Gleichzeitige Kryoschneiden mehrere Nagetier Gehirne

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um einzufrieren und Abschnitt Gehirngewebe von mehreren Tieren als eine zeitsparende Alternative zur Bearbeitung einzelner Gehirne. Dies senkt die Färbung Variabilität bei Immunohistochemistry und reduziert Zeit Kryoschneiden und Imaging.

Abstract

Histologie und Immunhistochemie sind Routineverfahren der Analyse zu visualisieren mikroskopische Anatomie und Proteine in biologischen Geweben zu lokalisieren. In Neurowissenschaften, sowie eine Fülle von anderen wissenschaftlichen Bereichen sind diese Techniken verwendet. Immunohistochemistry kann auf Schlitten montiert Gewebe- oder frei schwebenden Abschnitte erfolgen. Probenvorbereitung von Folie montiert, ist eine zeitintensive Prozess. Das folgende Protokoll für eine Technik, genannt die Megabrain reduziert den Zeitaufwand für Cryosection und Mount Hirngewebe um bis zu 90 % durch die Kombination mehrerer Gehirne in einem gefrorenen Block. Darüber hinaus reduziert diese Technik Variabilität zwischen runden, in einer großen Studie histochemische Färbung gesehen. Die aktuelle Technik wurde optimiert für die Verwendung von Nagetier Hirngewebe in nachgeschalteten immunhistochemische Analysen; jedoch kann es zu verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen angewendet werden, die Kryoschneiden verwenden.

Introduction

Hier präsentieren wir Ihnen das Protokoll für eine neuartige Methode, die wir Megabrain nennen, zu Cryosection mehrere Nagetier gleichzeitig für nachgeschaltete immunhistochemische Verfahren Gehirne entwickelt. Ein Megabrain ermöglicht die Herstellung der einzelnen Folien mit Gewebe aus mehreren Tieren. Diese Technik wurde optimiert, um koronalen Abschnitte aus 9 Erwachsene Ratte Hemisphären oder 5 Erwachsene voller Gehirne gleichzeitig geschnitten. Daher ist die Technik am ehesten zutreffenden in großen immunhistochemische Studien oder andere Analysen auf Schlitten montiert Hirngewebe aus einer großen Kohorte von Tieren gemacht.

Immunohistochemistry beinhaltet die Verwendung von spezifischen Antikörpern gegen Proteine des Interesses zu verstehen und zu charakterisieren ihren Ausdruck und zelluläre Veränderungen in bestimmten Gewebe^1,2,3. Die Verwendung von Immunohistochemistry ist in der neurowissenschaftlichen Forschung, unter anderen wissenschaftlichen Disziplinen, Beihilfe bei der zellulären und molekularen Verständnis des Gehirns⁴verbreitet. Groß angelegte Studien, an denen viele Tiere und Gehirn Abschnitte können Ressourcen- und zeitintensiv sein. Als solche gibt es eine vielfältige Beweggründe für die Entwicklung der Megabrain: Verkürzung verbrachte Kryoschneiden, Montage und Färbung Gewebe, wobei folglich weniger Reagenzien. Darüber hinaus die Möglichkeit, den Prozess zu optimieren und Flecken auf mehrere Köpfe in der gleichen Runde hilft, einige der Variabilität zwischen Chargen, eine Beschränkung von Immunohistochemistry³Färbung zu lindern. Darüber hinaus ein Megabrain-Schnitt ist eine zeitsparende Alternative zum Schneiden einzelne gefrorene Nager Gehirne und ermöglicht schnellen Vergleich der Gewebe zwischen Tieren oder sogar Behandlungsgruppen durch mikroskopiertechniken.

Protocol

Die Megabrain-Technik wurde optimiert, mit ganzen und Hemisected Gehirne von männlichen Erwachsenen C57Bl6 Mäuse⁵, juvenile Sprague-Dawley Ratten und Erwachsenen Sprague-Dawley Ratten, die Transcardially durchströmt mit 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) gefolgt waren von 4 % Paraformaldehyd⁶. Ähnliche Ergebnisse können in andere Stämme von Maus und Ratte, bei beiden Geschlechtern und in den verschiedenen Altersstufen durchgeführt werden. Die Studie zur Datengenerierung für diese Handschrift juvenile Sprague-Dawley Ratten verwendet und wurde von der University of Arizona institutionelle Tierpflege und Use Committee genehmigt, und Versuchstieren wurden für die Zuerkennung der Leitfaden für die Pflege und Nutzung des Labor betreut Tiere-⁷.

