Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att generera neutrofila extracellulära fällor (NETs) och drift NETQUANT, en helautomatisk programvara alternativ för kvantifiering av nät i immunofluorescensbilder.
Abstract
Neutrofila extracellulära fällor (nät) är webb-liknande antimikrobiella strukturer som består av DNA och granule härledda antimikrobiella proteiner. Immunofluorescensmikroskopi och bildbaserade kvantifieringsmetoder är fortfarande viktiga verktyg för att kvantifiera neutrofila extracellulär fälla formation. Det finns dock viktiga begränsningar för de immunofluorescensbaserade metoder som för närvarande finns tillgängliga för kvantifiering av nät. Manuella metoder för bildbaserad NETTOKVANTIFIERING är ofta subjektiva, benägna att fel och tråkiga för användare, särskilt icke-erfarna användare. Även för närvarande finns tillgängliga programalternativ för kvantifiering antingen halvautomatiska eller kräver utbildning före operationen. Här demonstrerar Vi implementeringen av en automatiserad immunofluorescensbaserad bildkvantifieringsmetod för att utvärdera NETTOBILDNINGEN som kallas NETQUANT. Programvaran är enkel att använda och har ett användarvänligt grafiskt användargränssnitt (GUI). Den anser biologiskt relevanta parametrar såsom en ökning av ytan och DNA: netto markör protein förhållande, och nukleär deformation för att definiera netto bildning. Dessutom, detta verktyg är byggd som en fritt tillgänglig app, och möjliggör Single-cell upplösning kvantifiering och analys.
Introduction
Neutrofiler är avgörande medlare av medfödda värd försvar svar mot en mängd olika mikrobiella patogener1. De utför sina antimikrobiella funktioner genom att släppa sina granulat som innehåller ett brett spektrum av antimikrobiella proteiner2, producerar reaktiva syreradikaler (ros) och hypoklorit1, och genom fagocytos3. Dessutom har Brinkmann et al. 4 beskrivna neutrofila extracellulära fällor (Nets) som en ny mekanism genom vilken neutrofiler fälla och eliminera invaderande patogener. Sedan deras upptäckt lite över ett decennium sedan4, nät har varit inblandade i en mängd olika infektiösa5,6 och icke-infektiösa7 morbidities. NET formation är en aktiv process och resulterar i extrudering av kromatin DNA belagd med granule-härledda antimikrobiella proteiner8. Några av de viktigaste förändringarna i cellulära och nukleär morfologi i samband med netto bildning inkluderar förlust av nukleär morfologi, kromatin avkondensering, mobilisering av granule proteiner från cytoplasman till kärnan och en ökning av den nukleära och cellulära diameter8,9.
Den Web-liknande nät, som kan visas som diffusa strukturer något större än cellen eller som strukturer flera gånger större än en enda neutrofila betraktas som indikatorer på netosis5,10. Med hjälp av fluorescensmikroskopi kan nät detekteras genom att sondera DNA med en fluorescerande sond som 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) och genom immunofluorescensfärgning mot NET-bundna proteiner som neutrofila elastase. Kvantifiering av överlappande Färgnings områden för DNA och NET-bundna proteiner bestämmer den totala ytan under NETs i en bild11.
Ett antal bildanalys alternativ finns tillgängliga för att utföra fluorescensbildbaserad kvantifiering av Nets11,12. Men dessa programalternativ presentera begränsningar i att inte vara användarvänliga och/eller helt automatiserad. I denna artikel, vi visar driften av NETQUANT13, en fritt tillgänglig app som kan utföra opartisk helt automatiserad immunofluorescensmikroskopi BILDBASERAD nettokvantifiering. Appen har ett användarvänligt grafiskt gränssnitt (GUI) och kan utföra Single-cell analys. Programvaran kvantifierar NETosis i en bild genom att upptäcka de morfologiska förändringarna i området av DNA-NET-bunden markör, kromatin dekondensation tillhörande deformation av kärnan och ökning av DNA: NET-bundet protein förhållande. Sammantaget tillåter de multipla netto definitionskriterierna en strikt nettokvantifiering över flera datamängder på ett förutsättningslös sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikkommittén vid Lunds universitet godkände insamling av venöst blod från friska frivilliga i enlighet med Helsingforsdeklarationen (2013/728). Alla volontärer gav sitt skriftliga informerade samtycke.
1. isolering av perifera Blodneutrofiler med Densitetsgradientcentrifugering
- Samla in humant venöst blod i tuber som innehåller heparin och låt rören nå rumstemperatur.
Anmärkning: minst 16 mL blod från en frisk givare krävs för att ge en tillräckligt stor cellpellet. - Blanda blodet med en volym på 2% dextran i saltlösning (0,9% NaCl) och låt sediment vid rumstemperatur i 30 min i en steril 50 mL koniskt centrifug röret.
- Aspirera supernatanten i ett sterilt 50 mL koniskt centrifugrör och centrifugera vid 200 x g i 10 min vid 4 ° c.
- Från detta steg och framåt fortsätter isoleringen vid 4 ° c eller på is.
- Omsuspendera pelleten i 5 mL iskall saltlösning och skikt ovanpå 5 mL av leukocytisolationgradienten (9,1% natriumdiatrizoat med 5,7% dextran, w/v) i ett sterilt 15 mL koniskt centrifugrör.
- Centrifugera i 30 min vid 400 x g vid 4 ° c.
- Aspirera supernatanten och kassera den.
- Lyse röda blodkroppar genom att reomera pelleten i 3 mL iskallt vatten i 30 s. Tillsätt omedelbart 1 mL 3,6% NaCl och fyll sedan på med 10 mL iskall saltlösning.
- Centrifugera cellsuspensionen i 10 minuter vid 350 x g.
- Ta bort supernatanten, samla in cellpelleten och Omsuspendera den i 1 mL saltlösning. Avsätta 10 μL i ett mikrocentrifugrör för bedömning av cell nummer och lönsamhet med hjälp av trypan Blue i en Bürkerkammare.
- Tillsätt 10 μL cellsuspension till 90 μL 0,4% trypan Blue-lösning. Ta 10 μL av cellsuspensionen i en Bürkerkammare. Räkna cellerna i 4 rutor bundna av 3 linjer i varje hörn av kammaren. Celler som visas mörkblå till upptaget av färgämne är icke-viabla, utesluta dem från det totala cellnumret.
- Uttrycka cellnumret som celler/mL enligt ekvationen nedan.
Anmärkning: här kammare faktorn var 10 000, utspädningsfaktorn var 10 och det totala antalet kvadrater var 4. - Späd ut den återstående cellsuspensionen till 10 mL för ett slutligt tvättsteg.
- Centrifugera i 5 min vid 200 x g.
- Omsuspendera neutrofilerna i RPMI-1640 med 2 mg/mL värmeinaktiverat humant serumalbumin (HSA) vid en koncentration av 5 x 105 celler/ml.
2. beredning av Täcklappar och stimulering av neutrofiler
- Placera en täckslip (10 mm, #1) i varje brunn på en 12-brunn tallrik och belägga täckslip genom att tillsätta 200 μL av 0,01% Poly-L-lysin lösning och lämna den vid 37 ° c över natten.
- Tvätta täckband med 300 μL fosfatbuffert saltlösning (PBS) en gång och låt torka.
- Tillsätt 400 μL 5 x 105 neutrofiler/ml i varje brunn och inkubera i rumstemperatur i 15 min.
- Flytta plattan som innehåller neutrofiler till en inkubator vid 37 ° c med 5% CO2 i 15 min.
- Ta bort supernatanten. Tillsätt 400 μl föruppvärmd RPMI-1640 medium med 2 mg/ml HSA till kontrollerna. Tillsätt 300 μL pre-warmed RPMI med 20 nM phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) för stimulering.
- Stimulera neutrofiler för 150 min vid 37 ° c med 5% CO2.
3. visualisering av nät
- Ta bort supernatanten och tvätta proverna 2x med 200 μL PBS.
- Fixera proverna genom att tillsätta 200 μL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS under 20 min vid 37 ° c.
Obs: PFA är giftigt och måste hanteras varsamt. - Tvätta proverna 3x med 200 μL PBS.
- Permeabilize proverna genom att tillsätta 50 μL av 0,5% Triton X-100 för 30 s.
- Tvätta proverna 3x med 200 μL PBS.
