Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Transdermal מדידה של קצב הסינון Glomerular בעכברים

Published: October 21, 2018 doi: 10.3791/58520
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 3, 3, 2, 2, 1
1Division of Nephrology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Cellular and Molecular Physiology, University of Liverpool, 3MediBeacon GmbH, 4Department of Veterinary Pathology and Public Health, Institute of Veterinary Science, University of Liverpool

Summary

כאן נתאר פרוטוקול כדי למדוד את קצב הסינון glomerular (GFR), בהכרה, לנוע בחופשיות עכברים באמצעות צג GFR דרך העור.

Abstract

ניתוח transdermal של קצב הסינון glomerular (GFR) הוא שיטת הוקמה המשמש להערכת תפקוד כלייתי עכבר ועכברוש, דגמים של אי-ספיקת כליות חריפה, מחלת כליות כרונית. בשיטת המדידה מורכב גלאי קרינה פלואורסצנטית ולמחקר מחוברת ישירות על העור בחלק האחורי של חיות בהכרה, נעה בחופשיות, מודד את הפרשה קינטיקה של מעקב GFR אקסוגני, fluorescein-isothiocyanate (FITC) sinistrin מצומדת (אינולין אנלוגי). מערכת זו תואר בפירוט בחולדות. עם זאת, בשל גודלם הקטן יותר, מדידה של GFR transcutaneous בעכברים מציג אתגרים טכניים נוספים. במאמר זה אנו מספקים לכן המדריך הראשון מעשי מפורט על השימוש צגים GFR transdermal בעכברים בהתבסס על החוויה המשולבת של שלושת הבלשים שונים מי להיות ביצוע וזמינותו הזה בעכברים על פני מספר שנים.

Introduction

השימוש transcutaneous GFR צגים בעכברים דווחה לראשונה על ידי שרייבר ועמיתיו בשנת 2012, אומתה על ידי השוואת מידות GFR שהושג באמצעות טכניקה זו, עם תוצאות מתקבל על ידי מדידה ישירה של אישור בולוס FITC-sinistrin דם טורי דוגם1. עד כה, היו 35 פירסומים שבהם צגים GFR transcutaneous היו בשימוש אצל חולדות ועכברים (רשימה המתעדכנת בקביעות של כתבות העת ואת התקצירים ועידה אשר שימשה את הצג GFR פרה ניתן למצוא MediBeacon אתר2). מידות GFR transdermal חולדות ועכברים שתיארנו במספר פרסומים1,3,4,5, והוא מדריך וידאו הממחיש את השימוש בחולדות שפורסמו6. עם זאת, מדידה בעכברים מציג אתגרים טכניים נוספים. כאן, אנו מספקים את המדריך הראשון מעשי מפורט על השימוש transdermal צגים GFR בעכברים.

ישנן מגוון סיבות מדוע חוקרים מתחילים בעד השימוש transdermal צגים GFR להעריך תפקוד כלייתי במודלים מכרסמים. Transdermal מדידה של FITC-sinistrin סיווג הוכח לספק מדד רגיש ומדויק יותר של תפקוד כלייתי לעומת הפרמטרים המסורתי של תפקוד הכליות כגון סרום קריאטינין ודם אוריאה חנקן (BUN)7, 8. על-ידי יישום אלגוריתם הערכה משופרת, פרידמן ועמיתיו הוכיחו כי המערכת מגיעה דיוק להשוות תקן זהב, הטכניקה אינפוזיה קבוע עבור GFR מדידה3. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו גם כי ניתוח רציפים באמצעות צגים GFR transcutaneous יכול לשמש ללמוד מוקדם שינויי תפקוד הכליות, כמו גם שחזור פונקציונלי לאחר אינדוקציה של אי-ספיקת כליות חריפה (אקי) ללא הפרעה עם דם החיה אמצעי אחסון או ספיקת הדם, מאז וזמינותו אינה דורשת רציפים דם הדגימה9,10. היכולת למדוד GFR ברמת דיוק גבוהה ורגישות שוב ושוב על אותה חיה הופכת טכניקה זו אטרקטיבי עבור מגוון רחב של דיסציפלינות מחקריות שונות. צגים GFR transdermal שנוצלו על ידי חברות התרופות כדי להעריך את הרעילות של תרכובות הרומן, כמו גם באוניברסיטאות למחקר בסיסי והתרגום.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות מקומיות ב בריטניה וב ארצות הברית. שני ניסויים אוניברסיטת ליברפול בוצעו תחת רישיון הניתן תחת חוק חיות (וצפייה) בריטניה 1986 ואושרו על-ידי ועדת האתיקה אוניברסיטת ליברפול. כל הניסויים שנערכו בהמרכז הרפואי האוניברסיטאי ואנדרבילט אושרו על ידי ואנדרבילט מוסדיים חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה.