1. Cryoprotection der PERFUNDIERTEN Gehirne

1. Folgende erfolgreiche Transcardial Perfusion⁶, sammeln die vollständige Gehirn^6,8 von Tieren und Post-zu beheben, indem man in ein 25 mL-Fläschchen mit 4 % Paraformaldehyd in PBS für 24 h.
   Achtung: Paraformaldehyd ist eine giftige Gewebe Fixiermittel; mit Vorsicht handhaben. Übertragen von Paraformaldehyd in einen speziell gekennzeichneten Abfallbehälter, der seine Konzentration und Volumen innerhalb einer chemischen Dampfhaube identifiziert und dann laden in der Chemieabfall Kabinett bis Chemikaliensicherheit oder ordnungsgemäß entsorgt geschultes Personal.
2. Nach 24 Stunden, in einer Dampfhaube verstrichen ist entfernen Sie Gehirne aus 4 % Paraformaldehyd mit einem Spachtel. Übertragen Sie das Gehirn in ein Fläschchen mit ca. 20 mL 15 % Saccharoselösung in 1 X Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS) bis Gehirn auf den Boden des Röhrchens (ca. 24 h sinkt).
3. Im Anschluss daran übertragen Sie das Gehirn auf ein Fläschchen mit ca. 20 mL 30 % Saccharoselösung in 1 X TBS, bis das Gehirn auf den Boden des Röhrchens (ca. 24 – 48 h) sinkt.

2. Gehirn Einfrieren

1. Legen Sie eine 500 mL-Becherglas auf einem Bett von Trockeneis in einem Eiskübel. Gießen Sie 300 – 400 mL Isopentane (2-Methyl-Butan) in das Becherglas.
2. Können Sie die Temperatur des Isopentane-45 ° C bis-50 ° c erreichen Genau zu überwachen Sie und pflegen Sie dieses Temperaturbereichs mit einem Thermometer, Konstanthaltung während des Verfahrens. Sicherstellen Sie, dass die Temperaturwerte aus der Mitte der Lösung und nicht beim Berühren der unteren oder Seite des Bechers entnommen werden.
3. Auf der Tischplatte, füllen ein Einweg Form einbetten (siehe Materialliste) ca. 1/2 voller optimale Arbeitstemperatur (Okt; siehe Tabelle of Materials) Compound. Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen im Office-Anpassungstool gibt. Gibt es entfernen Luftblasen sie mit einem Spatel oder einer Nadel.
4. Entfernen Sie das erste Gehirn aus der Durchstechflasche von 30 % Saccharose mit einem Spatel. An dieser Stelle Einfrieren entweder Gehirne ganz oder Hemisect, je nach Design der Studie.
   1. Verwenden Sie um Hemisected Köpfe eine neue Rasierklinge um einen sauberen Schnitt durch das Gewebe, die Hemisphären zu trennen. Wenn nicht für die Untersuchung benötigt, entfernen Sie das Kleinhirn und der olfaktorischen Birnen in diesem Stadium. Wenn das Kleinhirn für die Untersuchung erforderlich ist, wird vorgeschlagen, um eine Ebene Fläche am hinteren Ende des Gehirns zugunsten des Gehirns im stehen direkt im Werkzeug zu schneiden. Wenn die Studie nur Gewebe aus einer lokalisierten Region erforderlich ist, kann eine Nagetier Gehirn Matrix verwendet werden, basierte auf bekannten Koordinaten Gehirn blockieren.
5. Geben Sie einen numerischen Benennungssystem Gehirne. Zeichnen Sie ein Diagramm, wie in Abbildung 1dargestellt. Schreiben Sie die Nummer des ersten Gehirns platziert werden, in der Form von Megabrain in Position 2 Position 1 zu verlassen, als ein leerer Raum, in schnelle Identifizierung der Orientierung zu helfen, in dem die Gehirn eingefroren wurden.
6. Mit stumpfen Zange oder Pinzette, Abholung des Gehirns auf Position 1 gestellt werden. Orientieren Sie das Gehirn mit der Seite geschnitten werden erste nach oben. Senken Sie das Gehirn in das Office-Anpassungstool an der entsprechenden Stelle mit der Pinzette um seine Position anzupassen, bis es selbstständig steht.
7. Wiederholen Sie die Schritte 2,3 bis 2,5 für die restlichen Gehirn/Hemisphären in 3 – 10 Positionen eingefroren werden. Sollten Sie sich Gehirne/Hemisphären in eine symmetrische Anordnung.
8. Überprüfen Sie alle 9 Gehirne in der Megabrain-Form. Sobald die Gehirn unabhängig, aufrecht und richtig herum im Office-Anpassungstool (siehe Abb. 2 b) stehen, die Form fügen Sie mehr OCT hinzu, (bis oben auf die Köpfe fallen). Wieder, sicherzustellen Sie, dass es keine sichtbaren Luftblasen im Office-Anpassungstool.
9. Verwenden Sie die Zange um die Ecke des Werkzeugs, sicherzustellen, dass die Zange nicht im Office-Anpassungstool (Abbildung 3A) teilweise untergetaucht werden zu halten. Achten Sie darauf, die Schimmel-Niveau zu halten senken die Form in der Isopentane (-45 ° C bis-50 ° C) so dass unten der dritten Form ist untergetaucht. Halten Sie es hier Luftblasen im Office-Anpassungstool zu steigen an die Oberfläche und entfernt das Gewebe (Abb. 3 b) zu ermöglichen.
10. Nach 30 s, unten die ganze Form in die Isopentane und Entlassung aus der Zange, verlassen die Megabrain unter für mindestens 3 min (Abbildung 3 Wasser). Stellen Sie sicher, dass Schimmel ist Ebene gehalten, damit die Gehirne bleiben aufrecht und äquidistanten (Abbildung 3D).
11. Nach 3 min eingebettet Gebrauch der Zange zu entfernen den Schimmel mit dem gefrorenen, OCT Gehirne (Abbildung 3E) aus der Isopentane.
12. Sofort, wickeln Sie die Form und den Inhalt in Alufolie und beschriften Sie sie mit der Tierzahlen oder Megabrain Identifikation. Berühren Sie die gefrorenen Megabrain so sparsam wie möglich zu vermeiden, Auftauen des Gewebes.
13. Diese Megabrain kann jetzt in einem Gefrierschrank-20 ° C übertragen und dort gespeichert für ein Minimum von 24 h.
    Hinweis: Protokoll kann hier angehalten und die Megabrain kann gespeichert werden eingefroren, bis Kryoschneiden stattfindet.

