Summary
Aqui apresentamos um protocolo testado e comprovado para a purificação do cloroplasto complexos de importação de proteínas (complexo de TIC-TOC) usando a torneira-tag. O protocolo de afinidade-isolamento de uma etapa potencialmente pode ser aplicado a qualquer proteína e ser usado para identificar novos parceiros de interação por espectrometria de massa.
Abstract
Biogênese cloroplasto requer a importação de milhares de proteínas codificadas núcleo para o plastídeo. A importação destas proteínas depende do translocon no exterior (TOC) e membranas de cloroplastos internas (TIC). Os complexos TOC e TIC são multiméricas e provavelmente contêm componentes ainda desconhecidos. Um dos principais objetivos no campo é estabelecer o inventário completo de componentes TOC e TIC. Para o isolamento de complexos de TIC-TOC e a identificação de novos componentes, o receptor preprotein que toc159 tem sido modificado N-terminal pela adição da marca de purificação (torneira) de afinidade em tandem resultando em TAP-TOC159. A TAP-tag destina-se a dois passos de purificação da afinidade sequencial (daí "afinidade em tandem"). A TAP-tag usada nestes estudos consiste de um domínio N-terminal IgG-ligação derivado de proteína de Staphylococcus aureus , um (ProtA) seguido por um calmodulina-ligação do peptide (CBP). Entre essas marcas de dois afinidade, um tabaco etch clivagem de protease do vírus (TEV) site foi incluído. Portanto, protease do PEV pode ser usado para a eluição suave de complexos contendo TOC159 após a ligação de IgG grânulos. O protocolo apresentado aqui, a segunda etapa de purificação de calmodulina-afinidade foi omitida. O protocolo de purificação começa com a preparação e solubilização das membranas celulares totais. Após o tratamento de detergente, as proteínas de membrana solubilizado são incubadas com grânulos de IgG para o immunoisolation de torneira-TOC159-contendo complexos. Mediante vinculação e lavagem extensa, TAP-TOC159 contendo complexos são clivados e liberados os grânulos de IgG usando a protease TEV, pelo qual o domínio de S. aureus IgG-ligação é removido. Mancha de isolados ocidental TOC159 contendo complexos podem ser usados para confirmar a presença de proteínas TOC e TIC conhecidas ou suspeitas. Mais importante, os complexos contendo TOC159 têm sido utilizados com sucesso para identificar novos componentes dos complexos TOC e TIC por espectrometria de massa. O protocolo que apresentamos potencialmente permite o isolamento eficiente de qualquer proteína de membrana-limite complexo para ser usado para a identificação dos componentes ainda desconhecidos por espectrometria de massa.
Introduction
As plantas dependem de cloroplastos para fotossíntese e crescimento photoautotrophic1. A grande maioria das proteínas do cloroplasto é codificada no núcleo, sintetizada no citosol e importada para o cloroplasto através dos complexos TIC e TOC no envelope membranas2. O núcleo do complexo do TOC consiste no canal de proteína-realização de Toc75 e dos dois receptores GTPases Toc33 e Toc1593,4,5. TOC159 é essencial para a biogênese de cloroplastos e Medeia a acumulação maciça de proteínas associadas a fotossíntese6. O complexo TIC consiste no canal de proteína-realização de TIC20, bem como TIC110 e TIC407,8. Recentemente, uma translocação de proteínas 1MD complexa na membrana interna do envelope foi isolada e continha componentes inéditas9, um dos quais era TIC56. Estamos isolados recentemente co TIC56 a 1 MDA complexo usando o protocolo de purificação de afinidade de torneira-TOC159. Os dados indicaram uma sobreposição estrutural entre os complexos TOC/TIC "canônicos" e o 1 complexo MDa10. Anteriormente desconhecidos componentes como KOC1 também foram identificados como novos parceiros de interação dos TOC e TIC complexos usando o TAP-método descrito aqui10,11.
