Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لتوليد الفخاخ العدلات خارج الخلية (الناموسيات) وتشغيل NETQUANT ، وهو خيار البرمجيات التلقائي بالبالكامل للقياس الكمي من الناموسيات في الصور المناعية.
Abstract
الفخاخ خارج الخلية العدلات (الناموسيات) هي علي شبكه الإنترنت مثل الهياكل المضادة للميكروبات التي تتكون من الحمض النووي والحبيبية البروتينات المضادة للميكروبات. المجهر المناعي وطرق التحديد الكمي المستندة إلى الصورة لا تزال أدوات هامه لتكميم الخلايا العدلات تشكيل فخ. ومع ذلك ، هناك قيود رئيسيه علي الأساليب القائمة علي المناعي المتاحة حاليا لقياس الشبكات. الطرق اليدوية للقياس الكمي NET المستندة إلى الصورة غالبا ما تكون ذاتية ، عرضه للخطا ومملة للمستخدمين ، وخاصه المستخدمين غير المتمرسين. كما ان خيارات البرمجيات المتاحة حاليا للقياس الكمي هي اما شبه تلقائية أو تتطلب تدريبا قبل التشغيل. هنا ، ونحن نظهر تنفيذ طريقه القياس التلقائي القائم علي المناعي الصورة لتقييم تشكيل NET تسمي NETQUANT. البرنامج هو سهل الاستخدام ولها واجهه مستخدم رسوميه صديقه للمستخدم (GUI). وهي تعتبر المعلمات ذات الصلة بيولوجيا مثل زيادة في المساحة السطحية والحمض النووي: صافي نسبه البروتين علامة ، وتشوه الذرية لتحديد تشكيل NET. وعلاوة علي ذلك ، تم بناء هذه الاداه باعتبارها التطبيق المتاحة بحريه ، ويسمح للقياس الكمي دقه الخلية الواحدة والتحليل.
Introduction
العدلات هي وسطاء حاسمه من الاستجابات الدفاع المضيف الفطرية ضد مجموعه واسعه من مسببات الامراض الميكروبية1. يقومون بتنفيذ وظائفهم المضادة للميكروبات عن طريق الإفراج عن حبيباتهم التي تحتوي علي مجموعه واسعه من البروتينات المضادة للميكروبات2، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) و هيبوكلويد1، ومن خلال كثرة الكريات3. الاضافه إلى ذلك ، برينجمان وآخرون. 4 وصفت الفخاخ العدلات خارج الخلية (الشباك) كاليه جديده من قبل التي العدلات فخ والقضاء علي مسببات الامراض الغازية. منذ اكتشافها ما يزيد قليلا علي عقد من الزمان4, وقد تورطت الناموسيات في مجموعه واسعه من المعدية5,6 وغير المعدية7 الاعتلالات. تكوين NET هو عمليه نشطه والنتائج في قذف الحمض النووي الكروماتين المغلفة مع الحبيبية المشتقة من البروتينات المضادة للميكروبات8. وتشمل بعض التغييرات الرئيسية في المورفولوجية الخلوية والنووية المرتبطة بالتشكيل الصافي فقدان المورفولوجية النووية ، وتفكيك الكروماتين ، وتعبئة البروتينات الحبيبية من السيتوبلاسما إلى النواة وزيادة في القطر النووي والخلوي8،9.
الشبكة مثل شبك, اي يمكن ظهرت كبنيه منتشرة قليلا كبيره من الخلية أو بما ان بني عده أوقات كبيره من [العدلات] وحيده اعتبرت كمؤشرات من [نيسس]5,10. باستخدام المجهر الفلوري ، يمكن الكشف عن الناموسيات عن طريق التحقق من الحمض النووي مع مسبار الفلورسنت مثل 4 ' ، 6-diamidino-2-فينيلانديول (DAPI) وتلطيخ المناعي ضد البروتينات صافيه ملزمه مثل اللدائن المرنة. يحدد القياس الكمي للمناطق المتداخلة من تلطيخ الحمض النووي والبروتينات المربوطة بالناموسيات المساحة الاجماليه تحت الشباك في صوره11.