- Blockera proverna med 5% get serum i PBS för 1 h vid 37 ° c.
- Tillsätt 300 μL primär kanin anti-human neutrofila elastas i blockerande lösning vid en utspädning av 1:500 för 90 min vid 37 ° c.
- Tvätta proverna 3x med 300 μL PBS.
- Tillsätt 300 μL sekundär get anti-kanin fluorescerande antikropp vid en utspädning av 1:1000 för 90 min vid 37 ° c.
- Tvätta täckglas 3x med 300 μL PBS.
- Ta bort täckglas från brunnarna och montera täckglas med 10 μL monteringsmedel som innehåller DAPI. Förvara över natten vid rumstemperatur i mörker för att torka proverna.
Anmärkning: färgning av DNA med DAPI är förvisso ett kritiskt steg i metoden. Användarna kan också felsöka genom att lägga till exogena DAPI-lösning i ett slutligt koncentrationsintervall på 0,1 \ u 20120.5 μg/mL för 2 \ u20123 min, följt av 3 tvättsteg med 300 μL PBS. - Hämta bilder med ett bred fälts fluorescens-Mikroskop med hjälp av ett 20X-objektiv.
4. analys och kvantifiering av nät med hjälp av NETQUANT
Obs: NETQUANT kan laddas ner genom att klicka på installationsfilen som finns på Zenodo GitHub-arkivet eller Nordenfelt Lab-webbplatsen (https://Nordlab.med.lu.se/?page_id=34).
- Importera datauppsättningar för analys, namnge kanaler och konvertera bilder
- Öppna fliken Inställningar i NETQUANT.
- Välj källmappen för analys genom att klicka på alternativet Hämta sökväg i menyn Källa och välj den mapp som innehåller de bildsekvenser som ska analyseras.
- Klicka på den Get Path alternativet i mål-menyn och välj den mapp för att spara data efter bildanalys.
- Namnge kanalerna så att "DNA-kanal" motsvarar DNA-färgning (t. ex. DNA eller DAPI) och "net-Channel" skildrar net-bunden protein färgning (t. ex. netto, neutrofila elastase) i bilderna. För en smidig funktion av programvaran, (rekommenderas) namnge mappen som innehåller kontrollavbildningsfiler som "kontroll".
Obs: NET-kanalen avser endast den nätbundna granule-proteinmarkörens färgning. - Mata in bildmetadata i programvaran genom att klicka på knappen Läs in bildinformation i undermenyn bildinformation .
- Välj rätt kanalordning som finns i bilderna i undermenyn kanalordning . Det här alternativet har inkluderats som ett felsäkert sätt att förhindra oavsiktliga felmatchningar.
- Hämta primära Bildegenskaper från rådata och konvertera bilderna genom att klicka på knappen Förbered data. De konverterade bilderna visas i undermenyn exempel typ . Klicka på menyn exempel typ för att visa och välja alla datamängder som har erhållits för analys.
- Välj en bild från undermenyn prov typ och klicka på knappen Visa bilddata för att visa bilderna uppdelade i DNA respektive net-kanalen.
- Segmentering av celler i DNA-kanalen och nät kanalen
- Välj segmenteringsmetoden genom att klicka på undermenyn metod i både DNA-kanalen och net-kanalen.
Anmärkning: standardmetoden för segmentering är inställd på adaptiv och är den rekommenderade inställningen. Andra alternativ är också tillgängliga, inklusive global, Edge och Chan-Vese. Ett alternativ för vattendelare ingår också för att hjälpa till att skilja mellan tätt placerade celler eller nät. - Ange Segmenteringsfliken för att segmentera kontrollceller först i båda kanalerna genom att klicka på alternativet segment kontroll exempel .
- Välj PMA i undermenyn exempel typ och klicka på alternativet batch (rekommenderas) för att börja segmentering av alla bilder som ingår i datauppsättningen. Markera bilderna i menyn exempel typ och klicka på knappen Visa bilddata för att visualisera och validera binära Bildmasker (DNA-mask och nätmask) genererade efter segmentering.
- Välj segmenteringsmetoden genom att klicka på undermenyn metod i både DNA-kanalen och net-kanalen.
- Encellig analys av identifierbara egenskaper
- Ange fliken analys och analysera kontrollproverna genom att klicka på knappen Bestäm tröskelvärde .
- Ändra exempel typen till PMA och klicka på knappen Hämta Cellegenskaper för att slutföra analysen av stimulerade prover.
- Välj en bild från undermenyn prov typ och klicka på knappen Visa bilddata för att Visa överlägget och antalet celler och nätbildande celler i bilden.
- Jämförelse av cell egenskaper för att identifiera NET-Forming celler
- Välj prov från undermenyn exempel typ och klicka på knappen analysera nät för att slutföra analysen. Enskilda bilder kan väljas från urvalstyp undermenyn för analys eller hela partiet av bilder kan analyseras genom att välja batch-alternativet (rekommenderas).
- Justera netto kriterier manuellt om du vill ge optimala resultat för ett givet exempel. Jämför identifierade nät med originalbilderna för att bedöma kvaliteten på identifieringen.
NET-kriterierna kan sedan användas i alla bilder i datauppsättningen. Alla ändringar i NET-kriterierna tillämpas samtidigt i alla kontrollprover. Detta begränsar risken för eventuella skillnader som kan uppstå på grund av övermontering av netto parametrarna. Inställningarna i NET-kriterierna kan justeras enligt användarens krav. Förhållandet mellan falsk Discovery rates och NETQUANT har undersökts tidigare13. Typiska intervall för områdes ökning är 2 \ u20124, cirkularitet att vara 0,7 \ u 20120.9 och DNA/netto förhållandet vara 0,6 – 2,0. - Kontrollera data sammanfattningen i undermenyn celldata där antalet bilder, cellantal per bild och procent av Nets per bild visas.
Anmärkning: den totala procentandelen nät i hela datamängden visas med "NET-gauge". Det totala antalet bild antal, antal celler, procent av nät i provet (NETs%) och NETs% i kontrollprovet visas i tabellen sammanfattnings statistik under NET-mätaren. Vi rekommenderar att kontrolldata rapporteras tillsammans med de data som erhålls från stimulerade prover.
- Resultat utgångar
- Ange fliken utdata för att välja och Visa resultat utgångar.
- Utforska och jämföra olika data utdata som genereras från analysen av kontroll och PMA genom att välja form av utdata och klicka på output resultat knappen.
Anmärkning: alla data som genereras efter analys för både kontroller och stimuleringar sparas i analysmappen som valts i mål-undermenyn. Data sparas antingen i CSV-eller PDF-format. - Starta metod filen för att få den version av programvaran och net-kriterier som används för analysen (som ska inkluderas i metod avsnittet för publiceringsändamål).
- Klicka på resultatdata tabellen för att visualisera de enskilda datapunkterna i ett givet exempel.
- Visualisera NET Area distribution och DNA: netto förhållandet i proverna. Den röda linjen anger tröskelvärdet i diagrammen.
- Bestäm netto Area kontra form av DNA genom att klicka på den bivariate distributions filen.
- Läser in tidigare analys och batch alla steg
- Läs in tidigare lyckade analysinställningar i NETQUANT med hjälp av knappen Ladda tidigare analys .
- Använd knappen batch all Steps som finns i inställnings menyn för att köra steg 5 \ u201212 (figur 1, figur 2, figur 3, figur 4, figur 5) direkt för att få fram den slutliga utskriften.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
5 x 105 neutrofiler/ml var seedade på täckglas placeras i en 12-brunn tallrik och stimuleras med antingen 20 nm PMA eller lämnas ostimulerad för 150 min. Proverna färgas sedan med primär kanin anti-human neutrofila elastase antikroppar, sekundär get anti-kanin fluorophore konjugerade antikroppar och DAPI-en överföras märkt färg som fläckar DNA (se tabellen av material för detaljer). Ett minimum av 5 bilder förvärvades sedan med hjälp av ett epifluorescensmikroskopi Mikroskop och en 20x (na = 0,75) mål. Exempeldata som används för test analysen i manuskriptet kan laddas ner genom att följa länken https://Nordlab.med.lu.se/?page_id=34 och klicka på exempel på datamängds ikonen.
Här beskriver vi möjligheten för NETQUANT Workflow (figur 1) att kvantifiera netto bildningen i ett givet prov. Programvaruverktyget kan installeras som en app i MATLAB och kan användas utan någon tidigare kunskap om detta gränssnitt. GUI av NETQUANT användes för att analysera datauppsättningarna enligt beskrivningen ovan. Alla bilder som används för analys av NETQUANT lämnas alltid oförändrade i den överordnade katalogen. GUI är uppdelad i 4 flikar-fliken Inställningar, segmentering fliken analys fliken och resultat utdata fliken. Proverna utarbetades för analys på fliken Inställningar (bild 2). Filsökvägarna (1), namngivningskonventionerna (2), bildinformation (3) och kanal beställningar (4) definieras av användaren. Alternativet Förbered data (5) säkerställer att konverteringen och organisationen på ett standardiserat sätt i hela experimentet. Segmenteringsparametrarna var uppsättningen på fliken segmentering (figur 3) för att identifiera enskilda celler i proverna (6). Kontrollproverna segmenteras alltid först (7) före segmenteringen av stimulerade prover (8). Alla rekommenderade värden för segmentering anges på fliken programvara. De egenskaper som definierar ostimulerade kontrollceller först förvärvas (9) och sedan jämfört med PMA stimulerade celler (10) (figur 4). Näten analyseras sedan i proverna baserat på netto kriterierna (11) och visas med totalt antal bilder, antal celler och motsvarande nät i kontrollproverna. De slutliga data utgångarna från analysen valdes ut och visualiserades sedan (figur 5). Ett alternativ för att ladda och använda en tidigare lyckad analys, och ett batch-alla alternativ för att bearbeta grupper av steg 5-12 (figur 1, figur 2, figur 3, figur 4, figur 5) har också inkluderats i fliken Inställningar.
Under analysen analyserades totalt 2619 celler i experimentet. PMA stimulerade neutrofiler kunde generera 90,59% nät (NETs%) till skillnad från 25,87 NETs% i kontrollproverna (figur 6). Bildanalysen slutfördes inom 10 minuter från det att arbetsflödet initierades på programvaran. Sammanfattnings, NETQUANT ger en snabb och bekväm möjlighet att kvantifiera netto bildningen i bilder som har förvärvats med hjälp av immunofluorescensmikroskopi.
Bild 1: översikt över NETQUANT-arbetsflödet. Fluorescerande mikrografer av humana neutrofiler dubbelfärgade med anti-elastase och DAPI (DNA) bearbetas först och konverteras. Bilderna segmenteras sedan, följt av analys av Cellegenskaper, detektering av nät och resultat utgångar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: alternativ på fliken Inställningar i NETQUANT. Filsökvägar för datauppsättningarna som ska analyseras och datamappar anges på fliken Inställningar först (1). Namngivningskonventionerna fylls sedan i för att definiera kanalnamn och Kontrollmappens namn (2). Bildinformationen förvärvas sedan (3) följt av att namnge rätt kanalordning (4). Korrekt inställning av alla fält rekommenderas före bearbetningen av datauppsättningarna (5) för standardiserad bild konvertering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: flikparametrar för segmentering i NETQUANT. Parametrarna som används för segmentering av både DNA-kanal och NET-proteinmarkör inkluderar metod, känslighet, iterationer, minimiareal och vattendelare (6). Användning av en adaptiv segmenteringmetod och vattendelare rekommenderas. Dessutom kan andra inställningar som tillhandahålls som för inställningar i programvaran användas utan modifiering för de flesta ändamål. Kontrollproverna är först segmenterade (7) och därefter är de stimulerade proverna segmenterade (8). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: detektering av nät på fliken analys. Cellegenskaper som definierar ostimulerade celler analyseras och förvärvas från kontrollprover (9). Detta följs av analys av Cellegenskaper i de experimentella proverna (10). NET-definitionskriterierna (faldig ökning av cellområdet, nukleär deformation (värden 0 till 1) och DNA-Färgnings område/netto markör färgning område) appliceras på både kontroll och stimulerade prover för att definiera netto bildning (11). Mängden nät, totalt antal celler och antalet bilder i båda exemplen visas i avsnittet sammanfattnings statistik. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: visualisering av resultatutdatafiler i NETQUANT. Resultat erhållna efter analys kan väljas av den enskilde användaren. Resultatet utdata som kan genereras med NETQUANT innehåller en CSV-fil som innehåller datapunkter från enskilda celler. Också, histogram som skildrar distributionen av celler som genomgår ökning av netto (cellulära) område, deformation av kärnan på grund av kromatin avkondensering och DNA: netto-markör förhållande, och en 3D-graf av netto område kontra nukleär deformation genereras också i analysen. Alla utdata sparas automatiskt i den analysmapp som valts i fliken Inställningar som. csv-,. pdf-och. txt-filer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: analys av netto bildning. A) näten%, totalt antal celler och antalet bilder från testdatauppsättningen som observerats i den sammanfattande statistiken för kontroller och PMA-stimulerade (20 nm) neutrofiler. B) en sida vid sida-jämförelse av histogram som skildrar ökning av området, nukleär deformation (värden 0 till 1) och DNA/netto förhållandet i kontroll och PMA-stimulerade prover. Den röda linjen i histogramvärdena tröskelvärden för NET-definitionskriterierna. (C) jämförelse av 3D-graf över nettoarea kontra nukleär deformation som genereras av NETQUANT analys av kontroll och PMA-stimulerade prover. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Netto bildning är ett relativt Nytillskott till de olika neutrofila i4 och det har varit en märkbar våg av intresse att studera innebörden av nät i ett brett spektrum av forskningsområden5,7,14,15. Förvärv av bilder med hjälp av Immunofluorescensmikroskopi och efterföljande bildbaserad kvantifiering är en allmänt använd metod för att kvantifiera näten. Detta tillvägagångssätt har fördelen av att kunna detektera celler som bildar nät på en enda cellnivå och kan därför bättre minska bakgrunds signalen. Manuella kvantifieringsmetoder kan vara uttömmande, långsamma och beroende av användarens bias. Några halvautomatiska alternativ finns som har försett användare med tillförlitlig analys11,12. De kan dock kräva betydande teknisk skicklighet för drift eller kan kräva flera manuella steg för kvantifiering. Detta är utmanande särskilt för tidigare icke-erfarna användare. I en nyligen publikation har en helautomatisk beräkningsmetod använts för att kvantifiera netto bildningen med flödescytometri-baserad avbildning samt tunna vävnads sektioner. Det kan dock endast tillämpas på specifika scenarier och kräver också en betydande kunskap om programmering för operation16. För närvarande är helt automatiserad bildkvantifiering programvara tillägnad allmän NETTOKVANTIFIERING som är lätt att använda och besitter encells upplösning kapacitet är inte tillgänglig för forskare.
Här presenterar vi NETQUANT, en helt automatiserad NETTOKVANTIFIERING programvara som är fritt tillgänglig. Denna programvara har utvecklats specifikt för att kvantifiera netto bildning med hög stränghet med hjälp av immunofluorescensmikroskopi bilder, och med möjlighet att utföra Single-cell analys och kvantifiering. Bortsett från att överväga ökningen av Färgnings området under NETs, tar NETQUANT också hänsyn till nukleär deformation på grund av kromatin avkondensering och en ökning av DNA/NET-markör protein Co-lokalisering för att definiera netto bildningen i ett givet prov. Detta gör det möjligt att särskilja celler som endast har genomgått nukleär avkondensering från celler som genomgått fullständig netto bildning. De netto definitionskriterier som ingår i NETQUANT-algoritmen möjliggör högre stränghet vid kvantifiering jämfört med många tidigare kvantifieringsmetoder som enbart förlitar sig på en ökning av netto färgning.
Den GUI är aimed till vara förbrukaren-vänlig och enkel till använda. Varje steg i analysen numreras för att säkerställa att användarna kan följa arbetsflödet. En av de viktigaste funktionerna i programvaran är segmenteringen verktyg/flik som gör NETQUANT att utföra Single-cell analys i bilder, vilket är den högsta möjliga känslighet som kan uppnås. Detta gör NETQUANT ett av de få tillgängliga alternativen som kan utföra enkelcellskvantifiering för att kvantifiera netto bildningen. Dessutom har Mohanty et al. visat att programvaran även kan anpassas till bild variationer och förvärvs parametrar13. På grund av flexibiliteten som erbjuds i segmenteringen och NET-definitionskriterierna, kan givare och plattvariationer rymmas. NETQUANT kan hantera stora datamängder på ett adekvat sätt och kan användas för tillförlitlig bildanalys med hög kapacitet13.
Även om vi hittade arbetsflödet för att ge robusta resultat från flera givare, rekommenderar vi att användaren ska besluta om lämpliga värden baserat på enskilda exempel. I teorin kan de data som genereras efter analys också påverkas av hög celltäthet. Överdriven aggregering av nät kan också resultera i en minskning av antalet upptäckta nät. Detta beror på att segmenteringsalgoritmen inte kan särskilja intrasslade nät i separata händelser. Ett liknande problem med segmentering kan också uppstå när ostimulerade neutrofiler fastnar i näten. Användning av bilder som förvärvats vid 20X och 40X rekommenderas för närvarande eftersom NETQUANTS prestanda inte har testats på andra förstorings nivåer. Fortfarande, så länge pixelstorleken är korrekt inställd (antingen manuellt eller från metadata i load bild info avsnitt) programvaran bör anpassa området beräkningar korrekt till högre eller lägre förstoringar. Korrekt färgning av DNA och granule markör är en kritisk faktor. Dålig färgning eller dålig bildkvalitet i endera kanalen leder till suboptimala resultat. Därför, det rekommenderas att användaren bör bestämma ett lämpligt cell nummer, färgning förfarande och antikropp titer att ge optimala resultat.
NETQUANT har endast testats på nät som härrör från humana neutrofiler in vitro. Nät från andra arter kan också kvantifieras med lämpliga korrigeringar i kriterierna. NETTOKVANTIFIERING kan utföras på fasta prover i kammar bilder eller på glasbotten plåtar. Högkvalitativa bilder av prover färgade för DNA och granule protein markörer är kritiska. NETQUANT kan också anpassas för att kvantifiera andra former av extracellulära fällor (ET)-Osis, e.g., som visats av eosinofiler. Kvantifiera ETs i icke-granulocyter såsom monocyter är för närvarande inte möjligt som cytoplasmiska granule färgning område krävs för segmenteringsalgoritmen.
Sammanfattningsvis är NETQUANT ett enkelt, automatiskt och snabbt verktyg för att korrekt identifiera netto bildning som möjliggör Single-cell analys och kvantifiering. Vi tror att denna programvara kan sänka barriären för att utföra automatisk NETTOKVANTIFIERING och att forskarsamfundet kommer att gynnas av denna fritt tillgängliga app.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
TM och PN har ett patentsökt relaterat till de algoritmer som används i NETQUANT.
Acknowledgments
Arbetet finansierades av Crafoordska stiftelsen (TM och PN), statens forskningsstipendium (PN, TM), Vetenskapsrådet (PN) och Groschinsky Foundation (TM, PN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Heparinised plastic tubes | BD Biosciences | 367885 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 114547 | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine | Gibco | 11835-030 | |
| 50mL conical flasks | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 15mL conical flasks | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 12-well Tissue culture plates | Falcon | 10626491 | |
| #1 Coverslips 10mm | Menzel Glaser | CS10100 | |
| Glass slides | Menzel Glaser | 631-0098 | |
| Primary anti-human elastase | DAKO | DAKO rabbit 1373, contract immunization | |
| Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit | Life technologies | A-11072, A-11070 | |
| PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI | Life technologies | P36930 | Mounting medium |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Nikon Ti-E Epifluorescence microscope | Nikon | ||
| CCD camera | Andor Zyla | ||
| Plan Apochromat 20x, 40x objectives | Nikon | ||
| Windows 10 | Microsoft | Operating system | |
| macOS Sierra 10.12 | Apple | Operating system | |
| MATLAB | Mathworks |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Nordenfelt, P., Tapper, H. Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Sorensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
- Yipp, B. G., Kubes, P. NETosis: how vital is it? Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Mohanty, T., et al. A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa. Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).
- Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Coelho, L. P., et al. Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images. Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).
- Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps. Frontiers in Immunology. 8, 1999 (2017).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Cedervall, J., Olsson, A. K. Immunity Gone Astray - NETs in Cancer. Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).
- Ginley, B. G., et al. Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 17755 (2017).
