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Immunology and Infection

Cuantificación automatizada basada en imágenes de trampas extracelulares de neutrófilos mediante NETQUANT

doi: 10.3791/58528 Published: November 27, 2019

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para generar trampas extracelulares de neutrófilos (NET) y operar NETQUANT, una opción de software totalmente automática para la cuantificación de NETs en imágenes de inmunofluorescencia.

Abstract

Las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) son estructuras antimicrobianas similares a la web que consisten en proteínas antimicrobianas derivadas del ADN y del gránulo. La microscopía de inmunofluorescencia y los métodos de cuantificación basados en imágenes siguen siendo herramientas importantes para cuantificar la formación de trampas extracelulares de neutrófilos. Sin embargo, existen limitaciones clave en los métodos basados en la inmunofluorescencia que actualmente están disponibles para cuantificar los NET. Los métodos manuales de cuantificación de NET basada en imágenes suelen ser subjetivos, propensos a errores y tediosos para los usuarios, especialmente los usuarios no experimentados. Además, las opciones de software disponibles actualmente para la cuantificación son semiautomáticas o requieren capacitación antes de la operación. Aquí, demostramos la implementación de un método automatizado de cuantificación de imágenes basado en inmunofluorescencia para evaluar la formación NET denominada NETQUANT. El software es fácil de usar y tiene una interfaz gráfica de usuario (GUI) fácil de usar. Considera parámetros biológicamente relevantes como un aumento en la superficie y la relación de proteína de marcador DNA:NET, y la deformación nuclear para definir la formación de NET. Además, esta herramienta se construye como una aplicación de libre disposición, y permite la cuantificación y el análisis de la resolución de una sola celda.

Introduction

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Los neutrófilos son mediadores cruciales de las respuestas de defensa innatas del huésped contra una amplia variedad de patógenos microbianos1. Ejecutan sus funciones antimicrobianas liberando sus gránulos que contienen una amplia gama de proteínas antimicrobianas2,produciendo especies reactivas de oxígeno (ROS) e hipoclorito1,y a través de fagocitosis3. Además, Brinkmann et al. 4 describió las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) como un mecanismo novedoso por el cual los neutrófilos atrapan y eliminan los patógenos invasores. Desde su descubrimiento hace poco más de una década4, los NETs se han implicado en una amplia variedad de infecciosos5,6 y no infeccioso7 morbilidades. La formación de REDES es un proceso activo y da como resultado la extrusión de ADN de cromatina recubierto con proteínas antimicrobianas derivadas de gránulos8. Algunos de los cambios clave en la morfología celular y nuclear asociados con la formación de REDES incluyen la pérdida de morfología nuclear, la descondensación de cromatina, la movilización de proteínas de gránulos desde el citoplasma al núcleo y un aumento en el diámetro nuclear y celular8,9.

Los NET similares a la web, que pueden aparecer como estructuras difusas ligeramente más grandes que la célula o como estructuras varias veces más grandes que un solo neutrófilo se consideran indicadores de NETosis5,10. Mediante la microscopía de fluorescencia, las NET se pueden detectar sondeando el ADN con una sonda fluorescente como 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y por la tinción de inmunofluorescencia contra proteínas ligadas a redes netasas como la aslastasa de neutrófilos. La cuantificación de áreas superpuestas de tinción para ADN y proteínas ligadas a REDES determina el área total bajo NETs en una imagen11.

Hay varias opciones de análisis de imágenes disponibles para realizar la cuantificación basada en imágenes por fluorescencia de los NET11,12. Pero estas opciones de software presentan limitaciones para no ser fáciles de usar y/ o totalmente automatizados. En este artículo, demostramos el funcionamiento de NETQUANT13, una aplicación de libre disponibilidad que puede realizar una cuantificación NET basada en imágenes basada en imágenes de microscopía de inmunofluorescencia totalmente automatizada imparcial. La aplicación tiene una interfaz gráfica fácil de usar (GUI) y puede realizar análisis de una sola célula. El software cuantifica la NETosis en una imagen mediante la detección de los cambios morfológicos en el área del marcador enlazado a LA RED de ADN, la deformación asociada a la descondensación de cromatina del núcleo y el aumento de la relación de proteínas enlazadas dnalo:NET. En conjunto, los múltiples criterios de definición de NET permiten una cuantificación estricta de NET en varios conjuntos de datos de forma imparcial.

