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Immunology and Infection

नेटक्वांट का उपयोग करके न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप का स्वचालित छवि-आधारित क्वांटिफिकेशन

Published: November 27, 2019 doi: 10.3791/58528
Automatic Translation
1, 1
1Department of Clinical Sciences, Division of Infection Medicine, Lund University

Summary

यहां, हम न्यूट्रोफिल एक्सट्रासेलुलर ट्रैप (एनईटीएस) और ऑपरेटिंग नेटक्वांट पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जो इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों में एनईटीएस के परिमाणीकरण के लिए एक पूरी तरह से स्वचालित सॉफ्टवेयर विकल्प है।

Abstract

न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप (एनईटीएस) वेब जैसी एंटीमाइक्रोबियल संरचनाएं हैं जिनमें डीएनए और दाने दार ी से प्राप्त रोगाणुरोधी प्रोटीन शामिल हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और छवि आधारित क्वांटिफिकेशन विधियां न्यूट्रोफिल बाह्य जाल गठन को निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण बनी हुई हैं। हालांकि, इम्यूनोफ्लोरेसेंस-आधारित तरीकों की प्रमुख सीमाएं हैं जो वर्तमान में एनईटीएस की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपलब्ध हैं। छवि आधारित नेट क्वांटिफिकेशन के मैनुअल तरीके अक्सर व्यक्तिपरक होते हैं, उपयोगकर्ताओं, विशेष रूप से गैर-अनुभवी उपयोगकर्ताओं के लिए त्रुटि और थकाऊ होने की संभावना होती है। इसके अलावा, वर्तमान में क्वांटिफिकेशन के लिए उपलब्ध सॉफ्टवेयर विकल्प या तो अर्ध-स्वचालित हैं या ऑपरेशन से पहले प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। यहां, हम नेटक्वांट नामक नेट गठन का मूल्यांकन करने के लिए एक स्वचालित प्रतिकार आधारित छवि क्वांटिफिकेशन विधि के कार्यान्वयन को प्रदर्शित करते हैं। सॉफ्टवेयर का उपयोग करना आसान है और इसमें उपयोगकर्ता के अनुकूल ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) है। यह जैविक रूप से प्रासंगिक मापदंडों जैसे सतह क्षेत्र में वृद्धि और डीएनए: नेट मार्कर प्रोटीन अनुपात, और नेट गठन को परिभाषित करने के लिए परमाणु विरूपण पर विचार करता है । इसके अलावा, यह उपकरण एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ऐप के रूप में बनाया गया है, और एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन क्वांटिफिकेशन और विश्लेषण के लिए अनुमति देता है।

Introduction

न्यूट्रोफिल विभिन्न प्रकार के माइक्रोबियल रोगजनकों1के खिलाफ सहज मेजबान रक्षा प्रतिक्रियाओं के महत्वपूर्ण मध्यस्थ हैं। वे अपने कणिकाओं को रिहा करके अपने रोगाणुरोधी कार्यों को निष्पादित करते हैं जिनमें रोगाणुरोधी प्रोटीन2की एक विस्तृत श्रृंखला होती है, जो प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) और हाइपोक्लोराइट1का उत्पादन करती है, और फागोसाइटोसिस3के माध्यम से। इसके अलावा ब्रिंकमैन एट अल । 4 ने न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप (NETs) को एक उपन्यास तंत्र बताया जिसके द्वारा न्यूट्रोफिल जाल और हमलावर रोगजनकों को खत्म करते हैं। उनकी खोज के बाद से एक दशक पहले4से थोड़ा अधिक, NETs संक्रामक5,6 और गैर संक्रामक7 रुग्णियों की एक विस्तृत विविधता में फंसाया गया है । नेट गठन एक सक्रिय प्रक्रिया है और इसके परिणामस्वरूप क्रोनिलिन डीएनए का निष्कासन कण-व्युत्पन्न रोगाणुरोधी प्रोटीन8से लेपित होता है । नेट गठन से जुड़े सेलुलर और परमाणु आकृति विज्ञान में कुछ महत्वपूर्ण परिवर्तनों में परमाणु आकृति विज्ञान का नुकसान, क्रोमेटिन डिकंजेशन, साइटोप्लाज्म से नाभिक तक कणिका प्रोटीन जुटाना और परमाणु और सेलुलर व्यास8,9में वृद्धि शामिल है ।

वेब की तरह NETs, जो कोशिका से थोड़ा बड़ा संरचनाओं के रूप में प्रकट हो सकता है या संरचनाओं के रूप में कई बार एक ही न्यूट्रोफिल से बड़ा NETosis5,10के संकेतक के रूप में माना जाता है । फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, 4', 6-डिमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई) जैसे फ्लोरोसेंट जांच के साथ डीएनए की जांच करके और न्यूट्रोफिल इलास्टेज़ जैसे नेट-बाउंड प्रोटीन के खिलाफ इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला करके एनटीका का पता लगाया जा सकता है। डीएनए और नेट-बाउंड प्रोटीन के लिए धुंधला करने वाले क्षेत्रों का परिमाणीकरण एक छवि11में NETs के तहत कुल क्षेत्र निर्धारित करता है ।