وهناك عدد من خيارات تحليل الصور المتاحة لأداء القياس الكمي القائم علي الصورة من الشباك11,12. ولكن هذه الخيارات البرمجيات الحالية القيود في عدم ان تكون سهله الاستخدام و/أو مؤتمتة بالبالكامل. في هذه المقالة ، ونحن نظهر تشغيل NETQUANT13، وهو التطبيق المتاحة بحريه التي يمكن ان تؤدي غير متحيزة بالبالكامل المجهرية المناعية صوره المجهر القائم علي الصور NET. التطبيق لديه واجهه رسوميه سهله الاستخدام (GUI) ويمكن اجراء تحليل خليه واحده. البرنامج ثبت قيمه netosis في صوره عن طريق الكشف عن التغييرات المورفولوجية في منطقه الحمض النووي-صافي-ملزمه علامة ، الكروماتين تفكيك المرتبطة تشوه النواة وزيادة في الحمض النووي: صافي-نسبه البروتين. ومعا ، تسمح معايير التعريف المتعددة NET بالتحديد الكمي الصارم لصافي المعلومات عبر عده مجموعات من البيانات بطريقه غير متحيزة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافقت لجنه الأخلاق في جامعه لوند علي جمع الدم الوريدي من المتطوعين الأصحاء وفقا لإعلان هلسنكي (2013/728). وقدم جميع المتطوعين موافقتهم الكتابية المستنيرة.
1. عزل العدلات الدم المحيطي باستخدام الكثافة-التدرج طرد
- جمع الدم الوريدي البشري في أنابيب تحتوي علي الهيبارين والسماح للأنابيب للوصول إلى درجه حرارة الغرفة.
ملاحظه: مطلوب ما لا يقل عن 16 مل من الدم من متبرع صحي لإنتاج بيليه خليه كبيره بما فيه الكفاية. - خلط الدم مع حجم واحد من 2 ٪ ديكسسين في المالحة (0.9 ٪ كلوريد الصوديوم) والسماح لرواسب في درجه حرارة الغرفة لمده 30 دقيقه في أنبوب الطرد المركزي المخروطية 50 mL معقمه.
- يستنشق ماده طافي في العقيمة 50 mL أنبوب الطرد المركزي المخروطية والطرد المركزي في 200 x ز لمده 10 دقيقه في 4 ° c.
- من هذه الخطوة فصاعدا مواصله العزلة في 4 درجه مئوية أو علي الجليد.
- أعاده تعليق بيليه في 5 مل من المياه المالحة الباردة الجليد وطبقه علي راس 5 مل من التدرج عزل الكريات البيضاء (9.1 ٪ diatrizoate الصوديوم مع 5.7 ٪ ديكسدان ، ث/v) في معقمه 15 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطية.
- الطرد المركزي لمده 30 دقيقه في 400 x ز في 4 درجه مئوية.
- يستنشق العملاق ويتخلص منه.
- Lyse خلايا الدم الحمراء عن طريق أعاده تعليق بيليه في 3 مل من الماء المثلج لمده 30 ثانيه. فورا أضافه 1 مل من 3.6 ٪ كلوريد الصوديوم ومن ثم تملا مع 10 مل من الجليد الباردة المالحة.
- الطرد المركزي تعليق الخلية لمده 10 دقيقه في 350 x ز.
- أزاله supernatant ، وجمع بيليه الخلية وأعاده التعليق عليه في 1 مل من المحلول الملحي. نضع جانبا 10 μL في أنبوب الطرد المركزي لتقييم رقم الخلية والقدرة علي البقاء باستخدام التريكان الأزرق في غرفه بركر.
- أضافه 10 μL من تعليق الخلية إلى 90 μL من 0.4 ٪ التريكان الحل الأزرق. خذ 10 μL من تعليق الخلية في غرفه بركر. عد الخلايا في المربعات 4 ملزمه بثلاثه أسطر في كل ركن من أركان الغرفة. الخلايا التي تظهر باللون الأزرق الداكن لامتصاص الصبغة غير قابله للاستمرار ، وتستبعدها من إجمالي رقم الخلية.
- التعبير عن رقم الخلية كخلايا/مل كما هو محدد في المعادلة أدناه.
ملاحظه: كان عامل الغرفة هنا 10,000 ، وكان عامل التخفيف 10 وكان العدد الإجمالي للمربعات 4. - تمييع تعليق الخلية المتبقية إلى 10 مل لخطوه الغسيل النهائي.
- الطرد المركزي لمده 5 دقائق في 200 x ز.
- أعاده التعليق العدلات في RPMI-1640 مع 2 ملغ/مل الحرارية المصل الإنسان الزلال (HSA) في تركيز 5 × 105 خلايا/مل.
2. اعداد الشفتين وتحفيز العدلات
- وضع واحد كوفيرسليب (10 ملم ، #1) في كل بئر من 12 بئر لوحه ومعطف كوفيرسليب عن طريق أضافه 200 μl من 0.01 ٪ بولي-L-يسين حل وترك الأمر عند 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
- غسل الشفتين مع 300 μL الفوسفات العازلة المالحة (تلفزيوني) مره واحده وترك لتجف.
- أضافه 400 μL من 5 × 105 العدلات/مل لكل بئر واحتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 15 دقيقه.