3. Vorbereiten der Megabrain-Schnitt auf der Kryostat

1. Legen Sie die schranktemperatur Kryostaten bis-19 ° C. Stellen Sie sicher, dass diese Temperatur erreicht ist, bevor Sie fortfahren. Schneiden, sicherstellen Sie, dass die schranktemperatur zwischen-18 ° C und-20 ° C bleibt.
2. Nehmen Sie die Megabrain aus dem Tiefkühler-20 ° C und legen Sie sie in den Kryostaten. Legen Sie auch ein Futter von den entsprechenden Abmessungen und zwei dünnen Spitzen Pinsel in Kryostaten. Lassen Sie die Megabrain und das Bohrfutter im Kryostaten für mindestens 15 Minuten auf die Temperatur des Kryostaten kommen.
3. Kennzeichnen Sie Folien mit Megabrain-ID-Nummer und die Nummer der Folie entsprechend. Legen Sie die Folien auf einer Folie wärmer (35 – 45 ° C).
4. Packen Sie die Megabrain aus der Alufolie. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um vertikal schneiden Sie die Ecken des Schimmels erlauben einfache Entfernung des Blocks Okt. aus der Form (Abb. 4A).
5. Eine dünne Schicht (ca. 3 mm dick) Okt. auf das Futter zu verzichten.
6. Platzieren Sie schnell, mit minimalen Kontakt zwischen Fingern und das Office-Anpassungstool, die Megabrain auf dem Futter in der gewünschten Ausrichtung. Große Zange können auch für diesen Schritt verwendet werden, um Auftauen zu minimieren. Vor Beginn der Abschnitt, verlassen die Megabrain montiert Chuck in den Kryostaten für 15-20 min zum Office-Anpassungstool komplett gefrieren lassen.
7. Sobald die Basisschicht Okt. eingefroren hat, gelten eine 2 mm dicke Schicht OCT um die Seiten des dem Megabrain und zulassen, dass dies von den Seiten auf das Spannfutter heruntergekommen. Dies sichert die Megabrain an das Futter. Wieder, bevor Sie fortfahren, verlassen Sie die Megabrain montiert Chuck in den Kryostaten für 15-20 min zum Office-Anpassungstool zu frieren lassen.
8. Jede überschüssige OCT von Seiten oder unten des Futters (Abbildung 4 b) entfernen Sie mit einer Rasierklinge.