1. מכינים את FITC-sinistrin

  1. להכין 40 מ"ג/מ"ל של FITC-sinistrin בתוך תמיסת מלח פוספט buffered (PBS).
    הערה: Aliquots שניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים עם ירידה ניכרת באיכות; אולם יש להימנע מספר מחזורים ההקפאה-הפשרה. FITC-sinistrin הוא רגיש אור - לשמור את הצינור מוגן מפני אור.
  2. לחשב את עוצמת הקול של FITC-sinistrin הדרושים עבור כל עכבר:
    1. שוקלים כל העכבר בכל יום של המדידה.
    2. המינון המומלץ הוא 0.15 מ ג FITC-sinistrin גרם משקל הגוף.

2. העכבר הכנה

  1. היכונו כלובים נפרדים העכברים כשהם עוברים מדידות GFR. לספק מגבוני נייר כמה כדורי של מזון.

3. הסרת שיער העכבר (1-2 ימים לפני המדידה GFR)

  1. עזים ומתנגד את העכבר עם 3% איזופלוריין, ברגע זה העכבר, לשמור על הרדמה עם איזופלוריין 1.5 – 2%, בהתאם קצב הנשימה של העכבר. הנח את העכבר נוטה על משטח חום.
  2. השתמש מכונת גילוח חשמלית, ללכת נגד הכיוון של הפרווה, כדי להסיר את מרבית הפרווה מצד אחד של הגב של העכבר. לגלח מהחלק העליון של הרגליים האחוריות עד הצוואר, ועל -פני הצלעות.
  3. למרוח שכבה דקה של קרם אפילציה לאזור מגולח שימוש במקלון צמר גפן (איור 1 א'). הזז את ניצן כותנה נגד הכיוון של הפרווה כדי להבטיח כי הקצפת חלה קרוב לעור ככל האפשר.
  4. להסיר את הקרם לאחר 1-3 דקות על ידי שטיפה ספוגיות כותנה ומים חמים. לא לבצע את המדידה אם העור נראה מאוד מגורה ואדום לאחר מדידה, לא לחזור על אפילציה בתוך 72 h כדי למנוע נזק לעור.

4. הכנת שהצג GFR Transdermal

  1. השתמש באחת שתי מידות של מדבקות הזמינות. הראשון הוא 2.5 x 3 ס"מ2 במידה והוא יכול לשמש למדידות בעכברים ישירות. המדבקות אחרים 6 x 3 ס"מ2 בגודל נועדו לשמש חולדות או חיות גדולות אך ניתן לחתוך לגודל קטן יותר עבור שימוש בעכברים.
  2. קלף את לסגת צד אחד של המדבקה והדבק המכשיר GFR בצד דבק, מיצוב הנוריות בדיוק מעל החלון ברורה.
  3. חותכים התיקון דבק עודף כדי להתאים לגודל של הסוללה ואתקע צד אחד של תיקון הסוללה.