- نقل لوحه تحتوي علي العدلات إلى حاضنه في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2 لمده 15 دقيقه.
- أزاله الفائقة. أضافه 400 μL من الحرارة المسبقة RPMI-1640 المتوسطة مع 2 ملغ/مل HSA إلى الضوابط. أضافه 300 μL قبل الحرارة RPMI مع 20 نانومتر phorbol 12-myristate 13-خلات (نقدا) للتحفيز.
- تحفيز العدلات ل 150 دقيقه في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2.
3. تصور الشباك
- أزاله ماده طافي وغسل العينات 2x مع 200 μl من تلفزيوني.
- إصلاح العينات عن طريق أضافه 200 μL من 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) في الاذاعه التلفزيونية لمده 20 دقيقه في 37 درجه مئوية.
ملاحظه: PFA السامة ويجب التعامل معها بعناية. - غسل عينات 3x مع 200 μL من تلفزيوني.
- يتخلل العينات باضافه 50 μL من 0.5% تريتون X-100 لمده 30 ثانيه.
- غسل العينات 3x مع 200 μL من تلفزيوني.
- منع العينات مع 5 ٪ مصل الماعز في الاذاعه التلفزيونية لمده 1 ساعة في 37 درجه مئوية.
- أضافه 300 μL من الأرنب الابتدائي المضادة للإنسان العدلات المرنة في منع الحل في التخفيف من 1:500 لمده 90 دقيقه في 37 درجه مئوية.
- غسل العينات 3x مع 300 μL من تلفزيوني.
- أضافه 300 μL من الماعز الثانوية المضادة لأرنب الجسم الأجسام الفلورية في تخفيف 1:1000 لمده 90 دقيقه في 37 درجه مئوية.
- غسل الشفتين 3x مع 300 μL من تلفزيوني.
- أزاله الشفتين من الآبار وجبل coverslips مع 10 μL المتوسطة المتصاعدة التي تحتوي علي DAPI. يخزن بين عشيه وضحيها في درجه حرارة الغرفة في الظلام لتجفيف العينات.
ملاحظه: تلطيخ الحمض النووي مع DAPI هو بالتاكيد خطوه حاسمه في هذه الطريقة. يمكن للمستخدمين أيضا استكشاف الأخطاء وإصلاحها عن طريق أضافه حل DAPI الخارجية في نطاق تركيز نهائي من 0.1 \ u 20120.5 ميكروغرام/مل لمده 2 \ u20123 دقيقه ، تليها 3 خطوات الغسيل مع 300 μL. - الحصول علي الصور مع مجهر الحقل واسعه باستخدام هدف 20X.
4-تحليل وتقدير كميات الناموسيات باستخدام NETQUANT
ملاحظه: NETQUANT يمكن تحميلها عن طريق النقر علي ملف التثبيت الموجودة علي الأرشيف جيثب Zenodo أو الموقع الكتروني للمختبر Nordenfelt (https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34).
- استيراد مجموعات البيانات للتحليل وتسميه القناات وتحويل الصور
- افتح علامة التبويب "اعداد " في NETQUANT.
- اختر المجلد المصدر للتحليل بالنقر فوق الخيار الحصول علي المسار في القائمة المصدر وحدد المجلد الذي يحتوي علي تسلسلات الصور التي سيتم تحليلها.
- انقر فوق الخيار الحصول علي مسار في القائمة الهدف وحدد المجلد لحفظ البيانات التالية تحليل الصورة.
- اسم القناات بحيث "قناه الحمض النووي" يتوافق مع تلطيخ الحمض النووي (عليسبيل المثال، الحمض النووي أو dapi) و "صافي قناه" يصور تلطيخ البروتين صافي (عليسبيل المثال، صافي ، اللدائن المرنة) في الصور. لسلاسة أداء البرنامج ، (مستحسن) اسم المجلد الذي يحتوي علي ملفات صوره التحكم ك "السيطرة".
ملاحظه: تشير قناه NET إلى تلطيخ علامة البروتين الحبيبية الصافية فقط. - أطعم بيانات تعريف الصورة في البرنامج بالنقر علي زر معلومات تحميل الصور علي القائمة الفرعية لمعلومات الصورة.
- حدد ترتيب القناة الصحيح الموجود في الصور في القائمة الفرعية لترتيب القناة . تم تضمين هذا الخيار كامان للفشل لمنع حالات عدم التطابق العرضية.
- الحصول علي خصائص الصورة الاساسيه من البيانات الاوليه وتحويل الصور بالنقر فوق زر اعداد البيانات. تظهر الصور المحولة في القائمة الفرعية لنوع النموذج . انقر علي قائمه نوع العينة لعرض وتحديد كافة مجموعات البيانات التي تم الحصول عليها للتحليل.