Assim, a purificação de torneira-marca é um método eficiente para o isolamento de complexos de proteínas e a identificação de parceiros interagindo por subsequente análise de espectrometria de massa12. A TAP tag consiste em duas repetições de ligação de IgG separadas um calmodulina-ligação do peptide (CBP) por um tabaco etch local de clivagem de protease de vírus (TEV). O método original, que consiste de uma etapa de purificação de IgG-afinidade seguido por clivagem do PEV e cromatografia de afinidade-calmodulina subsequentes permitido nativa purificação da proteína altamente puro e grandes complexos13,14 . Nós temos o procedimento simplificado e demonstrou que os complexos de proteína que contêm TOC159 também podem ser purificados com eficiência usando somente a etapa de purificação de IgG-afinidade seguida de TEV-clivagem por eluição15. Em nossa experiência, a omissão da etapa de calmodulina-afinidade resultou em rendimentos mais elevados e, portanto, pode ser apropriada para proteínas de baixa abundância.
Em suma, temos engenharia transgênica estável a. thaliana linhas expressando TAP-TOC159 no ppi2 (toc159 KO mutante) fundo e estabeleceu como uma fonte confiável para a purificação de complexos de TIC-TOC. O protocolo para o isolamento do complexo TIC-TOC começa com a homogeneização do material vegetal em um buffer livre de detergente. Após a centrifugação, o sobrenadante é Descartado. A pelota que contém a fração do total da membrana é solubilizada usando um buffer contendo detergente. Após uma etapa de ultracentrifugação, o sobrenadante contendo complexos de TIC-TOC solubilizados é aplicado à IgG-resina para purificação da afinidade. Depois de várias etapas de lavagem, eluição é efectuada utilizando um buffer contendo protease TEV para seletivamente cleave a jusante dos domínios de IgG-vinculação e suavemente nativo TOC159 contendo complexos de lançamento. O eluato de PEV pode ser analisado diretamente pela mancha ocidental ou espectrometria de massa para identificar os parceiros de interação de TOC15910,11,15. O método também tem sido usado para identificar modificações borne-translational de TOC15915. No futuro, nativo TOC159 contendo complexos podem ser utilizados para estudos estruturais usando microscopia de cryoelectron.
Protocol
1. preparação das plantas de Arabidopsis
- Preparar 1 L de metade da força de Murashige e Skoog (MS) médio incluindo vitaminas com 1% de sacarose e ajustar o pH a 5.7 com hidróxido de potássio (KOH). Adicionar 0,8% de phytoagar e autoclave por 20 min a 120 ° C.
- Despeje 75 mL de meio MS por placa de Petri (diâmetro de 14,5 cm, altura 3 cm) e permitir que a solidificação por 1h.
- Adicionar 30 mg de Arabidopsis thaliana sementes para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e superfície esterilizar com etanol a 70% (v/v) contendo 0,05% (v/v) Triton X-100 por 5 min, seguido por 100% de etanol (v/v) por 10 min. Retire o etanol.
- Transferi as sementes para o papel de filtro estéril para secar. Polvilhe as sementes esterilizadas uniformemente em uma placa de MS (cada genótipo requer placas de pelo menos 8-10) e cada placa com fita cirúrgica do selo.
- Incube as placas a 4 ° C durante dois dias no escuro para sincronizar a germinação das sementes. Transferência para uma câmara de crescimento com o seguinte ciclo de luz: 8 h de 120 µmol m− 2 s− 1 luz e 16 h de dark 22-20 ° c.
2. preparação dos grânulos de HsIgG Agarose
- Suspender contas de agarose ativada por CNBr (4 g) em 100 mL de HCl de 1 mM e incube por 30 min à temperatura ambiente.
- Transferir os grânulos de agarose em um filtro de vidro sinterizado, lavar sob vácuo com 100 mL de HCl a 100 mM e repita 2 - 3 vezes.
Nota: Precool a solução de lavagem de 4 ° C. - Ressuspender o grânulos de agarose em 1 mL de HCl frio de 100 milímetros e transferir para um tubo de centrifuga conico de 50 mL. Lavar o filtro de vidro sinterizado com 3 mL de HCl a 100 mM e transferir o líquido para o tubo mesmo.
- Girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante com uma pipeta.
Nota: Não decante o tubo. - Resuspenda as gotas em 50 mL de tampão de ligação (tabela 1); Misture rapidamente e então giram em 400 × g por 5 min a 4 ° C.