(4) Kryoschneiden die Megabrain

1. Bevor Sie beginnen, zu gewährleisten, dass ein Becher mit mindestens 20 mL 1 X PBS zugänglich ist.
2. Positionieren Sie das Spannfutter montiert mit Megabrain, in der Futter-Kopf auf der Kryostat (Abbildung 4 b).
3. Festlegen der Kryostat schneiden auf die gewünschte Dicke. Die aktuelle Methode ist für 10 µm bis 50 µm Abschnitte optimiert worden.
4. Schneiden Sie das Office-Anpassungstool und Gewebe wie notwendig, um die gewünschte Gehirnregion für Gewebe-Sammlung (Abbildung 4) zu erreichen.
5. Wenn Sie bereit sind, Gewebe zu sammeln, senken Sie die Anti-Rolle-Platte ab, bis es auf der Bühne ruht und drehen Sie den Kryostaten Griff um einen Abschnitt zu nehmen. Heben Sie langsam die Anti-Roll-Platte, wobei Sie darauf achten, dass die geschnittenen Megabrain nicht auf die Anti-Roll-Platte befestigt ist und nicht von der Bühne Abbildung 4 fällt).
6. Verwenden Sie die Pinsel sanft Abschnitt Megabrain abrollen, bis sie flach auf der Kryostat-Bühne (Abbildung 5A) liegt. (Bei Bedarf halten Sie das Office-Anpassungstool flach mit dem Pinsel um Walzen zu verhindern).
7. Entfernen Sie die Folie von Folie wärmer und zeigen Sie die Folie, Label-Seite nach unten, über die Megabrain-Abschnitt auf der Bühne, so dass Abschnitt, um an der Folie kleben.
8. Schnell geben Sie einen Tropfen von 1 X PBS zu jedem Gewebe-Abschnitt auf der Folie und lassen Sie sich nicht diese zu trocknen, bis sie flach gereinigt worden sind (siehe Schritt 4,9).
9. Verwenden Sie einen feinen Spitzen Pinsel eingetaucht in 1 X PBS ausbürsten Bläschen im Gewebe und das Gewebe zu entfalten, so dass sie flach auf der Folie (Abbildung 5 b) liegt. Achten Sie darauf, nicht ändern Sie die Position der Gehirn-Abschnitte und verlieren dadurch die relative Position zu den anderen Abschnitten der Gewebe. Bearbeiten Sie das Gewebe mit Sorgfalt um Tränen zu vermeiden. Halten Sie Gehirn Bereiche Weg von den Rändern der Folie, wie peripheren Raum für ein Deckglas und PAP-Stift Anwendung in einigen Färbung Protokolle erforderlich ist.
10. Legen Sie die Folie wieder auf der Folie, wärmeren und trockenen für 45 min. Abdeckung je nach Bedarf zu verhindern, dass Staub absetzen auf das Gewebe. Nach dem Trocknen, speichern Sie die Folien bei-80 ° C bis zur weiteren Verwendung.

Representative Results

Eine positive Bilanz für diese Prozedur ist Gewebe, das liegt flach auf der Folie, ohne Bläschen oder Risse in der Ausrichtung, in der sie eingefroren waren. Gewebeschnitte werden gleichmäßig verteilt auseinander und leicht erkennbar durch gute Platzierung des Gehirns im Office-Anpassungstool und gute Schreibweise wie in Abbildung 1dargestellt. Vorausgesetzt, dass das Hirngewebe von Tieren in einem ähnlichen Alter gesammelt wurde, und das Gewebe wurde im Office-Anpassungstool richtig ausgerichtet, sollten Abschnitte gesammelt auf einer Folie eine ähnliche koronale Ebene, Vergleich von Hirnregionen zwischen Tieren darstellen. Unter der Voraussetzung, dass das Gewebe gut, mit minimalen Einfrieren Artefakt, eingefroren hat kann H & E Fleck um zu beurteilen, die Cryoprotection Qualität⁹durchgeführt werden. Immunohistochemistry kann durchgeführt werden, wie gezeigt mit dem Beflecken in Abbildung 6dargestellt.