- حدد صوره من القائمة الفرعية نوع نموذج وانقر علي زر بيانات الصورة العرض لعرض الصور تنقسم إلى الحمض النووي وقناه NET علي التوالي.
- تقسيم الخلايا في قناه الحمض النووي وقناه NET
- حدد طريقه التقسيم عن طريق النقر علي القائمة الفرعية أسلوب في كل من قناه الحمض النووي وقناه NET.
ملاحظه: يتم تعيين الأسلوب الافتراضي للتقسيم إلى التكيف وهو الاعداد الموصي به. خيارات أخرى متاحه أيضا بما في ذلك العالمية, حافه وتشان-Vese. كما يتم تضمين خيار مستجمعات المياه للمساعدة في التمييز بين الخلايا الموضوعة بشكل وثيق أو الشبكات. - ادخل علامة التبويب تجزئه لتقسيم خلايا عنصر التحكم أولا في كلا القناتين بالنقر فوق الخيار عينات عنصر تحكم المقطع .
- حدد نقدا من نموذج القائمة الفرعية نوع وانقر علي الخيار الدفعي (مستحسن) لبدء تجزئه جميع الصور المدرجة في مجموعه البيانات. حدد الصور في القائمة نوع العينة وانقر علي زر بيانات الصورة العرض لتصور والتحقق من صحة أقنعه الصورة الثنائية (قناع الحمض النووي وقناع NET) التي تم إنشاؤها بعد تقسيم.
- حدد طريقه التقسيم عن طريق النقر علي القائمة الفرعية أسلوب في كل من قناه الحمض النووي وقناه NET.
- تحليل الخلية الواحدة للخصائص القابلة للتحديد
- ادخل علامة التبويب تحليل وتحليل عينات التحكم بالنقر فوق الزر تحديد العتبة .
- تغيير نوع نموذج إلى نقدا وانقر علي الزر الحصول علي خصائص الخلية لإكمال تحليل العينات المحفزة.
- حدد صوره من نوع نموذج القائمة الفرعية وانقر علي زر بيانات صوره العرض لعرض التراكب وعدد الخلايا و NET تشكيل الخلايا في الصورة.
- مقارنه خصائص الخلية للتعرف علي خلايا التشكيل الصافي
- حدد عينه من نموذج نوع القائمة الفرعية وانقر علي زر تحليل الشباك لاستكمال التحليل. يمكن تحديد الصور الفردية من القائمة الفرعية لنوع العينة للتحليل أو يمكن تحليل مجموعه الصور بالبالكامل عن طريق تحديد خيار الدفعة (مستحسن).
- اضبط معايير NET يدويا للحصول علي أفضل النتائج لعينه معينه. قارن بين الشباك المحددة والصور الاصليه لتقييم نوعيه الهوية.
ملاحظه: يمكن بعد ذلك استخدام معايير NET عبر جميع الصور في مجموعه البيانات. يتم تطبيق إيه تغييرات في معايير NET في نفس الوقت عبر كافة عينات التحكم. وهذا يحد من امكانيه حدوث اي اختلافات محتمله قد تنشا بسبب الإفراط في تركيب بارامترات شبكه الإنترنت. يمكن تعديل الإعدادات في معايير NET وفقا لمتطلبات المستخدم. وقد تم استكشاف العلاقة بين معدلات الاكتشاف الزائفة و NETQUANT في السابق13. النطاقات النموذجية لزيادة المساحة هي 2 \ u20124 ، دائريه لتكون 0.7 \ u 20120.9 ونسبه الحمض النووي الصافي إلى 0.6-2.0. - افحص ملخص البيانات في القائمة الفرعية لبيانات الخلية حيث يتم عرض عدد الصور وتعداد الخلايا لكل صوره والنسبة المئوية للشباك لكل صوره.
ملاحظه: يتم عرض النسبة المئوية الاجماليه للشباك في مجموعه البيانات بأكملها بواسطة "المقياس الصافي". إجمالي عدد الصور ، عدد الخلايا ، النسبة المئوية للشباك في العينة (الناموسيات) ويتم عرض شبك +آت% في عينه التحكم في جدول إحصائيات التلخيص أسفل مقياس الشبكة. نوصي بان يتم الإبلاغ عن بيانات التحكم إلى جانب البيانات التي تم الحصول عليها من العينات المحفزة.
- مخرجات النتائج
- ادخل علامة التبويب إخراج لتحديد مخرجات النتائج وعرضها.
