Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Underliggende Gut hormon sekretion ved hjælp af den isolerede mekanismer perfunderet rotte tyndtarmen

Published: February 26, 2019 doi: 10.3791/58533
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Sciences and NNF Centre for Basic Metabolic Research, The Panum Institute, University of Copenhagen

Summary

Vi præsenterer her, en kraftfuld og fysiologiske model for at studere de molekylære mekanismer bag gut hormon sekretion og intestinale absorption — isoleret perfunderet rotte tyndtarmen.

Abstract

Tarmen er de største endokrine organ i kroppen, producerer mere end 15 forskellige peptid hormoner, der regulerer appetit og mad indtagelse, fordøjelse, næringsstof absorption og distribution og post prandial glukose udflugter. Forstå de molekylære mekanismer, der regulerer gut hormon sekretion er grundlæggende for at forstå og oversætte gut hormon fysiologi. Traditionelt, de underliggende gut hormon sekretion mekanismer er enten undersøgt in vivo (på forsøgsdyr eller mennesker) eller ved hjælp af gut hormon-secernerende primære slimhinde celle kulturer eller cellelinjer. Her introducerer vi en isoleret perfunderet rotte tyndtarmen som en alternativ metode til at studere gut hormon sekretion. Dyder af denne model er, at det bygger på intakt tarmen, hvilket betyder, at det indeholder de fleste af de fysiologisk vigtige parametre ansvarlig for udskillelsen i in vivo-undersøgelser, herunder slimhinde polarisering, paracrine forhold og ruter i perfusion/stimulus eksponering. Desuden, og i modsætning til in vivo-undersøgelser, tyndtarmen isolerede perfunderet rat giver mulighed for næsten fuldstændig eksperimentelle kontrol og direkte vurdering af sekretion. I modsætning til in vitro-undersøgelser er det muligt at studere både omfanget og dynamikken af sekretion og at behandle vigtige spørgsmål, såsom hvad stimuli forårsager udskillelsen af forskellige tarmhormoner, fra hvilken side af tarmen (luminale eller vaskulære) er sekretion stimuleres, og at analysere i detaljer molekylære sensorer bag den sekretoriske svar. Derudover er forberedelse en kraftfuld model for studiet af intestinale absorption og detaljer om dynamikken i intestinal absorption, herunder de ansvarlige transportvirksomheder.

Introduction

Tarmen er de største endokrine organ i kroppen, producerer mere end 15 forskellige peptid hormoner, der regulerer næringsstof absorption og næringsstof disposition, intestinal vækst og modulere appetit1. Tarmhormoner derfor involveret i mange grundlæggende fysiologiske processer, og at forstå disse mønstre af sekretion og molekylær detaljer, der styrer udskillelsen af de respektive hormoner er således vigtige for vores grundlæggende fysiologiske forståelse og for adressering translationel aspekter af gut hormon handlinger; men hvordan kan man studere de underliggende gut hormon sekretion molekylære sensing mekanismer? I almindelighed, hormon sekretion kan studeres i intakt organismer (mennesker eller forsøgsdyr), fra isolerede gut præparater eller fra gut hormon-secernerende primære cellekulturer eller udødeliggjort celle kulturer2,3, 4 , 5 , 6. vores foretrukne model er isolerede perfunderet rotte tyndtarmen, som er en fysiologisk relevante model, der tillader sekretion af tarmhormoner studeres i detaljer med optimal tidsopløsning (sekretion satser kan fastsættes med enhver tid base ned til andet), og resultaterne er sandsynligvis overføres til en in vivo situation7. Her, vi leverer en detaljeret protokol om, hvordan du udfører denne procedure, men først vil vi diskutere andre metoder til at studere gut hormon sekretion, herunder fordele og begrænsninger af disse modeller i forhold til den isolerede perfunderet rotte tyndtarmen.

Hvis man ønsker at fastslå, om en bestemt sammensatte regulerer udskillelsen af visse tarmhormoner, er undersøgelser hos mennesker det ultimative mål. Således, hvis et stof, der viser store effekter på sekretion af én eller flere tarmhormoner i gnavere (i vivo eller perfusions) eller fra hormon hemmelig celler (cellelinjer eller primærelementer), denne effekt er kun relevante for medicin og human fysiologi hvis det kan bekræftes hos mennesker. Men der er klare grænser for typen af undersøgelser, der kan udføres på mennesker, og in vivo-undersøgelser på forsøgsdyr er derfor ofte den næstbedste løsning for sådanne undersøgelser. Mus og rotter er de hyppigst anvendte forsøgsdyr formentlig på grund af deres bekvemme størrelse, lave omkostninger og mulighed for at genetisk ændre de gener, der mistænkes for at være involveret i de konkrete undersøgelse spørgsmål (f.eks. banke ud af en visse transporter eller receptor). I almindelighed, in vivo modeller drage fordel af fysiologisk intakt, men har også flere begrænsninger. Vigtigst, den lille størrelse af gnavere, især mus, er en begrænsende faktor, da de fleste assays til gut hormon kvantificering kræver mindst 20 µL plasma (og ofte meget mere), hvilket betyder, at mindst 100 µL af blod har tilbage at gøre en dublet kvantificering. Derfor er det kun muligt at opnå meget få prøver svarende til baseline prøver og en eller to efter stimulation prøver (total blodvolumen i en mus på 20 g er ~1.4 mL). Derfor potentielle sekretoriske reaktioner (fx, hurtigt eller sene forekommende svar) kan derfor blive savnet.

