Summary
Her presenterer vi en protokoll for generering av nøytrofile ekstracellulære feller (NETs) og drift av NETQUANT, et helautomatisk programvare alternativ for kvantifisering av NETs i immunofluorescence bilder.
Abstract
Nøytrofile ekstracellulære feller (NETs) er Web-lignende antimikrobielle strukturer bestående av DNA og granule avledet antimikrobielle proteiner. Immunofluorescence mikroskopi og bildebasert kvantifisering metoder er fortsatt viktige verktøy for å quantitate nøytrofile ekstracellulære felle formasjon. Det er imidlertid viktige begrensninger for de immunofluorescence metodene som for øyeblikket er tilgjengelige for kvantifisere NETs. Manuelle metoder for avbildningsbasert NET kvantifisering er ofte subjektive, utsatt for feil og kjedelige for brukere, spesielt ikke-erfarne brukere. Også for øyeblikket tilgjengelige programvarealternativer for kvantifisering er enten semi-automatisk eller krever opplæring før drift. Her viser vi implementeringen av en automatisert immunofluorescence bilde kvantifisering metode for å evaluere NET-formasjonen kalt NETQUANT. Programvaren er enkel å bruke og har en brukervennlig grafisk brukergrensesnitt (GUI). Det anser biologisk relevante parametre som en økning i areal og DNA: NET markør protein ratio, og kjernefysisk deformasjon å definere NET formasjon. Videre er dette verktøyet bygget som en fritt tilgjengelig app, og gir mulighet for én celle oppløsning kvantifisering og analyse.
Introduction
Nøytrofile er avgjørende meglere av medfødt vert forsvaret svar mot en rekke mikrobielle patogener1. De utfører sine antimikrobielle funksjoner ved å slippe sine granulater inneholder et bredt utvalg av antimikrobielle proteiner2, produsere reaktive oksygen arter (ros) og natriumhypokloritt1, og gjennom fagocytose3. I tillegg Brinkmann et al. 4 beskrevet nøytrofile ekstracellulære feller (Nets) som en roman mekanisme der nøytrofile felle og eliminere invaderende patogener. Siden deres oppdagelse litt over et ti år siden4, har Nets vært innblandet i et bredt utvalg av smittsomme5,6 og ikke-smittsomme7 morbidities. NET formasjon er en aktiv prosess og resulterer i ekstrudering av kromatin DNA belagt med granule-avledet antimikrobielle proteiner8. Noen av de viktigste endringene i cellulære og kjernefysiske morfologi forbundet med netto formasjon inkluderer tap av kjernefysisk morfologi, kromatin decondensation, mobilisering av granule proteiner fra cytoplasma til kjernen og en økning i kjernefysiske og cellulære diameter8,9.
De Web-lignende garn, som kan vises som diffuse strukturer litt større enn cellen eller som strukturer flere ganger større enn en enkelt nøytrofile regnes som indikatorerpå NETosis. Ved hjelp av fluorescens mikroskopi, kan NETs oppdages ved å undersøke DNA med en fluorescerende sonde som 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og ved immunofluorescence farging mot netto bundne proteiner som nøytrofile elastase. Kvantifisering av overlappende områder av farging for DNA og NET-Bound proteiner bestemmer det totale arealet under NETs i et bilde11.
En rekke bildeanalyse alternativer er tilgjengelige for å utføre fluorescens bildebasert kvantifisering av garn11,12. Bortsett fra disse programvare valgmulighetene gave begrensninger inne ikke tilværelse bruker-vennlig og/eller fullt ut automatisert. I denne artikkelen viser vi driften av NETQUANT13, en fritt tilgjengelig app som kan utføre upartiske helautomatisk immunofluorescence mikroskopi bilde-basert net kvantifisering. Programmet har et brukervennlig grafisk grensesnitt (GUI) og kan utføre enkelt celle analyse. Programvaren kvantifiserer NETosis i et bilde ved å detektere de morfologiske endringene i området DNA-NET-Bound markør, kromatin decondensation tilhørende deformasjon av kjernen og økning i DNA: NET-Bound protein ratio. Til sammen gir flere NET definisjons kriterier strenge NET-kvantifisering på tvers av flere datasett på en upartisk måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk komitéen i Lunds universitet godkjente innsamlingen av venøs blod fra friske frivillige i samsvar med Declaration of Helsinki (2013/728). Alle frivillige gitt deres skriftlige informert samtykke.
