Summary
在这里, 我们描述了一个协议, 以测量肾小球过滤率 (GFR) 在有意识的, 自由移动小鼠使用经皮 GFR 监测。
Abstract
肾小球滤过率 (GFR) 的透皮分析是一种用于评估小鼠肾功能和急性肾损伤和慢性肾脏疾病模型的成熟技术。测量系统包括一个微型荧光探测器, 直接附着在有意识的, 自由移动的动物背部的皮肤上, 并测量外源 GFR 示踪剂, 荧光素-异硫氰酸酯 (FITC) 的排泄动力学。共轭 sinistrin (菊粉模拟)。该系统已在大鼠中详细描述。然而, 由于其体积较小, 对小鼠经皮 GFR 的测量提出了额外的技术挑战。在这篇文章中, 我们提供了第一个详细的实用指南, 使用经皮 GFR 监测仪在小鼠基础上的结合经验, 三个不同的调查人员已经在小鼠进行了这一检测在数年。
Introduction
施莱伯和同事在2012年首次报告了使用经皮 GFR 监测仪, 并通过比较 GFR 的测量结果进行了验证, 通过直接测量 FITC-sinistrin 丸清除序列血液样本1。到目前为止, 已有35个同行评议出版物, 其中经皮 GFR 监测仪已在大鼠和小鼠中使用 (定期更新的期刊文章和会议摘要的清单, 其中使用了临床前 GFR 监测仪, 可在MediBeacon 网站2)。在大鼠和小鼠的透皮 GFR 测量已在一些出版物1,3,4,5和一个视频教程演示它在大鼠的使用已出版6。然而, 小鼠的测量带来了额外的技术挑战。在这里, 我们提供了第一个详细的实用指南, 使用经皮 GFR 监测仪在小鼠。
有多种原因, 调查人员开始倾向于使用经皮 GFR 监测仪评估啮齿类动物模型中的肾脏功能。与传统的肾功能参数如血清肌酐和血尿素氮 (包子) 7 相比, FITC-sinistrin 间隙的透皮检测可提供更灵敏、更准确的肾脏功能测量结果, 8。通过实施改进的评估算法, Friedemann 和同事证明, 该系统达到了与黄金标准相当的精度, GFR 测量的恒定输注技术3。最近的研究也表明, 使用经皮 GFR 监测仪进行顺序分析可用于研究肾功能的早期变化以及诱导急性肾损伤 (空格) 后的功能恢复, 而不会干扰动物的血液。体积或血流动力学, 因为该检测不需要连续血液取样9,10。在同一动物中反复测量高精度和灵敏性 GFR 的能力使得这种技术对各种不同的研究领域具有吸引力。经皮 GFR 监测仪已被制药公司用于评估新化合物的毒性, 以及在大学进行基础和转化研究。
Protocol
所有动物实验都是按照英国和美国当地的指导方针进行的。在利物浦大学进行的实验是根据《1986英国动物 (科学程序) 法》授予的执照进行的, 并得到了利物浦大学道德委员会的批准。在范德比尔特大学医疗中心进行的所有动物实验均由范德比尔特机构动物护理和使用委员会批准。
1. 准备 FITC-sinistrin
- 在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中制备40毫克/毫升 FITC sinistrin。
注意: 等份可以存储在-20 °c 几个月, 没有明显的质量下降;但应避免多次冻融循环。FITC-sinistrin 是光敏感的-保持管从光保护。 - 计算每只鼠标所需的 FITC sinistrin 的体积:
- 衡量每一个鼠标在每一天的测量。
- 建议剂量为0.15 毫克 FITC sinistrin 每克体重。
2. 鼠标准备
- 在进行 GFR 测量时, 为小鼠准备单独的笼子。提供吸水纸巾和几粒食物。
3. 从鼠标中取出毛发 (GFR 测量前1-2 天)
- 麻醉鼠标与3% 异氟醚, 一旦鼠标睡着了, 保持麻醉与1.5–2% 异氟醚, 根据鼠标的呼吸速率。将鼠标放在热垫上。
- 使用电动剃须刀, 与毛皮的方向, 从鼠标背部的一侧去除大部分毛皮。从后腿的顶端刮起脖子, 穿过肋骨。
- 使用棉芽将薄薄的脱毛霜涂在剃须区域 (图 1A)。将棉芽与毛皮的方向移动, 以确保奶油尽可能靠近皮肤。
- 用棉签和温水洗净后将奶油去除。如果皮肤在测量后看起来很红且很恼火, 不要在72小时内重复脱毛, 以免损害皮肤, 请勿执行测量。
4. 制备经皮 GFR 监测仪
- 使用可用的两种大小的修补程序之一。第一个是 2.5 x 3 厘米2的大小, 可用于小鼠的测量直接。其他补丁是 6 x 3 厘米2的大小, 是用来在大鼠或大动物, 但可以削减到较小的大小, 以用于小鼠。
- 剥下贴片一侧的背衬, 将 GFR 设备粘在粘合剂侧, 将 led 精确定位在清除窗口上方。
- 切掉多余的胶贴, 以适应电池的大小, 并将贴片的一侧贴在电池上。
5. 附着透皮 GFR 显示器
- 麻醉鼠标与异氟醚, 如步骤3.1 中所述, 并将鼠标容易地放在热垫上。麻醉小鼠仅用于放置经皮 GFR 监测和注射 FITC sinistrin;允许从麻醉中恢复以测量 FITC 衰变。
- 用70% 乙醇清洁预剃皮肤。在鼠标下方放置大约12厘米的防过敏丝胶带 (图 1B; 磁带的宽度应减少到 1.5–2 cm, 以便它不太宽的鼠标)。
- 将磁带放置在鼠标右侧, 只有大约2厘米, 其余部分位于左侧。折叠在胶带右侧的一端, 便于在测量后放置和拆卸。步骤5.3 和5.6 的左右指令用于在动物右侧放置设备, 如果需要, 可将其替换为动物左侧的设备放置。
- 将电池连接到设备上, 从电池上取下背衬, 并将其安全地放在设备顶部。当蓝色发光二极管 (led) 开始闪烁时, 设备已准备好使用, 并且数据采集开始。
- 从设备上取下背衬, 然后放到剃光的皮肤上。放置设备, 使 led 的窗口暴露在肋骨上-不要太靠近脊椎或四肢 (图 1C)。
- 使用白色磁带保护设备。首先保护右侧 (图 1D), 将其紧紧环绕在设备的所有边缘, 然后在鼠标和设备周围环绕左侧 (图 1E)。理想情况下, 磁带的左侧只覆盖设备, 右侧在鼠标腹部下方结束。
- 将胶带按在鼠标身体的圆周上, 将其连接在一起。胶带需要牢固地连接, 但不能紧。如果它太松散, 那么设备将移动太多, 并导致移动文物。然而, 它不应该是如此紧, 它限制呼吸或运动或给皮肤施加太大的压力。
- 在 FITC sinistrin 注射前3分钟保持设备不变, 以便进行稳定的背景读数。在这段时间, 温暖的尾巴用热垫或手套填充温水准备尾部静脉注射 (如果使用此路线)。
6. FITC-sinistrin 注射液
- 准备胰岛素注射器, 计算注射所需的 FITC sinistrin 量 (这可以四舍五入到最近的10微升)。
- 通过尾部静脉或复古轨道注射来管理 FITC sinistrin。FITC-sinistrin 应在一个平稳而快速的丸中进行管理, 以避免间隙曲线上的多个峰。最好只管理部分剂量, 而不是多次尝试管理 FITC sinistrin。
7. 测量 GFR
- 将鼠标放在笼子里, 从异氟醚麻醉和测量周期的持续时间中恢复。
- 在笼中观察鼠标1.5 小时, 然后取下设备。从有意识的鼠标移除设备是快速、高效且通常由鼠标耐受的, 但新用户可能更喜欢麻醉鼠标进行此步骤。
- 作为一种选择, 麻醉鼠标与异氟醚。
- 作为另一个选项, 将鼠标放在保持架顶部的线架上, 允许鼠标在设备被移除时抓住金属条。
- 在一个快速, 流畅的运动, 从腹部下方拉出白色石膏胶带, 并去除皮肤上的设备和黑色石膏。请注意, 电池尚未与设备断开连接。
- 将鼠标返回到其主笼子。
8. 读取和评估数据
- 小心断开电池与设备的连接
- 将设备连接到 USB 电缆, 然后将电缆连接到计算机
- 打开阅读软件 (Sensor_ctrl_app)
- 依次单击 "连接"、"读取"、"重新命名" 和 "保存", 然后关闭程序
- 按照相应手册中的说明处理和评估分析软件中的数据
Representative Results
在本节中, 我们介绍了使用经皮 GFR 显示器的代表性结果。经皮监测已被用于各种小鼠菌株和亚型和 CKD2的模型。
图 2显示了 FITC-sinistrin 间隙曲线在雄性 BALB 小鼠缺血再灌注损伤 (IRI) 与同时对侧肾切除术前后的表现。FITC-sinistrin 迅速从健康小鼠的循环中清除 (图 2A), 但间隙在小鼠中明显延迟 (图 2B, C)。在非常严重的小鼠中, FITC-sinistrin 荧光在90分钟的测量期内可能不会发生任何变化, 表明完全没有肾小球滤过 (图 2C)。
透皮 GFR 测量是微创的, 可用于监测多个时间点的同一小鼠肾脏功能的变化。图 3描绘了在基线下按顺序透皮 FITC-sinistrin 清除量测定的 GFR 的变化, 以及诱导 IRI 后1、2和4天 (单边缺血同时对侧肾切除)。所示数据包括 FITC sinistrin 间隙半衰期 (图 3A) 和 GFR (图 3B), 由测量的 FITC-sinistrin 游隙半衰期计算, 如施莱伯et al1所述。
在图 4中, 慢性肾脏疾病 (CKD) 被诱导在雄性 BALB 小鼠通过执行长期的单边 IRI 然后延迟对侧切除, 如11所述。GFR 在最初的 IRI 后26天通过透皮 FITC-sinistrin 清除进行评估。FITC-sinistrin 半衰期的增加 (图 4A), 因此 GFR (图 4B) 的减少, 表明这些小鼠肾功能受损。这些数据表明, 经皮 GFR 测量可用于测定 CKD 小鼠肾脏功能的变化。
图 5A显示, FITC-sinistrin 半衰期与半定量组织学评估在未受伤小鼠和不同严重程度的 IRI 诱导的小鼠的全系列 GFR 测量中的管状损伤密切相关。相比之下, 血清肌酐和血尿素氮 (包子) 与 FITC sinistrin 间隙 (图 5B, C) 呈正相关, 但与之相对较弱, 表明经皮 GFR 测量提供了更可靠的肾脏测量方法。与血清肌酐或包子相比, 在 IRI 诱导的亚纪后损伤 (管状损伤评分)。
图 1: 连接透皮 GFR 显示器.脱毛照片 (A), 在鼠标 (B) 下放置胶带, 将设备放置在鼠标的皮肤 (C) 上, 并通过环绕鼠标和设备 (D E) 将胶带固定在设备上,请单击此处以查看此图的较大版本.
图 2: FITC-sinistrin 在男性 BALB/c 小鼠在缺血再灌注损伤 (IRI) 同时对侧肾切除术前后的间隙曲线.在基线 (A) 和 IRI 手术后的一天 (B) 在同一只老鼠的间隙曲线, 表明此鼠标的肾功能受损。(C) 在 IRI 手术后一天, 一只更严重受伤的老鼠的清除曲线。FITC sinistrin 在测量期间没有清除, 表明肾功能衰竭。黑色数据点表示原始数据, 蓝色线表示3室配合, 绿线表示95% 置信区间。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 3: 男性 BALB/c 小鼠, 8-10 周经历单边缺血, 同时对侧肾切除 (n=5).GFR 在基线和1、2和4天手术后进行评估, 并与假手术对照小鼠 (n=5) 进行比较。在 (a) 中使用 FITC-sinistrin 半衰期, 连同老鼠的体重, 计算 GFR (B)。数据点表示单个动物, 误差线表示平均值和标准误差。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 4: 男性 BALB/c 小鼠8-10 周内单侧缺血, 8 天 (n=5) 延迟对侧肾切除术.GFR 在26天评估, 并与年龄匹配的健康对照小鼠 (n=5) 进行了比较。在 (a) 中使用 FITC-sinistrin 半衰期, 连同老鼠的体重, 计算 GFR (B)。数据点表示单个动物, 误差线表示平均值和标准偏差。在周期性酸-席夫染色肾切片上, 以盲观察者 (L.R.) 为基础, 对管状损伤评分0-50。这种方法是由王和同事12改编的。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 5: 三个肾脏功能/损伤 (n=39)、血清肌酐 (n=30) 和血尿素氮 (包子) (n=30)) 与 FITC-sinistrin 间隙 (半衰期) 的相关性.雄性 BALB 小鼠经过不同时期的单侧肾蒂夹钳 (25–45 min) 或假手术, 同时进行对侧肾切除, 诱导不同的亚临床严重程度, 4 天评估肾功能参数和组织病理学。在 IRI 之后。管状损伤评分与 FITC sinistrin 间隙呈显著正相关 (a;r2 = 0.88), 而血清肌酐 (B) 和包子 (C) 均显示阳性但较弱的相关性与 FITC sinistrin 间隙 (R2 = 0.64 和 0.52, 分别)。请点击这里查看这个数字的更大版本.
Discussion
这份手稿和随附的培训视频为小鼠使用透皮 GFR 显示器提供了实用指南。该过程中最关键的步骤是正确的附件的设备在动物的背部, 并安全地包裹在腹部周围的胶带。最好的位置是稍左或右中线, 在胸腔。该修补程序和设备需要牢固地连接到皮肤, 但他们不应该是如此紧, 他们限制呼吸, 运动, 或影响皮肤血液循环在设备下, 因为这将导致错误/不准确的测量。此外, 由于监测发生在有意识的小鼠后, 他们已经从麻醉中恢复, 正确地放置在身体的一部分, 从运动的干扰最低, 结果在小移动文物的透皮测量。因此, 重要的是, 该设备不太靠近上肢, 使小鼠可以自由移动他们的肩膀。
重要的是在 GFR 测量前脱毛小鼠一到两天, 因为脱毛影响 FITC-sinistrin 间隙的测量, 初步数据表明, 在测量透皮脱毛前立即 GFR 增加FITC-sinistrin 的明显半衰期。这种机制是未知的。因此, 为了在多个时间点和实验之间获得可靠的测量, 建议提前脱毛小鼠, 以便在进行 GFR 测量之前, 允许皮肤从这个过程中恢复。脱毛膏不应适用于同一区域的皮肤在72小时内之前的应用, 以避免化学损坏皮肤。在许多情况下, 毛皮的重新生长需要几天或长达一周的时间, 因此可以很容易地避免在72小时内重新应用脱毛霜。
因为50% 的血清肌酐由小鼠13的管状部分排泄, 并且由于肾小管内尿素的重吸收增加, 当老鼠脱水14时, 血清肌酐和包子是肾功能的不良标志物。然而, 由于其方便性, 这些检测继续被用作小鼠临床前研究中肾功能的主要指标。然而, 与正常或接近正常肾功能的小鼠的管状分泌物肌酐排泄的主要贡献13, 血清肌酐与 FITC-sinistrin 清除率的相关性很小 (低FITC-sinistrin 半衰期), 表明肌酐是对轻度肾损伤小鼠肾功能的一种不敏感的测量方法。与此相反, 在轻度肾功能损害小鼠中, 馒头与 FITC sinistrin 间隙有很好的相关性, 小鼠肾损伤 (高 FITC-sinistrin 半衰期) 与 FITC-sinistrin 间隙有很大关系。这可能是由于尿素重吸收与严重肾脏损伤的患病动物脱水相关的影响所致。
经皮 GFR 测量的一个主要优势, 与所有其他的丸隙或 GFR 测量的恒定输液技术相比, 它不需要仔细定时血液或尿收集。这些在小鼠身上可能特别具有挑战性, 因为它们的总血量和尿量与大鼠相比都低。此外, 小鼠只需要处理附件的设备和注射, 但不能为多个 venipunctures, 根据要求的经典丸清除试验15。此外, 麻醉的持续时间是短的, 因此它是可能的执行重复测量在单个小鼠随着时间的推移。测量的执行频率主要取决于小鼠的健康状况、研究者对静脉注射的能力以及对反复麻醉疗程的当地制度规定。在健康, 未受伤的小鼠, 透皮 GFR 测量可以每天执行, 对鼠标的最小或没有副作用。然而, 患有小鼠或 CKD 的受伤的老鼠不太可能容忍重复的麻醉疗程以及健康的小鼠, 因此测量的频率应该减少。
经皮 GFR 测量的主要局限性, 与小鼠 GFR 的丸清除方法相比, 其排泄动力学只是随着时间的相对荧光强度的变化而不是绝对示踪剂浓度的测定。因此, 仅能测量排泄动力学的单指数衰变的速率常数, 这是对细胞外体积16的 GFR 正常化的非常接近的估计。为了以 mL/分钟表示 GFR, 动物的胞外体积必须使用在先前研究中建立的转化因子进行估计, 其中 FITC-sinistrin 的血浆浓度同时测量1。然而, 这种转化因子可能无法正确估计所有小鼠胞外流体体积, 因为流体体积可能会受到各种外来因素的影响, 包括年龄、性别、水化状态 (可能受手术影响)干预以及肾脏损伤), 重量17。然而, 不同于评估小鼠 GFR 的追加剂量法, 经皮 GFR 测量受操作者依赖性的变化较小, 因为它不受剂量错误或血液收集时间错误的影响。
经皮 GFR 测量技术的另一个局限性是, 由于皮肤荧光染料的漂白和设备附件和示踪剂注射所需的麻醉, 在测量过程中可能会发生基线信号移位。Friedemann 和同事通过实施校正算法3解决了此限制。该算法的实现使经皮技术的精度提高, 与 GFR 的恒定输注技术相媲美。
一个经常被问到的问题是, 不同的小鼠菌株的皮肤色素沉着是否影响透皮 FITC-sinistrin 清除。由于深色颜料吸收蓝色激发和 FITC sinistrin 测量的绿色发射信号, 皮肤色素沉着降低了 FITC sinistrin 信号强度。然而, FITC sinistrin 的排泄率与整体信号强度无关。此外, 在被测信号较低的情况下, 有色小鼠的背景信号也较低。因为背景信号是皮肤荧光基团的自发荧光和激发光的反射的混合物, 我们发现, 在有色动物中, 背景到最大信号比是可比的, 甚至是改进的。此外, 由于反射光也被色素性皮肤吸收, 因此在有色小鼠身上, 由于周围皮肤接触反射光而引起的运动伪影减少。
总之, 我们提供的技术允许在有意识的, 自由移动的所有皮肤类型的小鼠 GFR 的精确测量。由于该技术与血液取样无关, 因此可以在 CKD 模型中反复使用同一动物进行纵向观察, 并可用于测量 GFR 在诱导后发生的快速变化。
Disclosures
D S K, 尖峰和 y 是 MediBeacon 公司的员工, 是经皮 GFR 显示器的制造商和分销商。
D S K 和尖峰是发明专利和专利申请的所提供的技术。
Acknowledgments
这项工作得到了范德比尔特肾脏病中心 (VCKD) 的支持, 部分由以下赠款资助: 国防部 PR161028 和 R01DK112688 (马克 de Caestecker)
我们感谢 MRC、EPSRC 和 BBSRC 资助的英国再生医学平台 "安全和功效, 聚焦成像技术中心" (MR/K026739/1) 对 LS、PM 和 BW 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transdermal GFR monitor (comes with 1 device, 2 batteries and 1 charger) | MediBeacon GmbH | TDM-MH001 | Reading software: MPD Lab; Analysis software: MPD Studio |
| Additional Batteries | MediBeacon GmBH | PWR-BT0001 | |
| Attachment patches | MediBeacon GmbH | small: PTC-SM001; large: PTC-LG001 | |
| FITC-sinistrin | MediBeacon GmbH | FTC-FS001 | |
| Hypoallergenic silk tape | e.g. Durapore (1538-2), or Kendall (7138C), or Leukosilk (01032-00) | ||
| Anaesthesia chamber, isoflurane, oxygen | |||
| Heat pad | |||
| Electric shaver | |||
| Depilatory (hair removal) cream | e.g. Veet or Nair | ||
| Cotton buds | |||
| Cotton swabs | |||
| Timer | |||
| Scales | |||
| 70% ethanol wipes |
References
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