Abbildung 1: Repräsentative Darstellung der Layoutbreite vorgeschlagenen Megabrain. Dies zeigt die Position Notation des Gewebes von 9 verschiedenen Tieren stammen. Das Zahlensystem dient, wie gezeigt; jedoch kann Nummerierung verwendet werden. 'X' ist repräsentativ für den leeren Raum entwickelt, um die Orientierung deutlich, in der das Gewebe eingefroren war. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: nicht falsch und richtig positioniert Gehirne in Form. (A) Gehirn-Hemisphären schlecht im OAT von oben und seitlich ausgerichtet. (B) gut abgestimmten Gehirnhälften im OAT von oben und seitlich. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Phasen des Gehirn einfrieren. (A) Megabrain vor in Isopentane-45 ° C eingetaucht wird. (B) Megabrain wenn in Isopentane getaucht. (C) Megabrain vollständig in Isopentane getaucht. (D) Megabrain gesenkt in Isopentane, zeigen, dass Gehirne aufrecht und gleich weit entfernt von einander während dieses Vorgangs bleiben sollte. (E) A gefroren Megabrain in ein Einbetten von Schimmel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: wichtige Etappen beim Schneiden ein Megabrain. (A) Megabrain Einbettung Schimmel in Kryostaten entzogen. (B) Chuck montiert mit Megabrain. (C) getrimmt Megabrain. (D) Megabrain Abschnitt auf der Kryostat Bühne. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5: Pre- und Post-montierten Megabrain Abschnitt. (A) gefroren Megabrain Abschnitt (40 µm) auf der Bühne der Kryostat. (B) Objektträger mit Megabrain Gewebe montiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6: Immunohistochemistry einer Megabrain Folie gefärbt mit Iba1. (A) Gewebe entnommen eine einheitliche Färbung zwischen unterschiedliche Gehirne in einer Studie Megbrain zeigt. (B) 20 X mikroskopische Aufnahmen der somatosensorischen Fass Feld (S1BF) Kortex Region jeder montierten Gehirn entnommen, zeigt konsistente ionisiert Kalzium-bindende Adapter Molekül 1 (Iba1) Färbung der Mikroglia zwischen Gehirnen. Maßstabsleiste = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Während dieses Vorgangs zu berücksichtigen, dass die Temperatur der Megabrain und seine Umgebung ständig überwacht werden muss, um zu verhindern, Auftauen und wieder einfrieren des Gewebes. Das Gehirn kann nur aus dem Tiefkühler-20 ° C bis zu 3 mal als entfernt werden jedes Mal, wenn es berührt wird und Links in den Kryostaten mit wärmeren schwankende Temperaturen, das Gewebe auftaut und gefriert, wodurch eine Gelee wie Textur und krankhaftes Gewebe Integrität¹⁰. Daher ist es optimal, um die Megabrain auf einmal schneiden.

Gewebe-Fixierung und Cryoprotection sind wesentliche Teile dieses Protokolls zu minimieren Kristall Eisbildung, externe mikrobielles Wachstum verringern und enzymatische Reaktionen, und bewahrt somit Gewebe Integrität¹⁰zu stoppen. Wenn die Gehirn nicht Cryoprotected mit Saccharose sind, kann dann Wasser im Gewebe Eiskristalle während des gefriervorgangs bilden, die shred des Gewebes und verursachen Löcher zu bilden. Während wir Verdünnungsreihen von Saccharose in TBS vorschlagen, können Gehirne für einen längeren Zeitraum (48-72 Stunden), ähnliche Cryoprotection zu erreichen direkt in 30 % Saccharose platziert werden. Jedoch empfiehlt es sehr, dass die Saccharose-Lösungen werden mit TBS-Variationen wie die Verwendung von PBS oder Wasser zu schlechten Cryoprotection der Megabrain und schlechte Gewebe-Qualität führt. Hämatoxylin und Eosin (H & E) Fleck lässt sich die Qualität der Cryoprotection und der daraus resultierenden Einfrieren Artefakt¹¹zu bewerten. Gut Gewebe-Qualität (mit minimalen Löcher) ist in histologischen Untersuchungen notwendig, da die Löcher stören können, die Bindung von Antikörpern sowie zur Reduktion der Gewebe Integritätdes der Zellen mit feinen Prozesse, die die Analyse von einigen Flecken beeinflussen können. Vermeiden Sie symmetrische Anordnung der Gehirne, wie dies kann Verwirrung stiften, wenn Sie versuchen, das Tier zu identifizieren, von dem jedes Gehirn bezogen wurde.