- استكشاف ومقارنه مخرجات البيانات المختلفة المتولدة من تحليل السيطرة وسلطه النقد المعنية عن طريق اختيار شكل الإخراج والنقر علي زر نتائج المخرجات .
ملاحظه: يتم حفظ كافة البيانات التي تم إنشاؤها بعد التحليل لكل من عناصر التحكم والتحفيز في مجلد التحليل كما تم اختياره في القائمة الفرعية المستهدفة. يتم حفظ البيانات اما بتنسيقات .csv أو .pdf. - تشغيل ملف الأسلوب للحصول علي إصدار البرنامج والمعايير الصافية المستخدمة للتحليل (ليتم تضمينها في قسم الأساليب لأغراض النشر).
- انقر فوق جدول بيانات النتائج لتصور نقاط البيانات الفردية في عينه معينه.
- تصور توزيع صافي المنطقة ونسبه الحمض النووي: NET في العينات. يشير الخط الأحمر إلى قيمه العتبة في الرسوم البيانية.
- تحديد منطقه NET مقابل شكل الحمض النووي عن طريق النقر علي ملف توزيع Bivariate .
- تحميل التحليل السابق ودفعه كل الخطوات
- تحميل إعدادات التحليل الناجحة سابقا في NETQUANT باستخدام زر التحليل السابق تحميل .
- استخدم الزر الدفعي كافة الخطوات المضمنة في قائمه الاعداد لتشغيل الخطوات 5 \ u201212 (الشكل1، الشكل 2، الشكل 3، الشكل 4، الشكل 5) مباشره للحصول علي الإخراج النهائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
5 × 105 العدلات/مل تم المصنفة علي الشفتين وضعت في لوحه 12 بئر وحفز مع اما 20 نانومتر النقد الأبيض أو اليسار غير المحفزة لمده 150 دقيقه. وكانت العينات ثم الملطخة باستخدام الرئيسية الأرانب المضادة للإنسان الأضداد اللدائن المرنة ، والماعز الثانوية المضادة لأرنب فلوكوفيري مترافق الأجسام المضادة و DAPI-صبغه فلوريسسينتلي الموسومة التي بقع الحمض النووي (انظر جدول المواد للحصول علي التفاصيل). ثم تم الحصول علي ما لا يقل عن 5 صور باستخدام المجهر الكتابي وهدف 20X (NA = 0.75). يمكن تحميل عينه من البيانات المستخدمة لتحليل الاختبار في المخطوطة عن طريق اتباع الرابط https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34 والنقر علي أيقونه نموذج المجموعة.
هنا نقوم بوصف قدره سير العمل NETQUANT (الشكل 1) لقياس تشكيل NET في عينه معينه. يمكن تثبيت أداه البرنامج كتطبيق في MATLAB ويمكن استخدامها دون اي معرفه سابقه لهذه الواجهة. تم استخدام واجهه المستخدم الرسوميه NETQUANT لتحليل مجموعات البيانات كما هو موضح أعلاه. جميع الصور المستخدمة للتحليل من قبل NETQUANT تبقي دائما دون تغيير في الدليل الأصل. يتم تقسيم واجهه المستخدم الرسوميه إلى 4 علامات تبويب الاعداد ، تبويب التجزئة ، تبويب التحليل وعلامة التبويب إخراج النتائج. وقد أعدت العينات للتحليل في علامة تبويب الاعداد (الشكل 2). يتم تعريف مسارات الملفات (1) واصطلاحات التسمية (2) ومعلومات الصور (3) وأوامر القناة (4) من قبل المستخدم. الخيار اعداد البيانات (5) يضمن ان التحويل والتنظيم بطريقه موحده طوال التجربة. وكانت معلمات التجزئة هي المجموعة في علامة تبويب التجزئة (الشكل 3) لتحديد الخلايا الفردية في العينات (6). وتكون عينات التحكم مجزاه دائما أولا (7) قبل تقسيم العينات المحفزة (8). يتم الاشاره إلى كافة القيم الموصي بها للتقسيم في علامة التبويب البرنامج. وتكتسب الخصائص التي تحدد خلايا التحكم غير المحفزة لأول مره (9) ثم تقارن بالخلايا المحفزة لسلطه النقد الخاصة (10) (الشكل 4). ويتم بعد ذلك تحليل الشباك في العينات استنادا إلى معايير NET (11) وعرضها مع إجمالي عدد الصور وتعداد الخلايا والناموسيات المقابلة في عينات التحكم. وقد اختيرت نواتج البيانات النهائية من التحليل ثم تم تصورها (الشكل 5). كما تم تضمين خيار لتحميل واستخدام تحليل ناجح سابقا ، وخيار مجموعه-كل لمعالجه مجموعات من الخطوات 5-12 (الشكل1، الشكل 2، الشكل 3، الشكل 4، الشكل 5) في علامة التبويب الاعداد.
