Summary
Dette arbejde præsenterer forberedelsen af methionin funktionaliserede biokompatible blok copolymere (mBG) via den reversible tilsætning-fragmentering kæde overførsel (RAFT) metode. Plasmid-DNA-kompleksdannsevnen for den opnåede MBG og deres transfektering effektivitet blev også undersøgt. FLÅDEN metode er meget gavnlig for polymeriserende monomerer indeholder særlige funktionelle grupper.
Abstract
Reversibel tilsætning-fragmentering kæde overførsel (RAFT) polymerisering integrerer fordelene ved radikal polymerisering og levende polymerisering. Dette arbejde præsenterer forberedelsen af methionin funktionaliserede biokompatible blok copolymere via RAFT polymerisering. For det første blev n, n-bis(2-hydroxyethyl) methacrylamid-b-N-(3-AMINOPROPYL) methacrylamid (BNHEMA-b-APMA, BA) syntetiseret via flåde polymerisering med 4, 4 '-azobis (4-cyanovaleric Acid) (acva) som en initierende middel og 4-cyanopentanoinsyre dithiobenzoat (CTP) som kæde overførings middel. Efterfølgende blev n, n-bis(2-hydroxyethyl) methacrylamid-b-N-(3-guanidinopropyl) methacrylamid (METHIONIN-podede bnhema-b-gpma, MBG) fremstillet ved at ændre amingrupper i APMA med methionin og guanidin Grupper. Tre slags blok polymerer, mBG1, mBG2 og mBG3, blev syntetiseret til sammenligning. En ninhydrin-reaktion blev anvendt til at kvantificere APMA-indholdet. mBG1, mBG2 og mBG3 havde henholdsvis 21%, 37% og 52% af APMA. Resultaterne af gel gennemtrængning kromatografi (GPC) viste, at BA-copolymere besidder molekylvægte på 16.200 (BA1), 20900 (BA2) og 27200 (BA3) g/mol. Plasmid DNA (pdna) kompleksdannere evne af de opnåede blok copolymer genbærere blev også undersøgt. Opladnings ratioen (N/P) var 8, 16 og 4, da pDNA blev fuldstændigt pakket med henholdsvis mBG1, mBG2, mBG3. Når N/P forholdet mellem mBG/pDNA polyplexer var højere end 1, Zeta potentialet af mBG var positiv. Ved et N/P-forhold mellem 16 og 32 var den gennemsnitlige partikelstørrelse af mBG/pDNA-polyplexer mellem 100-200 Nm. Samlet set illustrerer dette arbejde en enkel og bekvem protokol til blokken copolymer Carrier syntese.
Introduction
I de seneste år, genterapi er dukket op for den terapeutiske levering af nukleinsyre som lægemidler til behandling af alle former for sygdomme1. Udviklingen af genlæge midler, herunder plasmid-DNA (pDNA) og lille interfererende RNA (siRNA), er afhængig af stabiliteten og effektiviteten af lægemiddel leveringssystemet (DDS)2. Blandt alle DDS, kationiske polymer bærere har fordelene ved god stabilitet, lav immunogenicitet, og facile forberedelse og modifikation, som giver kationiske polymer bærere brede anvendelsesmuligheder3,4. Til praktiske anvendelser inden for biomedicin skal forskerne finde en kationisk polymer bærer med høj effektivitet, lav toksicitet og god målretnings evne5. Blandt alle polymer bærere, blok copolymere er en af de mest udbredte lægemidler levering systemer. Blok copolymere er intensivt undersøgt for deres selvstændige montage ejendom og evner til at danne micelles, mikrokugler, og nanopartikler i lægemiddel levering5. Blok copolymere kan syntetiseres via levende polymerisering eller klik kemi metoder.