Die aktuelle Technik wurde optimiert für koronalen Abschnitte; Es kann jedoch leicht angepasst, sagittale und transversale Abschnitte zu schneiden. Diese schneiden Modifikationen erfordert geeignete Variante des Gehirns Platzierung in Schritten von 2,5 bis 2,7. Es sei darauf hingewiesen, dass diese Anpassungen die Anzahl Gehirne verringern können, die in einem einbettenden Guss passen können.

Eine wesentliche Änderung dieser Technik ist der leere Raum an Positionsnummer 1 (siehe Abbildung 1). Dieser Raum soll einfache Identifizierung der Megabrain Orientierung zu ermöglichen, und daher das Tier zugeordnet jedes Gehirn zu identifizieren.

Diese Technik wurde modifiziert, um Gewebe aus einer größeren Anzahl von Tieren werden eingefroren und schneiden gleichzeitig in die Megabrain zu ermöglichen. Die Größe des Gehirns Nagetier ist daher abhängig von Geschlecht, Alter und Art; die Anzahl der Köpfe, die in der Form passen kann variieren. Es ist nicht ratsam, unterschiedlichen Alters, Geschlechts oder Behandlungsgruppen in separaten Megabrains zu trennen. Obwohl dies Größe Einheitlichkeit zu gewährleisten kann, kann es auch Bias und Subjektivität bei der Bildverarbeitung und Analyse erhöhen. Darüber hinaus gibt es unvermeidliche Varianz zwischen den Folien während der Immunhistochemie in jedem Protokoll, das zur Färbung Inkonsistenz zwischen Alter/Geschlecht Gruppen führen könnte.

Eine rechteckige, größere Chuck wurde verwendet, anstelle einer kreisförmigen, die verstärkte Unterstützung hinter dem Megabrain zur Verfügung gestellt.

Da die Form und den Inhalt der ein größeres Volumen als ein einzigartiges Gehirn in ein OCT-Schimmel waren, war mehr Zeit erforderlich, um das Gehirn in der Isopentane einfrieren. Durch Versuch und Irrtum war eine Zeitspanne, die gut einfrieren-Qualität (3,5 Minuten) bestimmt. Die Megabrain kann in die Isopentane länger gelassen werden; Allerdings muss die Temperatur im Bereich von-45 ° C bis-50 ° C, um Risse zu vermeiden bleiben das Office-Anpassungstool.

Es gibt viele verschiedene des Gewebes auf der Folie Megabrain, ist es möglich, dass Gewebe kann austrocknen und folglich eher spröde, während die Bürsten Schritte geworden. Um dieses Problem zu bekämpfen, sollte ein Tropfen PBS gelegt werden, auf jedem einzelnen Gehirn-Abschnitt zu feucht halten, bis es ausgebürstet wird.

Die Technik des Hemisecting ist das Gehirn für eine Studie, in der dies erforderlich ist, ist, entscheidend für gute Ergebnisse. Wenn Hemisecting des Gehirns, ist es wichtig, dass diese Zweiteilung erfolgt genau, um sicherzustellen, dass alle Hirnregionen mit der richtigen Hemisphäre intakt sind. Wenn das Kleinhirn oder olfaktorischen Birnen nicht für das Studium relevant sind, können sie entfernt werden. Entfernen dieses "überschüssige" Gewebe reduziert die Menge des Gewebes, die bei getrimmt werden muss Kryoschneiden. Wenn Sie das Kleinhirn können die Gehirne im Office-Anpassungstool vor dem Einfrieren leichter aufstehen.

Während ausgebürstet werden, halten Sie die Gewebeschnitte vom Rand der Folie. Dies lässt Raum für eine Linie von PAP Pen, eine hydrophobe Barriere, das Gewebe umgeben, das Voraussetzung bei einigen Immunohistochemistry-Protokollen ist. Darüber hinaus ist Platz für das Deckglas benötigt.