I modellen perfusion problemet er overvundet, som stor stikprøve diskenheder er opnået (strømningshastighed: 7,5 mL/min) og samling intervaller kan justeres efter behov for at sikre, ikke glip af de hurtige og korte langvarige svar (vi indsamle prøver hver min)7 . Et andet problem med i vivo studier i gnavere er at de fleste tarmhormoner er endnu mere hurtigt elimineret eller metaboliseres end i mennesker8,9,10, hvilket kan komplicere den efterfølgende biokemiske analyser. For eksempel, vi viste at GLP-1 metaboliseres i mus i en endnu hurtigere tempo end i mennesker (hvor T1/2 er 1-2 min.11) og endnu vigtigere, at kløvningen af GLP-1 i mus omfatter, ud over N-terminale spaltning af dipeptidyl-peptidase-4 (DPP4) (som er den store GLP-1 nedværdigende enzym i mennesker), yderligere spaltning af enzymet neutrale endopeptidase 24.1112. Derfor, nuværende kommercielle assays til kvantificering af GLP-1, som enten er baseret på den intakte isoform af GLP-1 (7-36amide) eller DPP-4 kløvet isoform (9-39amide), langt undervurdere GLP-1 sekretion i mus og resultere i misvisende resultater 12. i tyndtarmen isolerede perfunderet rotte de fleste af metabolismen af udskilles hormoner er elimineret eller markant reduceret, da plasma-medieret nedbrydning er undgået, og lever/nyre/lunge udvinding/nedbrydning forhindres fordi ( perfusate er indsamlet som det forlader tarmen).

Selvfølgelig vigtigt indsigt kan genereres ved hjælp af genetisk modificerede dyr, fx, natrium-glucose transporter-1 knockout mus13, men en detaljeret vurdering af de molekylære sensorer involveret i sekretionen ofte kræver betragtning af flere molekylære sites, spænder fra molekylære transportvirksomheder til ionkanaler og fra forskellige G-protein-koblede receptorer til intracellulære proteiner. For eksempel, målrettet vi aktivitet af ni forskellige molekylære sites når optrevling molekylære sensorerne ansvarlig for glucose-stimuleret GLP-1-sekretion7. En lignende undersøgelse ville ikke være muligt in vivo, som nogle af de forbindelser der anvendes har uspecifik eller skadelige/dødelige virkninger. For eksempel, når du bruger den perfused gut, var det muligt at vurdere intra cellulære glukosemetabolismen for udskillelsen af GLP-1 og neurotensin rolle ved at blokere ATP dannelse med 2-4-dinitrophenol7,14 samt rolle spænding-gated calcium kanaler for galdesyre stimuleret GLP-1, NT og PYY sekretion3. Stærkt giftige natrium-kanal blokker tetrodotoxin kan faktisk blive anvendt med succes i perfusion undersøgelser. Endelig, i perfusion model det kan direkte vurderes hvor i tarmen en visse sammensatte stimulerer sekretion af et bestemt hormon, som investigator kan blot vælge og forberede den ønskede region til perfuse, og samtidig kan det undersøges hvorvidt en stimulus forårsager udskillelsen ved aktivering af molekylære sensorer fra den luminale eller vaskulær side af tarmen3,15,16.

De sekretoriske mekanismer underliggende gut hormon sekretion kan også studeres ved brug af gut væv stykker (herunder humant væv), primære intestinal kulturer (normalt fra mus), udødeliggjort hormon secernerende cellelinjer (af musen eller menneskelig oprindelse), af gut væv monteret i Ussing kamrene eller af organoids (både oftest fra mus)2,3,4,5,6,17,18. I forhold til tarm perfusions, undersøgelser på menneskelige gut stykker, primære cellekulturer og cellelinjer er teknisk nemmere at udføre og er en hurtigere og billigere måde at generere data, men selvfølgelig studiet af gut stykker kræver adgang til friske menneskelige gut prøver. Men i disse modeller normal celle polariseringen af tarmen er i sagens natur tabt, hvilket betyder, at disse modeller kan ikke bruges til at vurdere normal aktivering af molekylære sensorer, og absorption processer kan også undersøges. Derudover sådanne undersøgelser normalt anvender statisk inkubationer (for op til flere h) som er meget ikke-fysiologisk og har intet at gøre med de celler normale sekretoriske dynamik, fordi det udskilles produkt ikke er fjernet og dermed kan feedback påvirke den udskillelsen af hormoner. Derimod i perfused tarmen, er udskilles og optages molekyler effektivt fjernet af slimhinde mikrocirkulationen som de er in vivo, sikre at transmucosal forløb så absorption og sekretion kan forekomme ved en normal sats. Derudover kan cellekulturer have dedifferentiated fra deres indfødte enteroendocrine celle oprindelse, hvilket betyder at de ikke længere er repræsentant for de oprindelige celler peptid indhold og udtryk for Molekylær sensorer, selv om de kan stadig udskille hormonet pågældende. Dette er eksempelvis tilfældet for GLP-1 secernerende celle linjer19.