5. צירוף שהצג GFR Transdermal

  1. להרדים את העכבר עם איזופלוריין כפי שמתואר בשלב 3.1, מקם את העכבר נוטה על משטח חום. עזים ומתנגד עכברים רק עבור השמה של צג ה-GFR transdermal הזרקה של FITC-sinistrin; אפשר לשחזר מן ההרדמה לשקילת FITC דעיכה.
  2. לנקות את העור מראש מגולח עם 70% אתנול. במקום כ- 12 ס מ של סרט משי היפואלרגנית תחת העכבר (איור 1B; הרוחב של הקלטת צריך להיות מופחת ל 1.5-2 ס מ כך שהוא לא רחבות מדי בשביל העכבר).
  3. מקם את הקלטת כך רק כ 2 ס מ הוא בצד הימני של העכבר, השאר הוא בצד השמאל. מקפלים קצה אחד של הצד הימני של הקלטת מיקום קל והסרת לאחר המדידה. ההוראות משמאל לימין עבור שלבים 5.3 ו- 5.6 עבור מיקום המכשיר בצד ימין של החיה, להחליף עבור מיקום המכשיר על הצד השמאלי של החיה במידת הצורך.
  4. לחבר את הסוללה למכשיר, להסיר את תמיכתה של הסוללה, בצורה מאובטחת להניחה על גבי המכשיר. המכשיר מוכן לשימוש ומתחיל קירור והקפאה כחול דיודות פולטות אור (נוריות) מתחילות להבהב.
  5. להסיר את תמיכתה של ההתקן ומקם על העור מגולח. מיקום המכשיר כך החלון חשיפת הנוריות הוא מעל הצלעות – אין קרוב מדי אל עמוד השדרה או הגפיים (איור 1C).
  6. תאבטח את המכשיר עם קלטת לבן. לאבטח את הצד הימני הראשון (איור 1D), לעטוף אותו בחוזקה כל הקצוות של התקן, ואז לעטוף בצד שמאל סביב העכבר על המכשיר (איור 1E). באופן אידיאלי, בצד שמאל של הקלטת מכסה רק את המכשיר, ומסתיים בצד הימני תחת הבטן של העכבר.
  7. לצרף את הקלטת על ידי לחיצה לצד היקף הגוף של העכבר. הסרט צריך להיות מחובר בחוזקה, אך לא צמוד. אם זה יותר מדי משוחרר אז המכשיר ינוע סביב מדי ולגרום חפצי אמנות תנועה. עם זאת, זה לא אמור להיות כל כך חזק שלא מגבילה את הנשימה או תנועה, או מפעיל לחץ רב מדי על העור.
  8. להשאיר את ההתקן ללא שינוי במשך 3 דקות לפני הזריקה FITC-sinistrin כדי לאפשר רקע קבועה קריאת להילקח. בתקופה זו, חמים הזנב עם משטח חום או כפפה מלא במים חמים כדי להתכונן הזרקת וריד הזנב (אם משתמשים במסלול זה).

6. FITC-sinistrin הזרקה

  1. להכין מזרק אינסולין עם הסכום המחושב של FITC-sinistrin הנדרש להזרקה (זה יכול להיות מעוגלים μL 10 הקרוב).
  2. לנהל FITC-sinistrin על-ידי וריד הזנב או הזרקת רטרו-מסלולית. FITC-sinistrin צריך להינתן בולוס חלקה אבל מהירה אחת כדי להימנע פסגות מרובות בעקומה סיווג. עדיף לנהל רק מנה חלקית מאשר לקבל מספר ניסיונות ניהול FITC-sinistrin.

7. מדידה של GFR

  1. הנח את העכבר בכלוב בכוחות עצמו, להתאושש מן ההרדמה איזופלוריין, למשך כל תקופת המדידה.
  2. לצפות את העכבר בתוך הכלוב עבור 1.5 h ולאחר מכן להסיר את ההתקן. הסרת ההתקן מהעכבר בהכרה הוא מהיר, יעיל, ו בדרך כלל נסבל היטב על ידי העכבר, אבל משתמשים חדשים עשויים להעדיף להרדים את העכבר בשלב זה.
    1. כמו אפשרות אחת, להרדים את העכבר עם איזופלוריין.
    2. כמו האפשרות השנייה, מקם את העכבר על המדף חוט על גג הכלוב, המאפשר את העכבר כדי לתפוס את מוטות המתכת בזמן שההתקן הוסר.
  3. למשוך את ההקלטה טיח לבן מתחת לבטן בתנועה אחת מהירה, חלקה, הסר את ההתקן ואת טיח שחור העור. להיזהר כי הסוללה לא לנתק את ההתקן עדיין.
  4. להחזיר את העכבר בכלוב בבית.