एनईटीएस11,12के फ्लोरेसेंस इमेज बेस्ड क्वांटिफिकेशन करने के लिए इमेज एनालिसिस के कई विकल्प उपलब्ध हैं । लेकिन इन सॉफ्टवेयर विकल्प उपयोगकर्ता के अनुकूल नहीं किया जा रहा है और/या पूरी तरह से स्वचालित में सीमाएं मौजूद हैं । इस लेख में, हम NETQUANT13के संचालन को प्रदर्शित करते हैं, जो एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ऐप है जो निष्पक्ष पूरी तरह से स्वचालित प्रतिकार माइक्रोस्कोपी छवि आधारित नेट क्वांटिफिकेशन कर सकता है। ऐप में यूजर फ्रेंडली ग्राफिकल इंटरफेस (जीयूआई) है और यह सिंगल-सेल एनालिसिस कर सकता है । सॉफ्टवेयर डीएनए-नेट-बाउंड मार्कर के क्षेत्र में रूपात्मक परिवर्तनों का पता लगाकर एक छवि में नेटोसिस की मात्रा निर्धारित करता है, न्यूक्लियस के क्रोमेटिन विवर्तन से जुड़ा हुआ है और डीएनए: नेट-बाउंड प्रोटीन अनुपात में वृद्धि होती है । एक साथ लिया, कई नेट परिभाषा मापदंड एक निष्पक्ष फैशन में कई डेटा सेट भर में कड़े नेट मात्रा करण के लिए अनुमति देता है ।

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Protocol

लुंड विश्वविद्यालय की आचार समिति ने हेलसिंकी (2013/728) की घोषणा के अनुसार स्वस्थ स्वयंसेवकों से शिरारक्त के संग्रह को मंजूरी दी । सभी स्वयंसेवकों ने अपनी लिखित सूचित सहमति प्रदान की ।

1. घनत्व-ढाल Centrifugation का उपयोग कर परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल का अलगाव

  1. हेपरिन युक्त ट्यूबों में मानव शिरारक्त एकत्र करें और ट्यूबों को कमरे के तापमान तक पहुंचने की अनुमति दें।
    नोट: एक स्वस्थ दाता से रक्त की एक ंयूनतम 16 मिलील के लिए एक पर्याप्त रूप से बड़ी सेल गोली उपज की आवश्यकता है ।
  2. खारा (0.9% NaCl) में 2% dextran की एक मात्रा के साथ रक्त मिश्रण और एक बाँझ 50 mL शंकुअप ट्यूब में 30 मेंस के लिए कमरे के तापमान पर तलछट करने के लिए अनुमति देते हैं।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मीटर के लिए 200 x ग्राम पर एक बाँझ 50 मीटर शंकुअप अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र में अधिष्ठातनी।
  4. इस कदम से आगे 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर अलगाव जारी है।
  5. एक बाँझ 15 mL शंकुदरी ट्यूब में ल्यूकोसाइट आइसोलेशन ढाल (5.7% dextran, w/v) के साथ 5.1% सोडियम डायट्रिज़ोएट (5.7% dextran, w/v) के 5 मिलील के शीर्ष पर बर्फ ठंड खारा और परत के 5 मिलील में गोली को फिर से निलंबित करें।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 400 x ग्राम पर 30 मिन के लिए सेंट्रलाइज।
  7. अधिवत्थान को एस्पिरेट करें और उसे त्याग दें।
  8. 30 एस के लिए बर्फ ठंडे पानी के 3 मिलील में गोली को फिर से निलंबित करके लाल रक्त कोशिकाओं । तुरंत ३.६% NaCl के 1 mL जोड़ें और फिर बर्फ ठंड खारा के 10 मिलील के साथ भरें ।
  9. 350 x ग्राम पर 10 मिन के लिए सेल निलंबन को सेंट्रलाइज किया।
  10. अधिनायक को हटा दें, सेल पैलेट को इकट्ठा करें और इसे खारा के 1 एमएल में फिर से निलंबित करें। एक Bürker कक्ष में ट्राइपैन नीले रंग का उपयोग कर सेल संख्या और व्यवहार्यता के मूल्यांकन के लिए एक माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में 10 μL अलग सेट करें ।
  11. 0.4% ट्राइपैन ब्लू सॉल्यूशन के 90 माइक्रोन में सेल सस्पेंशन के 10 माइक्रोन जोड़ें। एक Bürker कक्ष में सेल निलंबन के 10 μL ले लो। कक्ष के प्रत्येक कोने में 3 लाइनों से बंधे 4 वर्गों में कोशिकाओं की गणना करें। कोशिकाएं जो गहरे नीले रंग की दिखाई देती हैं, वे गैर-व्यवहार्य हैं, उन्हें कुल सेल संख्या से बाहर करें।
  12. नीचे दिए गए समीकरण द्वारा परिभाषित कोशिकाओं/mL के रूप में सेल संख्या व्यक्त करें ।
    Equation
    नोट: यहां चैंबर फैक्टर 10,000 था, कमजोर पड़ने का कारक 10 था और वर्गों की कुल संख्या 4 थी।
  13. अंतिम वाशिंग चरण के लिए शेष सेल निलंबन को 10 बजे तक पतला करें।
  14. 200 x ग्राम पर 5 मिन के लिए सेंट्रलाइज।
  15. 5 x 105 कोशिकाओं/mL की एकाग्रता पर 2 मिलीग्राम/mL हीट-निष्क्रिय मानव सीरम एल्बुमिन (एचएसए) के साथ आरपीएमआई-१६४० में न्यूट्रोफिल को फिर से निलंबित करें ।