وخلال التحليل ، تم تحليل ما مجموعه 2619 خليه في التجربة. وقد حفزت النقد العدلات كانت قادره علي توليد 90.59 ٪ من الناموسيات (الناموسيات) علي النقيض من 25.87 ناموسيه في عينات التحكم (الشكل 6). تم الانتهاء من تحليل الصور في غضون 10 دقائق من بدء سير العمل علي البرنامج. وباختصار ، NETQUANT يوفر خيارا سريعا ومريحه لقياس تشكيل NET في الصور التي تم الحصول عليها باستخدام المجهر المناعي.
الشكل 1: نظره عامه علي سير عمل NETQUANT. يتم معالجه الرسومات المجهرية الفلورسنت من العدلات البشرية مزدوجة ملطخه المضادة للمرنة و DAPI (DNA) لأول مره وتحويلها. ثم يتم تقسيم الصور ، تليها تحليل خصائص الخلية ، والكشف عن الشبكات ونواتج النتائج. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: خيارات علامة التبويب الاعداد في NETQUANT. يتم إدخال مسارات الملفات لبيانات المجموعات التي سيتم تحليلها ومجلدات الإخراج للبيانات في علامة التبويب "الاعداد" أولا (1). ثم يتم تعبئة اصطلاحات التسمية لتعريف أسماء القناات واسم مجلد عنصر التحكم (2). ثم يتم الحصول علي معلومات الصورة (3) متبوعه بتسميه ترتيب القناة الصحيح (4). ويوصي بالاعداد السليم لجميع الحقول قبل معالجه مجموعات البيانات (5) لتحويل الصورة الموحدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: معلمات علامة تبويب التجزئة في NETQUANT. المعلمات المستخدمة لتقسيم كل من قناه الحمض النووي وعلامة صافي البروتين وتشمل الأسلوب ، والحساسية ، والتكرار ، والحد الأدنى من المنطقة ومستجمعات المياه (6). ويوصي باستخدام طريقه التقسيم التكيفيه ومستجمعات المياه. أيضا ، يمكن استخدام الإعدادات الأخرى المقدمة كما المسبقة في البرنامج دون تعديل لمعظم الأغراض. وتكون عينات التحكم مجزاه أولا (7) ومن ثم تكون العينات المحفزة مجزاه (8). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الكشف عن الشباك في علامة التبويب التحليل. يتم تحليل خصائص الخلية التي تعرف الخلايا غير المحفزة ويتم الحصول عليها من عينات التحكم (9). ويلي ذلك تحليل خصائص الخلية في العينات التجريبية (10). يتم تطبيق معايير NET-تعريف (زيادة اضعاف في المنطقة الخلوية ، وتشوه النووية (القيم 0 إلى 1) والدنا تلطيخ المنطقة/صافي علامة منطقه تلطيخ) لكل من السيطرة وحفز العينات لتحديد تكوين NET (11). ويتم عرض كميه الناموسيات وعدد الخلايا الإجمالي ورقم الصور في كلتا العينتين في قسم الإحصاءات الموجزة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تصور ملفات مخرجات النتائج في NETQUANT. يمكن اختيار النتائج التي تم الحصول عليها بعد التحليل من قبل المستخدم الفردي. تتضمن مخرجات النتائج التي يمكن إنشاؤها باستخدام NETQUANT ملف .csv يحتوي علي نقاط بيانات من خلايا فرديه. أيضا, الرسوم البيانية التي تصور توزيع الخلايا التي تشهد زيادة في منطقه صافي (الخلوية), تشوه النواة بسبب أزاله الكثافة الكروماتين والحمض النووي: صافي-ماركر نسبه, والرسم البياني 3D من منطقه صافي مقابل تشوه النواة وتتولد أيضا في التحليل. يتم حفظ كافة المخرجات تلقائيا في مجلد التحليل الذي تم اختياره في علامة تبويب الاعداد كملفات .csv و .pdf و .txt. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تحليل التكوين الصافي. (ا) الشباك المئوية ، وإجمالي عدد الخلايا ، ورقم الصور من مجموعه بيانات الاختبار كما لوحظ في الإحصاءات الموجزة للضوابط والضوابط التي تحفزها النقد الكهربائي (20 نانومتر) العدلات. (ب) المقارنة جنبا إلى جنب بين الرسوم البيانية التي تصور الزيادة في المنطقة ، والتشوه النووي (القيم من 0 إلى 1) ، ونسبه الدنا إلى الصافي في السيطرة والعينات المحفزة من قبل سلطه النقد الخاصة. الخط الأحمر في قيم عتبه الرسوم البيانية لمعايير NET-تعريف. (ج) مقارنه الرسم البياني الثلاثي الابعاد لمنطقه الشبكة الصافية مقابل التشوه النووي المتولد عن تحليل NETQUANT للمراقبة والعينات المحفزة لسلطه النقد الخاصة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التشكيل الصافي هو أضافه حديثه نسبيا إلى المتنوعة العدلات ارمينتماريوم4 وكان هناك طفرة ملحوظة من الفائدة لدراسة اثار الشباك في مجموعه واسعه من مجالات البحث5,7,14,15. اقتناء الصور باستخدام المجهر المناعي والكمية اللاحقة التي تستند إلى الصورة هي طريقه تستخدم علي نطاق واسع لقياس الناموسيات. ويتميز هذا النهج بأنه قادر علي الكشف عن الخلايا التي تشكل شبكات علي مستوي خليه واحده ، التالي يمكن ان يقلل بشكل أفضل من اشاره الخلفية. ويمكن ان تكون الطرق اليدوية للقياس الكمي شامله وبطيئه وخاضعه لتحيز المستخدم. وهناك عدد قليل من الخيارات شبه التلقائية التي قدمت للمستخدمين مع تحليل موثوق11,12. ومع ذلك ، فانها قد تتطلب مهارة تقنيه كبيره للتشغيل أو قد تتطلب عده خطوات يدوية للقياس الكمي. وهذا يشكل تحديا خاصا للمستخدمين غير المتمرسين سابقا. وفي منشور صدر مؤخرا ، استخدمت طريقه حسابيه تلقائية بالبالكامل لقياس التشكيل الصافي باستخدام التصوير المستند إلى التدفق الخلوي وكذلك أقسام الانسجه الرقيقة. ومع ذلك ، لا يمكن تطبيقه الا علي سيناريوهات محدده ويتطلب أيضا معرفه كبيره بالبرمجة للعملية16. وفي الحاضر ، فان برامج القياس الألى للصور المؤتمتة بالبالكامل والمخصصة للقياس الكمي العام الصافي الذي يسهل استخدامه وتمتلك قدره علي حل الخلايا الواحدة غير متاحه للباحثين.
هنا نقدم NETQUANT ، وهو برنامج القياس الكمي NET المؤتمتة بالبالكامل المتاحة بحريه. وقد تم تطوير هذا البرنامج علي وجه التحديد لقياس تشكيل صافي مع الصرامة العالية باستخدام الصور المجهرية المناعية ، ومع القدرة علي اجراء تحليل خليه واحده والتقدير الكمي. والي جانب النظر في الزيادة في مجال تلطيخ تحت الشباك ، NETQUANT ياخذ أيضا في الاعتبار تشوه النووية بسبب أزاله الكثافة الكروماتين وزيادة في الدنا/صافي علامة البروتين المشترك لتحديد تشكيل NET في عينه معينه. وهذا يسمح بالتمييز بين الخلايا التي خضعت فقط لتفكيك الاسلحه النووية من الخلايا التي خضعت لتشكيل صافي كامل. وتسمح معايير التعريف NET الواردة في خوارزميه NETQUANT بزيادة الصرامة في القياس الكمي بالمقارنة بالعديد من النهج الكمية السابقة التي تعتمد فقط علي ازدياد مساحة البقع الصافية.
وتهدف واجهه المستخدم الرسوميه إلى ان تكون سهله الاستعمال وسهله الاستخدام. يتم ترقيم كل خطوه من خطوات التحليل للتاكد من ان المستخدمين يمكنهم متابعه سير العمل. واحده من الميزات الرئيسية الواردة في البرنامج هو أداه تجزئه/التبويب التي تسمح NETQUANT لاجراء تحليل خليه واحده في الصور ، والتي هي اعلي حساسية ممكنة التي يمكن تحقيقها. وهذا يجعل NETQUANT واحده من الخيارات القليلة المتاحة التي يمكن ان تؤدي الكمية خليه واحده لتشكيل صافي القيمة. الاضافه إلى ذلك ، أظهرت موهانتي وآخرون ان البرنامج يمكن ان تتكيف أيضا مع الاختلافات الصورة والمعلمات الاستحواذ13. ونظرا للمرونة التي توفرها معايير التجزئة والتعريف الصافي ، يمكن استيعاب الاختلافات بين الجهات المانحة واللوحات. NETQUANT يمكن التعامل مع مجموعات البيانات الكبيرة بشكل كاف ويمكن استخدامها لتحليل الصور عاليه الانتاجيه موثوق بها13.
علي الرغم من اننا وجدنا سير العمل لتحقيق نتائج قويه من مانحين متعددين ، نوصي ان المستخدم يجب ان تقرر علي القيم المناسبة استنادا إلى العينات الفردية. ومن الناحية النظرية ، فان البيانات المتولدة بعد التحليل يمكن ان تتاثر أيضا بكثافة الخلايا العالية. كما ان الإفراط في تجميع الناموسيات يمكن ان يؤدي إلى الحد من عدد الناموسيات المكتشفة. وذلك لان خوارزميه التجزئة لا يمكنها تمييز الشباك المتشابكة في احداث منفصلة. وهناك مشكله مماثله مع تجزئه قد تنشا أيضا عند المحاصرين العدلات غير المحفزة داخل الشباك. ويوصي حاليا استخدام الصور التي تم الحصول عليها في 20X و 40X كما لم يتم اختبار أداء NETQUANT علي مستويات التكبير الأخرى. لا يزال ، طالما تم تعيين حجم بكسل بشكل صحيح (اما يدويا أو من البيانات الوصفية في قسم معلومات صوره التحميل) البرنامج ينبغي تكييف حسابات المنطقة بدقه إلى اعلي أو اقل تكبير. تلطيخ السليم من الحمض النووي وعلامة الحبيبية هو عامل حاسم. والفقراء تلطيخ أو ضعف جوده الصورة في اي من القناتين يؤدي إلى نتائج دون المستوي الأمثل. ولذلك ، فمن المستحسن ان المستخدم يجب تحديد رقم الخلية مناسبه ، والاجراء تلطيخ والأجسام المضادة عيار لتحقيق النتائج المثلي.
وقد تم اختبار NETQUANT فقط علي الناموسيات المستمدة من العدلات البشرية في المختبر. ويمكن أيضا قياس الناموسيات من الأنواع الأخرى بالتصحيحات المناسبة في المعايير. يمكن اجراء القياس الكمي NET علي عينات ثابته في الشرائح الغرفة أو لوحات أسفل الزجاج متعددة الآبار. صور عاليه الجودة من العينات الملونة للحمض النووي والحبيبية علامات البروتين حرجه. ويمكن أيضا ان تتكيف NETQUANT لقياس اشكال أخرى من الفخاخ خارج الخلية (ET)-osis ، علي سبيل المثال، كما عرضتها الحمضات. القياس الكمي ETs في غير المحببة مثل الخلايا الاحاديه غير ممكن حاليا كما هو مطلوب منطقه تلطيخ الحبيبية الخلوية لخوارزميه التجزئة.
في الختام ، NETQUANT هو أداه بسيطه وتلقائية وسريعة لتحديد بدقه تشكيل NET التي تسمح لتحليل خليه واحده والتقدير الكمي. ونحن نعتقد ان هذا البرنامج قد يخفض الحاجز لأداء صافي الكمية التلقائي وان المجتمع البحثي سوف تستفيد من هذا التطبيق المتاحة بحريه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
TM و PN لديها براءات الاختراع المعلقة المتعلقة الخوارزميات المستخدمة في NETQUANT.
Acknowledgments
وتم تمويل العمل من قبل مؤسسه كرافورد (TM و PN) ، ومنحه البحوث الحكومية السويدية (PN ، TM) ، ومجلس البحوث السويدي (PN) ومؤسسه غروشنسكي (TM ، PN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Heparinised plastic tubes | BD Biosciences | 367885 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 114547 | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine | Gibco | 11835-030 | |
| 50mL conical flasks | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 15mL conical flasks | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 12-well Tissue culture plates | Falcon | 10626491 | |
| #1 Coverslips 10mm | Menzel Glaser | CS10100 | |
| Glass slides | Menzel Glaser | 631-0098 | |
| Primary anti-human elastase | DAKO | DAKO rabbit 1373, contract immunization | |
| Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit | Life technologies | A-11072, A-11070 | |
| PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI | Life technologies | P36930 | Mounting medium |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Nikon Ti-E Epifluorescence microscope | Nikon | ||
| CCD camera | Andor Zyla | ||
| Plan Apochromat 20x, 40x objectives | Nikon | ||
| Windows 10 | Microsoft | Operating system | |
| macOS Sierra 10.12 | Apple | Operating system | |
| MATLAB | Mathworks |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Nordenfelt, P., Tapper, H. Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Sorensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
- Yipp, B. G., Kubes, P. NETosis: how vital is it? Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Mohanty, T., et al. A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa. Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).
- Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Coelho, L. P., et al. Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images. Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).
- Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps. Frontiers in Immunology. 8, 1999 (2017).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Cedervall, J., Olsson, A. K. Immunity Gone Astray - NETs in Cancer. Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).
- Ginley, B. G., et al. Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 17755 (2017).