Det er derfor, vores opfattelse, at primære cellekulturer eller celle linje undersøgelser er mest egnet til screening og til at udføre typer eksperimenter, der ikke kan udføres i vivo eller i den isolerede perfused gut. For eksempel, en sande styrke af primære cellekulturer og cellekulturer linje er at intra cellulære sekundære budbringere (f.eks. Ca2 +, lejr, NAD(P)H) kan overvåges i realtid, og elektrisk signalering af hormonet hemmelig celler kan være undersøgt20,21,22. Derudover kan være gjort siRNA knockdown, hvilket er særligt nyttigt, hvis specifikke hæmmere ikke er tilgængelige20,21,22,23,24. Gut væv fra mus monteret i Ussing kamrene er for nylig blevet brugt til at studere de molekylære mekanismer bag galdesyre stimuleret GLP-1-sekretion, mens tarm organoids (fra mus) og menneskelige gut stykker er også blevet brugt til at studere den Molekylær detaljer gut hormon sekretion17,25. Mens de foerstnaevnte ydelser fra at være polariseret2 omfatter alle disse modeller statisk inkubationer. Undersøgelser på menneskelige gut stykker, dog drage fordel af ved hjælp af menneskelige, snarere end gnavere, væv, som er vigtigt siden arter forskel i væv udtryk af 7TM receptorer og molekylær transportvirksomheder kan resultere i forskellige molekylære sensing veje mellem arter. Faktisk de fleste dataene i dette felt er blevet genereret af undersøgelser på enten svin, mus eller rotter, og det er stadig undvigende om disse resultater kan overføres til mennesker. Det er imidlertid betryggende at de molekylære sensing mekanismer, der ligger til grund for glucose-stimuleret GLP-1 sekretion synes at være ens mellem mus, rotte, mand, og transkriptom og peptidomic profilering af mus og menneskelige L-celler afsløret stærke globale ligheder mellem to arter7,18,26,27.

Tyndtarmen isolerede perfunderet rotte har dog også nogle begrænsninger, der bør overvejes. Vigtigst af alt, er det umuligt at afgøre, om en given sekretoriske reaktion skyldes direkte aktivering af test-kemikaliet i de målrettede hormon-producerende celler eller rettere er forårsaget af en indirekte mekanisme. For eksempel, KCl øger straks GLP-1 sekretion fra perfused tarmen7, men det er stadig ukendt, om dette er en konsekvens af direkte depolarisering af L-celle eller resultater fra depolarisering af neuroner tæt på L-celler eller effekter af Samtidig udgav paracrine Stimulatorer/hæmmere. Data, der opstår fra undersøgelser ved hjælp af perfused tarmen, som har til formål at belyse de molekylære mekanismer bag sekretion bør derfor altid sættes i forbindelse med data fra andre mere specifikke modeller at øge evnen til at etablere kausalitet. For eksempel, glucose-stimuleret GLP-1 sekretion fra GLP-1 secernerende cellelinie GLUTag28,29 og primære mus L-celler afhænger af aktiviteten af glucose transportører (SGLT1 og GLUT2). Blokere disse transportører i tyndtarmen perfunderet rotte også dæmper sekretion20, hvilket betyder, at det er sandsynligt, at glucose-stimuleret GLP-1 sekretion i vid udstrækning er medieret af direkte aktioner af glucose på L-celle. En anden vigtig begrænsning af isolerede perfused tarmen er, at nogle af lipider er vanskelige at studere på grund af deres hydrophobicity. Selv om det er muligt at undersøge de endelige produkter af lipid fordøjelsen (fedtsyrer, diacyl glycerols, lysophosphatidylglycerols, etc.) og selvom præparatet kan muligvis re esterify af lipider intra-cellularly og måske pakke dem ind i Chylomichroner, transport af Chylomichroner ud af cellerne og deres efterfølgende udbredelse af lacteals af af villi er afbrudt, da den lymfe flow i den isolerede gut ikke kan sikres. Mest sandsynlige, derfor lipid absorption er standset når de absorberede produkter begynder at ophobe sig i cellerne. In vitro celle-systemer er endnu mindre egnet til lipid undersøgelser på grund af deres manglende polarisering. Naturligvis, denne begrænsning er kun relevant for lipider, som er absorberet og transporteret via lacteals, mens dem, der absorberes via de intestinale blodkar er tilbøjelige til at blive behandlet normalt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle undersøgelser blev gennemført med tilladelse fra den danske dyr eksperimenter Inspectorate (2013-15-2934-00833) og den lokale etiske udvalg, efter retningslinjerne i dansk lovgivning om dyreforsøg (1987) og nationale Institutter for sundhed (Publikationsnummer 85-23).

1. forsøgsdyr

  1. Opnå mandlige Wistar rotter (250 g) og hus 2 pr. bur med ad libitum adgang til standard chow og vand, og vedligeholde i en 12:12 h lys-mørke cyklus. Vores dyr faciliteter bruger ubehandlede vand og Alrtromin gnaver chow (1319 FORTI, Brogaarden, Lynge, Danmark).
    Bemærk: Tillad dyr mindst en uge af akklimatisering.

2. Præoperative præparater

  1. Gøre perfusion buffer: Krebs-Ringer bikarbonatbuffer suppleret med 0,1% BSA (brøkdel V), 5% dextran T-70, 3,5 mmol/L glukose og 5 mmol/L pyruvat, fumarat og glutamat (hvis nødvendigt); pH 7,4.
  2. Forberede et passende beløb af perfusion buffer ved at filtrere det gennem en passende størrelse på filter og justere pH til ~7.5 af dråbevis tilsætning af 5 M HCl.
  3. Føje 3-isobutylacetophenon-1-Methylxanthin (IBMX) (om nødvendigt) direkte til bufferen på dag i studiet til en slutkoncentration på 10 µM.
    Bemærk: IBMX er en phosphodiesterase inhibitor, der øger [lejr]jeg og dermed genskaber den følsomhed og lydhørhed af tarm i form af udskiller hormoner til en sekretoriske stimulus.
  4. Forbered test løsninger. Forberede vaskulære stimuli på en 20 x højere koncentration end den ønskede slutkoncentration i filtreret og pH-justeret perfusion buffer. Forberede luminale test stimuli i isotonisk saltvand i den endelige koncentration.
  5. Opløses ikke let opløselige forbindelser i 100% dimethylsulfoxid (DMSO) og fortyndes yderligere i perfusion buffer eller isotonisk saltvand. Vaskulære stimuli, opbevare den endelige DMSO koncentration på 1% eller derunder, som koncentrationer ovenfor dette skader i tarmen og kan føre til uspecifik gut hormon sekretion. Måle pH og tilpasse sig til ~7.5 Hvis det er nødvendigt.

