Cryosectioning simultânea de vários cérebros de roedores

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para congelar e secção de tecido cerebral de vários animais como uma alternativa economiza tempo de processamento único cérebro. Isto reduz a variabilidade de coloração durante a imuno-histoquímica e reduz o tempo cryosectioning e imagens.

Abstract

Histologia e imunohistoquímica são métodos de rotina de análise para visualizar a anatomia microscópica e localizar as proteínas dentro de tecidos biológicos. Em neurociência, bem como uma infinidade de outros campos científicos, estas técnicas são utilizadas. Imuno-histoquímica pode ser feito em tecido de slide montado ou seções flutuantes. Preparação de amostras de slides montados é um processo intensivo. O seguinte protocolo para uma técnica, chamada de Megabrain, reduziu o tempo levado para cryosection e montagem de tecido cerebral em até 90% combinando vários cérebros em um único bloco congelado. Além disso, esta técnica reduzida variabilidade vista entre rodadas, em um grande estudo histoquímico de coloração. A técnica atual foi otimizada para o uso de tecido cerebral de roedores em análises imuno-histoquímica a jusante; no entanto, pode ser aplicado a diferentes áreas científicas que usam cryosectioning.

Introduction

Aqui, apresentamos o protocolo para um método novo, que chamamos de Megabrain, desenvolvido para cryosection vários roedores cérebros simultaneamente para procedimentos de imuno-histoquímica a jusante. Um Megabrain permite a produção de slides único contendo tecido de vários animais. Esta técnica foi otimizada para corte coronais seções de 9 hemisférios do rato adulto, ou 5 cérebros completo adultos, simultaneamente. Portanto, a técnica é mais aplicável em estudos imuno-histoquímicos grandes ou outras análises feitos no tecido cerebral slide-montado de uma grande coorte de animais.

Imuno-histoquímica envolve o uso de anticorpos específicos dirigidos contra proteínas de interesse para compreender e caracterizar a sua expressão e as mudanças celulares em tecido específico^1,2,3. O uso de imuno-histoquímica é prevalente em pesquisas da neurociência, entre outras disciplinas científicas, auxiliando na compreensão do cérebro⁴celular e molecular. Estudos em grande escala envolvendo muitos animais e seções do cérebro podem ser tanto recurso e tempo intensivo. Como tal, há uma multifacetada lógica por trás do desenvolvimento da Megabrain: reduzir o tempo gasto cryosectioning, montagem e manchando o tecido, enquanto estiver usando, consequentemente, menos reagentes. Além disso, a capacidade de agilizar o processo e manchar o cérebro múltiplas na mesma rodada ajuda a aliviar um pouco a variabilidade entre lotes, uma limitação de imuno-histoquímica³a coloração. Além disso, um Megabrain de corte é uma alternativa de economia de tempo para secionar cérebros de roedores congelados individuais e permite a comparação rápida de tecido entre animais ou até mesmo grupos de tratamento por técnicas de microscopia.

Protocol

A técnica de Megabrain foi otimizada usando o cérebro todo e hemisected de C57Bl6 ratos adultos machos⁵, ratos Sprague-Dawley jovens e adultos ratos Sprague Dawley que foram perfundido com solução salina tamponada fosfato (PBS) seguida de 1x de transcardially por de paraformaldeído 4%⁶. Resultados semelhantes podem ser realizados em outras cepas de camundongo e rato, em ambos os sexos e de diferentes faixas etárias. O estudo para gerar dados para este manuscrito usado juvenis ratos Sprague-Dawley e foi aprovado pelo Comitê de uso e cuidados com animais institucional Universidade do Arizona, e os animais experimentais foram cuidados de acordo com o guia para o cuidado e o uso de laboratório Animais⁷.

1. Cryoprotection de cérebros perfundidos

1. Seguir bem sucedido transcardial perfusão⁶, recolher o cérebro cheio de^6,8 de animais e fixar, colocando em um frasco de 25 mL de paraformaldeído 4% em PBS por 24 h.
   Cuidado: Paraformaldehyde é um fixador de tecidos tóxicos; Manuseie com cuidado. Transferir o paraformaldeído para um contentor de resíduos especificamente rotulado que identifica sua concentração e volume dentro uma coifa química e então a loja nos resíduos químicos do armário até descartado por segurança química ou devidamente treinados.
2. Após decorrido 24 h, em uma coifa, retire os miolos paraformaldeído 4%, usando uma espátula. Transferi o cérebro para um tubo de aproximadamente 20 mL da solução de sacarose a 15% em 1x Tris salino (TBS) até o cérebro afunda até o fundo do frasco (aproximadamente 24 h).
3. Em seguida, transferi o cérebro de um frasco de cerca de 20 mL de solução de 30% de sacarose em 1 x TBS, até o cérebro afunda até o fundo do frasco (aproximadamente 24-48 h).

2. cérebro congelamento

1. Coloque um copo de vidro de 500 mL em uma cama de gelo seco em um balde de gelo. Despeje o copo de vidro, 300 – 400 mL de isopentano (2 metil-butano).
2. Permitir que a temperatura do isopentano chegar entre-45 ° C e -50 ° C. Intimamente, monitorar e manter esta faixa de temperatura com um termómetro, mantendo-se constante durante todo o procedimento. Certifique-se de que as leituras de temperatura são tomadas a partir do meio da solução e enquanto não tocar a parte inferior ou lateral do copo.
3. Sobre a bancada, preencher uma descartável incorporação molde (ver lista de materiais) cheio de aproximadamente 1/2 de temperatura de corte ideal (OCT; ver Tabela de materiais) composto. Certifique-se de que não há nenhuma bolha de ar na OCT. Se houver quaisquer bolhas de ar retire com uma espátula ou uma agulha.
4. Retire o primeiro cérebro do frasco de 30% de sacarose, com uma espátula. Neste ponto, ou congelar todo o cérebro ou hemisect, dependendo do projeto de estudo.
   1. Hemisected cérebro, use uma lâmina nova para fazer um corte limpo através do tecido para separar os hemisférios. Se não é necessário para o estudo, remova o cerebelo e os bulbos olfatórios nesta fase. Se o cerebelo é necessária para o estudo, sugere-se para cortar uma área plana na extremidade posterior do cérebro para auxiliar o cérebro no pé direto no molde. Se o estudo requer apenas o tecido de uma região localizada, uma matriz de cérebro de roedor pode ser usado para bloquear o cérebro com base nas coordenadas conhecidas.
5. Dar o cérebro um numérico nomeando o sistema. Desenhe um diagrama como mostrado na Figura 1. Escreva o número do primeiro cérebro para ser colocado no molde Megabrain na posição 2, deixando a posição 1 como um espaço em branco para ajudar na identificação rápida da orientação em que o cérebro foram congelado.
6. Usando fórceps rombudo ou uma pinça, pegar o cérebro para ser colocado na posição 1. Oriente o cérebro com o lado a ser cortado primeiro virado para cima. Baixe o cérebro em OCT no local apropriado, usando a pinça para ajustar sua posição até que ela representa de forma independente.
7. Repita as etapas de 2.3-2.5 para os cérebro/hemisférios restantes a serem congelados em posições 3 – 10. Evite os miolos/hemisférios de posicionamento em um layout simétrico.
8. Revise todos os 9 cérebros no molde Megabrain. Uma vez que o cérebro está independente, ereto e corretamente orientado na OCT (como mostrado na Fig. 2B), adicione mais OCT no molde (até o topo dos cérebros são cobertas). Novamente, certifique-se que não há nenhuma bolha de ar visível na OCT.
9. Use a pinça para segurar o canto do molde, assegurando que a pinça não tornar-se parcialmente submerso na OCT (Figura 3A). Tendo o cuidado de manter o nível do molde, baixe o molde para o isopentano (-45 ° C a-50 ° C) para que o fundo terceiro do molde está submersa. Segure aqui para permitir que quaisquer bolhas na OCT para subir à superfície e longe do tecido (Figura 3B).
10. Após 30 s, menor o molde inteiro para o isopentano e lançamento da pinça, deixando o Megabrain submersa pelo menos 3 min (Figura 3). Certifique-se de que o molde é mantido nível, assim cérebro permanecem na posição vertical e equidistantes (Figura 3D).
11. Após 3 min, uso a pinça para remover o molde contendo o congelado, OCT incorporado cérebros (Figura 3E) do isopentano.
12. Imediatamente, embrulhe o molde e seu conteúdo em folha de alumínio e rotulá-la com o seu número de animais ou Megabrain. Toque o Megabrain congelado com moderação quanto possível para evitar descongelar o tecido.
13. Este Megabrain agora pode ser transferida para um freezer-20 ° C e armazenado por um período mínimo de 24 h.
    Nota: Protocolo pode ser pausado aqui e o Megabrain pode ser armazenado congelados até cryosectioning tem lugar.

3. preparar o Megabrain para secionar no criostato

1. Regule a temperatura do gabinete do criostato a-19 ° C. Certifique-se que esta temperatura é atingida antes de continuar. Em toda a corte, certifique-se de que a temperatura do gabinete permanece entre-18 ° C e -20 ° C.
2. Pegue o Megabrain do congelador-20 ° C e coloque-o no criostato. Além disso, coloca um mandril das dimensões de tamanho apropriado e dois pincéis de ponta finas em criostato. Embora tanto o Megabrain e o chuck no criostato pelo menos 15 min vir para a temperatura do criostato.
3. Adequadamente os slides de etiqueta com o número de identificação de Megabrain e o número do slide. Colocar esses slides em um slide mais quente (35 a 45 ° C).
4. Desembrulhe o Megabrain partir da folha de alumínio. Use uma lâmina de barbear para cortar verticalmente os cantos do molde para permitir a fácil remoção do bloco de out do molde (Figura 4A).
5. Dispense uma camada fina (aproximadamente 3 mm de espessura) de outubro para o chuck.
6. Rapidamente, com contato mínimo entre os dedos e a OCT, coloque o Megabrain sobre o chuck, na orientação desejada. Pinça grande também pode ser usada para esta etapa para minimizar a descongelar. Antes de começar a seção, deixe o Megabrain montado chuck no criostato por 15 – 20 min permitir a OCT congelar completamente.
7. Uma vez que a camada de base de PTU congelou, aplicar uma camada de 2 mm de espessura OCT em torno dos lados da Megabrain e permitir isto a descer dos lados para o chuck. Isso ajuda a proteger o Megabrain para o chuck. Mais uma vez, antes de continuar, deixe o chuck Megabrain montado em criostato por 15 – 20 min permitir a OCT congelar.
8. Use uma lâmina de barbear para remover qualquer excesso OCT pelo lado ou fundo do mandril (Figura 4B).

4. Cryosectioning o Megabrain

1. Antes de começar, certifique-se de que um copo contendo pelo menos 20 mL 1X PBS está acessível.
2. Posicione o chuck, montado com o Megabrain, na cabeça do chuck no criostato (Figura 4B).
3. Defina o criostato para cortar na espessura desejada. A metodologia atual foi otimizada para 10 µm a 50 µm de seções.
4. Aparar a OCT e tecido conforme necessário para atingir a região do cérebro desejado para coleta de tecido (Figura 4).
5. Quando estiver pronto para coletar o tecido, baixe a placa anti-roll até descansa no palco e girar o punho do criostato para tomar uma única seção. Lentamente levante a placa anti-roll, tendo o cuidado que o Megabrain seccionado não está associado a placa anti-roll e não cai fora do palco, Figura 4).
6. Delicadamente, use os pincéis para Megabrain madeixa até ele é deitado de fase criostato (Figura 5A). (Se for necessário, mantenha a OCT plana usando os pincéis para impedir o rolamento).
7. Remover do slide mais quente e focalizar o slide, o lado da etiqueta virado para baixo, sobre a seção de Megabrain no palco permitindo a seção grudar o slide.
8. Rapidamente, aplicar uma gota de 1X PBS a cada secção de tecido no slide e não permita que estas secar até que eles tenham sido escovados lisos (consulte a etapa 4.9).
9. Use um pincel com ponta fino mergulhado em 1X PBS para escovar fora quaisquer bolhas no tecido e desdobre o tecido, então ele está deitado de slide (Figura 5B). Tome cuidado para não alterar a posição das seções do cérebro e, assim, perder a posição relativa às outras seções de tecido. Manipule o tecido com cuidado para evitar as lágrimas. Manter as seções do cérebro longe das bordas do slide, como espaço periférico é necessário para uma lamela e aplicação de caneta PAP em alguns protocolos de coloração.
10. Coloque o slide para o slide mais quente e seco durante 45 min. tampa conforme necessário para impedir que a poeira fixando-se sobre o tecido. Depois de seco, armazene os slides na-80 ° C até utilização posterior.