Wenn die Hemisphäre/Gehirn fällt oder während der Megabrain Einfrieren neigt, werden die Abschnitte nicht Co Hobel. Falls ein Gehirn größer als die anderen in einer einzigen Megabrain ist, kann ein ähnliches Ergebnis führen. Um dies zu überwinden, sind weitere Folien wählbar, Fleck, wo die fragliche Brain(s) auf den entsprechenden Bereich von Interesse sind.

Eine Einschränkung dieser Technik ist, die wie alle des Gewebes wird in einem Block von OCT eingefroren; Wenn technische Fehler vorliegt, wie z. B. eine schlechte soll eine falsche Temperatur Einfrieren, dann wird das Gewebe von mehreren Tieren betroffen (5-9 tierische Gehirnen anstelle von nur 1). Dies ist eher ein Problem, wenn Sie voll Gehirn und nicht Hemisected Abschnitte, weil die restlichen Hemisphäre kann eingefroren und einzeln geschnitten, um die gewünschten Abschnitte zu erhalten.

Eine weitere Einschränkung dieser Methode ist, dass bei der Kryostat schneiden die Megabrain anpassen, eine optimale Vorgehensweise geachtet werden muss. Dies ist auf alle Köpfe werden in unterschiedlichen Winkeln zueinander, ist dies kein Problem, wenn eine einzeln gefrorene Gehirn-Schnitt. Die Auswirkungen davon beim Gefrieren dadurch minimiert werden Gehirne sind aufrecht und ähnlicher Größe.

Einer der größten Vorteile von verwenden, die diese Technik über Einfrieren Gehirn einzigartig ist, dass es die gesamte Zeit einfrieren verkürzt und schneiden Gehirne um bis zu 90 %, wenn 9 im gleichen Tempo wie 1 Gehirn reduziert werden. Der andere entscheidende Vorteil dieser Technik ist, dass es eine kleinere Anzahl von Folien, die Gewebe von den erforderlichen Tieren gefärbt werden enthalten. Dies erhöht die Zuverlässigkeit und die Einheitlichkeit der immunhistochemischen Färbung, da alle Folien in der gleichen Runde gefärbt sind. Inkonsistenz zwischen Dias befleckt gleichzeitig vorhanden sein können, aber ein Megabrain können mehrere Studie Gehirne auf einer einzelnen Folie dargestellt werden, wodurch Variabilität und erhöht die Wirksamkeit der Analyse. Einheitliche Färbung ist ein entscheidender Vorteil in einer histologischen Untersuchung und eine große Bedeutung dieser Technik. Zu guter Letzt entstehen weniger Folien auch niedrigere Beschaffungskosten.

Diese Technik könnte für Schneiden sagittale Abschnitte von einem Nagetier Gehirn leicht geändert werden. Es könnte auch für den Einsatz in Kryoschneiden das Gewebe von verschiedenen Tiermodellen und verschiedene Arten von Gewebe, wie Muskeln und Leber Proben angepasst werden. Anpassungen an das Protokoll müssten gemacht werden, einschließlich der Optimierung des Betrags der Lösungen verwendet, die Größe der Kryostat Klinge/Bühne, und das Volumen der einbettenden Form.

Diese Technik könnte auch für schwebende Techniken angepasst werden wo würde das Protokoll erst Schritt 4.6 unverändert. Bei diesem Schritt müssten Gehirn getrennt und in separaten Platte Brunnen, befleckt werden gehoben werden. Extraobacht müssten ergriffen werden, nicht um den Gehirnscheiben in den Sortiervorgang zu verwechseln.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)	Fisher Scientific	14-373-65
Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Fisher Scientific	18-41
Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-128
Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap	Fisher Scientific	03-337-23
Sucrose, poly bottle 2.5 kg	Fisher Scientific	S2-212	Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.
2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical	Fisher Scientific	O3551-4
PYREX Tall-Form Beakers	Fisher Scientific	02-546E
Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C)	Fisher Scientific	13-201-642
Fisherbrand Scoopula Spatula	Fisher Scientific	14-357Q
STANLEY Razor Blade	Grainger	4A807
Edge-Rite Microtome blades	Fisher Scientific	14-070-60
Microscope slides (1" frost) - white	Fisher Scientific	22-034-979
Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2	Fisher Scientific	70-013-032	Dilute to 1X  before use
15 piece fine paint brushes	Amazon	B079J12ZRV
PAP pen	abcam	ab2601
Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.	Electron Microscopy Sciences	EMS065