Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a geração de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) e a operação NETQUANT, uma opção de software totalmente automática para quantificação de NETs em imagens de imunofluorescência.
Abstract
As armadilhas extracelulares neutrófilas (NETs) são estruturas antimicrobianas semelhantes à teia, consistindo de proteínas antimicrobianas derivadas de DNA e grânulo. A microscopia de imunofluorescência e os métodos de quantificação à base de imagem continuam a ser ferramentas importantes para quantitar a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos. No entanto, existem limitações fundamentais para os métodos baseados em imunofluorescência que estão atualmente disponíveis para quantificar NETs. Métodos manuais de quantificação NET baseada em imagem são muitas vezes subjetivos, propensos a erros e tediosos para os usuários, especialmente usuários não experientes. Além disso, as opções de software atualmente disponíveis para quantificação são semi-automáticas ou exigem treinamento antes da operação. Aqui, demonstramos a implementação de um método automatizado de quantificação de imagem baseado em imunofluorescência para avaliar a formação NET chamada NETQUANT. O software é fácil de usar e tem uma interface gráfica de usuário (GUI) amigável ao usuário. Considera parâmetros biologicamente relevantes, como um aumento na área de superfície e dna:net marcador proteína razão, e deformação nuclear para definir a formação NET. Além disso, esta ferramenta é construída como um aplicativo disponível gratuitamente e permite a quantificação e análise de resolução de células únicas.
Introduction
Neutrófilos são mediadores cruciais de respostas inatas de defesa do hospedeiro contra uma grande variedade de patógenos microbianos1. Eles executam suas funções antimicrobianas liberando seus grânulos contendo uma grande variedade de proteínas antimicrobianas2,produzindo espécies reativas de oxigênio (ROS) e hipoclorite1,e através da fagocitose3. Além disso, Brinkmann et al. 4 descreveram armadilhas extracelulares neutantes (NETs) como um novo mecanismo pelo qual os neutrófilos prendem e eliminam patógenos invasores. Desde a sua descoberta há pouco mais de umadécada,os NETs têm sido implicados numa grande variedade de5,6 e7 morbidadesnãoinfecciosas. A formação líquida é um processo ativo e resulta na extrusão do DNA de cromatina revestido com proteínas antimicrobianas derivadas de grânulo8. Algumas das principais mudanças na morfologia celular e nuclear associadas à formação net incluem a perda de morfologia nuclear, decondensation cromatina, mobilização de proteínas de granule do citoplasma para o núcleo e um aumento no diâmetro nuclear e celular8,9.
Os NETs semelhantes à web, que podem aparecer como estruturas difusas ligeiramente maiores do que a célula ou como estruturas várias vezes maiores do que um único neutrófilo são considerados como indicadores de NETosis5,10. Usando microscopia de fluorescência, nets podem ser detectados por sondagem de DNA com uma sonda fluorescente, como 4',6-diamidino-2-fenilatoladole (DAPI) e por imunofluorescência manchando contra net-bound proteínas como neutrophil elastase. Quantificação de áreas sobrepostas de coloração para DNA e proteínas net-bound determina a área total NETs em uma imagem11.
Uma série de opções de análise de imagem estão disponíveis para realizar quantificação baseada em imagem de fluorescência de NETs11,12. Mas essas opções de software apresentam limitações em não ser amigável e/ou totalmente automatizada. Neste artigo, demonstramos o funcionamento do NETQUANT13, um aplicativo disponível gratuitamente que pode executar quantificação líquida de microfluorescência totalmente automatizada imparcial. O aplicativo tem uma interface gráfica amigável (GUI) e pode realizar análisede célula única. O software quantifica a NETose em uma imagem detectando as mudanças morfológicas na área do marcador ligado ao DNA-NET, a descondensação da cromatina associou a deformação do núcleo e o aumento da relação de proteína dna:NET-bound. Em conjunto, os múltiplos critérios de definição NET permitem uma quantificação líquida rigorosa em vários conjuntos de dados de forma imparcial.
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Protocol
O comitê de ética da Universidade de Lund aprovou a coleta de sangue venoso de voluntários saudáveis de acordo com a Declaração de Helsínquia (2013/728). Todos os voluntários forneceram seu consentimento informado por escrito.
1. Isolamento de neutrófilos de sangue periféricos usando centrífugação de densidade-gradiente
- Coletar sangue venoso humano em tubos contendo heparina e permitir que os tubos para atingir a temperatura ambiente.
Nota: Um mínimo de 16 mL de sangue de um doador saudável é necessário para produzir uma pelota de célulasuficientemente grande. - Misture o sangue com um volume de 2% dextran em saline (0,9% NaCl) e deixe sedimentar à temperatura ambiente por 30 min em um tubo de centrífuga cônica estéril de 50 mL.
- Ascute o supernatant em um tubo cical e no centrífuga estéril da centrífuga de 50 mL cical em 200 x g para 10 min em 4 °C.
- A partir deste passo em diante, continue o isolamento a 4 °C ou no gelo.
- Resuspenda a pelota em 5 mL de soro frio e camada em cima de 5 mL de gradiente de isolamento de leukócito (9,1% diatrizoato de sódio com 5,7% dextran, w/v) em um tubo de centrífuga cônico estéril de 15 mL.
- Centrífuga por 30 min a 400 x g a 4 °C.
- Aspirar o supernatant e descartá-lo.
- Lyse glóbulos vermelhos, resuspendendo a pelota em 3 mL de água gelada para 30 s. Imediatamente adicionar 1 mL de 3,6% NaCl e, em seguida, encher-se com 10 mL de saline gelado.
- Centrífuga a suspensão celular por 10 min a 350 x g.
- Retire o supernatant, recolher a pelota celular e resuspendê-lo em 1 mL de saline. Reserve 10 μL em um tubo de microcentrífuga para avaliação do número celular e viabilidade usando o trypan azul em uma câmara de Bürker.
- Adicione 10 μL de suspensão celular a 90 μL de 0,4% de solução azul trypan. Tome 10 μL da suspensão da pilha em uma câmara de Bürker. Conte as células nos 4 quadrados ligados por 3 linhas em cada canto da câmara. As células que parecem azul escuro para a captação de corante são inviáveis, excluí-los do número total de células.
- Expresse o número celular como células/mL, conforme definido pela equação abaixo.
Nota: Aqui o fator de câmara era 10.000, o fator da diluição era 10 e o número total de quadrados era 4. - Diluir a suspensão celular restante para 10 mL para uma etapa de lavagem final.
- Centrífuga por 5 min a 200 x g.
- Resuspenda os neutrófilos em RPMI-1640 com 2 mg/mL de soro humano inativado de calor (HSA) a uma concentração de 5 x 105 células/mL.
2. Preparação de coverslips e estimulação de neutrófilos
- Coloque um coverslip (10 mm, #1) em cada poço de uma placa de 12 poços e cubra o coverslip adicionando 200 μL de 0,01% solução de poli-l-lisina e deixá-lo em 37 °C durante a noite.
- Lave os lábios com 300 μL fosfato tampão soline (PBS) uma vez e deixe secar.
- Adicione 400 μL de 5 x 105 neutrophils/mL a cada poço e incubar-se na temperatura ambiente para 15 min.
- Mova a placa contendo neutrófilos para uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2 para 15 min.
- Retire o supernatant. Adicione 400 μL de RPMI-1640 pré-aquecido com 2 mg/mL HSA aos controles. Adicione 300 μL RPMI pré-aquecido com 20 nM phorbol 12-myristate 13 acetato (PMA) para estimulação.
- Estimule os neutrófilos por 150 min a 37 °C com 5% de CO2.
3. Visualização de NETs
- Retire o supernatant e lave as amostras 2x com 200 μL de PBS.
- Corrigir amostras adicionando 200 μL de paraformaldeído de 4% (PFA) na PBS por 20 min a 37 °C.
Nota: PFA é tóxico e deve ser tratado com cuidado. - Lave amostras 3x com 200 μL de PBS.
- Permeabilize as amostras adicionando 50 μL de 0,5% Triton X-100 para 30 s.
- Lave as amostras 3x com 200 μL de PBS.
- Bloqueie as amostras com 5% de soro de cabra na PBS por 1 h a 37 °C.
- Adicione 300 μL de elastase anti-humano de neutrófilos de coelho primário em solução de bloqueio em uma diluição de 1:500 para 90 min a 37 °C.
- Lave as amostras 3x com 300 μL de PBS.
- Adicione 300 μL de anticorpo fluorescente anti-coelho de cabra secundário em uma diluição de 1:1000 para 90 min a 37 °C.
- Lave os coverslips 3x com 300 μL de PBS.
- Retire os lábios dos poços e monte o coverslip com 10 μL montagem média contendo DAPI. Armazenar durante a noite à temperatura ambiente no escuro para secar as amostras.
Nota: A coloração do DNA com DAPI é certamente um passo crítico no método. Os usuários também podem solucionar problemas adicionando solução DAPI exógena em uma faixa de concentração final de 0.1\u20120.5 μg/mL para 2\u20123 min, seguido por 3 passos de lavagem com 300 μL PBS. - Adquirir imagens com um microscópio de fluorescência de campo largo usando um objetivo 20X.
4. Análise e Quantificação de NETs usando NETQUANT
Nota: NETQUANT pode ser baixado clicando no arquivo de instalação encontrado no arquivo Zenodo Github ou no site do Nordenfelt Lab (https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34).
- Importação de conjuntos de dados para análise, nomeação de canais e conversão de imagens
- Abra a guia de configuração na NETQUANT.
- Escolha a pasta de origem para análise clicando na opção Get path no menu de origem e selecione a pasta contendo as sequências de imagem a serem analisadas.
- Clique na opção Get Path no menu alvo e selecione a pasta para salvar os dados após a análise de imagem.
- Cite os canais para que o "canal de DNA" corresponda com a coloração de DNA(por exemplo,DNA ou DAPI) e "NET-channel" retrata a mancha de proteína NET-bound(por exemplo,NET, elastase neutrófilo) nas imagens. Para o bom funcionamento do software, (recomendado) nome da pasta contendo os arquivos de imagem de controle como "controle".
Nota: O canal NET refere-se apenas à mancha de proteína de grânulo net-bound. - Alimente os metadados de imagem no software clicando no botão de informações de imagem Load no submenu de informações de imagem.
- Selecione a ordem correta do canal contida nas imagens no submenu de pedidos do Canal. Esta opção foi incluída como uma falha à prova de falhas para evitar incompatibilidades acidentais.
- Adquirir propriedades de imagem primária a partir dos dados brutos e converter as imagens clicando no botão de dados Prepare. As imagens convertidas aparecem no submenu tipo Sample. Clique no menu tipo Amostra para exibir e selecionar todos os conjuntos de dados adquiridos para análise.
- Selecione uma imagem do menu sub do tipo Sample e clique no botão de dados de imagem display para exibir as imagens divididas no DNA e no canal NET, respectivamente.
- Segmentação de células no canal de DNA e no canal NET
- Selecione o método de segmentação clicando no sub menu Método no canal de DNA e no canal NET.
Nota: O método padrão de segmentação é definido como adaptativo e é a configuração recomendada. Outras opções também estão disponíveis, incluindo global, borda e Chan-Vese. Uma opção de bacia hidrográfica também está incluída para ajudar a distinguir entre células colocadas de perto ou NETs. - Digite a guia de segmentação para células de controle do segmento em primeiro lugar em ambos os canais, clicando na opção de amostras de controle do segmento.
- Selecione pma a partir do tipo de amostra sub-menu e clique na opção lote (recomendado) para iniciar a segmentação de todas as imagens incluídas no conjunto de dados. Selecione as imagens no menu tipo amostra e clique no botão de dados de imagem display para visualizar e validar as máscaras de imagem binárias (máscara de DNA e máscara NET) geradas após segmentação.
- Selecione o método de segmentação clicando no sub menu Método no canal de DNA e no canal NET.
- Análise unicelular de propriedades identificáveis
- Digite a guia de análise e analisar as amostras de controle clicando no botão determinar limite.
- Alterar o tipo de amostra para PMA e clique no botão obter propriedades celulares para completar a análise de amostras estimuladas.
- Selecione uma imagem do submenu tipo sample e clique no botão de dados de imagem display para exibir a sobreposição e o número de células e células formadoras net na imagem.
- Comparação de propriedades celulares para identificar células formadoras de NET
- Selecione a amostra do submenu do tipo amostra e clique no botão Analyze NETs para concluir a análise. Imagens individuais podem ser selecionadas a partir do submenu tipo amostra para análise ou todo o lote de imagens pode ser analisado selecionando a opção de lote (recomendado).
- Ajuste os critérios da NET manualmente para produzir resultados ideais para uma determinada amostra. Compare NETs identificados com as imagens originais para avaliar a qualidade da identificação.
Nota: Os critérios net podem ser usados em todas as imagens no conjunto de dados. Quaisquer alterações nos critérios net são aplicadas simultaneamente em todas as amostras de controle. Isso limita a possibilidade de eventuais diferenças que possam surgir devido ao excesso de montagem dos parâmetros NET. As configurações nos critérios NET podem ser ajustadas de acordo com os requisitos do usuário. A relação entre as taxas de descoberta falsa e NETQUANT foi explorada anteriormente13. As escalas típicas para o aumento da área são 2\u20124, circularity a ser 0.7\u20120.9 e a relação do ADN/NET a ser 0.6-2.0. - Inspecione o resumo dos dados no submenu de dados cell, onde o número de imagens, a contagem de células por imagem e a porcentagem de NETs por imagem são exibidos.
Nota: A porcentagem total de NETs em todo o conjunto de dados é exibida pelo "indicador NET". A contagem total de imagens, a contagem celular, a porcentagem de NETs na amostra (NETs%) e os NETs% na amostra de controle são exibidos na tabela de estatísticas sumárias abaixo do indicador NET. Recomendamos que os dados de controle sejam relatados juntamente com os dados obtidos a partir de amostras estimuladas.
- Resultados
- Insira a guia De saída para selecionar e visualizar as saídas de resultados.
- Explore e compare as várias saídas de dados geradas a partir da análise do controle e do PMA selecionando a forma da saída e clicando no botão de resultados de saída.
Nota: Todos os dados gerados após a análise para controles e estimulação são salvos na pasta de análise escolhida no submenu alvo. Os dados são salvos em formatos .csv ou .pdf. - Ineve o arquivo Método para obter a versão do software e os critérios NET utilizados para a análise (a serem incluídos na seção de métodos para fins de publicação).
- Clique na tabela de dados de resultados para visualizar os pontos de dados individuais em uma determinada amostra.
- Visualize a distribuição da área NET e a relação DNA:NET nas amostras. A linha vermelha indica o valor limite nos gráficos.
- Determine a área NET versus a forma do DNA clicando no arquivo de distribuição bivariada.
- Carregamento de análise anterior e lote de todas as etapas
- Carregue configurações de análise previamente bem-sucedidas no NETQUANT usando o botão de análise anterior da Load.
- Use o botão Batch todas as etapas incluídas no menu de configuração para executar etapas 5\u201212 (Figura 1,Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5) diretamente para obter a saída final.
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Representative Results
5 x 105 neutrophils/mL foram semeados em coverslips colocados em uma placa de 12 poços e estimulados com 20 nM PMA ou deixados sem estímulo por 150 min. As amostras foram então manchadas usando anticorpos primários de nêutrons anti-humanos de coelho, anticorpos conjugados de fluorofiforas anticoelho de cabra secundário e DAPI - um corante fluorescente rotulado que mancha DNA (Veja a Tabela de Materiais para obter detalhes). Um mínimo de 5 imagens foram então adquiridas usando um microscópio de epifluorescência e um objetivo 20X (NA = 0,75). Os dados da amostra usados para a análise de teste no manuscrito podem ser baixados seguindo o link https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34 e clicando no ícone do conjunto de dados da amostra.
Aqui descrevemos a capacidade do fluxo de trabalho NETQUANT(Figura 1)para quantificar a formação NET em uma determinada amostra. A ferramenta de software pode ser instalada como um aplicativo no MATLAB e pode ser usada sem qualquer conhecimento prévio dessa interface. O GUI da NETQUANT foi usado para analisar os conjuntos de dados, conforme descrito acima. Todas as imagens utilizadas para análise pela NETQUANT são sempre deixadas inalteradas no diretório dos pais. O GUI é dividido em 4 guias - guia de configuração, guia de segmentação, guia de análise e guia de saída de resultados. As amostras foram preparadas para análise na guia de configuração(Figura 2). Os caminhos do arquivo (1), convenções de nomenclatura (2), informações de imagem (3) e pedidos de canal (4) são definidos pelo usuário. A opção de preparar dados (5) garante que a conversão e a organização de forma padronizada ao longo do experimento. Os parâmetros de segmentação foram o conjunto na guia de segmentação(Figura 3)para identificar células individuais nas amostras (6). As amostras de controle são sempre segmentadas primeiro (7) antes da segmentação de amostras estimuladas (8). Todos os valores recomendados para segmentação são indicados na guia de software. As propriedades que definem as células de controle não estimuladas são adquiridas pela primeira vez (9) e depois comparadas às células estimuladas por PMA (10) (Figura 4). Os NETs são então analisados nas amostras com base nos critérios da NET (11) e exibidos com contagens totais de imagem, contagens celulares e NETs correspondentes% nas amostras de controle. As saídas finais de dados da análise foram selecionadas e visualizadas(Figura 5). Uma opção para carregar e usar uma análise previamente bem-sucedida, e uma opção em todo o lote para processar grupos de etapas 5-12 (Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5) também foram incluídos na guia de configuração.
Durante a análise, foram analisadas 2619 células no experimento. Os neutrófilos estimulados pma foram capazes de gerar 90,59% NETs (NETs%) em contraste com 25,87 NETs% nas amostras de controle(Figura 6). A análise de imagem foi concluída dentro de 10 minutos de iniciar o fluxo de trabalho no software. Em resumo, a NETQUANT oferece uma opção rápida e conveniente para quantificar a formação líquida em imagens que foram adquiridas usando microscopia de imunofluorescência.
Figura 1: Visão geral do fluxo de trabalho da NETQUANT. Micrografias fluorescentes de neutrófilos humanos duplamente manchadas com anti-elastase e DAPI (DNA) são processadas e convertidas pela primeira vez. As imagens são segmentadas, seguidas pela análise de propriedades celulares, detecção de NETs e saídas de resultado. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Opções de guia de configuração na NETQUANT. Caminhos de arquivo para os conjuntos de dados a serem analisados e pastas de saída de dados são inseridas na guia de configuração primeiro (1). As convenções de nomenclatura são então preenchidas para definir nomes de canais e o nome da pasta de controle (2). As informações de imagem são então adquiridas (3) seguidas de nomear a ordem correta do canal (4). A configuração adequada de todos os campos é recomendada antes do processamento dos conjuntos de dados (5) para conversão de imagem padronizada. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Parâmetros de guia de segmentação na NETQUANT. Os parâmetros utilizados para segmentação do canal de DNA e do marcador de proteína NET incluem método, sensibilidade, iterações, área mínima e bacia hidrográfica (6). Recomenda-se o uso de um método de segmentação adaptativa e bacia hidrográfica. Além disso, outras configurações fornecidas como predefinições no software podem ser usadas sem modificação para a maioria dos fins. As amostras de controle são segmentadas pela primeira vez (7) e, em seguida, as amostras estimuladas são segmentadas (8). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Detecção de NETs na guia de análise. As propriedades celulares que definem células não estimuladas são analisadas e adquiridas a partir de amostras de controle (9). Segue-se a análise das propriedades celulares nas amostras experimentais (10). Os critérios de definição NET (aumento dobrável na área celular, deformação nuclear (valores 0 a 1) e área de coloração de DNA/área de coloração de marcador NET) são aplicados tanto ao controle quanto às amostras estimuladas para definir a formação de NET (11). A quantidade de NETs, a contagem total de células e o número de imagens em ambas as amostras é exibida na seção de estatísticas sumárias. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 5: Visualização dos arquivos de saída de resultados na NETQUANT. Os resultados obtidos após a análise podem ser selecionados pelo usuário individual. As saídas de resultado que podem ser geradas com netquant inclui um arquivo .csv contendo pontos de dados de células individuais. Além disso, histogramas que retratam a distribuição de células em aumento na área líquida (celular), deformação de núcleo devido à descondensação da cromatina e à relação DNA:NET-marcador, e um gráfico 3D da área NET versus deformação nuclear também são gerados na análise. Todas as saídas são salvos automaticamente na pasta de análise escolhida na guia de configuração como arquivos .csv, .pdf e .txt. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 6: Análise da formação NET. (A) Os NETs%, a contagem total de células e o número de imagens do conjunto de dados de teste, conforme observado nas estatísticas sumárias de controles e neutrófilos estimulados por PMA (20 nM). (B) Uma comparação lado a lado de histogramas que retratam o aumento na área, a deformação nuclear (valores 0 a 1) e a relação dna/NET no controle e amostras estimuladas pela PMA. A linha vermelha no limiar de histogramas valoriza os critérios de definição da NET. (C) Comparação do gráfico 3D da área NET versus deformação nuclear gerada pela análise NETQUANT de amostras de controle e estimuladas pela PMA. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
A formação NET é uma adição relativamente recente ao diverso armamentarium neutrófilo4 e tem havido uma onda notável de interesse para estudar a implicação de NETs em uma ampla gama de áreas de pesquisa5,7,14,15. A aquisição de imagens usando microscopia de imunofluorescência e quantificação subsequente baseada em imagem é um método amplamente utilizado para quantificar NETs. Esta abordagem tem a vantagem de ser capaz de detectar células formando NETs em um nível unicelular e, portanto, pode reduzir melhor o sinal de fundo. Métodos manuais de quantificação podem ser exaustivos, lentos e sujeitos a viés do usuário. Existem algumas opções semi-automáticas que forneceram aos usuários uma análise confiável11,12. No entanto, eles podem exigir habilidade técnica significativa para a operação ou podem exigir várias etapas manuais para quantificação. Isso é um desafio especialmente para usuários anteriormente não experientes. Em uma publicação recente, um método computacional totalmente automático tem sido usado para quantificar a formação NET usando imagens baseadas em citometria de fluxo, bem como seções de tecido fino. No entanto, ele só pode ser aplicado a cenários específicos e também requer um conhecimento significativo de programação para a operação16. Atualmente, o software de quantificação de imagem totalmente automatizado dedicado à quantificação geral da NET que é fácil de usar e possui capacidade de resolução de célulaúnica não está disponível para os pesquisadores.
Aqui apresentamos netquant, um software de quantificação NET totalmente automatizado que está disponível gratuitamente. Este software foi desenvolvido especificamente para quantificar a formação líquida com alta rigor usando imagens de microscopia de imunofluorescência e com a capacidade de realizar análise e quantificação unicelular. Além de considerar o aumento da área de coloração NETs, a NETQUANT também leva em conta a deformação nuclear devido à descondensação da cromatina e um aumento na co-localização de proteína de DNA/marcador NET para definir a formação de NET em uma determinada amostra. Isso permite distinguir células que só sofreram decondensation nuclear de células que sofreram formação NET completa. Os critérios de definição NET incluídos no algoritmo NETQUANT permitem maior rigor na quantificação em comparação com muitas abordagens de quantificação anteriores que dependem unicamente de um aumento na área de coloração LÍQUIDA.
O GUI tem como objetivo ser fácil de usar e simples de usar. Cada etapa da análise é numerada para garantir que os usuários possam acompanhar o fluxo de trabalho. Uma das principais características fornecidas no software é a ferramenta/guia de segmentação que permite à NETQUANT realizar análises unicelulares em imagens, que é a sensibilidade mais alta possível que pode ser alcançada. Isso faz da NETQUANT uma das poucas opções disponíveis que podem realizar quantificação unicelular para quantidadede formação NET. Além disso, Mohanty et al. demonstraram que o software também pode se adaptar às variações de imagem e parâmetros de aquisição13. Devido à flexibilidade oferecida nos critérios de segmentação e definição net, as variações de doadores e placas podem ser acomodadas. A NETQUANT pode lidar adequadamente com grandes conjuntos de dados e pode ser usada para análise de imagem de alta taxa de alta taxa de velocidade confiável13.
Embora tenhamos encontrado o fluxo de trabalho para produzir resultados robustos de vários doadores, recomendamos que o usuário decida sobre os valores apropriados com base nas amostras individuais. Em teoria, os dados gerados após a análise também podem ser influenciados pela alta densidade celular. Além disso, a agregação excessiva de NETs pode resultar na redução do número de NETs detectados. Isso ocorre porque o algoritmo de segmentação não pode distinguir NETs emaranhados em eventos separados. Um problema semelhante com a segmentação também pode surgir quando neutrófilos não estimulados estão presos dentro dos NETs. O uso de imagens adquiridas a 20X e 40X é atualmente recomendado, pois o desempenho da NETQUANT não foi testado em outros níveis de ampliação. Ainda assim, enquanto o tamanho do pixel for definido corretamente (manualmente ou de metadados na seção de informações de imagem de carga), o software deve adaptar os cálculos de área com precisão a ampliações mais altas ou mais baixas. A coloração apropriada do ADN e do marcador do grânulo é um fator crítico. Má coloração ou má qualidade da imagem em qualquer canal resultará em resultados abaixo do ideal. Portanto, recomenda-se que o usuário determine um número de celular adequado, procedimento de coloração e titer de anticorpos para produzir resultados ideais.
Netquant só foi testado em NETs derivados de neutrófilos humanos in vitro. Nets de outras espécies também podem quantificar com correções adequadas nos critérios. A quantificação LÍQUIDA pode ser realizada em amostras fixas em lâminas de câmara ou placas de fundo de vidro multi-poço. Imagens de alta qualidade de amostras manchadas para marcadores de dna e proteína de grânulo são críticas. Netquant também pode ser adaptado para quantificar outras formas de armadilhas extracelulares (ET)-osis, por exemplo, como exibido por eosinófilos. Quantificar ETs em não-grulócitos como monócitos atualmente não é possível, pois a área de coloração de grânulo citoplasmático é necessária para o algoritmo de segmentação.
Em conclusão, netquant é uma ferramenta simples, automática e rápida para identificar com precisão a formação NET que permite a análise de células únicas e quantificação. Acreditamos que este software pode diminuir a barreira para a realização de quantificação LÍQUIDA automática e que a comunidade de pesquisa se beneficiará deste aplicativo disponível gratuitamente.
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Disclosures
TM e PN têm uma patente pendente relacionada aos algoritmos utilizados na NETQUANT.
Acknowledgments
O trabalho foi financiado pela Fundação Crafoord (TM e PN), concessão de Pesquisa do Governo Sueco (PN, TM), conselho de pesquisa sueco (PN) e Groschinsky Foundation (TM, PN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Heparinised plastic tubes | BD Biosciences | 367885 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 114547 | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine | Gibco | 11835-030 | |
| 50mL conical flasks | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 15mL conical flasks | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 12-well Tissue culture plates | Falcon | 10626491 | |
| #1 Coverslips 10mm | Menzel Glaser | CS10100 | |
| Glass slides | Menzel Glaser | 631-0098 | |
| Primary anti-human elastase | DAKO | DAKO rabbit 1373, contract immunization | |
| Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit | Life technologies | A-11072, A-11070 | |
| PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI | Life technologies | P36930 | Mounting medium |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Nikon Ti-E Epifluorescence microscope | Nikon | ||
| CCD camera | Andor Zyla | ||
| Plan Apochromat 20x, 40x objectives | Nikon | ||
| Windows 10 | Microsoft | Operating system | |
| macOS Sierra 10.12 | Apple | Operating system | |
| MATLAB | Mathworks |
References
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