3. drift og Perfusion

Bemærk: En illustration af en perfusion setup er fastsat i figur 1.

  1. Bedøver rotter ved brug af en bedøvende regime, der kan opretholde kirurgisk anæstesi og analgesi for 30-40 min ved Hypnorm/Midazolam (0,3 ml/100 g kropsvægt, pr. ml: Hypnorm: 0,08 mg fentanyl, 2,5 mg fluanisone, 0,45 mg Methyl Parahydroxybenzoate, 0,05 mg Propyl Parahydroxybenzoate, Midazolam: 1,25 mg, Matrix Pharmaceuticals, Hellerup, Danmark)
  2. Check på grund af manglende reflekser (tå knivspids), placere rotten på opvarmet operationsbordet og udføre et snit i huden til at udsætte tarmen.
  3. Udsætte den terminale del af tyktarmen ved at flytte tyndtarmen til side så meget som muligt. Binde til at levere Vaskulaturen til tyktarmen og punktafgifter det gradvist med udgangspunkt i den terminal del af tyktarmen, bevæger sig i retning af tyndtarmen.
    1. Hvis kun en del af tyndtarmen er påkrævet for perfusion (øverste halvdel), punktafgifter ikke kræves segmenter efter at binde off leverer Vaskulaturen. For at minimere vævsskader, fugter tarmen med isotonisk saltvand og bruge podninger for at fjerne bindevæv.
  4. Indsæt et plastikrør (længde: ~ 15 cm, ydre diameter: ~0.4 cm) til tarm lumen (i den proksimale del) og binde det ordentligt ved hjælp af suturer. Skyl omhyggeligt med isotonisk saltvand (stuetemperatur) at tømme lumen af chyme.
  5. Perfuse lumen med isotonisk saltvand på et flow på 0,25 mL/min., ved hjælp af en 10 mL sprøjte tilsluttet en sprøjten pumpe.
  6. Flytte tarmen til side, så den øverste mesenterica arterie er tilgængelige og fjerne bindevæv og fedt væv for at udsætte arterien.
  7. Placer to suturer under den mesenterica arterie ved hjælp af fin spids pincet; en af suturerne er til løft af arterien til at styre blødning når arterie er blevet skåret og den anden er for at sikre det kateter, der skal placeres i arterien. Være forsigtig ikke at perforere arterie.
  8. Placer to suturer under portåren til sikring af metal kateter, der gonna være placeret i venen til samling af perfusion spildevand.
  9. Før skære hul i den mesenterica arterie, sikre, at det kateter, der kommer til indsatte i arterien er fyldt med perfusion buffer til at forhindre luft embolus dannelse.
  10. Klip et lille hul i mesenterica arterie ved hjælp af et par kirurgisk saks og Indsæt plastik kateteret straks efter.
  11. Umiddelbart efter, at kateteret er blevet sikret, indlede perfusion af tarmen ved at starte rulle pumpe (flow-hastighed = 7,5 mL/min).
  12. Bekræfte, at blodkarrene i tarmen Drej bleg inden for få sekunder, og portal vene bliver bleg.
  13. Umiddelbart efter ordentlig perfusion er blevet etableret, skæres et hul i portåren, indsætte metal kateteret og Fastgør det med sutur.
    Bemærk: Kateteret kan være vanskeligt at sted men løfte venen op ved forsigtigt at trække de mest proksimale sutur hjælper.
  14. Når katetre er på plads og perfusion output er tilfredsstillende, Dræb rotten af mellemgulvet perforation, være omhyggelig med ikke at rippe ud katetre.
  15. Indsamle perfusion output for 1 min og måle lydstyrken. Start perfusion pres erhvervelse/optagelser af Klik Udføre eksperimentet i pres optagelsesprogram.
  16. Dække gut med fugtede væv forhindre udtørring under eksperimentet.
  17. Sikre at den distale ende af tarmen ikke er blokeret, således at den luminale spildevand kan afslutte, ellers tarmen vil svulme, ødem vil udvikle, perfusion pres vil stige og perfusion output vil falde.
  18. Lad forberedelse for ca. 30 min. før indlede eksperimentet.
    Bemærk: De sekretoriske udgange af tarmhormoner er meget usikker i de første 15 min af perfusion, så dette ækvilibrering trin er nødvendige for at få en stabil basislinje.