I 1956, Szwarc et al. rejste emnet levende polymerisering, definere det som en reaktion uden kædebrydende reaktioner6,7. Siden da, flere teknikker var blevet udviklet til at syntetisere polymerer ved hjælp af denne metode; således, levende polymerisering ses som en milepæl af polymer videnskab8. Levende polymerisering kan klassificeres i levende anioniske polymerisering, levende kationisk polymerisering og reversibel deaktivering af radikal polymerisering (RDRP)9. Levende anioniske/kationiske polymeriseringer har et begrænset anvendelsesområde på grund af deres strenge reaktionsbetingelser10. Kontrolleret/levende radikal polymerisering (CRP) har milde reaktionsbetingelser, bekvem disposition, og godt udbytte og har således været en stor forsknings fokus i de seneste år11. I CRP, aktive formering kæder er reversibelt passiveret til sovende dem til at reducere koncentrationen af frie radikaler og undgå interaktion reaktion af formerings kæden radikaler. Tilsætning polymerisering kan kun fortsætte, hvis de inaktive hvilende formerings kæder er reversibelt animeret i kæde radikaler. Som en af de mest lovende former for levende radikal polymerisering, reversibel tilsætning-fragmentering kæde overførsel (RAFT) polymerisering er en metode, der gælder for udbytte blok polymerer med kontrolleret molekylvægt og struktur, smal molekylvægt distribution, og transporterer funktionelle grupper12. Nøglen til en vellykket flåde polymerisering er effekten af kæde overføringsmidler, normalt dithioesters, som besidder meget høj kæde overførsels konstant.
I dette papir, en flåde polymeriserings metode var designet til at forberede BNHEMA-b-APMA blok polymer, tager 4, 4 '-azobis (4-cyanovaleric syre) (acva) som en initierende middel og 4-cyanopentanoic syre dithiobenzoate (CTP) som et kæde overførings middel. RAFT polymerisering blev brugt to gange for at introducere BNHEMA i kationiske polymer bærere. Efterfølgende blev amingrupperne i APMA-kæden modificeret med methionin og guanidinylations reagens 1-amidinopyrazolhydrochlorid. Gøre brugen af de positive afgifter af guanidinylation reagens og methacrylamid polymer skelet struktur, den cellulære optagelse effektivitet af de opnåede blok polymer bærere blev forbedret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. syntese af BNHEMA polymer (PBNHEMA)
- 1,87 g n, n-bis(2-hydroxyethyl) METHACRYLAMID (bnhema) opløses i 1 ml destilleret vand i en polymeriserings flaske.
Bemærk: polymeriserings flasken er en rund bund kolbe med en gummiprop og en magnetisk omrører. - 0,03 g 4-cyanopentanoinsyre dithiobenzoat (CTP) og 0,02 g 4, 4 '-azobis (4-cyanovalericsyre) (ACVA) opløses i 0,5 mL af 1, 4-dioxan i et 5 mL bægerglas. Derefter tilsættes CTP-og ACVA-opløsningen til polymeriserings flasken fra trin 1,1.
- Ventilere reaktionssystemet i polymeriserings flasken med nitrogen via tre fryse pumpe-tø-cyklusser.
- I detaljer, fryse opløsningen i polymeriserings flasken ved hjælp af en kondensat fælde, fastsætte polymeriserings flasken til jern støtte, og vakuumize og injicere nitrogen i reaktionsblandingen via en ledning tippet med en nål (#9 nål, indvendig diameter 0,65 mm, udvendig diameter 0,9 mm). Forsegl polymeriserings flasken og tø opløsningen ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Gentag fryse pumpen-tø cyklusser tre gange.
- Sæt polymeriserings flasken i et 70 °C olie-bad og lad opløsningen reagere i 24 timer under nitrogen atmosfæren.
- Afkøl polymeriserings flasken ved 0 °C, og Åbn gummiproppen for at afslutte polymeriserings processen.
- Precool acetone i a-20 °C-køleskab i 2 timer og bland det derefter med reaktions opløsningen på trin 1,5 ved 50:1 (v/v). Derefter centrifugeres ved 8.200 x g i 10 min for at fjerne acetone og indsamle bundfaldet.
- For at rense den syntetiserede PBNHEMA opløses det indsamlede bundfald i 2 mL rent vand og blandes derefter med 100 mL forkølet acetone, med et forhold på 1:50 (v/v). Opløsningen centrifugeres ved 8.200 x g i 10 minutter, og bundfaldet opsamles. Gentag denne proces tre gange.
- Tør den producerede PBNHEMA med en 50 °C vakuum tørrere. Når tørret, vejes pulveret med en balance. Beregn udbyttesatsen i henhold til ligning 1.
1
Bemærk: i dette eksperiment var det opnåede udbytte 77,2%.
12. syntese af BNHEMA-b-APMA polymer (BA)
- 0,96 g N-(3-aminopropyl) methacrylamidhydrochlorid (APMA) og 0,93 g PBNHEMA opløses i 5 ml destilleret vand i et 10 ml bægerglas.
- 0,01 g 4, 4 '-azobis (4-cyanovaleric Acid) (ACVA) opløses i 0,5 mL af 1, 4-dioxan og blandes med APMA-PBNHEMA-opløsningen fra del 2,1.
- Blandingen overføres til en polymeriserings flaske og ventilerer med tørt kvælstof i 1 time.
- Sæt polymeriserings flasken i et 70 °C olie-bad og lad den reagere i 24 timer under nitrogen atmosfæren.
- Afkøl polymeriserings flasken ved 0 °C, og Åbn gummiproppen for at afslutte polymeriserings processen.
- Opløsningen overføres til den afkølede acetone fra trin 1,6, hvorefter opløsningen centrifugeres på 8.200 x g i 10 minutter for at udløse BA.
- BA opløses i 2 mL destilleret vand, og polymeren udfælles i kølet acetone. Gentag tre gange.
- Den producerede BA tørres i en 50 °C vakuum tørrere og vejes med det opnåede pulver. Beregn udbyttesatsen i henhold til ligning 2.
Bemærk: i dette eksperiment blev rente satsen beregnet til at være 82,0%.
3. Bestem mole procenten af APMA i BA copolymer via ninhydrin-metoden
Bemærk: spektrofotometri anvendes til at bestemme indholdet af multikomponent aminosyrer. Princippet er en farvereaktion af ninhydrin og aminosyre, hvor absorbansen er korreleret med aminosyre indholdet til en vis grad13,14.
- 5 g ninhydrin opløses i 125 mL kogende destilleret vand. Desuden opløses 5 g C-vitamin i 250 mL varmt destilleret vand. Tilsæt 250 ml vitamin C-opløsning dråbevis til ninhydrin-opløsningen under magnetisk omrøring. Fortsæt med at røre i 15 minutter, og afkøer derefter reaktions opløsningen i et 4 °C-køleskab.
- Tag opløsningen ud af køleskab og Filtrer ved at suge ved hjælp af en Buchner tragt for at opnå reduceret ninhydrin. Bundfaldet opsamles og bevares i en phosphorpentoxid-dehydrator.
- 85 mg ninhydrin opløses og 15 mg reduceret ninhydrin i 10 mL ethylenglycol monomethylether for at tilberede ninhydrin-farveopløsningen.
Bemærk: ninhydrin-farvestof opløsning kan reagere med α-amino i APMA og danne en violet forbindelse med en struktur som beskrevet i en tidligere undersøgelse15. - 1 mL 0, 1, 10, 100, 1.000 mg/mL APMA monomer opløsninger fortyndes med 1 mL acetatbuffer (2 M, pH 5,4), og tilsæt derefter 1 mL ninhydrin-farveopløsning.
- Opvarm blandingerne i 15 minutter i et kogende vandbad, og Afkøl dem derefter med rindende vand. Lad løsningerne sidde i 5-10 min og fortynde dem med 3 mL 60% ethylalkohol og bland dem grundigt. Absorbansen måles ved 570 nm ved hjælp af et spektrofotometer, og Standardkurven tegnes (ligning 3).
Bemærk: ligning 3 er afledt af den lineære montering af absorbansen ved 570 nm versus APMA-koncentrationen. - 0,01 g BA opløses i 1 mL destilleret vand. Tilsæt 1 mL acetatbuffer (2 M, pH 5,4) og 1 mL ninhydrin-farvestof opløsning. Det molære indhold af APMA beregnes efter absorbansen ved 570 nm.
5
Bemærk: beregningsformlerne er som følger (ligninger 3-6).
5
4. syntese af methionin-podede BA-polymer (mBA)
- 8,9 mg FOMC-methionin opløses i 5 mL DMSO i en genvindings kolbe.
- Tilsæt 6,92 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimidhydrochlorid (EDCl) og 4,86 mg 1-hydroxybenzotriazol (HOBT) til genvindings kolben og reagerer ved 0 °C i 0,5 h.
- 2,59 g BA opløses i 5 mL DMSO-opløsning, og derefter tilsættes 50 μL trimethylamin; Tilsæt denne opløsning dråbevis til genvindings kolben (trin 4,2), og lad opløsningen reagere i 0,5 timer ved stuetemperatur.
- Dialyze for at fjerne DMSO og trimethylamin fra BA-opløsningen i trin 4,3 ved hjælp af en dialysepose (MWCO 10 kDa) i et 2 L bægerglas i 24 timer; Udskift deioniseret vand hver 6 h.
- Fryse-tørre den opnåede mBA og vejer at beregne udbyttet sats i henhold til ligning 7.
Bemærk: i dette tilfælde blev rente satsen fastsat til 71%. - Kvantificer den NH2 -indeholdende mBA ved at måle absorbansen ved 570 nm for at beregne mængden af podede methionin. Det molære indhold af methionin beregnes efter ligning 8.
5. syntese af guanidineret og methionin konjugeret BNHEMA-b-APMA polymer (MBG)
Bemærk: tre forskellige mBA1, mBA2 og mBA3 copolymer blev syntetiseret. mBA3 copolymer bruges som et eksempel i de følgende trin.
- MBA3 indeholdende 60 μmol af amino gruppen opløses i 5 mL rent vand.
Bemærk: amino gruppe indholdet blev kvantificeret ved hjælp af ninhydrin-metoden som beskrevet i trin 3,5. - 40,6 mg (300 μmol) opløses i guanidinylations reagens 1-amidinopyrazolhydrochlorid i mBA-opløsninger.
- PH-værdien justeres til 9,0 med den mættede opløsning af natriumcarbonat, og den kan stabiliseres i 24 timer ved stuetemperatur.
- Du skal dialysere mBG-produktet med deioniseret vand ved hjælp af en dialysepose i et bægerglas (MWCO 10 kDa, 2 L) og bevare det i form af et frysetørret pulver.
Renteprocenten blev beregnet til at være 85% via ligning 8.
8 - MBG pulver opløses i D2O i NMR-rørene og karakteriserer det med 1h nuklear magnetisk resonansspektroskopi (1t NMR)16.
86. klargøring og karakterisering af mBG/pDNA-polyplexer
- 50 μg pDNA opløses i 50 μL RNase/DNase-frit vand.
- 1 mg MBG copolymerer opløses i 1 ml RNase/DNase-frit vand.
- Tilføj MBG copolymerer-opløsningen direkte i pdna-opløsningen i henhold til forskellige fodringsforhold, det vil være forskellige N/P-forhold (1:1, 4:1, 8:1, 16:1 og 32:1).
Bemærk: N/P-forholdet er defineret som molær forholdet for guanidin-gruppen i polymeren og fosfat gruppen i pDNA, nemlig det molære forhold i GPMA-kæden i polymeren og mononukleotid i pDNA. N/P-forholdet beregnes i henhold til molekylvægten af amino nitrogen (N) i mBG og fosfatgruppe (P) i pDNA. - Bland løsningerne med en vortex mixer og lad dem stå i 30 minutter ved stuetemperatur. Derefter spredes blandingen i fosfatbufferopløsning (PBS, pH 7,4) og bevarer de opnåede mBG/pDNA-polyplexer ved 4 °C for opfølgende eksperimenter.
Bemærk: den gennemsnitlige partikelstørrelse og Zeta potentialet i mBG og komplekserne blev detekteret ved hjælp af dynamisk lysspredning (DLS)17. - 10 μL af mBG/pDNA-Polyplex-opløsninger fortyndes med 1 mL PBS (pH 7,4) i DLS og Zeta potentielle prøve celler.
Bemærk: partikelstørrelse og Zeta potentiel detektion blev udført tre gange, og et gennemsnit af de tre værdier blev taget.
7. elektroforetisk retardering-eksperiment med mBG/pDNA-polyplexer
Bemærk: et elektroforetisk retardering-eksperiment blev udført for at bestemme minimums opladnings forholdet.
- Tag fem grupper af mBG/pDNA-polyplexerne med forskellige N/P-forhold (1:1, 4:1, 8:1, 16:1 og 32:1), der indeholder 50 μg pDNA.
- Tilsæt 6x loading buffer til mBG/pDNA Polyplex prøverne til en endelig koncentration af 1x.
- Tilføj løsningerne til 1,5% aghas gels, og Kør gelen ved 90 mV i 15 minutter ved hjælp af pDNA som kontrol.
- Tag billeder af geler ved hjælp af en gel Imager.
8. cytotoksicitet af mBG/pDNA-polyplexer
- Frø MCF-7 celler i 96-brønden plader ved en tæthed på 104 celler pr brønd. Derefter kultur cellerne for 12 h ved hjælp af DMEM medium (10% FBS og 1% antibiotika) i en befuret 37 °C inkubator leveres med 5% CO2.
- Udskift kulturmediet med antibiotika frie DMEM-kultur medier, der indeholder 10% føtal bovint serum (FBS) og mBG/pDNA-polyplexer med forskellige opladningsforhold (N/P 4, 8, 16 og 32, n = 6) i 6 timer, idet cellerne tilsættes med lige store mængder PBS-opløsning som kontrol. Udskift derefter kulturmediet med 150 μL frisk 1640 medium og yderligere kultur cellerne i 24 timer.
- Tilsæt 5 mg/mL 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) opløsning (20 μL/brønd) til 96-brønd pladerne og yderligere kultur cellerne i 4 timer.
- Fjern opløsningen, og tilsæt 150 μL DMSO til hver brønd, og ryst 96-brønd pladerne 30 sek.
- Mål den optiske tæthed (OD) ved 490 nm med en mikroplade læser for at vise cellens levedygtighed. Beregn celle levedygtigheds procenten i henhold til ligning 9.
Cellelevedygtighed% =
(9)
(9)9. transfection effektivitet af mBG/GFP-pDNA-polyplexer
- 50 μg pDNA, der indeholder reportage genet Green fluorescerende protein (GFP) pDNA (GFP-pDNA), opløses i 50 μL RNase/DNase-frit vand. Derefter opløses 1 mg mBG copolymere i 1 mL RNase/DNase-frit vand. Bland pDNA-og mBG-opløsningen med et opladningsforhold (N/P) på 1:1, 4:1, 8:1, 16:1 og 32:1, og Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur. Disperser mBG/GFP-pDNA-polyplexer-opløsningen ved hjælp af ultralydbølger (30 s) og opbevares ved 4 °C for opfølgende eksperimenter.
Bemærk: N/P-forholdet beregnes i henhold til molekylvægten af amino nitrogen (N) i mBG og fosfatgruppe (P) i pDNA. - Frø MCF-7 celler ved en densitet på 2 × 105 celler pr brønd i en 6-brønd plade og kultur dem ved 37 °c og 5% Co2 i en befuret inkubator for 12 h.
- Udskift dyrkningsmediet med det friske dyrkningsmedium, der indeholder mBG/GFP-pDNA-polyplexer af forskellige N/P-forhold (4, 8, 16 og 32) i 6 timer.
- Udskift mediet med 2 mL frisk RPMI1640 medium og kultur til 48 h.
- Saml cellerne og detektér den grønne fluorescens med et flow cytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BNHEMA blev fodret i henhold til den objektive polymerisation, der er vist i tabel 1. den sammenfattende procedure for mBG er vist i figur 1. For det første blev BNHEMA homopolymer fremstillet via den reversible tilsætning-fragmentering kæde Transfer (RAFT) metode i vand-dioxan system, ved hjælp af 4-cyanopentanoinsyre dithiobenzoate som et kæde overførings middel. For det andet blev PBNHEMA brugt som kæde overførings middel til at tilberede BNHEMA-b-APMA blok polymer. APMA monomer blev fodret i henhold til den objektive polymerisation, der er vist i tabel 1. Gel permeationkromatografi (GPC) blev udført for at påvise den molekylære vægt af BA med forskellige fodrings rater (tabel 1). Det faktiske molære indhold af APMA-kæder i BA med forskellige fodrings rater blev påvist via ninhydrin-metoden (tabel 1). Ifølge vores tidligere undersøgelse5, vi brugte mBG3 i den nuværende undersøgelse, fordi det har den højeste APMA indhold. Endelig blev methionin podet til APMA-kæden, og rest amingrupperne blev fuldstændig guanidinyleret for at tilberede mBG. Figur 2 er 1H NMR data af MBG. Den gennemsnitlige partikelstørrelse og Zeta-potentialet i mBG/pDNA-polyplexer var henholdsvis 124 nm og + 15,7 mV ved et N/P-forhold på 16 (figur 3).
Elektroforetisk retardering er en hurtig og enkel teknik, der involverer adskillelse af ubundet pDNA og copolymer/pDNA-Polyplex baseret på forskelle i deres elektroforetiske moteter i agrose gels. Det ubundne pDNA-bånd kan bevæge sig i den agrose gel under virkningen af det elektriske felt. I det elektroforetiske retardering-eksperiment (figur 4) kan pdna (med et N/P-forhold på 0) bevæge sig uden tilbageholdenhed i agrose gel og blev observeret som en stribe i gel Imager. Når pDNA er kompleks med mBG, er bevægelsen af pDNA retarderet og efterfølgende reduceres lysstyrken på båndet. Figur 4 viser, at MBG kan være helt kompleks med pdna, når N/P er højere end 4.
Cytotoksiciteten af mBG/pDNA-polyplexer blev målt ved hjælp af standard MTT-analysen (figur 5). Resultaterne viser, at mBG/pDNA-polyplexer tydeligvis har lavere cytotoksicitet end PEI/pDNA-polyplexer ved N/P-ratioen på 4, 8, 16 og 32 i MCF-7-celle linjen (P < 0,05, n = 3, envejs ANOVA). Desuden øges cytotoksiciteten af mBG/pDNA-polyplexer med øget N/P-ratio. Stigningen i cytotoksicitet af mBG/pDNA polyplexer med en øget N/P er et resultat af den positivt ladede GPMA komponent. mBG/pDNA-polyplexer viste mindre cytotoksicitet end PEI/pDNA-polyplexerne, hvilket kan tilskrives tilstedeværelsen af BNHEMA i copolymere, der afskærmning overfladen ladning af kationiske polymerer.
Det N/P-forhold, der blev anvendt i pdna transfektering-eksperimentet, blev valgt i henhold til cytotoksiske resultater. Som vist i figur 6blev transftionsevnen for MBG1, MBG2 og mBG3 sammenlignet ved at måle gfp-fluorescens intensitet, og resultaterne viste, at mBG3 er det optimale genbæreren. Selv om Pei/pdna-polyplexer med et n/p-forhold på 8 har en lignende transfektering-effektivitet som mBG3/pdna-polyplexer med et n/p-forhold på 32, har Pei højere cytotoksicitet og har ingen funktioner såsom narkotika lastning, hvilket begrænser dets anvendelse på det biomedicinske område. Resultaterne afslørede, at stigningen af AMPA-indhold er nøglen til at forbedre transfektering effektivitet af MBG copolymer. Som vi nævnte i en tidligere undersøgelse5, celle penetrering peptider (cpp'er) er 9-35 Mer kationiske eller mole peptider med en evne til at trænge ind i cellemembranen. Guanidin-gruppen er en kationisk cpp, der kan konjugeres til en polymer for at forbedre transfektering af polymer/pdna-Polyplex gennem en protein uafhængig transmembran-pathway. Derfor integrerer mBG copolymer fordele i forbindelse med guanidin grupper for celle penetration og BNHEMA komponenten til afskærmning, der viser et stort potentiale for effektiv genlevering.
| Prøve | BHEMA-b-APMA | Mw | Pdi | |
| Teoretisk værdi af APMA-indhold (%) | Faktisk værdi af APMA-indhold (%) | |||
| BNHEMA90-b-APMA30(BA1) | 25 | 21 | 16200 | 1,25 |
| BNHEMA90-b-APMA60(BA2) | 40% | 37% | 20900 | 1,21 |
| BNHEMA90-b-APMA90(BA3) | 50% | 52% | 27200 | 1,25 |
Tabel 1: sammensætningen af BNHEMA-b-APMA ved flåde polymerisering.
Figur 1: skematisk syntese procedure af mBG. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: 1H NMR Spectra af MBG i D2O. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: polyplexens partikelstørrelse og zeta-potentiale.
A) partikelstørrelsen af BA/pdna. B) partikelstørrelsen af MBG/pdna. C) Zeta-potentialet for BA/pdna. D) Zeta-potentialet i MBG/pdna. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Agrose gel elektroforese billeder af BA3
(a) , mBA3 (b) og mBG3 (c) polyplexer ved forskellige opladningsforhold.
Figur 5: cytotoksicitet af mBG/pDNA-polyplexer ved forskellige N/P-forhold i MCF7-cellelinje.
PEI/pDNA Polyplex blev brugt som kontrol. Dataene blev vist som middelværdien ± SD (n = 3). * indikerer p < 0,05 sammenlignet med PEI-gruppen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Transfection effektivitet af mBG/pDNA-polyplexer ved N/P-forhold på 4, 8, 16 og 32 blev målt ved flowcytometer.
Dataene blev vist som middelværdien ± SD (n = 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse introducerede en serie af BNHEMA-b-APMA blok polymer kationiske genbærere. Disse blok polymerer blev syntetiseret via den reversible tilsætning-fragmentering kæde Transfer (RAFT) metode. Det hydrofile segment bnhema blev introduceret for at forbedre opløselighed. Methionin og guanidin grupper blev modificeret for at forbedre målevnen og transfektering effektivitet5. APMA-kædens indhold steg, og guanidinylering i mBG copolymer reducerede partikelstørrelsen af mBG/pDNA-polyplexer. Partikelstørrelse og overflade potentiale gør komplekset let at over cellemembranen og gælder for transfection. De kritiske punkter i forsøget ligger i strengt at kontrollere molær forholdet mellem BNHEMA monomer og CTP til 45:1, molær ratio af CTP og ACVA til 2:1, og temperaturen til 70 °C. Under rensningen skal volumen forholdet mellem den forkølede acetone-og polymeropløsning være højere end 50:1.
Med den samme N/P-værdi, sammen med stigningen i andelen af APMA-kæden, falder partikelstørrelsen på mBG/pDNA-polyplexer. Disse resultater indikerer, at APMA kæde indhold stigning og guanidinylation kan reducere partikelstørrelse. Partikelstørrelse og overflade potentiale gør komplekset let at transportere på tværs af cellemembranen og gælder for transfection. Gel elektroforese blev brugt til at undersøge forholdet mellem kompleksdannere og N/p ratio og dataene viste, at minimum N/p er 4. Denne undersøgelse vil give værdifulde grunddata for yderligere undersøgelse af kationiske genbærere. BNHEMA-b-APMA er imidlertid ikke let forringet, og dets metabolisme proces in vivo er ikke klart nok. Derfor er klinisk anvendelse stadig en stor udfordring for kationiske polymer genbærere.
Høj effektivitet og lav toksicitet af genbærere er de nødvendige betingelser for deres kliniske anvendelse. Kationiske polymer genvektorer har fordele ved god stabilitet og ingen immunogenicitet, og de kan forberedes og modificeres nemt.
RAFT polymerisering er meget udbredt i Polymeriseringen af monomerer, herunder styren, methacrylat, acrylonitril, og acrylamid. Denne form for polymeriserings proces kan udføres ved lav temperatur. Også, RAFT polymerisering kan bruges til at syntetisere polymerer af fine strukturer. RAFT polymerisering beskrevet i denne protokol betragtes som en af de mest lovende potentielle metoder til fremstilling af biomedicinske polymerer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne bekræfter, at der ikke er nogen interessekonflikt med nogen finansiel organisation vedrørende det materiale, som diskuteres i denne artikel.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af det nationale centrale forsknings-og udviklings program i Kina (no. 2016YFC0905900), National Natural Science Foundation i Kina (NOS. 81801827, 81872365), grundlæggende forskningsprogram af Jiangsu-provinsen (Natural Science Foundation, No. BK20181086), og Jiangsu Cancer Hospital videnskabelig forskning fond (nr. ZK201605).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-hydroxybenzotriazole | Macklin Biochemical Co., Ltd,China | H810970 | ≥97.0% |
| 1,4-dioxane | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10008918 | AR |
| 1-amidinopyrazole Hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | A107935 | 98% |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | E106172 | AR |
| 4,4’-azobis(4-cyanovaleric acid) | Aladdin Co., Ltd., China | A106307 | Analytical reagent (AR) |
| 4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic Acid | Aladdin Co., Ltd., China | C132316 | >97%(HPLC) |
| Acetate | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 81014818 | AR |
| Acetone | Sinopharm chemical reagent Co., Ltd, China | 10000418 | AR |
| Agarose | Aladdin Co., Ltd., China | A118881 | High resolution |
| Ascorbic acid | Aladdin Co., Ltd., China | A103533 | AR |
| DMSO | Aladdin Co., Ltd., China | D103272 | AR |
| Ethylene glycol | Aladdin Co., Ltd., China | E103319 | AR |
| N-(3-aminopropyl)methacrylamide hydrochloride | Aladdin Co., Ltd., China | N129096 | ≥98.0%(HPLC) |
| N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide | ZaiQi Bio-Tech Co.,Ltd, China | CF259748 | ≥98.0%(HPLC) |
| Ninhydrin | Aladdin Co., Ltd., China | N105629 | AR |
| PBS buffer | Aladdin Co., Ltd., China | P196986 | pH 7.4 |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | pDNA-EGFP | pDNA-EGFP |
| Plasmid DNA | BIOGOT Co., Ltd, China | Pdna | pDNA |
| Sodium carbonate decahydrate | Aladdin Co., Ltd., China | S112589 | AR |
| Trimethylamine | Aladdin Co., Ltd., China | T103285 | AR |
References
- Flotte, T. R. Gene and Cell Therapy in 2018: A Look Ahead. Human Gene Therapy. 29, 1-1 (2018).
- Huang, W., et al. Nanomedicine-based combination anticancer therapy between nucleic acids and small-molecular drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 115, 82-97 (2017).
- Wu, Y., et al. Reversing of multidrug resistance breast cancer by co-delivery of P-gp siRNA and doxorubicin via folic acid-modified core-shell nanomicelles. Colloids & Surfaces B Biointerfaces. 138, 60-69 (2016).
- Quader, S., Kataoka, K. Nanomaterial-Enabled Cancer Therapy. Molecular Therapy. 25, 1501-1513 (2017).
- Wu, Y., et al. Multivalent methionine-functionalized biocompatible block copolymers for targeted siRNA delivery and subsequent reversal effect on adriamycin resistance in human breast cancer cell line MCF-7/ADR. Journal of Gene Medicine. 19, e2969 (2017).
- Szwarc, M. ‘Living’ Polymers. Nature. 178, 168-169 (1956).
- Szwarc, M., Rembaum, A. Polymerization of methyl methacrylate initiated by an electron transfer to the monomer. Journal of Polymer Science. 22 (100), 189-191 (1956).
- Mukhopadhyay, R. D., Ajayaghosh, A. Living supramolecular polymerization. Science. 349, 241 (2015).
- Ozkose, U. U., Altinkok, C., Yilmaz, O., Alpturk, O., Tasdelen, M. A. In-situ preparation of poly(2-ethyl-2-oxazoline)/clay nanocomposites via living cationic ring-opening polymerization. European Polymer Journal. 88, 586-593 (2017).
- Wu, W., Wang, W., Li, J. Star polymers: Advances in biomedical applications. Progress in Polymer Science. 46, 55-85 (2015).
- Boyer, C., et al. Copper-Mediated Living Radical Polymerization (Atom Transfer Radical Polymerization and Copper(0) Mediated Polymerization): From Fundamentals to Bioapplications. Chemical Reviews. 116, 1803-1949 (2016).
- Keddie, D. J. A guide to the synthesis of block copolymers using reversible-addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization. Chemical Society Reviews. 43, 496-505 (2014).
- Wu, Y., et al. Guanidinylated 3-gluconamidopropyl methacrylamide-s-3-aminopropyl methacrylamide copolymer as siRNA carriers for inhibiting human telomerase reverse transcriptase expression. Drug Delivery. 20, 296-305 (2013).
- Qin, Z., Liu, W., Guo, L., Li, X. Studies on Guanidinated N-3-Aminopropyl Methacrylamide-N-2-Hydroxypropyl Methacrylamide Co-polymers as Gene Delivery Carrier. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 23, 1-4 (2012).
- Friedman, M. Applications of the Ninhydrin Reaction for Analysis of Amino Acids, Peptides, and Proteins to Agricultural and Biomedical Sciences. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52, 385-406 (2004).
- Habuchi, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level. Journal of Visualized Experiments. (115), 1-9 (2016).
- Rao, D. A., Nguyen, D. X., Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Alani, A. W. Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles. Journal of Visualized Experiments. 102, 1-5 (2015).