2. कवरस्लिप और न्यूट्रोफिल की उत्तेजना की तैयारी

  1. 12-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में एक कवरस्लिप (10 मिमी, #1) रखें और 0.01% पॉली-एल-लिसिन समाधान के 200 माइक्रोन जोड़कर कवरस्लिप को कोट करें और इसे रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
  2. एक बार 300 माइक्रोन फॉस्फेट बफर लवइन (पीबीएस) के साथ कवरस्लिप धोएं और सूखने के लिए छोड़ दें।
  3. प्रत्येक कुएं में 5 x 105 न्यूट्रोफिल/एमएल के 400 माइक्रोन जोड़ें और 15 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  4. 15 मिन के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर के लिए न्यूट्रोफिल युक्त प्लेट ले जाएँ।
  5. अधिस्थान निकालें। नियंत्रण के लिए 2 मिलीग्राम/mL एचएसए के साथ पूर्वगरम RPMI-१६४० माध्यम के ४०० μL जोड़ें । उत्तेजना के लिए 20 एनएम phorbol 12-myristate 13-एसीटेट (पीएमए) के साथ 300 माइक्रोन पूर्व गर्म RPMI जोड़ें।
  6. 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 150 मिन के लिए न्यूट्रोफिल को उत्तेजित करें।

3. एनईटीएस का दृश्य

  1. अधिनेता को हटादें और नमूनों को पीबीएस के 200 माइक्रोन के साथ 2x धोएं।
  2. पीबीएस में 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 200 माइक्रोन को 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मीटर के लिए जोड़कर नमूने ठीक करें।
    नोट: पीएफए विषाक्त है और देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए।
  3. पीबीएस के 200 माइक्रोन के साथ नमूने 3x धोएं।
  4. 30 एस के लिए 0.5% ट्राइटन एक्स-100 के 50 माइक्रोन जोड़कर नमूनों को परमीबिलाइज करें।
  5. पीबीएस के 200 माइक्रोन के साथ नमूनों 3x धोएं।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए पीबीएस में 5% बकरी सीरम के साथ नमूनों को ब्लॉक करें।
  7. 37 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिन के लिए 1:500 के कमजोर पड़ने पर समाधान को अवरुद्ध करने में प्राथमिक खरगोश एंटी-ह्यूमन न्यूट्रोफिल इलास्टे के 300 माइक्रोन जोड़ें।
  8. पीबीएस के 300 माइक्रोन के साथ नमूनों 3x धोएं।
  9. 37 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिन के लिए 1:1000 के कमजोर पड़ने पर माध्यमिक बकरी विरोधी खरगोश फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के 300 माइक्रोन जोड़ें।
  10. कवरस्लिप 3x को पीबीएस के 300 माइक्रोन के साथ धोएं।
  11. कुओं से कवरस्लिप निकालें और DAPI युक्त 10 μL बढ़ते माध्यम के साथ कवरस्लिप माउंट । नमूनों को सुखाने के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर रात भर स्टोर करें।
    नोट: DAPI के साथ डीएनए का धुंधला होना निश्चित रूप से विधि में एक महत्वपूर्ण कदम है। उपयोगकर्ता 2 \u20123 min के लिए 0.1\u20120.5 μg/mL की अंतिम एकाग्रता रेंज में एक्सोजेनस डीएपीआई समाधान जोड़कर भी समस्या निवारण कर सकते हैं, इसके बाद 300 माइक्रोन पीबीएस के साथ 3 वाशिंग स्टेप ्स ।
  12. 20X उद्देश्य का उपयोग करके एक व्यापक क्षेत्र फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ छवियों का अधिग्रहण करें।

4. नेटक्वांट का उपयोग करके एनईटीएस का विश्लेषण और परिमाणीकरण

नोट: NETQUANT Zenodo Github संग्रह या Nordenfelt लैब वेबसाइट(https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34)पर पाया स्थापना फ़ाइल पर क्लिक करके डाउनलोड किया जा सकता है ।

  1. विश्लेषण के लिए डेटासेट आयात करना, चैनलों का नामकरण और छवियों का रूपांतरण
    1. नेटक्वांट में सेटअप टैब खोलें।
    2. स्रोत मेनू में गेट पाथ विकल्प पर क्लिक करके विश्लेषण के लिए स्रोत फ़ोल्डर चुनें और विश्लेषण किए जाने वाले छवि दृश्यों वाले फ़ोल्डर का चयन करें।
    3. लक्ष्य मेनू में प्राप्त पथ विकल्प पर क्लिक करें और छवि विश्लेषण के बाद डेटा को बचाने के लिए फ़ोल्डर का चयन करें।
    4. चैनलों का नाम इसलिए करें ताकि "डीएनए चैनल" डीएनए धुंधला(जैसे,डीएनए या डीपीआई) और "नेट-चैनल" से मेल खाती है, छवियों में नेट-बाउंड प्रोटीन धुंधला(जैसे,नेट, न्यूट्रोफिल इलास्टेस) को दर्शाया गया है। सॉफ्टवेयर के सुचारू संचालन के लिए, (अनुशंसित) नियंत्रण छवि फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर को "नियंत्रण" के रूप में नाम दें।
      नोट: नेट चैनल केवल नेट-बाउंड ग्रेन्यूल प्रोटीन मार्कर को संदर्भित करता है।
    5. इमेज इन्फॉर्मेशन सब-मेन्यू पर लोड इमेज इन्फॉर्मेशन बटन पर क्लिक करके इमेज मेटाडेटा को सॉफ्टवेयर में फीड करें।
    6. चैनल ऑर्डर सब-मेनू में छवियों में निहित सही चैनल ऑर्डर का चयन करें। आकस्मिक बेमेल को रोकने के लिए इस विकल्प को असफल-सुरक्षित के रूप में शामिल किया गया है।
    7. कच्चे डेटा से प्राथमिक छवि गुण प्राप्त करें और तैयार डेटा बटनपर क्लिक करके छवियों को परिवर्तित करें। परिवर्तित छवियां नमूना प्रकार उप-मेनू में दिखाई देती हैं। विश्लेषण के लिए प्राप्त सभी डेटासेट प्रदर्शित करने और चुनने के लिए नमूना प्रकार मेनू पर क्लिक करें।
    8. नमूना प्रकार उप मेनू से एक छवि का चयन करें और क्रमशः डीएनए और नेट चैनल में विभाजित छवियों को प्रदर्शित करने के लिए प्रदर्शन छवि डेटा बटन पर क्लिक करें ।
  2. डीएनए चैनल और नेट चैनल में कोशिकाओं का विभाजन
    1. डीएनए चैनल और नेट चैनल दोनों में मेथड सब मेन्यू पर क्लिक करके सेगमेंटेशन मेथड का चयन करें।
      नोट: विभाजन की डिफ़ॉल्ट विधि अनुकूली के लिए सेट है और अनुशंसित सेटिंग है। ग्लोबल, एज और चान-वेस सहित अन्य विकल्प भी उपलब्ध हैं । बारीकी से रखी गई कोशिकाओं या NETs के बीच अंतर करने में मदद करने के लिए एक वाटरशेड विकल्प भी शामिल है।
    2. सेगमेंट कंट्रोल नमूनों के विकल्प पर क्लिक करके दोनों चैनलों में सबसे पहले सेगमेंटकंट्रोल सेल में सेगमेंटेशन टैब दर्ज करें।
    3. नमूना प्रकार उप-मेनू से पीएमए का चयन करें और डेटा सेट में शामिल सभी छवियों का विभाजन शुरू करने के लिए बैच विकल्प (अनुशंसित) पर क्लिक करें। नमूना प्रकार मेनू में छवियों का चयन करें और बाइनरी इमेज मास्क (डीएनए मास्क और नेट मास्क) द्वारा खंडित होने की कल्पना और सत्यापन करने के लिए डिस्प्ले इमेज डेटा बटन पर क्लिक करें।
  3. पहचान योग्य गुणों का एकल-सेल विश्लेषण
    1. विश्लेषण टैब दर्ज करें और निर्धारित सीमा बटन पर क्लिक करके नियंत्रण नमूनों का विश्लेषण करें।
    2. नमूना प्रकार को पीएमए में बदलें और उत्तेजित नमूनों के विश्लेषण को पूरा करने के लिए प्राप्त सेल गुण बटन पर क्लिक करें।
    3. नमूना प्रकार उप-मेनू से एक छवि का चयन करें और ओवरले और छवि में कोशिकाओं और नेट बनाने वाली कोशिकाओं की संख्या प्रदर्शित करने के लिए डिस्प्ले इमेज डेटा बटन पर क्लिक करें।
  4. नेट बनाने वाली कोशिकाओं की पहचान करने के लिए सेल गुणों की तुलना
    1. नमूना प्रकार उप मेनू से नमूना चुनें और विश्लेषण को पूरा करने के लिए विश्लेषण NETs बटन पर क्लिक करें। विश्लेषण के लिए नमूना प्रकार उप-मेनू से व्यक्तिगत छवियों का चयन किया जा सकता है या बैच विकल्प (अनुशंसित) का चयन करके छवियों के पूरे बैच का विश्लेषण किया जा सकता है।
    2. दिए गए नमूने के लिए इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए नेट मानदंडों को मैन्युअल रूप से समायोजित करें। पहचान की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए मूल छवियों के साथ पहचाने गए NETs की तुलना करें।
      नोट: नेट मानदंड तो डेटा सेट में सभी छवियों में इस्तेमाल किया जा सकता है । नेट मापदंड में कोई भी परिवर्तन सभी नियंत्रण नमूनों में एक साथ लागू किया जाता है । यह नेट मापदंडों की अधिक फिटिंग के कारण उत्पन्न होने वाले किसी भी संभावित मतभेद की संभावना को सीमित करता है। नेट मापदंड में सेटिंग्स को उपयोगकर्ता की आवश्यकताओं के अनुसार समायोजित किया जा सकता है। झूठी खोज दरों और NETQUANT के बीच संबंध पहले13का पता लगाया गया है । क्षेत्र वृद्धि के लिए विशिष्ट पर्वतमाला 2 \u20124, परिपत्रता 0.7 \ u20120.9 और डीएनए/नेट अनुपात 0.6-2.0 हो रहे हैं ।
    3. सेल डेटा उप-मेनू में डेटा सारांश का निरीक्षण करें जहां छवियों की संख्या, छवि के अनुसार सेल गिनती और प्रति छवि एनईटीएस का प्रतिशत प्रदर्शित किया जाता है।
      नोट: पूरे डेटासेट में NETs का कुल प्रतिशत "नेट-गेज" द्वारा प्रदर्शित किया जाता है। कुल छवि गिनती, सेल गिनती, नमूना में NETs का प्रतिशत (NETs%) और नियंत्रण नमूने में NETs% नेट गेज के नीचे सारांश सांख्यिकी तालिका में प्रदर्शित कर रहे हैं । हम अनुशंसा करते हैं कि उत्तेजित नमूनों से प्राप्त डेटा के साथ नियंत्रण डेटा की रिपोर्ट की जाती है।
  5. रिजल्ट आउटपुट
    1. रिजल्ट आउटपुट का चयन करने और देखने के लिए आउटपुट टैब दर्ज करें।
    2. आउटपुट के रूप का चयन करके और आउटपुट परिणाम बटन पर क्लिक करके नियंत्रण और पीएमए के विश्लेषण से उत्पन्न विभिन्न डेटा आउटपुट का अन्वेषण और तुलना करें।
      नोट: लक्ष्य उप-मेनू में चुने गए विश्लेषण फ़ोल्डर में नियंत्रण और उत्तेजना दोनों के लिए पोस्ट-विश्लेषण उत्पन्न किए गए सभी डेटा को सहेजा जाता है। डेटा या तो .csv या .pdf प्रारूपों में सहेजे जाते हैं।
    3. विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले सॉफ़्टवेयर और नेट-मापदंड के संस्करण को प्राप्त करने के लिए विधि फ़ाइल लॉन्च करें (प्रकाशन उद्देश्यों के लिए विधियों अनुभाग में शामिल किया जाना)।
    4. किसी दिए गए नमूने में व्यक्तिगत डेटा बिंदुओं की कल्पना करने के लिए परिणाम डेटा तालिका पर क्लिक करें।
    5. नमूनों में नेट क्षेत्र वितरण और डीएनए: नेट अनुपात की कल्पना करें। लाल रेखा रेखांकन में दहलीज मूल्य इंगित करती है।
    6. द्विवरेट वितरण फ़ाइल पर क्लिक करके डीएनए के आकार बनाम शुद्ध क्षेत्र निर्धारित करें।
  6. पिछले विश्लेषण और बैच सभी चरणों लोड हो रहा है
    1. लोड पिछले विश्लेषण बटन का उपयोग करनेटक्वांट में पहले से सफल विश्लेषण सेटिंग्स लोड करें।
    2. अंतिम आउटपुट प्राप्त करने के लिए सीधे चरण 5 \u201212(चित्रा 1, चित्रा2, चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5)चलाने के लिए सेटअप मेनू में शामिल सभी चरण बटन का उपयोग करें।

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Representative Results

5 x १०५ न्यूट्रोफिल/mL को 12-अच्छी प्लेट में रखे गए कवरस्लिप पर वरीयता दी गई थी और या तो 20 एनएम पीएमए के साथ उत्तेजित किया गया था या १५० मिन के लिए अउत्तेजित छोड़ दिया गया था । इसके बाद नमूनों को प्राथमिक खरगोश विरोधी मानव न्यूट्रोफिल इलास्टेस एंटीबॉडी, माध्यमिक बकरी विरोधी खरगोश फ्लोरोफोर कंजुगेट एंटीबॉडी और डीएपीआई का उपयोग करके दाग दिया गया - एक फ्लोरोसेंटी लेबल वाले डाये जो डीएनए को दाग देता है (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)। इसके बाद कम से कम 5 छवियों को एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप और 20X (एनए = 0.75) उद्देश्य का उपयोग करके प्राप्त किया गया। पांडुलिपि में परीक्षण विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले नमूना डेटा को लिंक https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34 का पालन करके और नमूना डेटासेट आइकन पर क्लिक करके डाउनलोड किया जा सकता है।

यहां हम दिए गए नमूने में नेट गठन की मात्रा निर्धारित करने के लिए NETQUANT कार्यप्रवाह(चित्रा 1)की क्षमता का वर्णन करते हैं। सॉफ्टवेयर टूल को मैटलैब में ऐप के रूप में स्थापित किया जा सकता है और इस इंटरफ़ेस की पिछली जानकारी के बिना इसका उपयोग किया जा सकता है। नेटक्वांट के जीयूआई का उपयोग ऊपर वर्णित डेटासेट का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। NETQUANT द्वारा विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली सभी छवियों को हमेशा माता-पिता निर्देशिका में अनछुए छोड़ दिया जाता है। जीयूआई को 4 टैब में बांटा गया है - सेटअप टैब, सेगमेंटेशन टैब, एनालिसिस टैब और परिणाम आउटपुट टैब। नमूने सेटअप टैब(चित्रा 2)में विश्लेषण के लिए तैयार किए गए थे । फ़ाइल पथ (1), नामकरण सम्मेलन (2), छवि जानकारी (3) और चैनल ऑर्डर (4) उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित किए गए हैं। तैयार डेटा विकल्प (5) यह सुनिश्चित करता है कि रूपांतरण और संगठन पूरे प्रयोग में मानकीकृत फैशन में। खंडीकरण पैरामीटर नमूनों (6) में व्यक्तिगत कोशिकाओं की पहचान करने के लिए सेगमेंटेशन टैब(चित्रा 3)में सेट किए गए थे। नियंत्रण नमूनों को उत्तेजित नमूनों (8) के विभाजन से पहले हमेशा पहले (7) खंडित किया जाता है। विभाजन के लिए सभी अनुशंसित मूल्यसॉफ्टवेयर टैब में इंगित किए जाते हैं। अउत्तेजित नियंत्रण कोशिकाओं को परिभाषित करने वाले गुण पहले (9) प्राप्त किए जाते हैं और फिर पीएमए उत्तेजित कोशिकाओं (10)(चित्रा 4) कीतुलना में। एनईटीएस का विश्लेषण तब नेट मापदंड (11) के आधार पर नमूनों में किया जाता है और नियंत्रण नमूनों में कुल छवि गिनती, सेल मायने रखता है और इसी NETs% के साथ प्रदर्शित किया जाता है। विश्लेषण से अंतिम डेटा आउटपुट का चयन किया गया और फिर कल्पना(चित्रा 5)। पहले से सफल विश्लेषण को लोड करने और उपयोग करने के लिए एक विकल्प, और चरण 5-12 के समूहों को संसाधित करने के लिए एक बैच-सभी विकल्प(चित्रा 1, चित्रा 2, चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5)को भी सेटअप टैब में शामिल किया गया है।

विश्लेषण के दौरान प्रयोग में कुल 2619 कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया। पीएमए उत्तेजित न्यूट्रोफिल 90.59% NETs (NETs%) नियंत्रण नमूनों में 25.87 NETs% के विपरीत(चित्रा 6)। छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर कार्यप्रवाह शुरू करने के 10 मिनट के भीतर पूरा किया गया था। संक्षेप में, NETQUANT प्रतिकार माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्राप्त की गई छवियों में नेट गठन की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक त्वरित और सुविधाजनक विकल्प प्रदान करता है।

Figure 1
चित्रा 1: NETQUANT कार्यप्रवाह का अवलोकन। मानव न्यूट्रोफिल के फ्लोरोसेंट माइक्रोग्राफ एंटी-इलास्टीज और डीपीआई (डीएनए) के साथ दोहरे दाग वाले पहले संसाधित और परिवर्तित होते हैं। छवियों को तब खंडित किया जाता है, जिसके बाद सेल गुणों का विश्लेषण, एनईटीएस का पता लगाया जाता है और परिणाम आउटपुट होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: NETQUANT में सेटअप टैब विकल्प। डेटासेट का विश्लेषण करने के लिए फ़ाइल पथ और डेटा आउटपुट फ़ोल्डर्स सेटअप टैब पहले (1) में दर्ज किए जाते हैं। नामकरण सम्मेलनों को चैनल के नाम और नियंत्रण फ़ोल्डर नाम (2) को परिभाषित करने के लिए भरा जाता है। छवि जानकारी तो प्राप्त की है (3) सही चैनल आदेश (4) नामकरण के बाद । मानकीकृत छवि रूपांतरण के लिए डेटासेट (5) के प्रसंस्करण से पहले सभी क्षेत्रों के उचित सेटअप की सिफारिश की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: NETQUANT में सेगमेंटेशन टैब पैरामीटर। डीएनए चैनल और नेट-प्रोटीन मार्कर दोनों के विभाजन के लिए उपयोग किए जाने वाले मापदंडों में विधि, संवेदनशीलता, पुनरावृत्तियां, न्यूनतम क्षेत्र और वाटरशेड (6) शामिल हैं। एक अनुकूली विभाजन विधि और वाटरशेड के उपयोग की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, सॉफ्टवेयर में प्रीसेट के रूप में प्रदान की गई अन्य सेटिंग्स का उपयोग अधिकांश उद्देश्यों के लिए संशोधन के बिना किया जा सकता है। नियंत्रण नमूनों को पहले खंडित किया जाता है (7) और फिर उत्तेजित नमूनों को खंडित किया जाता है (8)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: विश्लेषण टैब में NETs का पता लगाना। अउत्तेजित कोशिकाओं को परिभाषित करने वाले सेल गुणों का विश्लेषण किया जाता है और नियंत्रण नमूनों (9) से प्राप्त किया जाता है। इसके बाद प्रायोगिक नमूनों (10) में सेल गुणों का विश्लेषण किया जाता है। नेट-परिभाषा मानदंड (सेलुलर क्षेत्र में गुना वृद्धि, परमाणु विरूपण (मूल्य 0 से 1) और डीएनए धुंधला क्षेत्र/नेट-मार्कर धुंधला क्षेत्र) नेट गठन (11) को परिभाषित करने के लिए नियंत्रण और उत्तेजित नमूनों दोनों पर लागू होते हैं । एनईटीएस की मात्रा, कुल सेल गिनती और दोनों नमूनों में छवियों की संख्या सारांश सांख्यिकी अनुभाग में प्रदर्शित की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: NETQUANT में परिणाम आउटपुट फ़ाइलों का दृश्य। विश्लेषण के बाद प्राप्त परिणामों को व्यक्तिगत उपयोगकर्ता द्वारा चुना जा सकता है। नेटक्वांट के साथ जेनरेट किए जा सकने वाले रिजल्ट आउटपुट में अलग-अलग कोशिकाओं के डेटा पॉइंट्स वाली .CSv फाइल शामिल है। इसके अलावा, नेट (सेलुलर) क्षेत्र में वृद्धि के दौर से गुजर कोशिकाओं के वितरण का चित्रण हिस्टोग्राम, क्रोमेटिन डिकंनन और डीएनए के कारण नाभिक का विरूपण: नेट-मार्कर अनुपात, और नेट क्षेत्र बनाम परमाणु विकृति का 3डी ग्राफ भी विश्लेषण में उत्पन्न होता है । सेटअप टैब में चुने गए विश्लेषण फ़ोल्डर में सभी आउटपुट स्वचालित रूप से सहेजे जाते हैं. सीएसवी, .pdf और .txt फ़ाइलें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: नेट गठन का विश्लेषण। (क) एनईटीएस%, कुल सेल काउंट और परीक्षण डेटा सेट से छवियों की संख्या जैसा कि नियंत्रण और पीएमए-उत्तेजित (20 एनएम) न्यूट्रोफिल के लिए सारांश आंकड़ों में देखा गया है । (ख) इस क्षेत्र में वृद्धि, परमाणु विरूपण (मूल्य 0 से 1) और नियंत्रण में डीएनए/नेट अनुपात और पीएमए-उत्तेजित नमूनों को दर्शाते हुए हिस्टोग्राम की साथ-साथ तुलना की जाती है । नेट-परिभाषा मानदंडों के लिए हिस्टोग्राम दहलीज मूल्यों में लाल रेखा। (ग) नियंत्रण के NETQUANT विश्लेषण और पीएमए-उत्तेजित नमूनों द्वारा उत्पन्न नेट क्षेत्र बनाम परमाणु विरूपण के 3डी ग्राफ की तुलना । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

नेट गठन विविध न्यूट्रोफिल आयुध4 के लिए अपेक्षाकृत हाल ही में जोड़ दिया गया है और अनुसंधान क्षेत्रों की एक विस्तृत श्रृंखला में NETs के निहितार्थ का अध्ययन करने के लिए ब्याज की एक उल्लेखनीय वृद्धि हुई है5,7,14,15। इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और बाद में छवि आधारित क्वांटिफिकेशन का उपयोग करछवियों का अधिग्रहण NETs की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है। इस दृष्टिकोण का लाभ एक एकल सेल स्तर पर NETs बनाने कोशिकाओं का पता लगाने में सक्षम किया जा रहा है और इसलिए बेहतर पृष्ठभूमि संकेत को कम कर सकते हैं । क्वांटिफिकेशन के मैनुअल तरीके संपूर्ण, धीमे और उपयोगकर्ता पूर्वाग्रह के अधीन हो सकते हैं। कुछ अर्ध-स्वचालित विकल्प मौजूद हैं जिन्होंने उपयोगकर्ताओं को विश्वसनीय विश्लेषण11,12प्रदान किया है। हालांकि, उन्हें ऑपरेशन के लिए महत्वपूर्ण तकनीकी कौशल की आवश्यकता हो सकती है या क्वाटिफिकेशन के लिए कई मैनुअल चरणों की आवश्यकता हो सकती है। यह विशेष रूप से पहले से गैर-अनुभवी उपयोगकर्ताओं के लिए चुनौतीपूर्ण है। हाल ही में एक प्रकाशन में, प्रवाह साइटोमेट्री आधारित इमेजिंग के साथ-साथ पतले ऊतक वर्गों का उपयोग करके नेट गठन की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक पूरी तरह से स्वचालित कम्प्यूटेशनल विधि का उपयोग किया गया है। हालांकि, इसे केवल विशिष्ट परिदृश्यों पर लागू किया जा सकता है और ऑपरेशन16के लिए प्रोग्रामिंग के महत्वपूर्ण ज्ञान की भी आवश्यकता होती है। वर्तमान में, सामान्य नेट क्वांटिफिकेशन की दिशा में समर्पित पूरी तरह से स्वचालित छवि क्वांटिफिकेशन सॉफ्टवेयर जिसका उपयोग करना आसान है और एकल-सेल संकल्प क्षमता शोधकर्ताओं के लिए अनुपलब्ध है।

यहां हम NETQUANT, एक पूरी तरह से स्वचालित नेट क्वांटिफिकेशन सॉफ्टवेयर पेश करते हैं जो स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है। यह सॉफ्टवेयर विशेष रूप से प्रतिकार माइक्रोस्कोपी छवियों का उपयोग करके उच्च स्ट्रिंग के साथ नेट गठन की मात्रा निर्धारित करने के लिए विकसित किया गया है, और एकल-सेल विश्लेषण और मात्राकरण करने की क्षमता के साथ। एनईटीएस के तहत धुंधला के क्षेत्र में वृद्धि पर विचार करने के अलावा, NETQUANT भी क्रोमेटिन विचरण और डीएनए/नेट मार्कर प्रोटीन सह स्थानीयकरण में वृद्धि के कारण परमाणु विकृति को ध्यान में रखता है ताकि किसी दिए गए नमूने में नेट गठन को परिभाषित किया जा सके । यह उन कोशिकाओं को अलग करने की अनुमति देता है जो केवल उन कोशिकाओं से परमाणु हतोत्साहन से गुजरे हैं जो पूर्ण शुद्ध गठन से गुजरे हैं। NETQUANT एल्गोरिदम में शामिल नेट परिभाषा मानदंड पहले के कई मात्राकरण दृष्टिकोणों की तुलना में मात्रा में उच्च तार-तार की अनुमति देता है जो नेट धुंधला के क्षेत्र में वृद्धि पर पूरी तरह से भरोसा करते हैं।

जीयूआई का उद्देश्य उपयोगकर्ता के अनुकूल और उपयोग करने के लिए सरल होना है। विश्लेषण के प्रत्येक चरण को यह सुनिश्चित करने के लिए गिने जाते हैं कि उपयोगकर्ता कार्यप्रवाह का पालन कर सकते हैं। सॉफ्टवेयर में प्रदान की गई प्रमुख विशेषताओं में से एक सेगमेंटेशन टूल/टैब है जो नेटक्वांट को छवियों में एकल-सेल विश्लेषण करने की अनुमति देता है, जो उच्चतम संभव संवेदनशीलता है जिसे प्राप्त किया जा सकता है । यह NETQUANT को उन कुछ उपलब्ध विकल्पों में से एक बनाता है जो नेट गठन को निर्धारित करने के लिए एकल-सेल क्वांटिफिकेशन कर सकते हैं। इसके अलावा, मोहंती एट अल ने दिखा दिया है कि सॉफ्टवेयर छवि विविधताओं और अधिग्रहण मापदंडों13के अनुकूल भी हो सकता है । विभाजन और नेट-परिभाषा मानदंडों में पेश लचीलेपन के कारण, दाता और प्लेट विविधताओं को समायोजित किया जा सकता है। NETQUANT बड़े डेटा सेट को पर्याप्त रूप से संभाल सकता है और विश्वसनीय उच्च थ्रूपुट छवि विश्लेषण13के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

यद्यपि हमने कई दानदाताओं से मजबूत परिणाम प्राप्त करने के लिए कार्यप्रवाह पाया, हम अनुशंसा करते हैं कि उपयोगकर्ता को व्यक्तिगत नमूनों के आधार पर उचित मूल्यों पर निर्णय लेना चाहिए। सिद्धांत रूप में, विश्लेषण के बाद उत्पन्न डेटा उच्च सेल घनत्व से भी प्रभावित हो सकता है। इसके अलावा, NETs के अत्यधिक एकत्रीकरण का पता चला NETs की संख्या में कमी में परिणाम कर सकते हैं । इसका कारण यह है कि विभाजन एल्गोरिदम अलग घटनाओं में उलझ NETs भेद नहीं कर सकते । विभाजन के साथ एक ऐसी ही समस्या भी पैदा हो सकती है जब एनईटीएस के भीतर अउत्तेजित न्यूट्रोफिल फंस जाते हैं। 20X और 40X पर प्राप्त छवियों के उपयोग की वर्तमान में सिफारिश की गई है क्योंकि NETQUANT के प्रदर्शन का अन्य आवर्धन स्तरों पर परीक्षण नहीं किया गया है। फिर भी, जब तक पिक्सेल का आकार सही ढंग से सेट किया जाता है (या तो मैन्युअल रूप से या लोड इमेज इन्फो सेक्शन में मेटाडेटा से) सॉफ्टवेयर को क्षेत्र गणना को उच्च या कम आवर्धन के लिए सही ढंग से अनुकूलित करना चाहिए। डीएनए और दानेदार मार्कर का उचित धुंधला एक महत्वपूर्ण कारक है । किसी भी चैनल में खराब धुंधला या खराब छवि की गुणवत्ता के परिणामस्वरूप उप-इष्टतम परिणाम होंगे। इसलिए, यह सिफारिश की जाती है कि उपयोगकर्ता को इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए एक उपयुक्त सेल नंबर, धुंधला प्रक्रिया और एंटीबॉडी टिटर निर्धारित करना चाहिए।

नेटक्वांट का परीक्षण केवल वीट्रो में मानव न्यूट्रोफिल से प्राप्त एनईटीपर किया गया है। अन्य प्रजातियों से NETs भी मापदंड में उचित सुधार के साथ मात्रा निर्धारित कर सकते हैं । नेट क्वांटिफिकेशन चैंबर स्लाइड या मल्टी-वेल ग्लास बॉटम प्लेट्स में फिक्स्ड नमूनों पर किया जा सकता है। डीएनए और दानेदार प्रोटीन मार्कर के लिए दाग नमूनों की उच्च गुणवत्ता छवियों महत्वपूर्ण हैं । NETQUANT को एक्सिसेलुलर ट्रैप (ईटी- ओसिस, जैसे,जैसे, जैसे, eosinophils द्वारा प्रदर्शित के अन्य रूपों की मात्रा निर्धारित करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। गैर-ग्रैनुलोसाइट्स जैसे मोनोसाइट्स में ईटीएस को मात्रा देने की मात्रा वर्तमान में संभव नहीं है क्योंकि विभाजन एल्गोरिदम के लिए साइटोप्लाज्मिक ग्रेनेल धुंधला क्षेत्र की आवश्यकता होती है।

निष्कर्ष में, NETQUANT नेट गठन की सटीक पहचान करने के लिए एक सरल, स्वचालित और तेजी से उपकरण है जो एकल-सेल विश्लेषण और मात्राकरण के लिए अनुमति देता है। हमारा मानना है कि इस सॉफ्टवेयर स्वचालित नेट क्वांटिफिकेशन प्रदर्शन के लिए बाधा कम हो सकती है और अनुसंधान समुदाय को इस स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ऐप से लाभ होगा।

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Disclosures

टीएम और पीएन के पास NETQUANT में उपयोग किए जाने वाले एल्गोरिदम से संबंधित पेटेंट लंबित है।

Acknowledgments

इस काम को क्रैफोर्ड फाउंडेशन (टीएम और पीएन), स्वीडिश गवर्नमेंट रिसर्च ग्रांट (पीएन, टीएम), स्वीडिश रिसर्च काउंसिल (पीएन) और ग्रोश्िंस्की फाउंडेशन (टीएम, पीएन) द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer Heparinised plastic tubes BD Biosciences 367885
Lymphoprep Axis-Shield 114547
RPMI-1640 with L-Glutamine Gibco 11835-030
50mL conical flasks Sarstedt 62.547.004
15mL conical flasks Sarstedt 62.554.002
12-well Tissue culture plates Falcon 10626491
#1 Coverslips 10mm Menzel Glaser CS10100
Glass slides Menzel Glaser 631-0098
Primary anti-human elastase DAKO DAKO rabbit 1373, contract immunization
Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit Life technologies A-11072, A-11070
PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI Life technologies P36930 Mounting medium
Goat serum Sigma-Aldrich G9023
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich 79346
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Nikon Ti-E Epifluorescence microscope Nikon
CCD camera Andor Zyla
Plan Apochromat 20x, 40x objectives Nikon
Windows 10 Microsoft Operating system
macOS Sierra 10.12 Apple Operating system
MATLAB Mathworks

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References

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नेटक्वांट का उपयोग करके न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप का स्वचालित छवि-आधारित क्वांटिफिकेशन
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Mohanty, T., Nordenfelt, P.… More

Mohanty, T., Nordenfelt, P. Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT. J. Vis. Exp. (153), e58528, doi:10.3791/58528 (2019).

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