- Dissolver 50 mg de liofilizado Homo sapiens IgG (Hs-IgG) em 10 mL de tampão de ligação, misture-os delicadamente os grânulos de agarose e incubar em agitador rotativo durante a noite a 4 ° C.
- Girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante com uma pipeta.
- Lave os grânulos de IgG-agarose com 50 mL de acoplamento buffer e girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C.
- Resuspenda os grânulos de IgG-agarose com 50 mL de tampão de bloqueio (tabela 1) e girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Repeti uma vez.
- Resuspenda IgG-agarose grânulos em 50 mL de tampão de bloqueio, gire a mistura por 2 h no RT e girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C.
- Remover o sobrenadante e ressuspender os grânulos de IgG-agarose em 200 mL de tampão de ligação de NaCl (tabela 1).
- Para bloquear qualquer restantes grupos de CNBr do cross-linking, lave os grânulos de IgG-agarose com 100 mL de HCl glicina 0,1 M, pH 2.8. Girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante. Lavar com 0,2 M glicina-HCl, pH 2.8, girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante. Finalmente, lave os grânulos de IgG-agarose com 200 mL de água ultrapura.
- Lave os grânulos de IgG-agarose com 200 mL de água ultrapura e, em seguida, 200 mL de tampão PBS (tabela 1).
- Resuspenda os grânulos de IgG-agarose em 20 mL de tampão PBS com 0.01% NaN3 (azida sódica) e armazenar a 4 ° C.
3. isolamento e solubilização da fração de membrana
- Moa 10 g de plântulas da . thaliana três semanas de idade em nitrogênio líquido, usando um pilão frio com areia.
- Adicionar 20 mL de frio retificadora Reserva (tabela 1) 10 g de tecido do chão, misture bem e descongele no gelo.
- Filtre o homogenate através de duas camadas de material de filtração rápida em um tubo de centrifuga conico de 50mL. Mergulhe o material de filtração rápida com moagem buffer antes da filtragem.
- Centrifugador do filtrado durante 10 minutos a 1.500 × g a 4 ° C e transferência o sobrenadante para um tubo de centrifuga conico 50ml refrigerados, repita o mesmo passo mais uma vez e recolher o sobrenadante. Uma amostra de 200 µ l da fração"total" de reter e armazenar a-80 ° C para posterior análise
- Transferir o sobrenadante para tubos de se frio 38,50 mL e superior a 35 mL com buffer moagem a frio. Centrífuga para 1h a 100.000 × g a 4 ° C em uma se.
- Transferi o sobrenadante para um tubo de centrifuga conico de 50 mL. Manter uma amostra de 200 µ l da "fração solúvel" e loja a-80 ° C para posterior análise.
- Ressuspender o pellet verde usando um homogeneizador de teflon de vidro, no buffer de moagem. Centrifugue durante 1 h a 100.000 × g a 4 ° C em um se e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender o verde em 18,75 mL de 1x Buffer usando um homogeneizador de teflon vidro de moedura e adicionar 9,375 mL de 1x tampão de moagem.
- Adicionar 9,375 mL de solução de x solubilisation 4 (tabela 1) (contendo o detergente TX-100) para dar a 37,5 mL e incubar durante 30 min num "agitador rotativo" a 4 ° C.
- Centrífuga para 1h a 100.000 × g a 4 ° C em uma se. Transferi o sobrenadante para um tubo de centrifuga conico de 50 mL. Manter uma amostra de 200 µ l do sobrenadante (futuro "fração de carga") e loja a-80 ° C para posterior análise.
- Resuspenda o pellet em 37,5 mL de tampão de moagem. Manter a amostra da parte insolúvel e loja a-80 ° C
4. imunoprecipitação
- Equilibrar a 100 µ l de resina embalada IgG-agarose no tampão A (tabela 1) e girar a 100 × g por 5 min a 4 ° C.
- Remover o sobrenadante e ressuspender a resina de IgG-agarose em 100 µ l de tampão A 4 ° c.
- Transferir a resina de IgG-agarose lavada para a 37,5 mL de membranas solubilizadas e incubar durante uma noite num agitador rotativo em um tubo de centrifuga conico de 50 mL a 4 ° C.
- Sedimentos o IgG-agarose da resina em 100 × g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante com uma pipeta. Manter uma amostra de 200 µ l da "fluir" e armazenar a-80 ° C para posterior análise.
- Lave a resina de IgG-agarose em 37,5 mL de tampão A e incubar durante 10 minutos num agitador rotativo.
- Sedimentos a resina de IgG-agarose em 100 × g por 5 min a 4 ° C, remover o sobrenadante com uma pipeta, adicionar 5 mL de moagem tampão A um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugar 100 × g, 4 ° C, 5 min. reter um 200 µ l da amostra da "Lavagem de 1" e armazenar a-80 ° C para uma análise posterior.
- Repetir os 5 mL passo três vezes com Buffer A. de lavagem
- Realizar as duas últimas etapas de lavagem sem os inibidores (NaF, inibidor de Protease e PMSF)
Nota: Inibidores já não são necessários nesta fase e omitidos para reduzir o custo. Manter uma amostra de 200 µ l da última lavagem etapa "final lavagem (W6)" e loja a-80 ° C para posterior análise. - Transferir a resina de IgG-agarose para uma coluna de rotação 500 µ l com um 35 µm filtro e lave os grânulos duas vezes com 300 µ l de tampão de eluição do PEV (tabela 1) (não contendo AcTEV) para o equilíbrio. Feche a coluna de rotação.
- Adicione 300 µ l de tampão de eluição de TEV contendo 50 unidades (10 µ l) de AcTEV. Prepare a mistura em um tubo antes de adicionar à resina.
- Incubar a coluna de rotação com grânulos em um thermomixer a 16 ° C, 350 rpm por 2 h. inverter a coluna suavemente várias vezes cada 30 min.
- Abra a coluna giro, colocá-lo em um novo tubo limpo 1,5 mL e a rotação em 100 × g por 5 min a 4 ° C, para recolher o eluato.
- Seca (por exemplo) 10% (v/v) da amostra eluted (~ 25 µ l) em um evaporador centrífugo e usar para espectrometria de massa ou outra uma análise mais aprofundada.
- Alíquota o eluato restante (~ 275 µ l) dividido em onze centrífuga 1,5 mL tubos (25 µ l cada), secar em um evaporador centrífugo e armazenar a-80 ° C.
- Analise as amostras mantidas durante todo o procedimento, bem como os eluídos pelo padrão de SDS-PAGE seguido immunoblotting. Para a preparação da amostra, precipitado de 50 µ g do Total (T), carga (L), fluxo (FT), lavar 1 (W1) e 200 µ l de lavagem 6 (W6) pela extração de clorofórmio/metanol16.
- Adicione 10 µ l de 2x do amortecedor do carregamento de SDS-PAGE (tabela 1) para as amostras precipitadas e 25 µ l de amostra seca eluted. Vórtice e ferver durante 10 minutos a 95 ° C, em um bloco de calor.
- Analisar Total (T), carga (L), fluxo (FT) através de lavagem 1 (W1), lavar 6 (W6) e eluição (E) pelo immunoblotting utilizando anticorpos anti-TOC159 para determinar a eficiência do processo de isolamento.
Representative Results
Descrevemos aqui um protocolo para a purificação de uma proteína de envelope de cloroplasto TAP-tag complexa de transgénicos a. thaliana plantas. Como mostrado na Figura 1A, plantas expressando a 35S:NTAP-TOC159 construção foram usadas para isolar este complexo enquanto plantas expressando a construção de 35S:NTAP foram usadas como um controle. Figura 1 B mostra as etapas detalhadas da purificação de complexos de proteínas TAP-TOC159 seguido por espectrometria de massa para permitir a identificação das proteínas de interação. A análise de immunoblot (Figura 2, lado direito) confirma que isolado TAP-TOC159 interage com TOC75 e TOC33 do complexo TOC. A quinase de membrana externa de cloroplasto KOC1 conhecido para fosforilar TOC159 co também isolado com o complexo de torneira-TOC159 (Figura 2B, lado direito). A presença de TIC110 revela que o complexo isolado de torneira-TOC159 também contém os componentes do complexo TIC. O anticorpo contra uma proteína de plastoglobule não relacionada com a importação de proteínas FBN1A não reconheceu o complexo TAP-TOC159, indicando a ausência de contaminações. No controle negativo, proteína NTAP immunoprecipitated não co isolar com qualquer das proteínas TIC-TOC (Figura 2, lado esquerdo) e confirma a especificidade da purificação TAP-TOC159.
Figura 1 . Esquema do processo de purificação da afinidade e construções. (A). O 35S:NTAP-TOC159 construção, codificação NTAP-TOC159 estàvel foi expressa em Arabidopsis thaliana. Plantas de controlo negativo expressaram a construção de 35S:NTAP, a TAP-tag sozinha de codificação. B. O protocolo de purificação de afinidade sábio passo consiste de membrana isolamento e solubilização, IgG agarose imuno-purificação, lavagens, clivagem de protease TEV e eluição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Purificação de afinidade em tandem da proteína TOC159. N-terminal com a TAP-tag TOC159 foi purificado de NTAP-TOC15: plantasppi2 Arabidopsis e torneira proteína purificada a partir de plantas de torneira: WT foi usada como um controle negativo. Total de proteínas de membrana de extratos (T), solubilizados proteína = fração de carga (L), fluxo (FT), primeiro e último lavar fracções (W1 e W6) e 10% do eluato TEV foram analisados pela mancha ocidental. A membrana foi sondada com os anticorpos contra o TOC159 (AT4G02510), TOC75 (AT3G46740), TOC33 (AT1G02280), KOC1 (AT4G32250), TIC110 (AT1G06950) e FBN1A (AT4G04020). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tabela de buffers | ||
| Tampão de ligação | NaHCO3 Ajustar para pH 8,5 ajustar o pH com 0,1 M Na2CO3 |
100 mM |
| Bloqueio de Buffer | Tris-HCl Ajuste o pH 8 com HCl. |
100 mM |
| Tampão PBS | Na2HPO4 KH2PO4 NaCl KCl Ajuste o pH 7.3 com HCl. |
4,3 mM 1.4 mM 137 2.7 |
| NaCl, tampão de ligação | Tampão de ligação NaCl |
1 M |
| 2 x Buffer de moagem | Tris-HCl, pH 7,5 com HCl. NaCl NaF PMSF Coquetel de inibidor de protease de planta |
100 mM 200 mM 5 mM 1 mM 0,20% |
| 4 x solução de solubilização | Glicerol Triton-X100 |
40% 3% |
| Tampão A | 2 x Buffer de moagem 1 x Buffer de moagem 4 x solução de solubilização |
100 ml 50 ml 25 ml 25% |
| Eluição de TEV Buffer | Tris-HCl, pH 8 com HCl EDTA, pH 8 com HCl NaCl Glicerol Triton-X100 DTT |
50 mM 0.5 mM 100 mM 10% 0,75% 1 mM |
| Buffer de 2 x carregamento SDS-PAGE | Tris-HCl pH 6,8 com HCl SDS Glicerol Azul de bromofenol DTT |
0,1 M 4% 20% 0,20% 0,2 M |
Tabela 1. Receitas do amortecedor.
Discussion
Temos demonstrado que uma única etapa de purificação de marca de torneira é um método eficiente e específico para a purificação do complexo Arabidopsis TIC-TOC. Embora a TAP-tag permitiria duas etapas sucessivas de purificação (IgG-seguido de purificação da afinidade de calmodulina depois TEV protease-clivagem), acreditamos que, em muitos casos, o primeiro passo de afinidade, seguido por clivagem de protease TEV serão suficiente. Nosso alvo, TOC159, é baixo o abundante e a inclusão da segunda etapa calmodulina-afinidade diminuída excessivamente o rendimento de proteína, que foi a principal razão para excluí-lo do nosso presente protocolo. O PEV-eluição em si é uma etapa de purificação altamente específico e suave que só vai liberar o alvo com a TAP-tag juntamente com os parceiros de interação associado enquanto contaminar as proteínas degola não especìfica para a resina de IgG permanecerá lá. Assim, em combinação com a etapa de IgG-afinidade, a eluição de TEV resulta em uma purificação suficientemente eficiente para nosso e provavelmente muitos outros fins.
Cuidado deve ser tomado que a construção com a TAP-tag é totalmente funcional em vivo. TOQUE de marcação poderia ter efeitos potencialmente deletérios na atividade da proteína, a estabilidade ou a localização. TOC159 consiste em três domínios, o domínio de ácido N-terminal, o domínio de GTP-ligando central e domínio C-terminal da membrana, que ancora TOC159 no exterior cloroplasto membrana2. Para evitar potenciais interferências com inserção de membrana, nós fundidos a TAP-tag para o N-terminal da TOC159. Fusão de N-terminal é bastante a exceção que a regra. Muitas proteínas contêm informações de direcionamento de N-terminal e, portanto, devem por a tag no C-terminal. Estamos garantido que TOC159 é funcional na vivo pela complementação do mutante ppi2 (um mutante de albino falta TOC159) com torneira-TOC159. O resgate do verde, o fenótipo tipo selvagem indicou que a TAP-TOC159 era funcional15.
O protocolo de purificação foi usado para identificar novos parceiros de interação de TOC159, que incluiu KOC1 e TIC5610,11. No total, cerca de 30 proteínas foram associadas com o complexo, sugerindo que a interação nova parceiros serão isolados e caracterizados em um futuro próximo. Enquanto é altamente recomendável a TAP-tag para purificação complexa, gostaríamos ainda de salientar que versões adicionais para aquele apresentado aqui existem e podem ser muito útil para algumas aplicações.
Disclosures
Os autores declaram não interesses concorrentes.
Acknowledgments
O trabalho foi apoiado por concessões do Swiss National Science Foundation (31003A_156998 e 31003A_176191) e da Universidade de Neuchâtel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaHCO3 | PanReac AppliChem | A0384 | |
| Tris | Biosolve | 0020092391BS | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7909 | |
| KH2PO4 | PanReac AppliChem | A2946 | |
| NaCl | PanReac AppliChem | A2942 | |
| NaF | Sigma | S1509 | Toxic |
| PMSF | PanReac AppliChem | A0999 | Toxic |
| Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | |
| Glycerol | PanReac AppliChem | A0970 | |
| Triton X100 | Roche | 10789704001 | |
| Glycine | PanReac AppliChem | A1067 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043 | |
| Dithiothreitol (DTT) | PanReac AppliChem | A1101 | |
| SDS | PanReac AppliChem | A0675 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
| HCl | VWR | 20252-290 | Corrosive |
| Sucrose | PanReac AppliChem | A3935 | |
| Murashige and Skoog medium with vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| Phytoagar | Duchefa Biochemie | P1003 | |
| Petri plate | Greiner Bio-one | 639102 | |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706 | |
| Ethanol | Fisher chemical | E/0600DF/15 | |
| Filter paper | Whatman | 10311804 | |
| Surgical tape | 3M | 1530-1 | |
| CNBr-Activated agarose beads (sepharose 4B) | GE Healthcare | 17-0430-01 | |
| Sintered glass filter | DURAN | 2515703 | |
| Centrifuge tube 50 mL | TPP | 91050 | |
| Purified immunoglobulin G (HsIgG) | MP Biomedicals | 855908 | |
| Rotating shaker | IKA | 4016000 | |
| NaN3 (sodium azide) | Sigma | 71290 | Toxic |
| Quick filtration material (Miracloth) | Merk-Millipore | 475855 | |
| Ultracentrifube XNP-80 | Beckman Coulter | A99839 | |
| Rotor SW 32 Ti | Beckman Coulter | 369650 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Glass teflon homogenizer (Potter) | Wheaton | 357426 | |
| Spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M1003 | |
| Filter 35µm for spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M513515 | |
| AcTEV | Invitrogen | 12575-015 | |
| Centrifugal evaporator (Speed Vac) | Eppendorf | 5305000100 | |
| FBN1A(PGL35) antibody | AgriSera | AS06 116 | RRID:AB_2247012 |
| Sand, Fontainebleau | VWR | 27460.295 |
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