8. קריאה של הערכת הנתונים

  1. בזהירות מנתק את הסוללה מהמכשיר
  2. מחבר את המכשיר כבל ה-USB ולאחר מכן חבר את הכבל למחשב
  3. פתח את תוכנת הקריאה (Sensor_ctrl_app.exe)
  4. סדר, לחץ על "התחבר", "לקרוא", "לשנות את השם", "שמור", וסגור את התוכנית
  5. התהליך והערכה של נתונים בתוכנת ניתוח כמתואר במדריך בהתאמה

Representative Results

בסעיף זה אנו מציגים תוצאות נציג של השימוש שהצג GFR transdermal. הצג transdermal כבר בשימוש מגוון רחב של זנים העכבר ודגמים של אקי ו CKD2.

איור 2 מציג נציג FITC-sinistrin סיווג עקומות בעכברים BALB/c זכר לפני ואחרי פגיעה reperfusion איסכמיה פציעה (IRI) עם כריתת כליה contralateral בו זמנית. FITC-sinistrin מנוקה במהירות של מחזור הדם בעכברים בריאים (איור 2 א), אך סיווג מעוכבת באופן דרמטי בעכברים עם AKI (איור 2B, ג). בעכברים עם אקי חמור מאוד, ייתכן שאין כל שינוי זריחה FITC-sinistrin במהלך תקופת מדידה 90 דקות, המציינת את העדר של סינון glomerular (איור 2C).

Transdermal GFR המדידה היא פולשנית והוא יכול לשמש כדי לעקוב אחר השינויים בתפקוד הכליות בעכברים אותו מעל נקודות זמן מרובות. איור 3 מתאר שינויים ב- GFR נקבע על ידי רציפים transdermal FITC-sinistrin סיווג מדידות בנקודת ההתחלה, 1, 2 ו 4 ימים לאחר גרימת IRI (חד צדדית איסכמיה עם כריתת כליה contralateral בו זמנית). הנתונים המוצגים כולל FITC-sinistrin סיווג half-life (איור 3 א), וכן GFR (איור 3B) שמחושבים נמדד FITC-sinistrin סיווג זמן מחצית החיים, כפי שמתואר על ידי שרייבר ואח1.

איור 4, מחלת כליות כרונית (CKD) היה המושרה בעכברים BALB/c זכר על-ידי ביצוע ממושך IRI חד-צדדית ואחריו כריתת כליה contralateral מושהה, כפי שמתואר11. GFR הוערכה על ידי סיווג transdermal FITC-sinistrin ביום 26 לאחר IRI הראשונית. העלייה בשיעור מחצית חיים FITC-sinistrin (איור 4A), ולכן הירידה GFR (איור 4B), מצביע על תפקוד כליות לקוי בעכברים אלו. נתונים אלה מדגימים כי transcutaneous מדידה GFR יכול לשמש כדי למדוד שינויים בתפקוד הכליות בעכברים עם CKD.

איור 5A מראה כי מחצית חיים FITC-sinistrin להרכב מקרוב הכמותיים למחצה הערכה היסטולוגית של פגיעה הכרישים על המדידות טווח מלא של GFR בעכברים שציווית, בעכברים עם severities שונות של אקי IRI-induced. לעומת זאת, סרום קריאטינין ודם חנקן אוריאה (BUN) הראתה חיובי אבל חלש יותר קורלציה עם סיווג FITC-sinistrin (איור 5B, ג), המציין כי מדידות GFR transcutaneous מספק מדד אמין יותר של הכליות פציעה (פציעה צינורי ציונים) בעקבות IRI-induced אקי יותר או סרום קריאטינין או לחמניה.