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Protocol

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El comité de ética de la Universidad de Lund aprobó la recolección de sangre venosa de voluntarios sanos de acuerdo con la Declaración de Helsinki (2013/728). Todos los voluntarios proporcionaron su consentimiento informado por escrito.

1. Aislamiento de neutrófilos de sangre periférica usando Centrifugación Density-Gradient

  1. Recoger sangre venosa humana en tubos que contienen heparina y permitir que los tubos alcancen la temperatura ambiente.
    Nota: Se requiere un mínimo de 16 ml de sangre de un donante sano para producir un pellet de células suficientemente grande.
  2. Mezclar la sangre con un volumen de 2% de dextran en solución salina (0,9% NaCl) y dejar sedimentar a temperatura ambiente durante 30 minutos en un tubo de centrífuga cónica estéril de 50 ml.
  3. Aspirar el sobrenadante en un tubo de centrífuga cónica estéril de 50 ml y centrífuga a 200 x g durante 10 min a 4 oC.
  4. A partir de este paso, continúa el aislamiento a 4oC o sobre hielo.
  5. Resuspender el pellet en 5 ml de salina helada y capa en la parte superior de 5 ml de gradiente de aislamiento de leucocitos (9,1% diatrizoato de sodio con 5,7% de dextran, p/v) en un tubo de centrífuga cónico estéril de 15 ml.
  6. Centrífuga durante 30 min a 400 x g a 4oC.
  7. Aspira rinde al sobrenadante y deséchalo.
  8. Lyse glóbulos rojos mediante la reanimación del pellet en 3 ml de agua helada durante 30 s. Añadir inmediatamente 1 mL de 3.6% NaCl y luego llenar con 10 mL de salina fría de hielo.
  9. Centrifugar la suspensión celular durante 10 min a 350 x g.
  10. Retire el sobrenadante, recoja el pellet celular y resuspenderlo en 1 ml de salina. Reservar 10 l en un tubo de microcentrífuga para la evaluación del número de celda y la viabilidad utilizando el azul de tripa en una cámara de B-rker.
  11. Añadir 10 sl de suspensión celular a 90 ml de solución azul trypan al 0,4%. Tomar 10 l de la suspensión de la célula en una cámara de B-rker. Cuente las celdas en los 4 cuadrados enlazados por 3 líneas en cada esquina de la cámara. Las células que aparecen de color azul oscuro a la suanada de tinte no son viables, excluyémoslas del número total de células.
  12. Exprese el número de celda como celdas/ml según lo definido por la ecuación siguiente.
    Equation
    Nota: Aquí el factor de cámara era 10.000, el factor de dilución era 10 y el número total de cuadrados era 4.
  13. Diluir la suspensión de celda restante a 10 ml para un paso de lavado final.
  14. Centrífuga durante 5 min a 200 x g.
  15. Resuspender los neutrófilos en RPMI-1640 con albúmina sérica humana (HSA) inactivada por calor de 2 mg/ml a una concentración de 5 x 105 células/ml.

2. Preparación de Coverslips y Estimulación de Neutrófilos

  1. Coloque un cubreobjetos (10 mm, #1) en cada pocal de una placa de 12 pocillos y cubra el cubreobjetos añadiendo 200 ml de solución de poli-l-lisina al 0,01% y déjelo a 37 oC durante la noche.
  2. Lave los cubreobjetos con solución salina tampón de fosfato de 300 l (PBS) una vez y déjelo secar.
  3. Añadir 400 éL de 5 x 105 neutrófilos/ml a cada pocil e incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
  4. Mover la placa que contiene neutrófilos a una incubadora a 37 oC con 5% deCO2 durante 15 min.
  5. Retire el sobrenadante. Añadir 400 l de medio RPMI-1640 precalentado con 2 mg/ml de HSA a los controles. Añadir 300 l de RPMI precalentado con 20 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) para la estimulación.
  6. Estimular los neutrófilos durante 150 min a 37 oC con 5% co2.