1. isolering av perifere blod nøytrofile bruke Density-gradient sentrifugering
- Samle humant venøs blod i rør som inneholder heparin og la rørene å nå romtemperatur.
Merk: minst 16 mL blod fra en sunn donor er nødvendig for å gi en tilstrekkelig stor celle pellet. - Bland blodet med ett volum på 2% dextran i saltvann (0,9% NaCl) og la det være sediment ved romtemperatur i 30 minutter i et sterilt 50 mL konisk sentrifugerør.
- Aspirer supernatanten i et sterilt 50 mL konisk sentrifugerør og sentrifuger ved 200 x g i 10 min ved 4 ° c.
- Fra dette trinnet videre fortsette isolert ved 4 ° c eller på is.
- Resuspend pellet i 5 mL iskald saltvann og lag på toppen av 5 mL leukocytter isolasjon gradient (9,1% natrium diatrizoate med 5,7% dextran, w/v) i et sterilt 15 mL konisk sentrifugerør.
- Sentrifuger for 30 min ved 400 x g ved 4 ° c.
- Aspirer supernatanten og kast den.
- Lyse røde blodceller ved å blanding pellet i 3 mL iskaldt vann for 30 s. umiddelbart Tilsett 1 mL 3,6% NaCl og fyll opp med 10 mL iskald saltvann.
- Sentrifuger cellen suspensjon for 10 min på 350 x g.
- Fjern supernatanten, samle celle pellet og resuspend den i 1 mL saltvann. Sett til side 10 μL i et mikrosentrifugen rør for vurdering av celle nummer og levedyktighet ved hjelp av trypan blå i et Bürker kammer.
- Tilsett 10 μL av celle fjæring til 90 μL av 0,4% trypan blå oppløsning. Ta 10 μL av celle fjæringen i et Bürker kammer. Telle cellene i de 4 rutene bundet av 3 linjer i hvert hjørne av kammeret. Celler som vises mørk blå til opptaket av fargestoff er ikke-levedyktig, utelukke dem fra det totale celle tallet.
- Uttrykk celle nummeret som celler/mL som definert av ligningen nedenfor.
Merk: her kammer faktor var 10 000, fortynning faktor var 10 og det totale antall kvadrater var 4. - Fortynne resterende celle suspensjon til 10 mL for et endelig vasketrinn.
- Sentrifuger for 5 min ved 200 x g.
- Resuspend den nøytrofile i RPMI-1640 med 2 mg/mL varme-deaktivert humant serum albumin (HSA) ved en konsentrasjon på 5 x 105 celler/ml.
2. utarbeidelse av Coverslips og stimulering av nøytrofile
- Plasser en dekkglass (10 mm, #1) i hver brønn av en 12-brønn plate og frakk dekkglass ved å legge 200 μL av 0,01% Poly-L-lysin løsning og la den ved 37 ° c over natten.
- Vask coverslips med 300 μL fosfat buffer (PBS) én gang og la det tørke.
- Tilsett 400 μL av 5 x 105 nøytrofile/ml til hver brønn og ruge ved romtemperatur i 15 min.
- Flytt platen inneholder nøytrofile til en inkubator på 37 ° c med 5% CO2 for 15 min.
- Fjern supernatanten. Tilsett 400 μL av prewarmed RPMI-1640 medium med 2 mg/mL HSA til kontroller. Tilsett 300 μL pre-varmet RPMI med 20 nM phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetate (PMA) for stimulering.
- Stimulere nøytrofile for 150 min ved 37 ° c med 5% CO2.
3. visualisering av NETs
- Fjern supernatanten og vask prøvene 2x med 200 μL av PBS.
- Fiks prøvene ved å tilsette 200 μL av 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS i 20 min ved 37 ° c.
Merk: PFA er giftig og må håndteres med forsiktighet. - Vask prøvene 3x med 200 μL av PBS.
- Permeabilize prøvene ved å tilsette 50 μL av 0,5% Triton X-100 for 30 s.
- Vask prøvene 3x med 200 μL av PBS.
- Blokker prøvene med 5% geit serum i PBS for 1 t ved 37 ° c.
- Tilsett 300 μL av primær kanin anti-humant nøytrofile elastase i blokkerings løsning ved en fortynning av 1:500 for 90 min ved 37 ° c.
- Vask prøvene 3x med 300 μL av PBS.
- Tilsett 300 μL av sekundær geit anti-kanin fluorescerende antistoff ved en fortynning av 1:1000 for 90 min ved 37 ° c.
- Vask coverslips 3x med 300 μL av PBS.
- Fjern coverslips fra brønnene og Monter dekkglass med 10 μL monterings medium som inneholder DAPI. Oppbevar natten ved romtemperatur i mørket for å tørke prøvene.
Merk: farging av DNA med DAPI er absolutt et kritisk skritt i metoden. Brukerne kan også feilsøke ved å legge til eksogene DAPI-løsning ved et endelig konsentrasjons område på 0,1 \ u 20120.5 μg/mL i 2 \ u20123 min, etterfulgt av 3 vasketrinn med 300 μL PBS. - Skaff deg bilder med et bredt felts fluorescens mikroskop med et 20X mål.
4. analyse og kvantifisering av NETs som bruker NETQUANT
Merk: NETQUANT kan lastes ned ved å klikke installasjonsfilen funnet på Zenodo GitHub arkiv eller Nordenfelt Lab nettsted (https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34).
- Importere datasett for analyse, navngiving av kanaler og konvertering av bilder
- Åpne kategorien Oppsett i NETQUANT.
- Velg kildemappen for analyse ved å klikke på alternativet Hent bane i kildemenyen, og velg mappen som inneholder bilde sekvensene som skal analyseres.
- Falle i staver på bli sti valgmuligheten inne målet meny og velge folderen for bevarer informasjonen fulgte bildet analyse.
- Navn kanalene slik at "DNA-kanal" samsvarer med DNA farging (f. eksDNA eller DAPI) og "NET-Channel" viser NET-Bound protein farging (f. eksnetto, nøytrofile elastase) i bildene. For jevn funksjon av programvaren, (anbefales) navn mappen som inneholder kontroll bildefiler som "kontroll".
Merk: NET kanalen henviser bare til farging av NET-Bound granule protein markør. - Feed bildet metadata i programvaren ved å klikke Last bildeinformasjon knappen på bildeinformasjon undermenyen.
- Velg riktig KANALREKKEFØLGE som finnes i bildene i undermenyen for kanalrekkefølgen . Dette alternativet er inkludert som en feilsikker for å forhindre utilsiktet uoverensstemmelser.
- Hent primære bildeegenskaper fra rådata, og konvertere bildene ved å klikke klargjør data-knappen. De konverterte bildene vises i undermenyen for prøve typen . Klikk på eksempel type menyen for å vise og velge alle datasett som er anskaffet for analyse.
- Velg et bilde fra undermenyen sample type og klikk på knappen for å vise bildedata for å vise bildene som er delt inn i HENHOLDSVIS DNA-og net kanalen.
- Segmentering av celler i DNA-kanalen og NET kanalen
- Velg segmentering metoden ved å klikke på metode undermenyen i både DNA kanalen og net kanalen.
Merk: standardmetoden for segmentering er satt til adaptiv og er den anbefalte innstillingen. Andre alternativer er også tilgjengelig, inkludert global, Edge og Chan-vese. Et vannskille alternativ er også inkludert for å bidra til å skille mellom tett plasserte celler eller NETs. - Gå inn i kategorien Segmentering for å segmentere kontroll celler først i begge kanaler ved å klikke alternativet Segment kontroll eksempler .
- Velg PMA fra eksempel type undermeny og klikk på batch alternativet (anbefales) for å begynne segmentering av alle bildene som er inkludert i datasettet. Velge avbildningene inne prøven type meny og falle i staver på utfoldelse image data knapp å visualisere og godkjenne det binær image maske (DNA maske og nettmaske) utviklet stolpe-segmentering.
- Velg segmentering metoden ved å klikke på metode undermenyen i både DNA kanalen og net kanalen.
- Enkelt celle analyse av identifiserbare egenskaper
- Angi analyse kategorien og analyser kontroll eksemplene ved å klikke på knappen Bestem terskel .
- Endre prøve typen til PMA og klikk på Hent celle egenskaper knappen for å fullføre analysen av stimulert prøver.
- Velg et bilde fra undermenyen sample type , og klikk på knappen for å vise bildedata for å vise overlegget og antall celler og netto forming celler i bildet.
- Sammenligning av egenskaper for celle for å identifisere NET-forming Cells
- Velg prøve fra undermenyen for prøve typen, og klikk på analyser Nets -knappen for å fullføre analysen. Individuelle bilder kan velges fra eksempel type undermeny for analyse eller hele batch av bilder kan analyseres ved å velge batch alternativet (anbefales).
- Juster NET-kriterier manuelt for å gi optimale resultater for et gitt utvalg. Sammenlign identifiserte NETs med de originale bildene for å vurdere kvaliteten på identifikasjonen.
Merk: NET-kriteriene kan deretter brukes på tvers av alle bilder i datasettet. Eventuelle endringer i NET-kriteriene brukes samtidig på tvers av alle kontroll eksempler. Dette begrenser muligheten for potensielle forskjeller som kan oppstå på grunn av over-montering av NET parametrene. Innstillingene i NET-kriteriene kan justeres i henhold til brukerens behov. Forholdet mellom falske funn priser og NETQUANT har blitt utforsket tidligere13. Typiske områder for areal økningen er 2 \ u20124, sirkularitet å være 0,7 \ u 20120.9 og DNA/NET ratio til å være 0,6 – 2,0. - Inspiser data sammendraget i undermenyen for celledata der antall bilder, celle telling per bilde og prosentandel av Nets per bilde vises.
Merk: den totale prosentandelen av garn i hele datasettet vises med "NET-gauge". Totalt bilde antall, celle telling, prosentandel av NETs i utvalget (NETs%) og NETs% i kontroll prøven vises i tabellen for sammendragsstatistikk under NET måleren. Vi anbefaler at kontrolldataene rapporteres ved siden av data innhentet fra stimulert prøver.
- Resultat utganger
- Angi utdata -fanen for å velge og vise resultat utganger.
- Utforske og sammenligne de ulike data utganger generert fra analysen av kontroll og PMA ved å velge form av output og klikke på output resultater knappen.
Merk: all data generert post-analyse for både kontroller og stimuleringer lagres i analyse mappen som valgt i mål undermenyen. Data lagres enten i CSV-eller PDF-format. - Start Method-filen for å få tak i versjonen av programvaren og net-kriteriene som brukes for analysen (for å bli inkludert i metoder-delen for publikasjons formål).
- Klikk på resultatdata tabellen for å visualisere de individuelle datapunktene i et gitt utvalg.
- Visualisere NET området distribusjon og DNA: NET ratio i prøvene. Den røde linjen indikerer terskelverdien i diagrammene.
- Bestem NET-området kontra form av DNA ved å klikke på bivariate distribusjons fil.
- Laster forrige analyse og batch alle trinn
- Last inn tidligere vellykkede analyse innstillinger i NETQUANT ved hjelp av knappen Last inn forrige analyse .
- Bruk batch alle trinnene knappen inkludert i Oppsett -menyen for å kjøre trinn 5 \ u201212 (figur 1, figur 2, Figur 3, Figur 4, figur 5) direkte for å få det endelige resultatet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
5 x 105 nøytrofile/ml ble sådd på coverslips plassert i en 12-brønn plate og stimulert med enten 20 nM PMA eller venstre unstimulated for 150 min. Prøvene ble deretter farget ved hjelp av primære kanin anti-humant nøytrofile elastase antistoffer, sekundære geit anti-kanin fluoroforen bøyd antistoffer og DAPI-en fluorescensmerkete merket fargestoff som flekker DNA (se tabell over materialer for detaljer). Et minimum av 5 bilder ble deretter kjøpt ved hjelp av en epifluorescence mikroskop og en 20X (NA = 0,75) mål. Eksempel data som brukes til test analysen i manuskriptet kan lastes ned ved å følge linken https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34 og klikke på eksempel datasett-ikonet.
