre les tranches de cerveau dans le processus de tri.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)	Fisher Scientific	14-373-65
Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Fisher Scientific	18-41
Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-128
Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap	Fisher Scientific	03-337-23
Sucrose, poly bottle 2.5 kg	Fisher Scientific	S2-212	Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.
2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical	Fisher Scientific	O3551-4
PYREX Tall-Form Beakers	Fisher Scientific	02-546E
Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C)	Fisher Scientific	13-201-642
Fisherbrand Scoopula Spatula	Fisher Scientific	14-357Q
STANLEY Razor Blade	Grainger	4A807
Edge-Rite Microtome blades	Fisher Scientific	14-070-60
Microscope slides (1" frost) - white	Fisher Scientific	22-034-979
Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2	Fisher Scientific	70-013-032	Dilute to 1X  before use
15 piece fine paint brushes	Amazon	B079J12ZRV
PAP pen	abcam	ab2601
Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.	Electron Microscopy Sciences	EMS065