Figure 1
איור 1: הצמדת שהצג GFR transdermal. תמונות של הסרת שיער (A), השמה של הקלטת תחת העכבר (B), המיקום של המכשיר על העכבר העור (C) ואבטחה המכשיר על ידי ליפוף בקלטת סביב העכבר על המכשיר (D-E) נא לחצו כאן הצג גרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

Figure 2
איור 2: דוגמה FITC-sinistrin עקומות סיווג בעכברים BALB/c זכר לפני ואחרי פגיעה reperfusion איסכמיה פציעה (IRI) עם כריתת כליה contralateral בו זמנית. סיווג עקומות בסיסית (A), ואת יום אחד לאחר ניתוח IRI (B) העכבר זהה, המציין לקויי תפקוד כלייתי ב העכבר הזה. (ג) אישור לעקומה של עכבר נפצעו בחומרה רבה יותר יום אחד לאחר הניתוח IRI. היה אין אישור של FITC-sinistrin במהלך תקופת המדידה, המציין אי ספיקת כליות. נקודות נתונים השחור מייצג את הנתונים הגולמיים קווים כחולים מייצגים את התאמת 3 תאים, הקו הירוק מייצג את מרווחי ביטחון של 95%. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: עכברים BALB זכר/c, גיל 8-10 שבועות שעברו איסכמיה חד צדדית עם כריתת כליה contralateral בו זמנית (n = 5). GFR היה בנקודת ההתחלה, בימים 1, 2 ו- 4 לאחר הניתוח, והשוו עם בקרה המופעלים המזויפים עכברים (n = 5). מחצית חיים FITC-sinistrin (א) שימש, יחד עם משקל הגוף של העכברים, כדי לחשב GFR (B). נקודות נתונים מייצגים חיות בודדות, קווי שגיאה מייצגים וב שגיאה סטנדרטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: זכר BALB/c עכברים בגיל 8-10 שבועות שעברו איסכמיה חד צדדית עם כריתת כליה contralateral מושהה-יום 8 (n = 5). GFR הוערכה על ידי ביום 26 ו היה לעומת גיל מתאימים בקרה בריאים עכברים (n = 5). מחצית חיים FITC-sinistrin (א) שימש, יחד עם משקל הגוף של העכברים, כדי לחשב GFR (B). נקודות נתונים מייצגים חיות בודדות, קווי שגיאה מייצגים וסטיית. פציעה צינורי היה הבקיע 0-50 המבוססת על מידת היווצרות נמק ויוצרות משקיף עיוור (שנודיע) במקטעי כליות המחזורית חומצה-שיף-צבעונית. שיטה זו הייתה ממאמרו של וואנג ועמיתיו12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: המתאם של שלוש מידות של פונקציה/נזק לכליות (הערכה היסטולוגית של פגיעה צינורי (n = 39), סרום קריאטינין (n = 30) ודם חנקן אוריאה (BUN) (n = 30)) עם סיווג FITC-sinistrin (half-life). עכברים BALB/c זכר עברה תקופות שונות של pedicle כליות חד צדדית מחבר חובק למעקה-(25-45 דקות) או ניתוח דמה, עם כריתת כליה contralateral בו זמנית לזירוז שונים חומרת אקי, ואת תפקוד כלייתי פרמטרים ו histopathology היו העריך ביום ד' לאחר IRI. התוצאה פגיעה צינורי הראו מתאם חיובי חזק עם סיווג FITC-sinistrin (; R2 = 0.88), ואילו סרום קריאטינין (B), וגם הלחמניות (C) הראתה חיובי אבל חלש יותר קורלציה עם סיווג FITC-sinistrin (R2 = 0.64 ו- 0.52, בהתאמה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

כתב היד הזה בסרטון הדרכה המלווה את מספקים הנחיות מעשיות לשימוש של transdermal GFR צגים בעכברים. השלבים הקריטיים ביותר בהליך הם החזקה נכונה של המכשיר על החיה הגב, והגלישה בבטחה את הקלטת סביב הבטן. התנוחה הטובה ביותר או מעט ימינה או שמאלה של האמצע, מעל קשת הצלעות. תיקון, התקן צריך להיות מחובר היטב על העור, אך הם לא צריך להיות כל-כך חזק. שהם להגביל את הנשימה, התנועה, או להשפיע על זרימת הדם לעור מתחת המכשיר, כמו זה יוביל למדידות פגום/לא מדויק. בנוסף, מאז ניטור מתרחשת בעכברים בהכרה לאחר הם התאוששו מן ההרדמה, לתקן את המיקום של המכשיר מצד הגוף עם הפרעה הנמוך מתוצאות תנועה במדידות transdermal עם חפצי אמנות תנועה קטנה. מסיבה זו, חשוב כי המכשיר אינם ממוקמים קרוב העליון בגפיים כך העכברים יכול לנוע בחופשיות את הכתפיים שלהם.