3. Visualización de NETs

  1. Retire el sobrenadante y lave las muestras 2 veces con 200 s de PBS.
  2. Corrija las muestras añadiendo 200 s de paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS durante 20 min a 37 oC.
    Nota: La PFA es tóxica y debe manipularse con cuidado.
  3. Las muestras de lavado 3 x con 200 ml de PBS.
  4. Permeabilizar las muestras añadiendo 50 sL de 0.5% Triton X-100 para 30 s.
  5. Lave las muestras 3 veces con 200 ml de PBS.
  6. Bloquear las muestras con un 5% de suero de cabra en PBS durante 1 h a 37 oC.
  7. Añadir 300 ml de elastasa de neutrófilos antihumanosa de conejo primario en solución de bloqueo a una dilución de 1:500 durante 90 min a 37 oC.
  8. Lave las muestras 3 veces con 300 s de PBS.
  9. Añadir 300 ml de anticuerpo fluorescente anticonejo de cabra secundario a una dilución de 1:1000 durante 90 min a 37 oC.
  10. Lavar los cubreobjetos 3x con 300 sl de PBS.
  11. Retire los cubreobjetos de los pozos y monte el cubreobjetos con un medio de montaje de 10 l que contenga DAPI. Conservar durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad para secar las muestras.
    Nota: La tinción de ADN con DAPI es sin duda un paso crítico en el método. Los usuarios también pueden solucionar problemas mediante la adición de una solución de DAPI exógena en un rango de concentración final de 0,1 u20120,5 g/ml durante 2 u20123 min, seguido de 3 pasos de lavado con 300 ol pbS.
  12. Adquiera imágenes con un microscopio de fluorescencia de campo ancho utilizando un objetivo 20X.

4. Análisis y cuantificación de NETs utilizando NETQUANT

Nota: NETQUANT se puede descargar haciendo clic en el archivo de instalación que se encuentra en el archivo Zenodo Github o en el sitio web de Nordenfelt Lab (https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34).