4. eksperiment

  1. Efter ca. 30 min. af perfusion, skal du starte eksperimentet ved at indsamle den første grundlinje prøve ved hjælp af en brøkdel samler. Indsamle prøver på det ønskede tidsinterval (f.eks. hver min, 6,5-7,5 mL er normalt indsamlet) og placere dem på is inden for få min.
  2. Inspicere den boble fælde regelmæssigt, og hvis tømt, refill det med perfusion buffer.
    1. Indsamle buffer gennem tre-vejs pik-ventil, umiddelbart før det træder orgel og fra kateter indsat i portåren (efter at det har været perfunderet via orgel) for at bekræfte, at orglet er metabolisk aktive. Indsamle prøver i starten og slutningen af forsøget at vurdere levedygtighed i hele eksperimentet.
    2. Måle prøver hurtigt, med en automatiseret blod-gas analysator, da de fleste plastic indeholder/sprøjter ikke helt lufttæt, giver anledning til udveksling med den atmosfæriske luft.
  3. Efter 10-15 min af baseline samling, stimulere med den første test-kemikaliet. Administrere intraarteriel stimulering med sprøjten pumpe gennem en tre-vejs stophane (flow = 0.350 mL/min).
  4. Udføre luminale stimulering af en indledende bolus injektion (2,5 mL/min. over de første 5 min), at erstatte isotonisk saltvand, der allerede i lumen, efterfulgt af administration af test-opløsningen mindre gennemstrømningshastighed (0,5 mL/min).
  5. For at sikre, at lumen hurtigt tømt af test-kemikaliet, når den luminale stimulation periode er overstået, skal du skylle intestinal lumen med isotonisk saltvand ved at anvende samme strømningshastigheder som ovenfor.
  6. Indsamle baseline prøver til 15-30 min, før de næste test-kemikaliet administreres. Afhængigt af protokollen, kan 2-3 test stimuli normalt være inkluderet pr. eksperiment. Hvis den eksperimentelle protokol omfatter aktivering/hæmning af en given molekylære hjemmeside samtidigt med administration af en given secretagogue, altid pre stimulere med aktivator/hæmmer 10-15 min før administration af secretagogue til sikre, at webstedet molekylære hæmmes i begyndelsen af secretagogue infusion.
  7. I slutningen af protokollen, administrere (5-10 min) en passende positiv kontrol test for lydhørhed af forberedelse og indsamle 10-15 min oprindelige prøver efter perioden stimulation.
    Bemærk: Flere test stoffer kan bruges som positiv kontrol, f.eks., stimuli for stigende [lejr]jeg (f.eks. foskolin eller IBMX), [Ca2 +]jeg (f.eks. bombesin eller neuromedin C), depolariserende agenter (f.eks., 30-50 mM KCl) eller mere fysiologisk relevante stimuli som makronæringsstoffer: glucose, Peptoner og aminosyrer. Valget af positiv kontrol afhænger imidlertid af det eksperimentelle resultat. Glucose er for eksempel en dårlig cholecystokinin (CCK) secretagogue bombesin er ikke en robust secretagogue til glukose-afhængige insulinotropic peptid (GIP) sekretion30.
  8. Efter slutningen af forsøget, punktafgifter den perfused gut, vejer det og måle dens længde. Sætte det i PARAFORMALDEHYD og gemme det (4 ° C) for potentielle senere histokemiske analyse af/vævsskader integritet, for eksempel ved H & E farvning.

5. biokemiske målinger

  1. Kvantificere koncentrationen af udskilles peptider i det venøse spildevand ved brug af en in-house eller kommercielt tilgængelig radioimmunoassays (RIA) eller ELISA-assays. Studier, der undersøger intestinale absorption, kvantificere molekyle af interesse, fx, glukose eller aminosyrer, i det venøse spildevand.
    Bemærk: Perfusate er normalt en god basal buffer for de fleste analyser, herunder assays, der bygger på enzymatiske reaktioner (f.eks. kvantificeringen af glucose ved metoden glucoseoxidase).

6. dataanalyse

  1. Præsentere data på forskellige måder, for eksempel som en tid-koncentration graf, der viser den faktiske sekretoriske output (flow x koncentration) og som kolonne plot skildrer den samlede sekretoriske output i baseline og svar perioder (normalt 10-15 tiden point).
  2. Afbilde de faktiske målte koncentration af de respektive hormoner som koncentration enheder. (pmol/L),
    Bemærk: Det er at foretrække i stedet udtrykke data som output (fmol/min), fordi med denne model, i modsætning til in vivo-undersøgelser, de opnåede værdier er den faktiske sekretoriske output (på grund af den konstante samling af perfusion spildevand).
  3. Afhængigt af antallet grupper skal analyseres statistisk, brug to-sidede parret t-test (to grupper) eller en-vejs ANOVA for gentagne målinger (mere end to grupper) efterfulgt af en passende post-hoc test for flere sammenligninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Evnen til at bestemme, om en given stimulus forårsager udskillelsen af gut hormon af interesse bygger på en stabil basislinje sekretion. Desuden, hvis ingen svar på stimulus er observeret, en robust sekretoriske svar på den positive kontrol skal være indlysende at udelukke, at manglen reaktion på test stimulus ikke afspejler en generel mangel på lydhørhed. Figur 2A og 2B viser et eksempel på god kvalitetsdata; GLP-1 sekretion fra isolerede perfunderet rotte tyndtarmen er vist 1-min. mellemrum (middel ± SEM). Ved basal betingelser er sekretion stabil; både før og efter indgift af test stimulus (insulin), og en robust sekretoriske svar til positivt er kontrol (bombesin (BBS)) indlysende. Derudover har i gennemsnit GLP-1-sekretion på basal betingelser (i de respektive baseline perioder forud insulin eller BBS administration) samt gennemsnit sekretion under insulin og BBS stimulation er vist som søjlediagrammer (middel ± SEM). Sekretion blev testet for Statistisk signifikans af en-vejs ANOVA for gentagne målinger. Baseret på disse kombinerede data, kan det konkluderes, at intraarteriel insulin ikke stimulerer GLP-1 sekretion fra isolerede perfunderet rotte tyndtarmen.

Figur 2 c og 2D viser et eksempel på GLP-1 sekretion fra isolerede perfunderet rotte tyndtarmen. I modsætning til figur 2A og 2Ber disse data af dårlig kvalitet; sekretionen er usikker på basal betingelser og driver opad hele på en måde, der synes at være relateret til teste substans administrationer (intra-luminale og intraarteriel fructose, henholdsvis) og den positive kontrol, BBS, ikke resulterer i statistisk signifikant øget GLP-1-sekretion. Det er derfor umuligt at konkludere om fructose stimulering give anledning til GLP-1-sekretion, fx, er øget GLP-1 sekretion i slutningen af vaskulære fructose stimulation en fruktose-medieret svar eller ej.

Figure 1
Figur 1: et eksempel på en opsætning af perfusion. Systemet består af en plexiglas stand, en opvarmet operationsbordet, en varmeveksler med indbyggede boble fælde, en trykmåler og spindel pumpe til perfusion pres justering. Perfusion system er forbundet med en Termostatstyret cirkulationspumpe, som opvarmer gasset (95% O2, 5% CO2) perfusion buffer til 37 ° C. Derudover perfusion pres registreres løbende og transduced af optagelse tryktransduceren og visualiseret og gemt på en PC med passende software. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Data fra isolerede perfunderet rotte tyndtarmen. (A, B) et eksempel på et veludført eksperimenter og pålidelige data, (C, D) et eksempel på sub-optimale data hvor perfusion pres øges, og perfusion output faldt drastisk i tiden løbet af undersøgelsen. (A) GLP-1 (total) output (fmol/min) er vist på basal betingelser og svar på intraarteriel insulin administration (200 og 1000 pM, som angivet). Bombesin (BBS), en velkendt, potent GLP-1 secretagogue, blev infunderet intra-arterially i slutningen af forsøget til kontrol for lydhørhed (pos. kontrol). Data præsenteres som middel ± SEM, n = 4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Isolerede perfunderet rotte tyndtarmen er en kraftfuld forskningsværktøj, der giver dynamik og molekylære mekanismer bag gut hormon sekretion studeres i detaljer. Det mest afgørende skridt for den vellykkede produktion af data med denne model er den kirurgiske operation. Håndtering af tarmen medfører uundgåeligt nogle skader på tarmen og bør derfor holdes på et absolut minimum. Endnu vigtigere, er hastigheden af operation nøglen, især med hensyn til tidspunktet for kateter placering i den mesenterica arterie. Vores erfaring er, at kateteret skal være korrekt placeret, og perfusion bør indledes inden for et par min. efter at have skåret hul i fartøjet. Placeringen af katetre er den mest udfordrende del af handlingen og kompliceres af den lille størrelse af arteria mesenterica og den tynde væg Vena, og dette trin kræver nogle praksis. Hurtig indsættelse af den venøse kateter er dog ikke så presserende som tilfældet for den mesenterica arterie, som tarmen er nu perfunderet og holdt i live. Det næste vigtige skridt er at udføre eksperimentet. Hvis handlingen blev udført, den perfused gut vil normalt trives og være lydhøre over for op til 3 h og perfusion pres og output vil typisk være konstant over hele eksperimentet. Den vigtigste faktor for et vellykket eksperiment på dette tidspunkt er at undgå bobler at komme ind i systemet, da det medfører luft embolisering, som enten øjeblikkeligt reducerer eller eliminerer perfusion output. Som perfusion bufferen indeholder BSA og er gasset for at sikre tilstrækkelig ilttilførsel til den perfused gut, er det svært at forhindre dannelsen af boblerne helt. Bobler bør imidlertid være fanget i den systemer bubble fælde, men dette tømmer gradvist over tid (jo flere bobler, den hurtigere tømning) og det er derfor vigtigt at holde et vågent øje med boble fælde og genopfylde den med perfusion buffer når det er nødvendigt. Det er også vigtigt at holde perfusate pH-værdien under 7,5 — at øge pH, calciumcarbonat bundfald kan danne, hindre kapillar flow og forårsager en alvorlig forøgelse perfusion pres.

Perfused tarmen er en temmelig robust forberedelse, men det tåler ikke høje koncentrationer af vaske-og rengøringsmidler som galdesyrer, ethanol og DMSO. Derfor brugen af detergenter bør helst undgås men er undertiden nødvendig for at få tungtopløselige stoffer i løsning. Perfused tarmen generelt tolererer rengøringsmidler administreres intra-luminally bedre end intra-vascularly. For eksempel, blev administration af 1 mM taurodeoxycholic syre (en sekundær, konjugeret galdesyre) tolereret godt når infunderes intraluminally men straks resulterede i blokerede perfusion output når leveret intra-arterially2. Vaskulære stimulering, opbevare den endelige DMSO koncentration på under 1% at undgå uspecifik sekretoriske svar (DMSO stimulerer, for eksempel, GLP-1 sekretion) og undgå forårsager vævsskader resulterer i øget perfusion pres og nedsat perfusion output. Eksperimenter skal tilsidesættes, hvis perfusion output falder med mere end 20% i løbet af undersøgelsen, hvis perfusion trykket stiger mere end 20%, eller hvis ødemer udvikler. Overholdelse af disse makroskopisk succeskriterier (herunder hurtig indføring af kateter i arteria mesenterica) normalt resulterer i god kvalitet i ~14/15 eksperimenter.

Efter endt eksperimentet, er den næste kritiske procedure at vælge den relevante metode og analyse til kvantificering af hormone(s) af interesse. Høj gennem læg paavisning af peptid hormoner kan udføres ved hjælp af immunassays: radioimmunoassay eller ELISA. I hvert fald er det stærkt anbefales at validere de respektive assays før du bruger dem for eksempel kvantificering, som ikke alle kommercielt tilgængelige assays udføre tilfredsstillende med hensyn til følsomhed, specificitet og nøjagtighed (for eksempler vedrørende GLP-131). Med hensyn til specificitet er krydsreaktivitet, som altid, en bekymring. Uspecifik indblanding og matrix effekter er generelt mindre udtalt med kunstige perfusates i forhold til plasma. Med hensyn til følsomhed, er det ofte meget lettere at få pålidelige data fra perfusions end fra i vivo undersøgelser som peptid koncentrationer ofte er højere, fordi perfusion spildevandet ikke fortyndes i systemisk cirkulation, og fordi eliminering processer (af lever/lunge/nyre) undgås. Typisk, baseline koncentrationer i venøse spildevand ligge inden for de lavere arbejdsområde i de fleste assays (i tilfælde af GLP-1 (total), neurotensin (i alt) og PYY (alt): 8-15 pmol/L) mens stimuleret svar kan nå så højt som 200-300 pmol/L3.

I sammenligning, baseline værdier af de samme hormoner i plasmaet fra raske mennesker, rotte eller mus er typisk og 5-10 pmol/L svar værdier er 15-30 pmol/L3,32.

Hvis de foruddefinerede succeskriterier er overholdt, genererede perfusion data er normalt af god kvalitet og den statistiske analyse er så ligetil. I forhold til udskillelsen af glukagon, insulin og somatostatin fra isolerede perfunderet rotte eller mus bugspytkirtlen, basal udskillelsen af tarmhormoner er stabil, og temmelig ens mellem eksperimenter vedrørende målte koncentrationer, og sekretion er ikke klart pulsatile. Kollektivt, variationen i datasættet er derfor minimalt og en stikprøve på så lavt som tre perfusion eksperimenter er ofte tilstrækkelig til at opnå Statistisk signifikans. Dog er at standardisere og undgå type-2-fejl, samt at reducere muligheden for med udsigt over mindre godt udtalt svar, en stikprøve på seks til otte anbefalet.

I Resumé er isolerede perfunderet rotte tyndtarmen en vigtig, fysiologisk relevante, eksperimentel model, der kan bruges til at undersøge de direkte virkninger af et givet stof på gut hormon sekretion. Vigtige grundlæggende spørgsmål, såsom hvor i tarmen et secretagogue stimulerer sekretion, om det stimulerer udskillelsen gennem aktivering af luminally eller basolaterally beliggende sensorer, og hvilke molekylære sensorer er aktiveret og dermed ansvarlig for sekretionen kan behandles i detaljer med denne model. Det bør dog, anerkendes, at frakobling af gut fra donordyret, for nogle undersøgelse spørgsmål, muligvis af relevans. For eksempel tarmen interagerer tæt sammen med leveren (tarm-lever akse) og hjerne (gut-hjerne-akse), og mekanismer, der er afhængige af denne cross-talk derfor undersøges ikke med denne model. Kvaliteten af operationen er den afgørende faktor for datakvalitet og de vigtigste faktorer for en vellykket operation er at holde håndtering af tarmen til et minimum og hurtigt starte perfusion af tarmen, når den mesenterica arterie er blevet skåret. Det er vores erfaring, at det tager 2-4 måneder af praksis, før data af god kvalitet er produceret. Når teknikken er blevet lært, er mulighederne for denne metode dog næsten uendelige og kun begrænset af opløselighed i teststoffer og eventuelle skadelige virkninger teststoffer kan have på perfused væv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne til dette arbejde erklære ingen potentielle interessekonflikter relevant for denne artikel.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af en ubegrænset tilskud til Prof. Jens Juul Holst fra Novo Nordisk Center for metaboliske grundforskning (Novo Nordisk Fonden, Danmark), en særskilt bevilling fra Novo Nordisk Fonden for at gøre gnaver perfusion undersøgelser (give nr. NNF15OC0016574), et tilskud til at Prof. Holst fra European Research Council (Grant no.695069) og det europæiske EU 's syvende rammeprogram for forskning, teknologiske og demonstrationsaktiviteter (Grant nr. 266408) samt en postdoc give Rune E. Kuhre fra Lundbeckfonden (R264-2017-3492). Vi takker Jenna E. Hunt og Carolyn F. Deacon for omhyggelig korrekturlæsning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals for perfusion buffer
Bovine serum albumin (BSA) Merck 1.12018.0500
Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O) Merck 102382
Dextran 70 Pharmacosmos 40014
Fumaric acid disodium salt (C44H2Na2O4) Sigma Aldrich F9642
Glucose (C6H12O6) Merck 108342
Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4) Merck 105886
Potasium chloride (KCl) Merck 104936
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Merck 104873
Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4) Merck 106619
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Merck
Sodium chloride (NaCl) Merck 106404
Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O) Merck 106445
Name Company Catalog Number Comments
Perfusion equitment
Universial perfusion system Harvard Bioscience, Inc. 732316
BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834 Harvard Bioscience, Inc.
Roller Pump, with four channels Harvard Bioscience, Inc. 730100
Windkessel Harvard Bioscience, Inc. 732068
Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz Harvard Bioscience, Inc. 730125
Operating table, heated on tripod stand, type 873 Harvard Bioscience, Inc. 733776
Cannula with basked, OD = 2.0 mm, ID = 1.0 mm Harvard Bioscience, Inc. 733313

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
  2. Brighton, C. A., et al. Bile Acids Trigger GLP-1 Release Predominantly by Accessing Basolaterally Located G Protein-Coupled Bile Acid Receptors. Endocrinology. 156, 3961-3970 (2015).
  3. Kuhre, R. E., et al. Bile acids are important direct and indirect regulators of the secretion of appetite- and metabolism-regulating hormones from the gut and pancreas. Molecular Metabolism. , (2018).
  4. Roberge, J. N., Brubacker, P. L. Secretion of Proglucagon-Derived Peptides in Response to Intestinal Luminal Nutrients. Endocrinology. 128, 3169-3174 (1991).
  5. Brubaker, P. L., Schloos, J., Drucker, D. J. Regulation of glucagon-like peptide-1 synthesis and secretion in the GLUTag enteroendocrine cell line. Endocrinology. 139, 4108-4114 (1998).
  6. Jacobsen, S., et al. Changes in Gastrointestinal Hormone Responses, Insulin Sensitivity, and Beta-Cell Function Within 2 Weeks After Gastric Bypass in Non-diabetic Subjects. Obesity Surgery. 22, 1084-1096 (2012).
  7. Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine. Diabetes. 64, 370 (2014).
  8. Svendsen, B., Holst, J. J. Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines. Peptides. 77, 47-53 (2016).
  9. Ratner, C., et al. Effects of Peripheral Neurotensin on Appetite Regulation and Its Role in Gastric Bypass Surgery. Endocrinology. 157, 3482-3492 (2016).
  10. Wewer Albrechtsen, N. J., et al. Dynamics of glucagon secretion in mice and rats revealed using a validated sandwich ELISA for small sample volumes. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 311, E302-E309 (2016).
  11. Vilsboll, T., Agerso, H., Krarup, T., Holst, J. J. Similar elimination rates of glucagon-like peptide-1 in obese type 2 diabetic patients and healthy subjects. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 88, 220-224 (2003).
  12. Windelov, J. A., et al. Why is it so difficult to measure glucagon-like peptide-1 in a mouse? Diabetologia. 60, 2066-2075 (2017).
  13. Gorboulev, V., et al. Na+-d-glucose Cotransporter SGLT1 is Pivotal for Intestinal Glucose Absorption and Glucose-Dependent Incretin Secretion. Diabetes. 61, 187-196 (2012).
  14. Kuhre, R. E., Bechmann, L. E., Wewer Albrechtsen, N. J., Hartmann, B., Holst, J. J. Glucose stimulates neurotensin secretion from the rat small intestine by mechanisms involving SGLT1 and GLUT2, leading to cell depolarization and calcium influx. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 308, E1123-E1130 (2015).
  15. Kuhre, R. E., Christiansen, C. B., Saltiel, M. Y., Wewer Albrechtsen, N. J., Holst, J. J. On the relationship between glucose absorption and glucose-stimulated secretion of GLP-1, neurotensin, and PYY from different intestinal segments in the rat. Physiological Reports. 5, (2017).
  16. Svendsen, B., et al. An analysis of cosecretion and coexpression of gut hormones from male rat proximal and distal small intestine. Endocrinology. 156, 847-857 (2015).
  17. Goldspink, D. A., et al. Mechanistic insights into the detection of free fatty and bile acids by ileal glucagon-like peptide-1 secreting cells. Molecular Metabolism. 7, 90-101 (2018).
  18. Sun, E. W., et al. Mechanisms Controlling Glucose-Induced Glp-1 Secretion in Human Small Intestine. Diabetes. , (2017).
  19. Kuhre, R. E., et al. Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716 and STC-1 cells: a comparison to native L-cells. Journal of Molecular Endocrinology. 56, 11 (2016).
  20. Reimann, F., et al. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell Metabolism. 8, 532-539 (2008).
  21. Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, 161-175 (2005).
  22. Kuhre, R. E., et al. Fructose stimulates GLP-1 but not GIP secretion in mice, rats and humans. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306, G622-G630 (2014).
  23. Reimann, F., Tolhurst, G., Gribble, F. M. G-Protein-Coupled Receptors in Intestinal Chemosensation. Cell Metabolism. 15, 421-431 (2012).
  24. Parker, H. E., et al. Molecular mechanisms underlying bile acid-stimulated glucagon-like peptide-1 secretion. British Journal of Pharmacology. 165, 414-423 (2012).
  25. Petersen, N., et al. Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids. Diabetes. 63, 410-420 (2014).
  26. Parker, H., et al. Predominant role of active versus facilitative glucose transport for glucagon-like peptide-1 secretion. Diabetologia. 55, 2445-2455 (2012).
  27. Roberts, G. P., et al. Comparison of Human and Murine Enteroendocrine Cells by Transcriptomic and Peptidomic Profiling. Diabetes. , (2019).
  28. Reimann, F., Gribble, F. M. Glucose-Sensing in Glucagon-Like Peptide-1-Secreting Cells. Diabetes. 51, 2757-2763 (2002).
  29. Drucker, D. J., Jin, T., Asa, S. L., Young, T. A., Brubaker, P. L. Activation of proglucagon gene transcription by protein kinase-A in a novel mouse enteroendocrine cell line. Molecular Endocrinology. 8, Baltimore, Md. 1646-1655 (1994).
  30. Svendsen, B., et al. GLP1- and GIP-producing cells rarely overlap and differ by bombesin receptor-2 expression and responsiveness. The Journal of Endocrinology. 228, 39-48 (2016).
  31. Bak, M. J., et al. Specificity and sensitivity of commercially available assays for glucagon-like peptide-1 (GLP-1): implications for GLP-1 measurements in clinical studies. Diabetes, Obesity & Metabolism. 16, 1155-1164 (2014).
  32. Jacobsen, S. H., et al. Effects of gastric bypass surgery on glucose absorption and metabolism during a mixed meal in glucose-tolerant individuals. Diabetologia. 56, 2250-2254 (2013).

Tags

Medicin spørgsmål 144 isoleret perfunderet rotte tyndtarmen Molekylær sensorer gut hormon sekretion næringsstof absorption intakt cellulære polarisering glukagon-lignende pepide-1 metoder til at studere gut hormon sekretion.
Underliggende Gut hormon sekretion ved hjælp af den isolerede mekanismer perfunderet rotte tyndtarmen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuhre, R. E., Holst, J. J.… More

Kuhre, R. E., Holst, J. J. Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine. J. Vis. Exp. (144), e58533, doi:10.3791/58533 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter