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Acompanhamento a longo prazo de vídeo de animais aquáticos, Cohoused: um estudo de caso da atividade locomotora diária do lagostim (Nephrops norvegicus)

Published: April 8, 2019 doi: 10.3791/58515
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 1, 2
1Universitat Oberta de Catalunya, 2Institute of Marine Sciences, Spanish National Research Council (CSIC), 3Institute for Environmental Protection and Research (ISPRA), 4Department of Biology and Ecology of Fishes, Leibniz-Institute of Freshwater Ecology and Inland Fisheries
* These authors contributed equally

Summary

Aqui nós apresentamos um protocolo para controlar individualmente os animais durante um longo período de tempo. Ele usa a visão computacional, métodos para identificar um conjunto de marcas construídos manualmente usando um grupo de lagostas como estudo de caso, simultaneamente, fornecendo informações sobre como a casa, manipulam e marcam as lagostas.

Abstract

Apresentamos um protocolo relacionado a uma técnica de controle de vídeo baseada na limiarização de imagem que torna possível controlar individualmente os animais cohoused e subtração de fundo. Nós testamos a rotina de rastreamento com quatro cohoused lagostim (Nephrops norvegicus) sob condições de luz-escuridão durante 5 dias. As lagostas tinham sido marcadas individualmente. A instalação experimental e as técnicas de rastreamento utilizadas baseiam-se inteiramente sobre o software de código aberto. A comparação entre a saída de rastreamento com uma detecção manual indica que as lagostas eram corretamente detectado 69% das vezes. Entre as lagostas detectadas corretamente, suas marcas individuais foram corretamente identificados 89,5% das vezes. Considerando a taxa de quadros usados no protocolo e a taxa de circulação de lagostas, o desempenho de rastreamento o vídeo tem uma boa qualidade, e os resultados representativos suportam a validade do protocolo em produzir dados valiosos para as necessidades de pesquisa (individual ocupação de espaço ou padrões de atividade locomotora). O protocolo apresentado aqui pode ser facilmente personalizado e é, portanto, transferível para outras espécies, onde o acompanhamento individual de espécimes em um grupo pode ser valioso para responder às perguntas de pesquisa.

Introduction

Nos últimos anos, rastreamento automatizado baseado em imagem forneceu conjuntos de dados altamente precisos que podem ser usados para explorar questões básicas em ecologia e comportamento de disciplinas1. Esses conjuntos de dados podem ser usados para a análise quantitativa do comportamento animal2,3. No entanto, cada metodologia de imagem usada para controlar os animais e avaliação de comportamento tem seus pontos fortes e limitações. Nos protocolos de rastreamento com base em imagem que usa a informação espacial de quadros anteriores em um filme para controlar animais4,5,6, erros podem ser introduzidos quando cruzam os caminhos dos dois animais. Esses erros são geralmente irreversíveis e propagam-se através do tempo. Apesar dos avanços computacionais que reduzem ou quase eliminam este problema5,7, estas técnicas ainda precisam de ambientes homogêneos experimentais para rastreamento e identificação animal precisa.

O emprego de marcas que podem ser identificados exclusivamente em animais evita esses erros e permite o acompanhamento a longo prazo dos indivíduos identificados. Marcadores amplamente utilizados (por exemplo, códigos de barra e códigos QR) existem na indústria e comércio e podem ser identificados utilizando técnicas de visão de computador bem conhecidos, tais como aumentada realidade (por exemplo, ARTag8) e calibração da câmera (por exemplo, CALTag9 ). Animais marcados anteriormente têm sido utilizados para estudos comportamentais de alta produtividade em diferentes espécies animais, por exemplo, formigas3 ou abelhas10, mas alguns desses sistemas anteriores não são otimizadas para reconhecer tags isolado3.

O protocolo de rastreamento apresentado neste trabalho é especialmente adequado para rastreamento de animais, imagens de um canal, tais como infravermelho (IR) luz ou luz monocromática (particularmente, nós usamos luz azul). Portanto, o método desenvolvido não usa pistas de cor, sendo também aplicáveis a outras configurações onde há restrições em iluminação. Além disso, usamos etiquetas personalizadas concebidas de modo a para não perturbar as lagostas e, ao mesmo tempo, permitir a gravação com câmeras de baixo custo. Além disso, o método utilizado aqui é baseado na deteção de marca independente de quadro (i.., o algoritmo reconhece a presença de cada marca na imagem independentemente das trajectórias anteriores). Esse recurso é relevante em aplicações onde os animais podem ser ocluídos temporariamente ou trajetórias dos animais podem se cruzam.

O design da marca permite seu uso em diferentes grupos de animais. Uma vez que os parâmetros do método são definidos, pode ser transferida para resolver outros problemas de controle de animais sem a necessidade de formação de um classificador específico (outros crustáceos ou gastrópodes). As principais limitações de exportar o protocolo são do tamanho da marca e a necessidade de ligação com o animal (o que faz não é adequado para pequenos insetos, como moscas, abelhas, etc.) e o pressuposto 2D para a circulação de animais. Essa restrição é significativa, dado que o método proposto assume que o tamanho de etiqueta permanece constante. Um animal mover-se livremente em um ambiente 3D (por exemplo, peixe) iria mostrar tamanhos de marca diferente dependendo de sua distância para a câmera.

O propósito do presente protocolo é fornecer uma metodologia user-friendly para acompanhamento de vários animais marcados por um longo período de tempo (dias ou semanas), em um contexto 2D. A abordagem metodológica baseia-se na utilização de hardware e software de fonte aberta. O software livre e open source permite adaptações, modificações e redistribuição livre; Portanto, o software gerado melhora em cada etapa11,12.

O protocolo apresentado aqui se concentra em um laboratório criado para acompanhar e avaliar a atividade locomotora de quatro animais aquáticos em um tanque por 5 dias. Os arquivos de vídeo gravados a partir de uma imagem de lapso de tempo de 1 s e compilados em um vídeo em 20 frames por segundo (1 dia gravado ocupa cerca de 1 h de vídeo). Todas as gravações de vídeo são automaticamente pós-processada para obter posições animais, aplicação de algoritmos e métodos de visão de computador. O protocolo permite a obtenção de grandes quantidades de dados, evitando sua anotação manual, que foi mostrada para ser demorada e trabalhosa em anteriores trabalhos experimentais13de controle.

Nós usamos o lagostim (Nephrops norvegicus) para o estudo de caso; assim, nós fornecemos condições de laboratório específicas para mantê-los. Lagostas executam ritmos de surgimento de toca bem estudados que estão sob o controle do relógio circadiano14,15, e quando cohoused, formam a hierarquia de dominância16,17. Portanto, o modelo apresentado aqui é um bom exemplo para pesquisadores interessados na modulação do comportamento, com um foco específico sobre ritmos circadianos social.

A metodologia apresentada aqui é facilmente reproduzida e pode ser aplicada a outras espécies, se existe a possibilidade de distinguir entre animais com marcas individuais. Os requisitos mínimos para a reprodução de tal abordagem em laboratório são (i) isotérmicos quartos para a instalação experimental; (ii) um fornecimento contínuo de água; (iii) mecanismos de controle de temperatura de água; (iv) um sistema de controle de luz; (v) uma câmera USB e um computador padrão.

Neste protocolo, usamos Python18 e OpenCV19 (Open Source computador Vision Library). Contamos com rápido e comumente aplicadas as operações (tanto em termos de implementação e execução), tais como plano de fundo subtração20 e imagem limiarização21,22.

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Protocol

As espécies utilizadas neste estudo não é uma espécie em extinção ou protegida. Experimentos de laboratório e de amostragem seguiram a legislação espanhola e o regulamento interno (ICM-CSIC) de institucional em matéria de bem-estar dos animal. Amostragem de animais foi realizada com a permissão da autoridade local (Governo Regional da Catalunha).

1. amostragem e manutenção animal

Nota: O seguinte protocolo baseia-se no pressuposto de que pesquisadores podem saborear s. norvegicus no campo durante a noite para evitar danos ao fotorreceptores23. Exposição de s. norvegicus ao sol deve ser evitada. Após a amostragem, as lagostas são suposto ser alojados em uma facilidade de aclimatação semelhante ao relatado anteriormente17,24, com um fluxo contínuo de água refrigerada do mar (13 ° C). Os animais utilizados neste estudo são do sexo masculinos no estado intermoult, com um comprimento de cefalotórax (CL; média ± DP) de 43.92 ± 2,08 mm (N = 4).

  1. Manter os indivíduos em compartimentos isolados para evitar quaisquer danos devido a lutas individuais (ver Figura 1a-d).
  2. Alimentá-los cerca de 3x por semana em momentos aleatórios para não interferir com o ritmo circadiano.
    Nota: Neste experimento, mexilhões (cerca de 4 g / lagosta) foram usadas como alimento. Mexilhões foram comprados de fornecedores de alimentos congelados e foram adequados para consumo humano.
  3. Usar a luz azul (425-515 nm) para simular luz horas de acordo com a sensibilidade espectral de25 espécies e as condições ambientais em 400 m profundo26 (veja Figura 1 c,d).
    Nota: A instalação usada aqui tem um teto vertical de dois azuis (478 nm) lâmpadas fluorescentes que produziu uma intensidade de luz de 12 lx a 1 m de distância entre as lâmpadas. Consulte a Figura 1a de posição dos candeeiros de tecto e a Tabela de materiais para as características do fabricante e dos técnicas lâmpadas.
  4. Ajustar o fotoperíodo de 12/12 horas de luz/escuridão centro de aclimatação ou simular o fotoperíodo natural da latitude local.
  5. Regular a temperatura de instalação de 13 ° C e monitorar 2 x diariamente para verificar a temperatura da água da mar admitida é de cerca de 13 ° C (ver Figura 1e).
  6. Regule a entrada de água do mar, a uma taxa de cerca de 4 L/min para manter boa oxigenação.
    Nota: A água do mar circula em um circuito aberto (sem filtros e bombas adicionais são usadas). O abastecimento de água depende dos serviços de planta do aquário principal.

Figure 1
Figura 1 : Vistas de aclimatação facilidade. (um) tanque de prateleiras. (a1) Água do mar de entrada. (a2) Luzes de teto fluorescente. (b) detalhe da luz azul iluminação. (c) detalhe da célula Animal. (d) detalhe de um painel de controle de instalações isoladas. (e) temperatura de configuração para uma das entradas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. construção da marca

Nota: A tag usada aqui pode ser alterada de acordo com as características do animal-alvo ou outras considerações específicas.

  1. Corte quatro círculos de 40 mm de diâmetro a partir de uma folha de plástico preto.
  2. Corte de um branco PVC folha plástica dois triângulos equiláteros com lados de 26 mm.
  3. Corte de um branco PVC folha plástica dois círculos de 26 mm de diâmetro.
  4. Marque o centro dos círculos e triângulos brancos e fazer um buraco de 10 mm.
  5. Cole as quatro formas brancas ao centro dos quatro círculos pretos.

Figure 2
Figura 2 : As quatro rótulos usadas para a marcação individual das lagostas. Círculo, círculo-buraco, triângulo, triângulo-buraco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. experimental Setup

Nota: A arena experimental é suposto para ser de forma independente da câmara experimental de mas em estreita proximidade com a facilidade de aclimatação.

  1. Prepare uma câmara experimental onde a temperatura do ar pode ser controlada e mantida à mesma temperatura como a água do mar na área experimental.
  2. Modifica um tanque de fibra de vidro (1.500 x 700 x 300 mm) para ser usado como uma arena de experimental. Adicione quatro burrows usando tubos de PVC flexíveis no fundo do tanque e vara de areia na superfície onde as lagostas são deveria para mover (Figura 3b-e). Para mais detalhes, consulte17,,27.
    1. Fornecer a arena experimental com LEDs azuis electrobomba submersível (472 nm, simulando luz horas) e IR LEDs (850 nm, condições escuras) (ver também Figura 3a)17,24.
      Nota: Diodo emissor de luz é usado devido ao seu impacto de baixa temperatura e a disponibilidade de controle eletrônico utilizável e hardware livre. Utilizou-se uma instalação isolada com uma temperatura ambiente e água do mar de 13 ± 0,5 ° C.
    2. Mantenha sempre o IR LEDs ligado.
      Nota: O IR é necessário para gravar vídeo no escuro e em condições de luz. Não é necessário desligá-lo.
    3. Conecte os LEDs azuis com um aparato para gerenciar o fotoperíodo. Veja as sugestões na Tabela de materiaise para mais detalhes, consulte Sbragaglia et al.. 17 (também mostrado na Figura 3a).
      Nota: Iluminação em vídeo ou imagem-automatizada de análises é um fator crítico. Iluminação regular sem sombras por toda a arena evitando reflexões de superfície de água facilita a posterior vídeo ou análise de imagem. No âmbito do presente protocolo, utilizaram-se as condições de luz/escuridão apenas 12/12. Luz e escuridão gradualmente foram alcançadas dentro de 30 min, e um roteiro de luz-controlador é adicionado como arquivo suplementar 1.
    4. Coloque a entrada da água do mar refrigerada em um canto do tanque e a tomada correspondente no canto oposto.
    5. Regule a entrada de água do mar com um caudal de cerca de 4 L/min.
    6. Cercam o tanque com uma cortina preta a fim de proporcionar um isolamento completo de outro luz (Figura 3a).
  3. Coloque o tripé para que a câmara web é fixo ao lado da arena experimental e posição da câmera de vídeo acima (130 cm) e no centro da arena experimental (75 x 32,5 cm (ver Figura 3a).
  4. Verifique se a câmera de vídeo está na posição centrada (ver passo 3.3) para certificar-se não foi movida involuntariamente.
  5. Conecte a câmera da web para um computador que é colocado do lado de fora da cortina (Figura 3a).
    1. Instale o software para gerenciar a gravação de lapso de tempo com a câmera de vídeo.
      Nota: Gravações de lapso de tempo dependem de velocidade do movimento da espécie. Consulte também a Tabela de materiais para a câmera, lente olho de peixe, PC e características de software e fabricantes usados aqui.
    2. Ajuste os parâmetros do vídeo gravação de acordo com as características da espécie.
      Nota: Considerando a taxa de mobilidade de s. norvegicus, uma gravação de lapso de tempo 1 s foi usada aqui, e o vídeo foi salvo a cada 24 h.
    3. Certifique-se de criar um timestamp (incluindo a data) no vídeo lapso de tempo (como isso pode ajudar para o futuro manual de Pontuação do comportamento).

Figure 3
Figura 3 : Instalação experimental. (a) diagrama da Assembleia do experimental aquisição de tanque e vídeo. (b) vista geral do tanque experimental. (c) fundo vista do tanque experimental, indicando a burrows artificial. (d), Top view, mostrando o fundo do tanque experimental. (e) detalhe de uma das entradas de toca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. experimental julgamento e preparação de animais

Nota: Todas as etapas com animais devem ser feitas na instalação de aclimatação e sob condições de luz vermelha, de acordo com a sensibilidade espectral de lagosta da Noruega25. Quando se deslocam os animais entre a aclimatação e a instalação experimental, evite qualquer exposição de lagostas à luz, com um saco preto opaco para cobrir a geladeira.

  1. Preparar uma geladeira anteriormente separada em quatro compartimentos submersos com água a cerca de 7 ° C.
  2. Prepare as quatro marcas anteriormente construída e rápida colagem, como cianoacrilato.
  3. Prepare uma bandeja com gelo picado.
  4. Selecione as quatro lagostas para serem marcadas na instalação de aclimatação e colocar cada um em um compartimento do congelador.
  5. Espere 30 min e, em seguida, iniciar o procedimento de marcação.
    1. Pegue uma lagosta e colocá-lo no gelo esmagado por 5 min para imobilizá-lo e facilitar a operação de marcação.
    2. Secar a parte superior do cefalotórax a lagosta com papel de adsorção e colocar uma gota de cola rápida sobre ele.
    3. Coloque a tag horizontalmente no topo do cefalotórax do animal, em contacto com a cola, e esperar o tempo suficiente para a endurecer (por cerca de 20 s).
    4. Retornar a lagosta para seu compartimento na geladeira e prosseguir com os outros três animais da mesma forma.
    5. Coloque as lagostas voltar para a cela onde estavam anteriormente e esperar 24h para ter certeza que a marca está devidamente colada.
    6. Transferi as lagostas da instalação de aclimatação à câmara experimental, usando a mesma geladeira que foi usada para o procedimento de marcação.
  6. Iniciar a gravação de vídeo e esperar 5 minutos antes de introduzir as lagostas marcadas. Obter uma imagem de fundo em média de 100 quadros iniciais.
    Nota: Esperar um mínimo de 1 min é obrigatório para obter o quadros de fundo sem etiquetado lagostas; Eles são necessários para o processamento de vídeo.
  7. Introduza os animais um por um no tanque de experimentação dentro de seu respectivo compartimento, mantendo a água nele.
  8. Esperar por eles para sair; Se eles não saírem, ajudá-los delicadamente inclinando o compartimento. Consulte a Figura 4 como exemplo dos animais dentro do tanque sob condições experimentais.

Figure 4
Figura 4 : Quadro de vídeo raw. Um exemplo de um quadro de representante de um dos vídeos Time-Lapse coletados durante os experimentos. No canto superior direito, mostramos o carimbo de hora com a data, hora e quadro. Observe as diferenças na iluminação do aquário no canto inferior da imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. a análise Script

  1. Realizar a análise após a conclusão do experimento.
    1. Abra o script de visão de computador para análise de vídeo.
    2. Lançar o programa em Java para calcular as posições e a distância percorrida pelas lagostas e inserir os dados no banco de dados.
      Nota: Este programa é um algoritmo baseado na distância euclidiana28.
    3. Lançamento script SQL para binning dados como intervalo de tempo desejado (ex. 10 min).

6. computador visão Script para análise de vídeo

Nota: O script evita correção de imagem de fisheye, porque ele não introduz um erro relevante na configuração experimental. No entanto, é possível corrigir isso com OpenCV câmera calibração funções29 baseado em vetor e matriz de rotação métodos30,31.

  1. Selecione a linguagem de programação Python18 .
  2. Selecione a imagem de19 OpenCV e biblioteca de processamento de vídeo.
  3. Carrega um vídeo.
    Nota: Formatos de vídeo AVI ou . MP4 foram utilizados neste experimento, mas isto não é obrigatório. Depende os FourCC32 codecs instalados no sistema operacional.
  4. Execute as seguintes etapas para cada quadro Fi no vídeo.
    1. Subtrair o fundo20B (média dos últimos 100 frames, obtidos da etapa 4.6) do atual quadro Fie atualizar a imagem de fundo B como Fi. Use a função BackgroundSubtractorMOG2 da biblioteca OpenCV19 (veja os scripts no arquivo complementar 2).
    2. Determine o conjunto de regiões de interesse (ROIs) R a partir de pixels com movimento relevante indicado pelo subtrator de fundo. Use o método aplicável de BackgroundSubtractorMOG2 na biblioteca de19 OpenCV (veja os scripts no arquivo complementar 2). No conjunto, incluem as detecções animais do quadro anterior, em animais além de conta.
    3. Execute as seguintes etapas para cada ROI Ri
      1. Aplicar a função dilate e computar os contornos33 do ROI Ri. Use as funções se dilatam e findContours da biblioteca OpenCV19 (veja os scripts no arquivo complementar 2).
      2. Calcule o casco área34Oi no número de pixels. Use a função convexHull da biblioteca OpenCV19 (veja os scripts no arquivo complementar 2).
      3. Calcular o raio35ri de ROI Ri. Use a função minEnclosingCircle da biblioteca OpenCV19 (veja os scripts no arquivo complementar 2).
      4. Calcule a solidez si do ROI Ri. Solidez é a relação entre a área de contorno (obtida na etapa 6.4.3.1) à sua área de superfície convexa (obtida na etapa 6.4.3.2) de Ri.
      5. Calcule a taxa de proporção ai de ROI Ri. Proporção é a relação entre a largura e a altura do Ri-retângulo delimitador. O retângulo delimitador é calculado usando a função boundingRect da biblioteca OpenCV19 .
    4. Selecione um conjunto reduzido de ROIs como um candidato para conter os animais, ajustando as propriedades para a área do casco, raio, solidez e proporção.
      1. Verifique se hi é menos 500,0 ou maior que 100000.0. Em caso afirmativo, descarte o ROI Ri. Caso contrário, manter o Ri como um candidato ROI para a localização de animais.
      2. Verifique se o ri é inferior a 40,0. Em caso afirmativo, descarte o ROI Ri. Caso contrário, manter o Ri como um candidato ROI para a localização de animais.
      3. Verifique se o si é menos do que -4.0 descartar o ROI Ri. Caso contrário, manter o Ri como um candidato ROI para a localização de animais.
      4. Verifique se a ai é menor que 0,15 ou superior a 4.0. É então, descartar o ROI Ri. Caso contrário, manter o Ri como um candidato ROI para a localização de animais.
        Nota: O uso de ROIs reduz o custo computacional, focando a busca de marca na região do corpo do animal. Animais detecções de quadros anteriores são incluídas para evitar detecções erradas quando os animais não estão se movendo.
    5. Analise o animal ROIs para determinar a identidade da marca. Execução de etapas a seguir para cada ROI Ri e para cada interno ROI Pie extrair o ROIs interno P.
      1. Binarize a imagem em tons de cinza Pi usando o algoritmo de limiarização de36 de Otsu.
      2. Calcule os contornos33 de Pi, como na etapa 6.4.3.1.
      3. Calcule o casco área34Oi e a proporção ai, como em etapas 6.4.3.2 e 6.4.3.5.
      4. Calcule os momentosde forma37,38mi de Pi. Use a função momentos da biblioteca de19 OpenCV (veja os scripts no arquivo complementar 2).
      5. Selecione um conjunto reduzido de ROIs como um candidato para conter as marcas, utilizando os seguintes critérios.
        1. Verifique se hi é menos 150,0 ou superior a 500,0. Em caso afirmativo, descarte o ROI de Pi. Caso contrário, mantenha o Pi como candidato ROI para a localização da marca.
        2. Verifique se a ai é menor do que 0,5 ou maior que 1,5. Em caso afirmativo, descarte o ROI de Pi. Caso contrário, mantenha o Pi como candidato ROI para a localização de animais.
        3. Verifique se o mi é superior a 0,3. Em caso afirmativo, descarte o ROI de Pi. Caso contrário, mantenha o Pi como candidato ROI para a localização de animais.
    6. Classifica a tag ROIs. Aproximada de um polígono39 usando o OpenCV19 função38 para cada selecionado ROI Pi19.
      1. Verificar se há exatamente três vértices no polígono aproximado; atribua a tag para a classe de triângulo . Caso contrário, atribua a classe circle à região de marca.
        Nota: Aproximado de polígono armazenado usando uma matriz com os vértices.
      2. Verifique se o pixel central do ROI Pi. Se é um pixel preto , atribua o Pi à classe escondido . Caso contrário, atribua o Pi para a classe de branco .
        Nota: O centro de forma é deduzido a partir os momentos calculados na etapa 6.4.5.4. Procure os pixels pretos em uma área de um raio de 4 pixels em torno do centro.
  5. Salvar os dados do quadro: quadro data, tempo de quadro, forma classe, x centro forma e y centro forma coordenada.
  6. Continue com o próximo quadro ou encerrar o processo. Consulte a Figura 5 abaixo como um exemplo visual dos passos do roteiro de trabalho e assistir o Video 1 como um exemplo de script funcionando.

Figure 5
Figura 5 : Etapas relevantes do script de processamento de vídeo (1) avaliar o movimento de subtração de fundo sobre a média dos últimos 100 frames. (2) resultado do algoritmo da subtração de fundo. (3) aplicar uma operação morfológica dilate às áreas branco-detectado. (4) aplicar correção, estático, principal ROI; polígono amarelo corresponde à área inferior do tanque. (5) calcular contornos para cada região branco-detectado no ROI principal e realizar uma análise estrutural para cada contorno detectado. (6) verificar valores de propriedade estrutural e, em seguida, selecione os candidatos ROI de segundo nível. (7) Binarize quadro usando um algoritmo de limiarização de Otsu; o script só funciona com ROIs de segundo nível. (8) para cada binarized ROI de segundo nível, calcular os contornos das regiões brancas e realizar uma análise estrutural para cada um detectado contorno. (9) verificar a propriedade estrutural valores e, em seguida, seleciona candidatos internos de ROI. (10) para cada contorno no candidato interno de ROI, calcular os descritores/momentos. (11) Verifique se as partidas de forma detectados com o modelo forma e aproximam um polígono para os melhores candidatos de partida. (12) verificar o número de vértices do polígono aproximado e determinar a figura geométrica: círculo ou triângulo. (13), calcular a figura central e verificar se ocorrem pixels pretos; Se sim, é uma figura furada. (14) resultado visual após análise do quadro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Representative Results

Nós construímos manualmente um subconjunto dos dados experimentais para validar a análise automatizada de vídeo. Um tamanho de amostra de 1.308 quadros com um nível de confiança de 99% (que é uma medida de segurança que mostra se a amostra reflete com precisão a população, dentro de sua margem de erro) e uma margem de erro de 4% (que é uma porcentagem que descreve como fechar o resposta a amostra deu é o valor real da população) foi aleatoriamente selecionado, e realizou-se uma anotação manual de identificação correta de ROIs e a correta identificação da marca dentro de cada ROI. Observe que um único quadro pode conter um número variável de ROIs dentro de um intervalo indeterminado porque algumas lagostas podem ser escondidas dentro do burrows ou um ROI contém dois ou mais animais ou falsas detecções.

O número total de animais nos quadros de 1.308 foi 3.852 (ROIs anotados manualmente). O método revelado 3.354 detecções de animais. Um total de 701 (21%) destas detecções eram falsos positivos (ou seja, o número de ROIs onde a lagosta foi confundida com o plano de fundo). O número total de animais contados, 2.653 detecções (79%) foram corretamente correspondência (i.., o número de vezes que o classificador reconhecido corretamente a presença de uma lagosta nas regiões detectadas; ver também Figura 6a, b). No que diz respeito o total presente nos quadros de 1.308 3.852 ROIs, o script detecta 69% dos indivíduos.

Em relação a deteção de marca, o script identificado 2.353 candidatos ROI como etiquetas (89% das 2.653 regiões detectadas com animais). O classificador com êxito identificado como marca de classe 1.808 dessas tags (em que o candidato é classificado como um círculo, triângulo, círculo furado ou triângulo furado) e perdeu 545 casos (23% dos 2.353 candidatos ROI para tag). Relacionadas com a classificação de marca, 1.619 são corretamente identificados (89,5%, Figura 6f). Só 70 tags onde erradamente classificadas (3,8% erro, Figura 6e) e o restante 119 (6,6%) correspondeu a falsos positivos (ROIs internos, identificados como marca que correspondia à partes de animais, tais como garras; Figura 6D).

Figure 6
Figura 6 : Representante exibições de quadros mostrando situações experimentais mais comuns durante a análise de vídeo. (um) errado animal detecção, uma área de plano de fundo é detectada. (b), Animal misdetection. Dois animais são próximos um do outro e só é detectado. (c), forma misdetection. O animal é detectado (retângulo azul), mas a marca não é detectada. (d) falsa deteção de forma. As duas formas são detectadas, e uma é uma garra. (e) Classificação errada de uma forma. Um triângulo é classificado como triângulo-buraco. (f) Ideal situação. Todos os animais são detectados e as tags são corretamente identificadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Após a análise de vídeo foi concluída, os dados obtidos posições (X, Y) podem ser usados para avaliar diferentes padrões comportamentais de lagostas. Por exemplo, nós traçamos uma ocupação de espaço é automatizado mapa usando estimativa de densidade de kernel bidimensional com um eixo-alinhados bivariado normal do kernel, avaliado em uma grade quadrada de41,42 com o melhor desempenho estimado pelo algoritmo de estatístico. A maior cor intensidade representa as áreas foram que as lagostas passaram um percentual maior de seu tempo (Figura 7). Vídeo 2 dá um exemplo visual de rastreamento de animais.

Outro exemplo é representado pelos ritmos de atividade diária de lagostas, plotado como milímetros e coberto em intervalos de tempo de 10 min guardado (Figura 8). Nós removemos os dados correspondentes para as primeiras 24 horas da experiência, que correspondeu ao processo de adaptação ambiental dos animais.

Figure 7
Figura 7 : Mapa de ocupação do espaço. O gráfico mostra apenas a área do tanque de fundo que é a área de deslocamento do animal (ver polígono amarelo na Figura 6). As áreas foram as lagostas etiquetadas diferentes que passou mais tempo aparecem coloridas; intensidade de cor mais elevada significa mais tempo de ocupação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8 : Ritmos de atividade diária de lagostas plotados como milímetros e coberto em intervalos de tempo de 10 min guardado. Bandas cinzas indicam as horas de escuridão em 12/12 luz/escuridão, com o tempo do sol começando às 07:00 e a hora do nascer do sol começando às 19:00 clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Movie 1
Vídeo 1: Desktop registro de um exemplo de uma análise de vídeo funcionando script O vídeo mostra em 2 min e 27 s 1 h de imagens em tempo real (3.625 frames). Observe que não há nenhum acúmulo de erro para o animal e tag misdetections e eventos não identificados enquanto a gravação está sendo feita. Clique aqui para baixar este vídeo.

Movie 2
Video 2: vídeo do animal após a análise do aparelho locomotor de rastreamento. Usamos o X, Y coordenadas de pixel de imagem obtidos a partir da análise de vídeo e os armazenados no banco de dados, para desenhar o controle animal nos vídeos gravados como um exemplo do script de análise de vídeo. Quanto mais a pista, mais rápido o animal se move e a mais de distância percorrida. Neste caso, 30 s de vídeo corresponde a 12 min de tempo real. Clique aqui para baixar este vídeo.

Arquivo complementar 1: Clique aqui para baixar este arquivo. 

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Discussion

Os resultados de desempenho e representante obtidos com o protocolo de controle de vídeo confirmaram sua validade para a investigação aplicada no domínio do comportamento animal, com um foco específico sobre modulação social e ritmos circadianos dos animais cohoused. A eficácia da detecção de animais (69%) e a precisão da discriminação marca (89,5%) juntamente com as características comportamentais (ou seja, taxa de circulação) das espécies-alvo usadas aqui sugerem que este protocolo é uma solução perfeita para ensaios experimentais a longo prazo (por exemplo, dias e semanas). Além disso, o protocolo oferece a vantagem básica de ser fácil de usar e mais rápido no seu desenvolvimento e personalização em relação a outras técnicas, como algoritmos de aprendizado automático e neurais redes43. As técnicas de rastreamento usadas aqui representam o refinamento final de uma atividade experimental começado com uma abordagem um pouco diferente de44.

Um passo crítico no protocolo é o design de marca; é preciso considerar que a implementação de outros projetos de marca pode melhorar o desempenho da binarização de Otsu. Por exemplo, uma das fontes de erro relatado aqui foi o misdetection entre o preto fora círculo na marca e a forma geométrica interna branca (ver Figura 9 com um quadro de binarized com um detalhe desse erro). É possível melhorar o processo de binarização, aumentando o diâmetro (2-3 mm), do círculo preto fora a forma geométrica interna branca, ou trocando as marca as cores (branco/preto). Nós não consideramos o uso da imagem funções morfológicas como corroer ou dilatam quando tentando corrigir esse erro, dado que estas operações modifiquem as propriedades estruturais da marca fotografado, sendo, portanto, não é possível manter os valores de limiar do script. Em conclusão, é aconselhável adaptar o design de marca para a anatomia do animal espécie alvo. Isso envolve o ajuste dos valores de limiar o roteiro e as propriedades estruturais de acordo com o novo design.

Figure 9
Figura 9 : Detalhe do quadro erros de binarização. Um círculo vermelho mostra como lagostas e etiquetas são detectadas como um único objeto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A fonte mais relevante de erros foi a detecção perdida da ROIs (externa e interna). O script de análise de vídeo apresentado aqui não é capaz de manter o controle de indivíduos que estão ocultos ou ainda por um período maior do que 100 frames (o número de quadros que o script reter como história de fundo). Para evitar problemas com isto, guardávamos a última posição de um indivíduo até que ele é detectado novamente. Este parâmetro possa influenciar os resultados da falta de animais imóveis ou ocultos. Este fato deve ter em conta quando se utiliza este protocolo com espécies mostrando taxas de mobilidade diferente do que os apresentados aqui para as lagostas. O script de análise e taxa de quadro de vídeo deve ser modificado e ajustado para as espécies utilizadas de acordo com seu comportamento específico.

Um grande desafio foi obter um azul monocromático (472 nm) e IV (850 nm) iluminação, para evitar a possibilidade de danos na retina e ajustar as condições de luz ambientais para habitat23,45 do animal. Portanto, o componente de cor em gravação de vídeo não é relevante e gravações de vídeo foram realizadas em escala de cinza. O sistema propõe permite programar diferentes períodos de tempo luz e modifica o sistema de iluminação de acordo com o destino das suas características mudando o espectro de luz LED. Outra personalização a considerar no protocolo aqui apresentado é a taxa de circulação do animal alvo. Para este caso específico, a taxa de quadros usado foi 1 frame por segundo, produzindo arquivos de vídeo de cerca de 1 h gravação comprimento correspondente às 24h de experimental. Essas duas personalizações (tons de cinza e taxa de quadros) permitiram-nos obter arquivos de vídeo com um tamanho reduzido que fossem fácil de trabalhar com e reduziram a capacidade de armazenamento e tempo de máquina para rastreamento.

Uma limitação do método descrito é que ele só foi testado com as espécies apresentadas aqui; no entanto, existem sem razões específicas relativas à aplicação do presente protocolo para outras espécies que permitem a realização de etiquetas de identificação. Outra limitação importante é que o protocolo não é adequado para acompanhar os movimentos de animais apêndices (por exemplo, queles). Por exemplo, crustáceos decápodes usam movimentos queles para exibir dominância entre coespecíficos. Futuras implementações visam melhorar este aspecto.

O protocolo proposto se assemelha a de software comercial existente anterior46 publicado métodos SwisTrack e idTracker7,47. O software comercial46 usa subtração de fundo para detectar animais, semelhantes para os scripts aqui apresentados. Embora abrange um espectro mais amplo de aplicativos, ele é programado usando um programa interpretado comercialmente linguagem48, que não é uma solução open source e é economicamente dispendiosa. O método de47 SwisTrack usa a biblioteca de19 OpenCV, da mesma forma que a abordagem apresentada aqui. No entanto, ele é codificado em C++. Usamos o código Python, que é geralmente mais fácil para se adaptar às necessidades particulares de cada ambiente. IdTracker7 é uma forte abordagem codificada em um programa interpretado comercialmente48 mas alvos saliente animais aplicativos idioma. Os resultados corretos de rastreamento podem ser comprometidos quando os animais são ocluídos por um longo período de tempo, como ocorre em condições experimentais apresentadas aqui. O método apresentado aqui processos cada frame de forma independente e não é influenciado pela trajetória anterior do animal. Portanto, um erro em um quadro específico não se propaga para futuros quadros. Este fato é relevante neste aplicativo, mas também as restrições o método apresentado aqui a um conjunto específico de animais (aqueles que permitem a marcação manual).

Outro aspecto a considerar é que usamos software livre durante o desenvolvimento do protocolo, incluindo o pós-processamento e o armazenamento dos dados gerados pelo script de análise de vídeo, bem como o código usado para controlar o sistema de iluminação. Os dados processados são armazenados em um sistema de banco de dados relacional livre (MySQL). Estes dados processados podem ser obtidos através de consultas em Standard Query Language (SQL), de acordo com o formato desejado. O leitor pode modificar e adaptar o código aberto e livremente, adaptá-lo às necessidades particulares.

No que respeita à toxicidade de método, a etapa apenas delicada é o colar da marca para o animal. Usamos cola de cianoacrilato, devido à sua baixa toxicidade, seu uso largo médico49e sua ampla utilização em aquários para fragging corais e fixar os fragmentos com cola50. A maior preocupação sobre a sua utilização é a toxicidade do vapor para os seres humanos. Nós reduzimos a exposição ao mínimo. A saúde e segurança executiva e programa nacional de toxicologia dos Estados Unidos concluíram que o uso do cianoacrilato de etila é seguro51.

As aplicações futuras deste protocolo são a automatização da detecção de outros comportamentos de buraqueira crustáceos (por exemplo, brigas, toca dominância). Também pretendemos melhorar o algoritmo para obter a análise de vídeo em tempo real e usar redes neurais convolucional52 para melhor detecção de animais.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores agradecem à Dr. Joan B. empresa que financiou a publicação deste trabalho. Também, os autores agradecem aos técnicos da zona de aquário experimental no Instituto de Ciências marinhas em Barcelona (ICM-CSIC) por sua ajuda durante o trabalho experimental.

Este trabalho foi financiado pelo projeto RITFIM (CTM2010-16274; investigador principal: J. Aguzzi) fundada pelo Ministério espanhol de ciência e inovação (MICINN) e a concessão de TIN2015-66951-C2-2-R do Ministério espanhol de economia e competitividade.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tripod 475 Manfrotto A0673528 Discontinued
Articulated Arm 143 Manfrotto D0057824 Discontinued
Camera USB 2.0 uEye LE iDS UI-1545LE-M https://en.ids-imaging.com/store/products/cameras/usb-2-0-cameras/ueye-le.html
Fish Eye Len C-mount f = 6 mm/F1.4 Infaimon Standard Optical  https://www.infaimon.com/es/estandar-6mm
Glass Fiber Tank 1500 x 700 x 300 mm3
Black Felt Fabric
Wood Structure Tank 5 Wood Strips 50x50x250 mm
Wood Structure Felt Fabric 10 Wood Strips 25x25x250 mm
Stainless Steel Screws As many as necessary for fix wood strips structures
PC 2-cores CPU, 4GB RAM, 1 GB Graphics, 500 GB HD
External Storage HDD 2 TB capacity desirable
iSPY Sotfware for Windows PC iSPY https://www.ispyconnect.com/download.aspx
Zoneminder Software Linux PC Zoneminder https://zoneminder.com/
OpenCV 2.4.13.6 Library OpenCV https://opencv.org/
Python 2.4 Python https://www.python.org/
Camping Icebox
Plastic Tray
Cyanocrylate Gel To glue tag’s 
1 black PVC plastic sheet (1 mm thickness) Tag's construction
1 white PVC plastic sheet (1 mm thickness) Tag's construction
4 Tag’s Ø 40 mm Maked with black & white PVC plastic sheet
3 m Blue Strid Led Ligts (480 nm) Waterproof as desirable
3 m IR Strid Led Ligts (850 nm) Waterproof as desirable
6 m  Methacrylate Pipes Ø 15 mm Enclosed Strid Led
4 PVC Elbow  45o Ø 63 mm Burrow construction
3 m Flexible PVC Pipe Ø 63 mm Burrow construction
4 PVC Screwcap Ø 63 mm Burrow construction
4 O-ring Ø 63 mm Burrow construction
4 Female PVC socket glue / thread Ø 63 mm Burrow construction
10 m DC 12V Electric Cable Light Control Mechanism
Ligt Power Supply DC 12 V 300 W Light Control Mechanism
MOSFET, RFD14N05L, N-Canal, 14 A, 50 V, 3-Pin, IPAK (TO-251) RS Components 325-7580 Light Control Mechanism
Diode, 1N4004-E3/54, 1A, 400V, DO-204AL, 2-Pines RS Components 628-9029 Light Control Mechanism
Fuse Holder RS Components 336-7851 Light Control Mechanism
2 Way Power Terminal 3.81 mm RS Components 220-4658 Light Control Mechanism
Capacitor 220 µF 200 V RS Components 440-6761 Light Control Mechanism
Resistance 2K2 7 W RS Components 485-3038 Light Control Mechanism
Fuse 6.3 x 32 mm2 3A RS Components 413-210 Light Control Mechanism
Arduino Uno Atmel Atmega 328 MCU board RS Components 715-4081 Light Control Mechanism
Prototipe Board CEM3,3 orific.,RE310S2 RS Components 728-8737 Light Control Mechanism
DC/DC converter,12 Vin,+/-5 Vout 100 mA 1 W RS Components 689-5179 Light Control Mechanism
2 SERA T8 blue moonlight fluorescent bulb 36 watts SERA Discontinued/Light isolated facility

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Acompanhamento a longo prazo de vídeo de animais aquáticos, Cohoused: um estudo de caso da atividade locomotora diária do lagostim (<em>Nephrops norvegicus</em>)
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Garcia, J. A., Sbragaglia, V., Masip, D., Aguzzi, J. Long-term Video Tracking of Cohoused Aquatic Animals: A Case Study of the Daily Locomotor Activity of the Norway Lobster (Nephrops norvegicus). J. Vis. Exp. (146), e58515, doi:10.3791/58515 (2019).

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