  1. Importación de conjuntos de datos para análisis, nomenclatura de canales y conversión de imágenes
    1. Abra la pestaña Configuración en NETQUANT.
    2. Elija la carpeta de origen para el análisis haciendo clic en la opción Obtener ruta en el menú de origen y seleccione la carpeta que contiene las secuencias de imágenes que se van a analizar.
    3. Haga clic en la opción Obtener ruta en el menú de destino y seleccione la carpeta para guardar los datos después del análisis de imagen.
    4. Nombre los canales de modo que "canal de ADN" se corresponda con la tinción de ADN(por ejemplo,ADN o DAPI) y "canal NET" representa la tinción de proteína ligada a LA RED(porejemplo, NET, elastasa de neutrófilos) en las imágenes. Para el buen funcionamiento del software, (recomendado) nombre la carpeta que contiene los archivos de imagen de control como "control".
      Nota: El canal NET hace referencia únicamente a la tinción del marcador de proteína de gránulo enlazado a NET.
    5. Alimentar los metadatos de la imagen en el software haciendo clic en el botón Cargar información de imagen en el submenú Información de imagen.
    6. Seleccione el orden de canal correcto contenido en las imágenes en el submenú Orden de canal. Esta opción se ha incluido como a prueba de fallos para evitar discrepancias accidentales.
    7. Adquiera propiedades de imagen principal de los datos sin procesar y convierta las imágenes haciendo clic en el botón Preparar datos. Las imágenes convertidas aparecen en el submenú Tipo de ejemplo. Haga clic en el menú Tipo de ejemplo para mostrar y seleccionar todos los conjuntos de datos adquiridos para su análisis.
    8. Seleccione una imagen del submenú Tipo de muestra y haga clic en el botón Mostrar datos de imagen para mostrar las imágenes divididas en el canal DNA y NET respectivamente.
  2. Segmentación de células en el canal de ADN y el canal NET
    1. Seleccione el método de segmentación haciendo clic en el submenú Método en el canal de ADN y el canal NET.
      Nota: El método predeterminado de segmentación se establece en adaptativo y es la configuración recomendada. Otras opciones también están disponibles, incluyendo global, edge y Chan-Vese. También se incluye una opción de cuenca hidrográfica para ayudar a distinguir entre células o NET colocadas de cerca.
    2. Introduzca la pestaña Segmentación para segmentar las celdas de control primero en ambos canales haciendo clic en la opción Muestras de control de segmento.
    3. Seleccione PMA en el submenú de tipo de muestra y haga clic en la opción Lote (recomendado) para comenzar la segmentación de todas las imágenes incluidas en el conjunto de datos. Seleccione las imágenes en el menú de tipo de muestra y haga clic en el botón Mostrar datos de imagen para visualizar y validar las máscaras de imagen binarias (máscara de ADN y máscara NET) generadas después de la segmentación.
  3. Análisis de una sola celda de propiedades identificables
    1. Introduzca la pestaña de análisis y analice las muestras de control haciendo clic en el botón Determinar umbral.
    2. Cambie el tipo de muestra a PMA y haga clic en el botón Obtener propiedades de celda para completar el análisis de muestras estimuladas.
    3. Seleccione una imagen del submenú Tipo de muestra y haga clic en el botón Mostrar datos de imagen para mostrar la superposición y el número de celdas y celdas de formación de REDES en la imagen.
  4. Comparación de propiedades de celda para identificar celdas formadoras de NET
    1. Seleccione la muestra del submenú de tipo de muestra y haga clic en el botón Analizar NET para completar el análisis. Las imágenes individuales se pueden seleccionar en el submenú de tipo de muestra para el análisis o se puede analizar todo el lote de imágenes seleccionando la opción de lote (recomendado).
    2. Ajuste los criterios de NET manualmente para obtener resultados óptimos para una muestra determinada. Compare los NET identificados con las imágenes originales para evaluar la calidad de la identificación.
      Nota: Los criterios de NET se pueden utilizar en todas las imágenes del conjunto de datos. Cualquier cambio en los criterios de NET se aplica simultáneamente en todos los ejemplos de control. Esto limita la posibilidad de cualquier diferencia potencial que pueda surgir debido al exceso de ajuste de los parámetros de NET. La configuración de los criterios NET se puede ajustar según los requisitos del usuario. La relación entre las tasas de detección falsas y NETQUANT se ha explorado anteriormente13. Los rangos típicos para el aumento de área son de 2 u20124, la circularidad será de 0,7 u20120.9 y la relación ADN/NET será de 0,6 a 2,0.
    3. Inspeccione el resumen de datos en el submenú Datos de celda donde se muestra nifique el número de imágenes, el número de celdas por imagen y el porcentaje de NET por imagen.
      Nota: El porcentaje total de NET en todo el conjunto de datos se muestra mediante el "indicador NET". El recuento total de imágenes, el recuento de celdas, el porcentaje de NET en la muestra (NET%) y NETs% en el ejemplo de control se muestran en la tabla de estadísticas de resumen debajo del indicador NET. Recomendamos que los datos de control se notifiquen junto con los datos obtenidos de muestras estimuladas.
  5. Resultados de resultados
    1. Introduzca la pestaña Salida para seleccionar y ver las salidas de resultados.
    2. Explore y compare las diversas salidas de datos generadas a partir del análisis de control y PMA seleccionando la forma de la salida y haciendo clic en el botón Resultados de salida.
      Nota: Todos los datos generados después del análisis para controles y estimulaciones se guardan en la carpeta de análisis como se selecciona en el submenú de destino. Los datos se guardan en formatos .csv o .pdf.
    3. Inicie el archivo Method para obtener la versión del software y los criterios de NET utilizados para el análisis (que se incluirán en la sección de métodos con fines de publicación).
    4. Haga clic en la tabla De resultados para visualizar los puntos de datos individuales de una muestra determinada.
    5. Visualice la distribución del área NET y la relación DNA:NET en las muestras. La línea roja indica el valor de umbral en los gráficos.
    6. Determine el área NET frente a la forma del ADN haciendo clic en el archivo de distribución Bivariate.
  6. Carga de análisis anteriores y todos los pasos de lote
    1. Cargue la configuración de análisis previamente correcta en NETQUANT mediante el botón Cargar análisis anterior.
    2. Utilice el botón Lote todos los pasos incluidos en el menú Configuración para ejecutar los pasos 5-u201212(Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5) directamente para obtener la salida final.

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Representative Results

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5 x 105 neutrófilos/ml fueron sembrados sobre los cubreobjetos colocados en una placa de 12 pocillos y estimulados con PMA de 20 nM o sin estimular durante 150 min. Las muestras se teñían entonces utilizando anticuerpos primarios anti-humanos neutrófilos elastasa, anticuerpos conjugados secundarios con fluoróforo anticonejo de cabra y DAPI - un tinte fluorescentemente etiquetado que mancha el ADN (Ver la Tabla de Materiales para más detalles). A continuación, se adquirieron un mínimo de 5 imágenes utilizando un microscopio de epifluorescencia y un objetivo de 20 veces (NA a 0,75). Los datos de muestra utilizados para el análisis de pruebas en el manuscrito se pueden descargar siguiendo el enlace https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34 y haciendo clic en el icono del conjunto de datos de muestra.

Aquí se describe la capacidad del flujo de trabajo NETQUANT(figura 1) para cuantificar la formación de NET en un ejemplo determinado. La herramienta de software se puede instalar como una aplicación en MATLAB y se puede utilizar sin ningún conocimiento previo de esta interfaz. La GUI de NETQUANT se utilizó para analizar los conjuntos de datos como se describió anteriormente. Todas las imágenes utilizadas para el análisis por NETQUANT siempre se dejan inalteradas en el directorio primario. La GUI se divide en 4 pestañas: pestaña de configuración, pestaña de segmentación, pestaña de análisis y pestaña de salida de resultados. Los ejemplos se prepararon para su análisis en la ficha de configuración (Figura 2). El usuario define las rutas de acceso de archivo (1), las convenciones de nomenclatura (2), la información de imagen (3) y los pedidos de canal (4). La opción de preparar datos (5) garantiza que la conversión y la organización de forma estandarizada a lo largo del experimento. Los parámetros de segmentación se establecieron en la pestaña de segmentación(Figura 3) para identificar celdas individuales en las muestras (6). Las muestras de control siempre se segmentan primero (7) antes de la segmentación de muestras estimuladas (8). Todos los valores recomendados para la segmentación se indican en la pestaña de software. Las propiedades que definen las células de control no estimuladas se adquieren primero (9) y luego se comparan con las células estimuladas por PMA (10)(Figura 4). A continuación, los NET se analizan en las muestras en función de los criterios NET (11) y se muestran con el número total de imágenes, los recuentos de celdas y los NET correspondientes% en las muestras de control. Se seleccionaron los resultados de los datos finales del análisis y, a continuación, se visualizaron(figura 5). También se ha incluido en la ficha de configuración una opción para cargar y utilizar un análisis correcto anteriormente y una opción de proceso de todo lotes para procesar grupos de pasos 5-12(Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5).

Durante el análisis, se analizaron un total de 2619 células en el experimento. Los neutrófilos estimulados por PMA fueron capaces de generar 90.59% NETs (NETs%) en contraste con 25,87 NETs% en las muestras de control(Figura 6). El análisis de imágenes se completó en un plazo de 10 minutos desde el inicio del flujo de trabajo en el software. En resumen, NETQUANT ofrece una opción rápida y conveniente para cuantificar la formación de NET en imágenes que se han adquirido mediante microscopía de inmunofluorescencia.

Figure 1
Figura 1: Información general del flujo de trabajo NETQUANT. Las micrografías fluorescentes de neutrófilos humanos de doble tela con antielastasa y DAPI (ADN) se procesan y convierten primero. A continuación, las imágenes se segmentan, seguidas de un análisis de las propiedades de la célula, la detección de NET y las salidas de resultados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Opciones de la ficha Configuración en NETQUANT. Las rutas de acceso de archivo para los datasets que se van a analizar y las carpetas de salida de datos se introducen primero en la pestaña de configuración (1). A continuación, las convenciones de nomenclatura se rellenan para definir los nombres de canal y el nombre de la carpeta de control (2). La información de la imagen se adquiere (3) seguida de nombrar el orden de canal correcto (4). Se recomienda la configuración adecuada de todos los campos antes del procesamiento de los datasets (5) para la conversión de imágenes estandarizada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Parámetros de la pestaña Segmentación en NETQUANT. Los parámetros utilizados para la segmentación tanto del canal de ADN como del marcador de proteína NET incluyen el método, la sensibilidad, las iteraciones, el área mínima y la cuenca hidrográfica (6). Se recomienda el uso de un método de segmentación adaptativo y cuenca hidrográfica. Además, otros ajustes proporcionados como ajustes preestablecidos en el software se pueden utilizar sin modificaciones para la mayoría de los propósitos. Las muestras de control se segmentan primero (7) y luego se segmentan las muestras estimuladas (8). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Detección de NETs en la pestaña de análisis. Las propiedades celulares que definen las células no estimuladas se analizan y se adquieren a partir de muestras de control (9). Esto es seguido por el análisis de las propiedades celulares en las muestras experimentales (10). Los criterios de definición de NET (aumento del área celular, deformación nuclear (valores 0 a 1) y área de tinción de ADN/área de tinción de marcador esdern) se aplican tanto a las muestras de control como estimuladas para definir la formación de REDES (11). La cantidad de NETs, el recuento total de celdas y el número de imágenes en ambas muestras se muestra en la sección de estadísticas de resumen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Visualización de archivos de salida de resultados en NETQUANT. Los resultados obtenidos después del análisis pueden ser seleccionados por el usuario individual. Las salidas de resultados que se pueden generar con NETQUANT incluyen un archivo .csv que contiene puntos de datos de celdas individuales. Además, en el análisis también se generan histogramas que representan la distribución de células que experimentan un aumento en el área NET (celular), la deformación del núcleo debido a la descondensación de cromatina y la relación ADN:NET-marcador, y un gráfico 3D del área NET frente a la deformación nuclear. Todas las salidas se guardan automáticamente en la carpeta de análisis elegida en la pestaña de configuración como archivos .csv, .pdf y .txt. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Análisis de la formación de NET. (A) El NETs%, el recuento total de células y el número de imágenes del conjunto de datos de prueba, tal como se observa en las estadísticas resumidas de los controles y los neutrófilos estimulados por PMA (20 nM). (B) Una comparación lado a lado de histogramas que representa el aumento en el área, la deformación nuclear (valores 0 a 1) y la relación ADN/NET en muestras de control y estimuladas por PMA. La línea roja en los valores de umbral de histogramas para los criterios de definición de NET. (C) Comparación del gráfico 3D del área NET frente a la deformación nuclear generada por el análisis NETQUANT de muestras de control y estimuladas por PMA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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La formación NET es una adición relativamente reciente al diverso armamentario de neutrófilos4 y ha habido una notable oleada de interés para estudiar la implicación de los NETs en una amplia gama de áreas de investigación5,7,14,15. La adquisición de imágenes mediante microscopía de inmunofluorescencia y la cuantificación posterior basada en imágenes es un método ampliamente utilizado para cuantificar las NET. Este enfoque tiene la ventaja de ser capaz de detectar células que forman NETs a un nivel de una sola célula y, por lo tanto, puede reducir mejor la señal de fondo. Los métodos manuales de cuantificación pueden ser exhaustivos, lentos y estar sujetos a sesgos del usuario. Existen algunas opciones semiautomáticas que han proporcionado a los usuarios un análisis fiable11,12. Sin embargo, pueden requerir una habilidad técnica significativa para el funcionamiento o pueden requerir varios pasos manuales para la cuantificación. Esto es un desafío especialmente para los usuarios no experimentados anteriormente. En una publicación reciente, se ha utilizado un método computacional totalmente automático para cuantificar la formación de REDES mediante imágenes basadas en citometría de flujo, así como secciones de tejido delgado. Sin embargo, sólo se puede aplicar a escenarios específicos y también requiere un conocimiento significativo de la programación para la operación16. Actualmente, el software de cuantificación de imágenes totalmente automatizado dedicado a la cuantificación general de NET que es fácil de usar y posee capacidad de resolución de una sola célula no está disponible para los investigadores.

Aquí presentamos NETQUANT, un software de cuantificación de NET totalmente automatizado que está disponible de forma gratuita. Este software ha sido desarrollado específicamente para cuantificar la formación de NET con alta rigurosidad utilizando imágenes de microscopía de inmunofluorescencia, y con la capacidad de realizar análisis y cuantificación de una sola célula. Además de considerar el aumento en el área de tinción bajo NETs, NETQUANT también tiene en cuenta la deformación nuclear debido a la descondensación de cromatina y un aumento en la colocalización de proteínas de marcador de ADN/NET para definir la formación de NET en una muestra dada. Esto permite distinguir las células que sólo han sido sometidas a descondensación nuclear de las células que han sido sometidas a una formación completa de NET. Los criterios de definición de NET incluidos en el algoritmo NETQUANT permiten una mayor rigencia en la cuantificación en comparación con muchos enfoques de cuantificación anteriores que se basan únicamente en un aumento en el área de tinción de NET.

La interfaz gráfica de usuario está destinada a ser fácil de usar y fácil de usar. Cada paso del análisis está numerado para garantizar que los usuarios puedan seguir el flujo de trabajo. Una de las características clave proporcionadas en el software es la herramienta de segmentación / pestaña que permite a NETQUANT realizar análisis de una sola celda en imágenes, que es la mayor sensibilidad posible que se puede lograr. Esto hace de NETQUANT una de las pocas opciones disponibles que pueden realizar la cuantificación de una sola célula para cuantificar la formación de NET. Además, Mohanty y otros han demostrado que el software también puede adaptarse a las variaciones de imagen y a los parámetros de adquisición13. Debido a la flexibilidad ofrecida en los criterios de segmentación y definición neta, se pueden acomodar las variaciones de donantes y placas. NETQUANT puede manejar grandes conjuntos de datos adecuadamente y se puede utilizar para un análisis de imágenes fiable de alto rendimiento13.

Aunque encontramos que el flujo de trabajo produce resultados sólidos de varios donantes, se recomienda que el usuario decida los valores adecuados en función de las muestras individuales. En teoría, los datos generados después del análisis también podrían verse influenciados por la alta densidad celular. También, la agregación excesiva de NETs puede dar lugar a la reducción del número de NET detectados. Esto se debe a que el algoritmo de segmentación no puede distinguir los NET enredados en eventos independientes. Un problema similar con la segmentación también puede surgir cuando los neutrófilos no estimulados están atrapados dentro de los NET. Actualmente se recomienda el uso de imágenes adquiridas en 20X y 40X, ya que el rendimiento de NETQUANT no se ha probado en otros niveles de ampliación. Aún así, siempre y cuando el tamaño del píxel se establezca correctamente (ya sea manualmente o a partir de metadatos en la sección de información de la imagen de carga), el software debe adaptar los cálculos de área con precisión a aumentos superiores o inferiores. La tinción adecuada del ADN y del marcador del gránulo es un factor crítico. Una mancha deficiente o una mala calidad de imagen en cualquiera de los canales darán como resultado resultados poco óptimos. Por lo tanto, se recomienda que el usuario debe determinar un número de célula adecuado, procedimiento de tinción y título de anticuerpos para producir resultados óptimos.

NETQUANT sólo se ha probado en NETs derivados de neutrófilos humanos in vitro. Los NET de otras especies también se pueden cuantificar con correcciones adecuadas en los criterios. La cuantificación NET se puede realizar en muestras fijas en portaobjetos de cámara o placas inferiores de vidrio multipozo. Las imágenes de alta calidad de muestras manchadas para marcadores de ADN y proteína de gránulo son fundamentales. NETQUANT también se puede adaptar para cuantificar otras formas de trampas extracelulares (ET)-osis, por ejemplo, como se exhibe por los eosinófilos. Actualmente no es posible cuantificar las ET en no granulocitos como los monocitos, ya que el área de tinción de gránulos citoplasma según sea necesaria para el algoritmo de segmentación.

En conclusión, NETQUANT es una herramienta sencilla, automática y rápida para identificar con precisión la formación de NET que permite el análisis y la cuantificación de una sola célula. Creemos que este software puede reducir la barrera para realizar la cuantificación automática de NET y que la comunidad de investigación se beneficiará de esta aplicación disponible de forma gratuita.

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Disclosures

TM y PN tienen una patente pendiente relacionada con los algoritmos utilizados en NETQUANT.

Acknowledgments

El trabajo fue financiado por la Fundación Crafoord (TM y PN), la beca sueca de investigación gubernamental (PN, TM), el Consejo de Investigación Sueco (PN) y la Fundación Groschinsky (TM, PN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer Heparinised plastic tubes BD Biosciences 367885
Lymphoprep Axis-Shield 114547
RPMI-1640 with L-Glutamine Gibco 11835-030
50mL conical flasks Sarstedt 62.547.004
15mL conical flasks Sarstedt 62.554.002
12-well Tissue culture plates Falcon 10626491
#1 Coverslips 10mm Menzel Glaser CS10100
Glass slides Menzel Glaser 631-0098
Primary anti-human elastase DAKO DAKO rabbit 1373, contract immunization
Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit Life technologies A-11072, A-11070
PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI Life technologies P36930 Mounting medium
Goat serum Sigma-Aldrich G9023
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich 79346
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Nikon Ti-E Epifluorescence microscope Nikon
CCD camera Andor Zyla
Plan Apochromat 20x, 40x objectives Nikon
Windows 10 Microsoft Operating system
macOS Sierra 10.12 Apple Operating system
MATLAB Mathworks

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Cuantificación automatizada basada en imágenes de trampas extracelulares de neutrófilos mediante NETQUANT
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Mohanty, T., Nordenfelt, P. Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT. J. Vis. Exp. (153), e58528, doi:10.3791/58528 (2019).More

Mohanty, T., Nordenfelt, P. Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT. J. Vis. Exp. (153), e58528, doi:10.3791/58528 (2019).

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