Representative Results

Um resultado final positivo para este procedimento é um tecido que se encontra no slide, sem bolhas ou lágrimas, na orientação em que estavam congelados. Seções do tecido são espaçadas separados e facilmente identificável devido a boa colocação do cérebro na OCT e boa notação como demonstrado na Figura 1. Supondo que o tecido cerebral foi coletado de animais de idade semelhante, e que o tecido foi devidamente alinhado na OCT, seções coletadas em um slide devem representar um plano coronal semelhante, permitindo a comparação de regiões do cérebro entre os animais. Desde que o tecido tem congelado, com congelamento mínimo artefato, coloração H & E pode ser realizada para avaliar a qualidade de cryoprotection⁹. Imuno-histoquímica pode ser realizada conforme demonstrado com a coloração mostrada na Figura 6.

Figura 1: diagrama representativo de um layout sugerido de Megabrain. Isto mostra a notação de posição do tecido derivado de 9 animais diferentes. O sistema de número é projetado como demonstrado; no entanto, pode ser utilizado qualquer sistema de numeração. 'X' é a representante do espaço em branco projetado para mostrar claramente a orientação em que o tecido foi congelado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: incorretamente e corretamente posicionado cérebros no molde. (A) hemisférios mal alinhados em OCT do topo e o lado do cérebro. (B) hemisférios do cérebro bem alinhados em OCT do topo e o lado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: etapas do cérebro congelando. (A) Megabrain antes de ser submerso em isopentano-45 ° C. (B) Megabrain quando submerso em isopentano. (C) Megabrain totalmente submerso em isopentano. (D) Megabrain sendo baixado em isopentano, demonstrando que o cérebro deve ficar ereto e equidistantes um do outro durante este processo. (E) A congelado Megabrain em um molde de encastre. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: principais fases em cortar um Megabrain. (A) Megabrain sendo removido do molde a incorporação no criostato. (B) Chuck montado com Megabrain. (C) aparadas Megabrain. (D) Megabrain seção no palco do criostato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: seção de pré e pós-montada Megabrain. (A) congelado Megabrain seção (40 µm) no palco do criostato. (B) lâmina de vidro montado com tecido Megabrain. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: imuno-histoquímica de um slide Megabrain manchadas com Iba1. (A) tecido tirado de um uniforme de coloração entre diferentes cérebros em um estudo, indica Megbrain. (B) x 20 microscópicas imagens tomadas da região de córtex somatossensorial barril campo (S1BF) de cada cérebro montado, mostrando consistente ionizado molécula adaptador de ligação de cálcio 1 (Iba1) coloração da microglia entre cérebros. Barra de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

É preciso considerar durante este procedimento que a temperatura da Megabrain e seus arredores deve ser constantemente monitorada para evitar descongelar e recongelar do tecido. O cérebro só pode ser removido do congelador-20 ° C acima de 3 vezes como cada vez é tocado e esquerda no criostato, com uma temperatura mais quente flutuante, o tecido derrete e refreezes, causando uma geleia como textura e tecido anormal integridade¹⁰. Portanto, é ideal para cortar o Megabrain tudo de uma vez.

Cryoprotection e fixação de tecidos são peças-chave do presente protocolo para minimizar a formação de cristais de gelo, reduzir o crescimento microbiano externo e pare de reações enzimáticas, preservando a integridade de tecido¹⁰. Se o cérebro não está cryoprotected com sacarose, água dentro o tecido pode formar cristais de gelo durante o processo de congelação, que Desfie o tecido e causar buracos ao formulário. Enquanto nós sugerimos diluições em série de sacarose em TBS, cérebros podem ser colocados diretamente em 30% de sacarose durante um período prolongado (48-72 horas) alcançar semelhante cryoprotection. No entanto, é recomendável que as soluções de sacarose são feitas com variações de TBS, tais como o uso de PBS ou água resultará em cryoprotection pobre da Megabrain e da qualidade pobre do tecido. Coloração de hematoxilina e eosina (H & E) pode ser usada para avaliar a qualidade do cryoprotection e consequente congelamento artefato¹¹. Tecido boa qualidade (com furos mínimas) é essencial em estudos histológicos, como os buracos podem interromper a ligação de anticorpos, bem como reduzir a integridade do tecido de células com processos bem, o que podem afetar a análise de algumas manchas. Evite a colocação simétrica dos cérebros, pois isso pode causar confusão ao tentar identificar o animal do qual cada cérebro foi obtido.

A técnica atual foi otimizada para secções coronais; no entanto, pode ser facilmente adaptado para cortar seções sagitais e transversais. Essas modificações de corte exigirá a variação apropriada de colocação de cérebro em etapas 2.5 através de 2.7. Note-se que estas adaptações podem reduzir o número de cérebros que cabem em um molde de encastre.

Uma modificação fundamental desta técnica é o espaço em branco no número de posição 1 (como mostrado na Figura 1). Este espaço é projetado para permitir a fácil identificação da orientação Megabrain e, portanto, identificar o animal que está associado com cada cérebro.

Esta técnica foi modificada para permitir que o tecido de um número maior de animais a ser congelados e corte simultaneamente no Megabrain. O tamanho do cérebro de roedor é dependente de sexo, idade e espécie o número de cérebros que se encaixam no molde pode variar. Não é aconselhável separe diferentes idades, sexos ou grupos de tratamento em separado Megabrains. Embora isto pode assegurar a uniformidade de tamanho, também pode aumentar viés e subjetividade durante a geração de imagens e análise. Além disso, há uma inevitável variação entre os slides durante a imuno-histoquímica em qualquer protocolo, o que poderia levar a coloração inconsistência entre grupos de idade/sexo.

Um Retangular, maior chuck foi usado, no lugar de uma circular, que proporcionou maior apoio por trás da Megabrain.

Assim o molde e seu conteúdo de um volume maior do que a de um cérebro singular em um molde de OCT, mais tempo foi necessário para congelar o cérebro no isopentano. Por tentativa e erro, determinou-se um período de tempo que desde congelamento de boa qualidade (3,5 minutos). O Megabrain pode ser deixada no isopentano por mais tempo; no entanto, a temperatura deve ficar na faixa de-45 ° C a-50 ° C para evitar rachar a OCT.

Como há muitas partes de tecido no Megabrain slide, é possível que o tecido pode secar e, consequentemente, tornam-se mais frágeis durante as etapas de escovagem. Para combater este problema, uma gota de PBS deve ser colocada em cada seção individual do cérebro para mantê-lo úmido, até que é escovado para fora.

A técnica de hemisecting o cérebro, para um estudo em que isso é necessário, é fundamental para a obtenção de bons resultados. Quando hemisecting o cérebro, é importante que essa bissetriz é feito precisamente para garantir a que todas as regiões do cérebro estão intactas com o hemisfério correto. Se o cerebelo ou bulbos olfatórios não são relevantes para o estudo, podem ser removidas. Remover esse 'excesso' de tecido reduz a quantidade de tecido que precisarão ser aparadas quando cryosectioning. Remover o cerebelo permite que o cérebro se levantar mais facilmente na OCT antes do congelamento.

Enquanto ser escovados para fora, mantenha as seções de tecido longe da borda do slide. Isso permite que o espaço para uma linha de caneta PAP, uma barreira hidrofóbica, para cercar o tecido, que é uma exigência de alguns protocolos de immunohistochemistry. Além disso, o espaço é necessário para a lamela.

Se o hemisfério/cérebro cai ou se inclina durante o Megabrain congelar, então, as seções não será co plaina. Um resultado semelhante pode resultar se um cérebro é maior do que os outros em um único Megabrain. Para superar isso, mais slides podem ser selecionados para manchar onde o brain(s) em questão está em área apropriada de interesse.

Uma limitação dessa técnica é que, como todos do tecido é congelado em um bloco de PTU; se há um erro técnico, como um mau congela devido a uma temperatura incorreta e, em seguida, o tecido de vários animais será afetado (5-9 cérebros animais em vez de apenas 1). Este é mais um problema ao usar o cérebro completo e não hemisected seções, porque o hemisfério restante pode ser congelado e seccionado individualmente para obter as seções desejadas.

Uma outra limitação para este método é que, ao ajustar o criostato para cortar o Megabrain, uma abordagem melhor ajuste deve ser tomada. Isto é devido todo cérebro sendo em ângulos ligeiramente diferentes para o outro, Considerando que este não é um problema quando um cérebro singularmente congelado de seccionamento. Os efeitos disso podem ser minimizados durante o congelamento, garantindo os cérebros são eretas e de um tamanho similar.

Uma das maiores vantagens de usar esta técnica sobre congelamento cérebros singularmente é que encurta o tempo total gasto congelando e cérebros de corte em até 90%, se 9 estão sendo cortados no mesmo ritmo como 1 cérebro. A outra principal vantagem desta técnica é que permite um menor número de slides que contêm tecido de animais necessários para ser manchado. Isso aumenta a confiabilidade e a uniformidade de coloração imuno-histoquímica, desde que todas as lâminas são coradas na mesma rodada. Pode haver inconsistência entre lâminas coradas ao mesmo tempo, mas um Megabrain pode permitir vários cérebros de estudo a ser representado em um único slide, assim reduzindo a variabilidade e aumentar a validade da análise. Ter coloração consistente é uma vantagem fundamental em qualquer estudo histológico e uma grande importância do uso desta técnica. Por último, menos slides também incorrer em custos de abastecimento.

Esta técnica pode ser facilmente modificada para seções a corte sagital de um cérebro de roedor. Também pode ser adaptada para uso em cryosectioning o tecido de modelos animais diferentes e diferentes tipos de tecidos, tais como amostras de músculo ou fígado. Adaptações ao protocolo teria de ser feita, incluindo a otimização da quantidade de soluções usadas, tamanho da lâmina/fase criostato e o volume do molde de encastre.

Esta técnica também pode ser adaptada para técnicas de livre flutuação, onde o protocolo permaneceria o mesmo até o passo 4.6. Neste passo, cérebro precisaria ser separados e levantado em poços da placa separada para ser manchado. Um cuidado especial precisa ser tomado para não confundir as fatias do cérebro no processo de classificação.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)	Fisher Scientific	14-373-65
Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Fisher Scientific	18-41
Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-128
Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap	Fisher Scientific	03-337-23
Sucrose, poly bottle 2.5 kg	Fisher Scientific	S2-212	Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.
2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical	Fisher Scientific	O3551-4
PYREX Tall-Form Beakers	Fisher Scientific	02-546E
Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C)	Fisher Scientific	13-201-642
Fisherbrand Scoopula Spatula	Fisher Scientific	14-357Q
STANLEY Razor Blade	Grainger	4A807
Edge-Rite Microtome blades	Fisher Scientific	14-070-60
Microscope slides (1" frost) - white	Fisher Scientific	22-034-979
Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2	Fisher Scientific	70-013-032	Dilute to 1X  before use
15 piece fine paint brushes	Amazon	B079J12ZRV
PAP pen	abcam	ab2601
Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.	Electron Microscopy Sciences	EMS065