זה חשוב depilate העכברים 1-2 ימים לפני המדידה GFR, כמו אפילציה משפיע על מידת הסיווג FITC-sinistrin, עם נתונים ראשוני המציין את אפילציה מיד לפני המדידה של transdermal GFR מגביר לכאורה מחצית החיים של FITC-sinistrin. מנגנון זה אינו ידוע. לכן, על מנת לקבל מדידות אמין על נקודות זמן מרובות, בין ניסויים, מומלץ depilate העכברים מראש, כדי לאפשר לעור להתאושש תהליך זה לפני שתמשיך עם GFR מדידות. אפילציה קרם לא צריך להיות מוחל על אותו אזור של העור בתוך 72 h של יישום מראש, כדי למנוע נזק כימי על העור. במקרים רבים, הפרווה מחדש את הצמיחה לוקח כמה ימים או שבוע, אז יישום מחדש של אפילציה קרם בתוך 72 h בקלות ניתן להימנע.

כי למעלה ל- 50% של סרום קריאטינין מופרש על ידי סעיף צינורי עכברים13, כי אין התחדשות מוגברת של שתנן מ בקוריאנית כליות כאשר עכברים מיובש14, סרום קריאטינין לחמניה הם סמנים המסכן של תפקוד הכליות. עם זאת, בגלל הנוחות שלהם, אלה מבחני להמשיך לשמש המדד המרכזי של תפקוד כלייתי מחקרים פרה של אקי, CKD בעכברים. עם זאת, בקנה אחד עם תרומה עיקרית של הפרשת צינורי כדי קריאטינין הפרשה בעכברים עם נורמלי או בסמוך לשם תפקוד כליות תקין13, סרום קריאטינין הראו מתאם קטן עם סיווג FITC-sinistrin במחירים סיווג גבוהות (נמוך FITC-sinistrin half-life), המציין את קריאטינין הוא מדד רגישות של תפקוד כלייתי אצל עכברים עם אי-ספיקת כליות קלה. לעומת זאת, בעוד לחמניה להרכב טוב FITC-sinistrin סיווג בעכברים עם פגיעה כלייתית קלה, יש עניים קורלציה בין סיווג לחמנייה או FITC-sinistrin בעכברים עם אי-ספיקת כליות חמורה יותר (FITC-sinistrin גבוהה מחצית חיים). זו נגרמת ככל הנראה על ידי אפקטים של התחדשות אוריאה המשויך התייבשות אצל בעלי חיים חולים עם אי-ספיקת כליות חמורה.

היתרון העיקרי של המדידה GFR transdermal, לעומת כל סיווג בולוס אחרים או אינפוזיה קבוע שיטות למדידה GFR, היא כי הוא אינו דורש אוספים בדם או בשתן מתוזמן היטב. אלה יכולים להיות מאתגרים במיוחד בעכברים כפי שהם אמצעי אחסון נמוכה בדם הכולל והפלט השתן לעומת חולדות. יתר על כן, עכברים צריכים להיות מטופלים רק עבור קובץ מצורף של המכשיר, הזרקה, אך לא עבור venipunctures מרובות, כנדרש עבור בולוס קלאסית אישור ניסויים15. יתר על כן, משך הזמן של הרדמה קצר, ככזה זה אפשרי לבצע מדידות חוזרות ונשנות בעכברים בודדים לאורך זמן. התדירות שבה מדידות יכול להתבצע בעיקר תלוי מצב בריאותו של העכברים, כשרון של החוקר זריקות תוך ורידי, ולתקנות מוסדיים מקומיים על הפעלות חוזרות הרדמה. בעכברים בריאים, שציווית, יכול להתבצע transdermal GFR מדידות מדי יום, עם תופעות מינימליות או לא שלילית על העכבר. עם זאת, פצוע עכברים הסובלים אקי או CKD צפויים לסבול הפעלות חוזרות הרדמה, כמו גם עכברים בריאים, ולכן צריך להיות מופחת התדירות של מדידות.

המגבלה העיקרית של המדידה GFR transdermal, לעומת שיטות סיווג בולוס למדוד GFR בעכברים הוא קינטיקה הפרשה נמדדים רק כמו שינוי עוצמת קרינה פלואורסצנטית יחסית לאורך זמן, ולא כפי ריכוזים מעקב מוחלטת. בגלל זה, זה אפשרי רק למדוד את קצב קבוע דעיכה מעריכית יחיד של הפרשה קינטי, המהווה הערכה מאוד קרוב של GFR מנורמל חוץ-תאי אחסון16. כדי לבטא GFR ב mL/min, נפח חוץ-תאי של החיה יש להערכה באמצעות פקטור המרה שהוקמה במחקרים קודמים שבהם היו מדידות סימולטני של פלזמה ריכוזים של FITC-sinistrin תרגיל1. עם זאת, גורם המרה זה עשוי לא כראוי מעריכים כרכים נוזל חוץ-תאי באותה מידה גם בעכברים כל, מאז נפח נוזלים עלולים להיות מושפעים על ידי מגוון של גורמים חיצוניים, כולל גיל, סקס, מצב הידרציה (אשר עשוי להיות מושפע כירורגי התערבויות וכן אי-ספיקת כליות), ומשקל17. אולם, בניגוד בולוס מינון שיטה להערכת GFR בעכברים, transcutaneous מדידה GFR הוא להשתנות פחות תלוי המפעיל כפי לא ישפיע על ידי שגיאות מינון או שגיאות תזמון האוספים דם.

מגבלה נוספת לשיטת המדידה של GFR transcutaneous הוא כי משמרות אות בסיסית עלולה להתרחש במהלך המדידה בשל הלבנת העור fluorophores, ההרדמה הנדרש להזרקה המצורף, מעקב המכשיר. מגבלה זו זו נדונה על ידי פרידמן ועמיתיו על-ידי יישום של אלגוריתם תיקון3. מימוש אלגוריתם זה הוביל לשיפור דיוק של הטכניקה transdermal להשוות טכניקה אינפוזיה מתמדת של הערכת GFR.

שאלה שכיחה היא אם עור פיגמנטציה ב העכבר שונים זנים משפיעה transdermal את סיווג FITC-sinistrin. עור פיגמנטציה מפחיתה את עוצמת האות FITC-sinistrin מאז פיגמנטים כהים סופג את עירור כחול, ירוק הפליטה אותות מן המידות FITC-sinistrin. עם זאת, שיעור הפרשה של FITC-sinistrin אינה תלויה הכולל אות בעוצמה. יתר על כן, בעוד האות נמדד הוא נמוך, האות רקע גם הוא נמוך בעכברים פיגמנט. כי האות הרקע הוא תערובת של autofluorescence של העור fluorophores השתקפות האור עירור, מצאנו כי היחס אות רקע-כדי-מקסימום הוא דומות, או אפילו יותר טוב, בבעלי חיים פיגמנט. בנוסף, התנועה חפצים, אשר נגרמות על ידי חשיפה של העור שמסביב משתקף האור, מופחתים בעכברים פיגמנט מאז האור משתקף גם נספג על ידי פיגמנט העור.

לסיכום, הטכניקה הוצגו מאפשר מדידה מדויקת של GFR ב בהכרה, לנוע בחופשיות עכברים לכל סוגי העור. הטכניקה היא עצמאית של לקיחת דמים, ניתן להשתמש שוב ושוב על אותה חיה תצפיות האורך במודלים CKD, כמו גם עבור המדד של שינויים מהירים של GFR להתרחש לאחר אינדוקציה של אקי.