Her beskriver vi evnen til NETQUANT arbeidsflyt (figur 1) for å kvantifisere net formasjon i et gitt utvalg. Programvaren verktøyet kan installeres som en app i MATLAB og kan brukes uten tidligere kjennskap til dette grensesnittet. GUI av NETQUANT ble brukt til å analysere datasettene som beskrevet ovenfor. Alle bilder som brukes til analyse av NETQUANT, forblir alltid uendret i den overordnede mappen. Det GUI er delt i 4 tabs â € setup tab, segmentering tab, analyse tab og resultater produksjon tab. Prøvene ble klargjort for analyse i oppsetts fanen (figur 2). Filbanene (1), navnekonvensjoner (2), bildeinformasjon (3) og kanal ordrer (4) er definert av brukeren. Alternativet Forbered data (5) sikrer at konverteringen og organiseringen på en standardisert måte gjennom hele eksperimentet. Den segmentering parametrene var satt i segmentering kategorien (Figur 3) for å identifisere individuelle celler i prøvene (6). Kontroll prøvene er alltid segmentert først (7) før segmentering av stimulert prøver (8). Alle anbefalte verdier for segmentering er angitt i programvare fanen. Egenskapene som definerer unstimulated kontroll celler er først anskaffet (9) og deretter sammenlignet med PMA stimulert celler (10) (Figur 4). NETs blir deretter analysert i prøvene basert på NET kriteriene (11) og vist med totalt antall bilder, celle tellinger og tilsvarende garn% i kontroll prøvene. Den endelige data utganger fra analysen ble valgt og deretter visualisere (figur 5). Et alternativ for lasting og bruk av en tidligere vellykket analyse, og en batch-alle muligheten til å behandle grupper av trinn 5-12 (figur 1, figur 2, Figur 3, Figur 4, figur 5) har også blitt inkludert i Oppsett-kategorien.
Under analysen ble totalt 2619 celler analysert i eksperimentet. PMA stimulert nøytrofile var i stand til å generere 90,59% garn (NETs%) i motsetning til 25,87-garn% i kontroll prøvene (figur 6). Bildeanalysen ble fullført innen 10 minutter etter initiering av arbeidsflyten på programvaren. Oppsummert gir NETQUANT en rask og praktisk mulighet til å kvantifisere NET formasjon i bilder som er ervervet ved hjelp immunofluorescence mikroskopi.
Figur 1: oversikt over NETQUANT-arbeidsflyt. Fluorescerende micrographs av humant nøytrofile Double beiset med anti-elastase og DAPI (DNA) er først behandlet og konvertert. Bildene blir deretter segmentert, etterfulgt av analyse av celle egenskaper, deteksjon av NETs og resultat utganger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: alternativer for kategorien Oppsett i NETQUANT. Filbaner for datasettene som skal analyseres, og mapper for utdata skrives inn i Oppsett-kategorien først (1). Navnekonvensjonene fylles deretter ut for å definere kanalnavn og navnet på kontroll mappen (2). Bildeinformasjonen blir deretter anskaffet (3) etterfulgt av å navngi riktig KANALREKKEFØLGE (4). Riktig oppsett av alle feltene anbefales før behandling av datasettene (5) for standardisert bilde konvertering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Kategori parametere for segmentering i NETQUANT. Parametrene som brukes for segmentering av både DNA-kanal og NET-protein markør inkluderer metode, følsomhet, gjentakelser, minimum areal og vannskille (6). Bruken av en adaptiv segmentering metode og vannskille anbefales. Også andre innstillinger gitt som forhåndsinnstillinger i programvaren kan brukes uten modifikasjoner for de fleste formål. Control prøvene er første segmentert (7) og deretter stimulert prøvene er segmentert (8). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: påvisning av Nets i analyse fanen. Celle egenskapene som definerer unstimulated celler analyseres og anskaffes fra kontroll prøver (9). Dette etterfølges av analyse av celle egenskaper i de eksperimentelle prøvene (10). NET-Definition kriterier (fold økning i mobilnettet området, kjernefysisk deformasjon (verdier 0 til 1) og DNA flekker området/NET-markør farging området) er brukt på både kontroll og stimulert prøver å definere NET formasjon (11). Antall garn, totalt antall celle antall og bilder i begge eksemplene vises i sammendragsstatistikk delen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: visualisering av resultat utdatafiler i NETQUANT. Resultater oppnådd post-analyse kan velges av den enkelte bruker. Resultat utgangene som kan genereres med NETQUANT inkluderer en CSV-fil som inneholder datapunkter fra enkeltceller. Også, histogrammer viser distribusjon av celler som gjennomgår økning i NET (Cellular) område, deformasjon av kjernen på grunn av kromatin decondensation og DNA: NET-markør ratio, og en 3D graf av NET området versus kjernefysisk deformasjon er også generert i analysen. Alle utganger lagres automatisk i analyse mappen som er valgt i oppsett fanen som CSV-, PDF-og TXT-filer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: analyse av net formasjon. (A) Nets%, totalt celle antall og antall bilder fra test datasett som observert i sammendraget statistikk for kontroller og PMA-stimulert (20 nM) nøytrofile. (B) en side-ved-side-sammenligning av histogrammer som viser økning i området, kjernefysisk deformasjon (verdier 0 til 1) og DNA/net ratio i kontroll og PMA-stimulert prøver. Den røde linjen i terskelverdiene for NET Definition-kriteriene i histogrammer. (C) sammenligning av 3D-graf av net-området versus kjernefysisk deformasjon generert av NETQUANT analyse av kontroll og PMA-stimulert prøver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Netto formasjon er et relativt nylig tillegg til de ulike nøytrofile armamentarium4 og det har vært en merkbar bølge av interesse å studere konsekvensen av garn i et bredt spekter av forskningsområder5,7,14,15. Anskaffelse av bilder ved hjelp av Immunofluorescence mikroskopi og påfølgende bildebasert kvantifisering er en mye brukt metode for å kvantifisere NETs. Denne tilnærmingen har fordelen av å kunne oppdage celler som danner garn på et enkelt cellenivå, og kan derfor bedre redusere bakgrunns signalet. Manuelle metoder for kvantifisering kan være uttømmende, langsom og underlagt brukerens bias. Et par halv--automatisk valgmulighetene eksisterer det ha forsynt brukernes med pålitelig analyse11,12. Imidlertid, de kunne forlange betydelig teknisk sikkerhet for operasjon eller kanskje forlange adskillige håndbok skritt for kvantifisering. Dette er utfordrende spesielt for tidligere ikke-erfarne brukere. I en fersk publikasjon, en helautomatisk beregningsmetode har blitt brukt til å kvantifisere NET formasjon ved hjelp av Flow flowcytometri-baserte Imaging samt tynne vev seksjoner. Men det kan bare brukes til bestemte scenarier og krever også en betydelig kunnskap om programmering for drift16. For tiden helautomatisk bilde kvantifisering programvare dedikert mot generelle NET kvantifisering som er enkel å bruke og besitter én celle oppløsning kapasitet er utilgjengelig for forskere.
Her presenterer vi NETQUANT, en helautomatisk NET kvantifisering programvare som er fritt tilgjengelig. Denne programvaren er utviklet spesielt for å kvantifisere NET dannelse med høy stringens ved hjelp av immunofluorescence mikroskopi bilder, og med evnen til å utføre enkelt celle analyse og kvantifisering. Bortsett fra å vurdere økningen i området flekker under NETs, NETQUANT også tar hensyn til kjernefysisk deformasjon på grunn av kromatin decondensation og en økning i DNA/NET-markør protein co-lokalisering å definere NET formasjon i et gitt utvalg. Dette gjør det mulig å skille celler som bare har gjennomgått kjernefysiske decondensation fra celler som har gjennomgått fullstendig NET dannelse. NET definisjons kriteriene som er inkludert i NETQUANT-algoritmen gir høyere stringens i kvantifisering sammenlignet med mange tidligere kvantifisering tilnærminger som bare baserer seg på en økning i arealet av NET farging.
Det GUI er hadde til hensikt å være bruker-vennlig og enkel å bruk. Hvert trinn i analysen er nummerert for å sikre at brukerne kan følge arbeidsflyten. En av de viktigste funksjonene som tilbys i programvaren er segmentering verktøyet/kategorien som gjør at NETQUANT å utføre én celle analyse i bilder, som er den høyeste mulige følsomhet som kan oppnås. Dette gjør NETQUANT en av de få tilgjengelige alternativene som kan utføre enkelt celle kvantifisering å quantitate NET formasjon. I tillegg har Mohanty et al. vist at programvaren også kan tilpasse seg bilde variasjoner og anskaffelses parametre13. På grunn av fleksibiliteten som tilbys i segmentering og NET-Definition kriterier, donor og plate variasjoner kan innkvarteres. NETQUANT kan håndtere store datasett tilstrekkelig og kan brukes for pålitelig bildeanalyse med høy gjennomstrømming13.
Selv om vi fant arbeidsflyten å gi robuste resultater fra flere givere, anbefaler vi at brukeren bør bestemme de aktuelle verdiene basert på de enkelte prøvene. I teorien kan dataene generert post-analyse også være påvirket av høy celle tetthet. Dessuten kan overdreven aggregering av NETs resultere i reduksjon av antall NETs oppdaget. Dette er fordi segmentering algoritmen ikke kan skille viklet inn NETs i separate hendelser. Et lignende problem med segmentering kan også oppstå når unstimulated nøytrofile er fanget i NETs. Bruken av bilder ervervet på 20X og 40X er for øyeblikket anbefalt som NETQUANT ytelse ikke har blitt testet på andre forstørrelsesnivåer. Likevel, så lenge pikselstørrelsen er satt riktig (enten manuelt eller fra metadata i Last bilde info delen) programvaren skal tilpasse området beregninger nøyaktig til høyere eller lavere forstørrelser. Riktig farging av DNA og granule markør er en kritisk faktor. Dårlig farging eller dårlig bildekvalitet i begge kanaler vil resultere i suboptimal resultater. Derfor anbefales det at brukeren skal bestemme et passende celle nummer, farging prosedyre og antistoff titer å gi optimale resultater.
NETQUANT har bare blitt testet på NETs avledet fra humant nøytrofile in vitro. NETs fra andre arter kan også kvantifisert med riktige korrigeringer i kriteriene. NET kvantifisering kan utføres på faste prøver i kammeret lysbilder eller multi-brønn glassbunn plater. Høy kvalitet bilder av prøvene beiset for DNA og granule protein markører er kritiske. NETQUANT kan også tilpasses til å kvantifisere andre former for ekstracellulære feller (ET)-Osis, f. eks, som utstilt ved eosinofile. Kvantifisere ETs i ikke-granulocytter som monocytter er for øyeblikket ikke mulig som cytoplasmatiske granule farging området er nødvendig for segmentering algoritmen.
Avslutningsvis er NETQUANT en enkel, automatisk og rask verktøy for nøyaktig identifisering NET formasjon som gjør det mulig for enkelt celle analyse og kvantifisering. Vi mener at denne programvaren kan senke barrieren for å utføre automatiske NET kvantifisering og at forskningsmiljøet vil dra nytte av denne fritt tilgjengelige appen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
TM og PN har et patent påvente knyttet til algoritmer som brukes i NETQUANT.
Acknowledgments
Arbeidet ble finansiert av Crafoord Foundation (TM og PN), svensk stats forskningsstipend (PN, TM), svensk forskningsråd (PN) og Groschinsky Foundation (TM, PN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Heparinised plastic tubes | BD Biosciences | 367885 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 114547 | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine | Gibco | 11835-030 | |
| 50mL conical flasks | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 15mL conical flasks | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 12-well Tissue culture plates | Falcon | 10626491 | |
| #1 Coverslips 10mm | Menzel Glaser | CS10100 | |
| Glass slides | Menzel Glaser | 631-0098 | |
| Primary anti-human elastase | DAKO | DAKO rabbit 1373, contract immunization | |
| Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit | Life technologies | A-11072, A-11070 | |
| PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI | Life technologies | P36930 | Mounting medium |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Nikon Ti-E Epifluorescence microscope | Nikon | ||
| CCD camera | Andor Zyla | ||
| Plan Apochromat 20x, 40x objectives | Nikon | ||
| Windows 10 | Microsoft | Operating system | |
| macOS Sierra 10.12 | Apple | Operating system | |
| MATLAB | Mathworks |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Nordenfelt, P., Tapper, H. Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Sorensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
- Yipp, B. G., Kubes, P. NETosis: how vital is it? Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Mohanty, T., et al. A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa. Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).
- Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Coelho, L. P., et al. Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images. Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).
- Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps. Frontiers in Immunology. 8, 1999 (2017).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Cedervall, J., Olsson, A. K. Immunity Gone Astray - NETs in Cancer. Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).
- Ginley, B. G., et al. Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 17755 (2017).