Disclosures

D S-K, JF YS הם עובדים ב MediBeacon GmbH היצרן ומפיץ של צג ה-GFR transdermal.
D S-K JF ממציאים פטנטים, בקשות לפטנטים עבור טכנולוגיית הציג בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המרכז ואנדרבילט עבור מחלת הכליה (VCKD), מומן בחלקו על ידי המענקים הבאים: משרד ההגנה PR161028 ו- R01DK112688 (מארק דה Caestecker)

אנו להכיר לתמוך LS, PM ו BW על ידי MRC, EPSRC במימון BBSRC בבריטניה הרגנרציה לרפואה פלטפורמה "הבטיחות והיעילות, מקוד ברכזת טכנולוגיות הדמיה" (מר/K026739/1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transdermal GFR monitor (comes with 1 device, 2 batteries and 1 charger) MediBeacon GmbH TDM-MH001 Reading software: MPD Lab; Analysis software: MPD Studio
Additional Batteries MediBeacon GmBH PWR-BT0001
Attachment patches MediBeacon GmbH small: PTC-SM001; large: PTC-LG001
FITC-sinistrin MediBeacon GmbH FTC-FS001
Hypoallergenic silk tape e.g. Durapore (1538-2), or Kendall (7138C), or Leukosilk (01032-00)
Anaesthesia chamber, isoflurane, oxygen
Heat pad
Electric shaver
Depilatory (hair removal) cream e.g. Veet or Nair
Cotton buds
Cotton swabs
Timer
Scales
70% ethanol wipes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schreiber, A., et al. Transcutaneous measurement of renal function in conscious mice. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 303 (5), F783-F788 (2012).
  2. MediBeacon. Related Publications. , Available from: http://www.medibeacon.com/preclinical/publications/ (2018).
  3. Friedemann, J., et al. Improved kinetic model for the transcutaneous measurement of glomerular filtration rate in experimental animals. Kidney International. 90 (6), 1377-1385 (2016).
  4. Schock-Kusch, D., et al. Reliability of transcutaneous measurement of renal function in various strains of conscious mice. PLoS One. 8 (8), e71519 (2013).
  5. Schock-Kusch, D., et al. Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves. Kidney International. 79 (11), 1254-1258 (2011).
  6. Herrera Pérez, Z., Weinfurter, S., Gretz, N. Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents. Journal of Visualized Experiments. (109), 53767 (2016).
  7. Cowley, A. W. Jr, et al. Progression of glomerular filtration rate reduction determined in conscious Dahl salt-sensitive hypertensive rats. Hypertension. 62 (1), 85-90 (2013).
  8. Scarfe, L., et al. Measures of kidney function by minimally invasive techniques correlate with histological glomerular damage in SCID mice with adriamycin-induced nephropathy. Scientific Reports. 5, 13601 (2015).
  9. Lazzeri, E., et al. Endocycle-related tubular cell hypertrophy and progenitor proliferation recover renal function after acute kidney injury. Nature Communications. 9 (1), 1344 (2018).
  10. Street, J. M., et al. The role of adenosine 1a receptor signaling on GFR early after the induction of sepsis. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 314 (5), F788-F797 (2018).
  11. Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  12. Wang, W., et al. Endotoxemic acute renal failure is attenuated in caspase-1-deficient mice. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 288 (5), F997-F1004 (2005).
  13. Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).
  14. Bankir, L., Yang, B. New insights into urea and glucose handling by the kidney, and the urine concentrating mechanism. Kidney International. 81 (12), 1179-1198 (2012).
  15. Qi, Z., et al. Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 286 (3), F590-F596 (2004).
  16. Peters, A. M. The kinetic basis of glomerular filtration rate measurement and new concepts of indexation to body size. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 31 (1), 137-149 (2004).
  17. Chapman, M. E., Hu, L., Plato, C. F., Kohan, D. E. Bioimpedance spectroscopy for the estimation of body fluid volumes in mice. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 299 (1), F280-F283 (2010).

Tags

סינון Glomerular רפואה בעיה 140 קצב FITC-sinistrin דרך העור עכברים מכרסמים תפקוד כליות
Transdermal מדידה של קצב הסינון Glomerular בעכברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scarfe, L., Schock-Kusch, D.,… More

Scarfe, L., Schock-Kusch, D., Ressel, L., Friedemann, J., Shulhevich, Y., Murray, P., Wilm, B., de Caestecker, M. Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice. J. Vis. Exp. (140), e58520, doi:10.3791/58520 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter