Summary
Hier presenteren we een krachtige en fysiologische model voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de darm hormoon afscheiding en intestinale absorptie — de geïsoleerde geperfundeerd rat dunne darm.
Abstract
De darm is het grootste endocriene orgaan van het lichaam, het produceren van meer dan 15 verschillende peptide-hormonen die de eetlust en voedsel inname, spijsvertering, nutriënten-absorptie en distributie en postprandiale glucose excursies regelen. Inzicht in de moleculaire mechanismen die gut hormoon afscheiding regelen is fundamenteel voor het inzicht en het vertalen van gut hormoon fysiologie. Traditioneel, de mechanismen die ten grondslag liggen aan de darm hormoon afscheiding zijn ofwel studeerde in vivo (in proefdieren of mens) of met behulp van gut hormoon-afscheidende primaire mucosal cel culturen of cellijnen. Hier introduceren we een geïsoleerde geperfundeerd rat dunne darm als een alternatieve methode voor het bestuderen van de darm hormoon afscheiding. De deugden van dit model zijn dat het afhankelijk van de darm intact is, wat betekent dat het grootste deel van de verantwoordelijk voor de afscheiding in in vivo onderzoek, met inbegrip van mucosal polarisatie, paracrine relaties en routes van fysiologisch belangrijke parameters recapituleert perfusie/stimulans blootstelling. Bovendien, en in tegenstelling tot in vivo onderzoek, voorziet de geïsoleerde geperfundeerd rat dunne darm bijna volledige experimentele controle en directe beoordeling van secretie. In tegenstelling tot het in vitro onderzoek is het mogelijk om te studeren zowel de omvang en de dynamiek van secretie en om belangrijke vragen te stellen, zoals wat prikkels veroorzaken de secretie van verschillende hormonen, van welke kant van de darm (luminal of vasculaire) afscheiding is gestimuleerd, en om te analyseren in detail moleculaire sensoren ten grondslag liggen aan de secretoire reactie. Bovendien, is de voorbereiding een krachtig model voor de studie van intestinale absorptie en details met betrekking tot de dynamiek van intestinale absorptie met inbegrip van de verantwoordelijke transporteurs.
Introduction
De darm is het grootste endocriene orgaan van het lichaam, het produceren van meer dan 15 verschillende peptide hormonen die regelen nutriënten-absorptie en nutriënten dispositie, intestinale groei en moduleren eetlust1. Gut hormonen zijn, dus betrokken bij vele fundamentele fysiologische processen, en het begrip van deze patronen van secretie en de moleculaire details waarmee de secretie van de respectieve hormonen is dus van belang voor onze basic fysiologische begrip en voor het aanpakken van translationeel aspecten van gut hormoon acties; maar hoe kan men het bestuderen van de moleculaire sensing mechanismen ten grondslag liggen aan de darm hormoon afscheiding? In het algemeen, de secretie van het hormoon kan worden bestudeerd in intact organismen (mens of proefdieren), uit geïsoleerde gut preparaten of darm hormoon-afscheidende primaire celculturen of vereeuwigd cel culturen2,3, 4 , 5 , 6. onze voorkeur model is de geïsoleerde geperfundeerd rat dunne darm, die een fysiologisch relevante model waarmee de afscheiding van hormonen van de darm is tot in detail met optimale tijd resolutie (secretie tarieven kunnen worden bepaald met elk gewenst moment worden bestudeerd basis tot de tweede), en de resultaten zijn waarschijnlijk overdraagbaar naar een in vivo situatie7. Hier bieden we een gedetailleerd protocol over het uitvoeren van deze procedure, maar eerst zullen we andere methoden voor het bestuderen van de darm hormoon afscheiding, met inbegrip van de voordelen en beperkingen van deze modellen ten opzichte van de geïsoleerde geperfundeerd rat dunne darm.
Als men wenst vast te stellen of een specifieke stof de afscheiding van bepaalde hormonen gut regelt, zijn studies bij de mens het uiteindelijke doel. Dus, als een samengestelde grote gevolgen voor de secretie van één of meerdere gut hormonen in knaagdieren (in vivo of perfusions geeft) of van hormoon afscheidende cellen (cellijnen of primaire cellen), dit effect is alleen relevant voor geneeskunde en menselijke fysiologie als het kan worden bevestigd bij de mens. Echter, er zijn duidelijke grenzen voor het type van studies die bij de mens kunnen worden uitgevoerd, en in vivo onderzoek op proefdieren zijn, daarom vaak de tweede beste optie voor dergelijke studies. Muizen en ratten zijn de meest gebruikte proefdieren vermoedelijk vanwege hun handige formaat, lage kosten en de mogelijkheid om het genetisch veranderen de genen die verdacht worden van betrokkenheid bij de specifieke studie vragen (bijvoorbeeld kloppen uit een bepaalde vervoerder of receptor). In het algemeen, in vivo modellen profiteren van die fysiologisch intact, maar hebben ook verschillende beperkingen. Belangrijker, de geringe omvang van knaagdieren, met name muizen, is een beperkende factor, aangezien de meeste testen voor gut hormoon kwantificering ten minste 20 µL vereist van plasma (en vaak nog veel meer), wat betekent dat ten minste 100 µL bloed moet worden ingetrokken om een duplicaat kwantificering. Daarom is het alleen mogelijk te krijgen zeer weinig monsters overeenkomt met basislijn monsters en één of twee na stimulatie monsters (het volume van de totale bloed in een muis van 20 g is ~1.4 mL). Bijgevolg, potentiële secretoire Reacties (bijvoorbeeld, snel of laat voorkomende reacties) kan daarom worden gemist.
In het model van de perfusie, dit probleem wordt overwonnen, als grote steekproef volumes worden verkregen (debiet: 7,5 mL/min) en de intervallen van de collectie kunnen worden aangepast om ervoor te zorgen dat de snelle en korte durende reacties zijn niet gemist (wij voorbeelden verzamelen om min)7 . Een ander probleem met in vivo onderzoeken bij knaagdieren is dat de meeste gut hormonen zelfs meer zijn snel geëlimineerd of gemetaboliseerd dan in mensen8,9,10, die de latere biochemische analyse kunnen bemoeilijken. Bijvoorbeeld, we toonden dat GLP-1 wordt gemetaboliseerd in muizen in een nog sneller tempo dan bij de mens (1-2 min11is waar T1/2 ) en, nog belangrijker, waarbij het splijten van GLP-1 bij muizen, naast N-terminale decolleté door dipeptidyl-dipeptidylpeptidase-4 (DPP4) (dat is het grote GLP-1 vernederende enzym bij de mens), verder splijten door het enzym neutrale endopeptidase 24.1112. Bijgevolg, huidige commerciële testen voor de kwantificering van GLP-1, die ofwel zijn gebaseerd op de intacte isovorm van GLP-1 (7-36amide) of de DPP-4 gekloofd isovorm (9-39amide), enorm onderschatten van GLP-1 secretie in muizen en leiden tot misleidende resultaten 12. in de dunne darm van geïsoleerde geperfundeerd rat, allermeest naar de stofwisseling van secreted hormonen is uitgeschakeld of aanzienlijk verlaagd, aangezien plasma-gemedieerde afbraak wordt vermeden, en extractie/aantasting van de lever/nier/longen wordt geblokkeerd omdat ( perfusaat wordt verzameld als het verlaat de darm).
Natuurlijk belangrijk inzicht kan worden gegenereerd door het gebruik van genetisch gemodificeerde dieren, bijvoorbeeld, sodium-glucose transporter-1 knock-out muizen13, maar een gedetailleerde beoordeling van de moleculaire sensoren die betrokken zijn bij de secretie vaak vereist behandeling van meerdere moleculaire sites, variërend van moleculaire vervoerders tot ionenkanalen en van verschillende G-proteïne-gekoppelde receptoren aan intracellulaire eiwitten. Bijvoorbeeld, we gericht de activiteit van negen verschillende moleculaire sites bij het ontrafelen van de moleculaire sensoren verantwoordelijk voor glucose-gestimuleerd GLP-1 secretie7. Een soortgelijk onderzoek zou niet mogelijk in vivo als sommige van de stoffen gebruikt aspecifieke hebben of schadelijke/letale effecten. Bijvoorbeeld, wanneer u de perfused darm, was het mogelijk om het beoordelen van de rol van intra-cellulaire glucose metabolisme voor de secretie van GLP-1 en neurotensin door het blokkeren van ATP vorming met 2-4-dinitrofenol7,14 , evenals de rol van spanning-gated calcium kanalen voor gal zuur gestimuleerd GLP-1, NT en PYY secretie3. Inderdaad, de zeer giftig natrium kanaal blocker tetrodotoxine kan met succes worden toegepast in de perfusie-studies. Ten slotte, in de perfusie-model het kan worden rechtstreeks beoordeeld waar in de darm een bepaalde stof stimuleert de secretie van een bepaald hormoon, zoals de onderzoeker kan eenvoudig kiezen en bereiden van het gewenste gebied te perfuse, en op hetzelfde moment kunnen worden onderzocht of een stimulus veroorzaakt secretie door activering van moleculaire sensoren van de luminal of vasculaire kant van de darm3,15,16.
De secretoire mechanismen onderliggende gut hormoon afscheiding kan ook worden bestudeerd door gebruik van gut weefsel stukken (inclusief menselijk weefsel), intestinale culturen van de primaire (meestal van de muizen), vereeuwigd hormoon afscheidende cellijnen (voor muis of menselijke oorsprong) door de darm weefsel in Ussing chambers of door organoids (beide meestal uit muizen)2,3,4,5,6,17,18gemonteerd. Vergeleken met intestinale perfusions, studies over de menselijke darm stukken, primaire celculturen en cellijnen zijn technisch eenvoudiger uit te voeren en een snellere en goedkopere manier van het genereren van gegevens, maar natuurlijk de studie van gut stukken vereist toegang tot vers menselijke darm exemplaren. Echter, in deze modellen de normale cel polarisatie van de darm is inherent verloren, wat betekent dat deze modellen niet worden gebruikt voor het beoordelen van de normale activering van moleculaire sensoren, en absorptie processen ook kunnen niet worden bestudeerd. Bovendien dergelijke studies meestal statische incubations dienst (voor tot verschillende h) die is zeer niet-fysiologische en heeft niets te maken met de cellen normaal secretoire dynamiek, omdat het secreted product wordt niet verwijderd en dus kan feedback invloed op de afscheiding van hormonen. In tegenstelling, in de perfused darm, worden secreted en geabsorbeerd moleculen efficiënt verwijderd door de mucosal microcirculatie zoals ze in vivo zijn, ervoor te zorgen dat de transmucosal verlopen worden gehandhaafd zodat absorptie en secretie tegen een normale prijs optreden kunnen. Bovendien, celculturen kunnen hebben dedifferentiated hun inheemse enteroendocrine cel afkomstig zijn, wat betekent dat ze zijn niet langer de vertegenwoordiger van de oorspronkelijke cellen peptide inhoudelijk en expressie van moleculaire sensoren, hoewel ze nog steeds het desbetreffende hormoon afscheiden. Dit is bijvoorbeeld het geval voor de GLP-1 dat cel lijnen19.
Het is daarom onze mening dat primaire celculturen of mobiele lijn studies zijn meest geschikt voor screeningonderzoek en voor het uitvoeren van typen experimenten die niet kunnen uitgevoerd in vivo worden of in de geïsoleerde perfused darm. Bijvoorbeeld, een ware kracht van de primaire celculturen en lijn celculturen is dat intra-cellulaire secundaire boodschappers (bv Ca2 +, kamp, NAD(P)H) in real-time kan worden gecontroleerd, en elektrische signalering van het hormoon afscheidende cellen kunnen 20,21,22onderzocht. Bovendien, kan siRNA knockdown gebeuren, dat is met name handig als specifieke remmers niet beschikbaar20,21,22,23,24. Weefsel van de darm van muizen die zijn gemonteerd in Ussing kamers onlangs is gebruikt voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de gal-zuur gestimuleerd GLP-1 secretie, terwijl intestinale organoids (van muizen) en menselijke darm stukken zijn ook gebruikt voor het bestuderen van de moleculaire details van gut hormoon afscheiding17,25. Overwegende dat de vroegere uitkeringen worden gepolariseerd2 al deze modellen gekenmerkt door statische incubations. Studies over de menselijke darm stukken, echter profiteren van het gebruik van weefsel van menselijke, in plaats van knaagdieren, die belangrijk is aangezien soorten verschil in weefsel expressie van 7TM-receptoren en moleculaire vervoerders kunnen resulteren in verschillende moleculaire sensing routes tussen soorten. In feite, de meeste gegevens in dit veld is gegenereerd door studies over varkens, muizen of ratten, en het blijft ongrijpbaar of deze bevindingen kunnen worden overgedragen op de mens. Het is echter gerust te stellen dat de moleculaire sensing mechanismen die ten grondslag liggen aan de glucose-gestimuleerd GLP-1 secretie lijken vergelijkbaar tussen muis, rat, man, en transcriptomic en peptidomic profilering van muis en mens L-cellen bleek sterk global overeenkomsten tussen de twee soorten7,18,26,27.
De geïsoleerde geperfundeerd rat dunne darm, maar heeft ook enkele beperkingen die u moeten overwegen. Bovenal is het onmogelijk om te bepalen of een bepaalde secretoire reactie voortvloeit uit directe activering door de teststof voor de gerichte hormoon-producerende cellen of liever gezegd wordt veroorzaakt door een indirect mechanisme. Bijvoorbeeld, KCl verhoogt direct GLP-1 secretie van de perfused darm7, maar het blijft onbekend of dit een gevolg van directe depolarisatie van de L-cel of van depolarisatie van neuronen dicht bij de L-cellen of de gevolgen van resultaten tegelijkertijd uitgebracht paracrine stimulatoren/remmers. Gegevens als gevolg van studies met behulp van de perfused darm die gericht zijn op het ophelderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de afscheiding moet daarom altijd worden in context geplaatst met gegevens die zijn verkregen van andere meer specifieke modellen tot het verhogen van de mogelijkheid om vast te stellen causaliteit. Glucose-gestimuleerd GLP-1 secretie van de GLP-1 dat cellijn GLUTag28,29 en van de primaire muisknop L-cellen is bijvoorbeeld afhankelijk van de activiteit van de vervoerders van de glucose (SGLT1 en GLUT2). Deze vervoerders in de geperfundeerd rat dunne darm blokkeren ook verzwakt secretie20, wat betekent dat het is waarschijnlijk dat glucose-gestimuleerd GLP-1 secretie is grotendeels gemedieerd door directe acties van glucose op de L-cel. Een andere belangrijke beperking van de geïsoleerde perfused darm is dat sommige van de lipiden zijn moeilijk om te studeren als gevolg van hun hydrophobicity. Hoewel het mogelijk is te onderzoeken van de eindproducten van lipide spijsvertering (vetzuren, diacyl glycerols, lysophosphatidylglycerols, enz.) en hoewel de voorbereiding mogelijk opnieuw esterify pak de lipiden tijdens cellularly en misschien ze in chylomicrons, het vervoer van de chylomicrons uit de cellen en hun latere opname door de lacteals van de villi is verstoord, omdat de stroom van lymfe in de geïsoleerde darm kan niet worden beveiligd. Meest waarschijnlijk, daarom, lipide absorptie is stopgezet zodra de geabsorbeerde producten begint te ophopen in de cellen. De cel in vitro-systemen zijn zelfs minder geschikt voor lipide studies wegens hun gebrek aan polarisatie. Uiteraard is deze beperking is alleen relevant voor lipiden die worden geabsorbeerd en vervoerd via de lacteals, overwegende dat die geabsorbeerd via de intestinale bloedvaten dreigen te worden normaal verwerkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle studies werden uitgevoerd met toestemming van de Deense dier experimenten inspectie (2013-15-2934-00833) en de lokale ethisch comité, overeenkomstig de richtsnoeren van de Deense wetgeving inzake dierproeven (1987) en de nationale Instituten voor gezondheid (publicatienummer 85-23).
1. proefdieren
- Verkrijgen van mannelijke Wistar ratten (250 g), huis 2 per kooi, met ad libitum toegang tot standaard chow en water, en onderhouden in een 12:12 h licht-donker cyclus. Onze dieren faciliteiten maakt gebruik van niet-behandelde water en Alrtromin knaagdier chow (1319 FORTI, Brogaarden, Lynge, Denemarken).
Opmerking: Toestaan dat dieren ten minste één week voor acclimatisatie.
2. preoperatieve voorbereiding
- Perfusie buffer maken: Krebs-Ringer bicarbonaat buffer aangevuld met 0,1% BSA (deel V), 5% dextran T-70, 3,5 mmol/L glucose en pyruvaat 5 mmol/L, fumaraat en glutamaat (indien nodig); pH 7.4.
- Bereiden van een voldoende hoeveelheid perfusie buffer door het filteren door middel van een passende omvang van de filter en breng pH op ~7.5 door toevoeging van de dropwise van 5 M HCl.
- 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (indien nodig) rechtstreeks toevoegen aan de buffer op de dag van de studie om een eindconcentratie van 10 µM.
Opmerking: IBMX wordt een fosfodiesterase remmer dat [kamp]ik verhoogt en daardoor herstelt de gevoeligheid en de responsiviteit van de darm in termen van afscheidende hormonen op een secretoire prikkel. - Bereiden test oplossing(en). Vasculaire prikkels op een 20 x hogere concentratie dan de gewenste eindconcentratie in gefilterde en pH-aangepast perfusie buffer voor te bereiden. Luminal test prikkels in een isotone zoutoplossing in de uiteindelijke concentratie voor te bereiden.
- Los niet gemakkelijk oplosbare verbindingen in 100% dimethylsulfoxide (DMSO) en vul verder perfusie buffer of isotone zoutoplossing. Voor vasculaire stimuli, de uiteindelijke concentratie van DMSO op 1% of lager, als concentraties boven dit de darm beschadigen en kan leiden tot aspecifieke gut hormoon afscheiding te houden. PH meten en aan te passen aan ~7.5 indien nodig.
3. werking en perfusie
Opmerking: Een illustratie van een perfusie setup vindt u in Figuur 1.
- Anesthetize van de ratten door gebruik van een verdoving regime dat chirurgische anesthesie en analgesie voor 30-40 min door Hypnorm/Midazolam aankunnen (0.3 ml/100 g lichaamsgewicht, per ml: Hypnorm: 0,08 mg fentanyl, 2,5 mg fluanisone, 0,45 mg Methyl Parahydroxybenzoate, 0,05 mg Propyl-Parahydroxybenzoate, Midazolam: 1,25 mg, Matrix Pharmaceuticals, Hellerup, Denemarken)
- Controleren bij gebrek aan reflexen (Teen snuifje), plaatst u de rat op de verwarmde operatietafel en uitvoeren van een insnijding van de huid tot het blootstellen van de darm.
-
De terminal deel van de dikke darm door het bewegen van de dunne darm opzij zoveel mogelijk bloot. Tie van het leveren van therapieën aan de dikke darm en de accijnzen het geleidelijk vanaf de terminal deel van de dikke darm, op weg naar de dunne darm.
- Als er slechts een bepaald deel van de dunne darm is vereist voor perfusie (de bovenste helft), accijnzen niet-vereiste segmenten na koppelverkoop uit het verstrekken van therapieën. Minimaliseren van weefselschade, hydrateren van de darm met isotonische zoutoplossing en wissers kunt verwijderen van bindweefsel.
- Invoegen van een plastic buis (lengte: ~ 15 cm, buitendiameter: ~0.4 cm) in de intestinale lumen (in het proximale deel) en de stropdas goed met behulp van hechtingen. Spoel zorgvuldig met isotonische zoutoplossing (kamertemperatuur) de lumen van Chymus legen.
- Perfuse de lumen met de isotonische zoutoplossing in een flow van 0,25 mL/min, met behulp van een 10 mL spuit aangesloten op een spuitpomp.
- De darm opzij verplaatsen, zodat de bovenste mesenterische slagader toegankelijk is en verwijderen van bindweefsel en vet weefsel om de slagader bloot te stellen.
- Plaats twee hechtingen onder de mesenterische slagader met behulp van fijne punt pincet; een van de hechtingen is om de slagader naar besturingselement bloeden zodra de slagader heeft verlaagd en de andere is voor het beveiligen van de katheter die moet worden geplaatst in de slagader op te heffen. Nemen voorzichtigheid niet aan perforate van de slagader.
- Plaats twee hechtingen onder de ader van de portal voor het beveiligen van de metalen katheter dat gaat in de ader voor collectie van perfusie effluent worden geplaatst.
- Zorg ervoor dat de katheter die tot ingevoegd in de slagader gaat is gevuld met perfusie buffer lucht embolus vorming te voorkomen voordat het gat in de mesenterische slagader knippen.
- Knip een klein gaatje in de mesenterische slagader met behulp van een paar chirurgische schaar en invoegen van de kunststof katheter onmiddellijk na.
- Onmiddellijk nadat de katheter is verkregen, initiëren perfusie van de darm door het starten van de roller pomp (debiet = 7,5 mL/min).
- Bevestigen dat de bloedvaten in de darm bleke binnen enkele seconden zet, en de portal vein bleke draait.
- Onmiddellijk nadat de juiste perfusie is vastgesteld, een gat te maken in de portal ader, plaats de metalen katheter en veilig met de hechtdraad.
Opmerking: De katheter kan zijn moeilijk te plek maar de ader door voorzichtig trekken de meest proximale hechtdraad helpt opheft. - Zodra de katheters ingevoerd worden en perfusie uitvoer bevredigend is, doden de rat door middenrif perforatie, voorzichtig om niet te rippen van de katheters.
- Verzamelen van perfusie output voor 1 min en meet het volume. Start de perfusie druk acquisitie/opnames door Klik Experiment uitvoeren in het programma voor het opnemen van druk.
- Dekking van de darm met bevochtigde weefsel te voorkomen uitdroogt tijdens het experiment.
- Zorg ervoor dat de distale einde van de darm niet is geblokkeerd, zodat de luminal afvalwater kan afsluiten, anders de darm zal zwellen, oedeem zal ontwikkelen, perfusie druk toenemen zal en perfusie uitvoer zal dalen.
- Laat de voorbereiding gedurende ongeveer 30 minuten vóór de inleiding van het experiment.
Opmerking: De secretoire uitgangen van gut hormonen zijn zeer wankele voor de eerste 15 min van perfusie, zodat deze evenwichtsinstelling stap is nodig om een gestage basislijn.
4. experiment
- Na ongeveer 30 min van perfusie, start het experiment door het verzamelen van de eerste basislijn monster met behulp van een breuk-verzamelaar. Monsters verzamelen op het gewenste interval (bijvoorbeeld elke min, 6.5-7.5 mL worden meestal verzameld) en leg ze op ijs binnen paar minuten.
-
De waterventiel regelmatig controleren en, als leeggemaakt, vullen het met perfusie buffer.
- Verzamel de buffer door middel van de drie-pik-wegkraan onmiddellijk voordat zij het orgel en van de katheter in de ader portal (nadat het heeft zijn geperfundeerd door middel van het orgel) ingevoegd om te bevestigen dat het orgel metabolisch actief is. Het verzamelen van monsters aan het begin en einde van het experiment te beoordelen van de levensvatbaarheid gedurende het gehele experiment.
- Meten monsters snel, met een geautomatiseerde bloed-gas analyzer, aangezien meest kunststof bevat/spuiten niet volledig luchtdicht, aanleiding uit te wisselen met de atmosferische lucht.
- Na 10-15 min van basislijn collectie, stimuleren met de eerste teststof. Intra-arteriële stimulaties beheren met een spuitpomp via een drieweg afsluiter (stroom = 0.350 mL/min).
- Luminal stimulaties uitvoeren door een eerste bolus injectie (2,5 mL/min gedurende de eerste 5 min), ter vervanging van de isotonische zoutoplossing die al in het lumen, gevolgd door de administratie van de meetoplossing ligt een lager debiet (0,5 mL/min).
- Om ervoor te zorgen dat de lumen wordt snel geleegd van teststof na het verstrijken van de luminal stimulatie, spoel de intestinale lumen met isotonische zoutoplossing door dezelfde stroomsnelheid zoals hierboven toe te passen.
- Verzamel monsters van de basislijn voor de 15-30 min voordat de volgende teststof wordt toegediend. Afhankelijk van het protocol, kunnen 2-3 test prikkels meestal worden opgenomen per experiment. Als de experimentele protocol activering/inhibitie van een bepaalde moleculaire site tegelijk met de toediening van een bepaalde secretagogue bevat, altijd vooraf stimuleren met de activator/remmer 10-15 min voor het beheer van de secretagogue te Zorg ervoor dat de moleculaire site aan het begin van de infusie van de secretagogue wordt geremd.
- Aan het eind van het protocol, beheren (5-10 min) een geschikt positieve controle om te testen voor responsiviteit van de voorbereiding en het verzamelen van 10-15 min basislijn monsters na de periode van de stimulatie.
Opmerking: Verschillende stoffen kunnen worden gebruikt als positieve controle, bijvoorbeeld test, stimuli voor toenemende [kamp]ik (bijvoorbeeld foskolin of IBMX), [Ca2 +]ik (bijvoorbeeld Bombesine of neuromedin C), depolarizing agentia (bijvoorbeeld, 30-50 mM KCl) of meer fysiologisch relevante prikkels zoals macronutriënten: Peptonen, aminozuren, glucose, enz. De keuze van positieve controle is echter afhankelijk van de experimentele resultaten. Glucose is bijvoorbeeld een slechte Cholecystokinine (CCK) secretagogue Bombesine is dat niet een robuuste secretagogue voor glucose-afhankelijke insulinotropic peptide (GIP) secretie30. - Na het einde van het experiment, de perfused darm accijnzen, wegen en meten van de lengte. Zet het in paraformaldehyde en slaat (4 ° C) voor potentiële later histochemische analyse van weefsel integriteit/schade, bijvoorbeeld door H & E kleuring.
5. biochemische metingen
- Kwantificeren van concentraties van secreted peptiden in het veneuze afvalwater door gebruik van een eigen bedrijf of commercieel beschikbare radioimmunoanalyses (RIA) of ELISA-testen. Voor studies die intestinale absorptie onderzoeken, de molecule van belang, bijvoorbeeld, -glucose of aminozuren, in het veneuze effluent te kwantificeren.
Opmerking: Het perfusaat is meestal een goed basaal buffer voor de meeste analyses, met inbegrip van tests die is gebaseerd op enzymatische reacties (zoals kwantificering van glucose door de glucoseoxidase-methode).
6. de gegevensanalyse
- Presenteren van gegevens op verschillende manieren, bijvoorbeeld als een grafiek van de tijd-concentratie toont de werkelijke secretoire output (stroom x concentratie) en als kolom complot beeltenis van de totale secretoire uitgang basislijn en antwoord perioden (gewoonlijk 10-15 keer punten).
- Uitzetten van de werkelijke gemeten concentratie van de respectieve hormonen als concentratie eenheden. (pmol/L),
Opmerking: Het is beter om in plaats daarvan express-gegevens als output (fmol/min) omdat met dit model, in tegenstelling tot in vivo onderzoek, de verkregen waarden de werkelijke secretoire output (vanwege de constante collectie van perfusie effluent zijn). - Afhankelijk van het aantal groepen statistisch worden geanalyseerd, gebruik tweezijdige gepaarde t-test (twee groepen) of one-way ANOVA voor herhaalde metingen (meer dan twee groepen) gevolgd door een passende post-hoc test voor meerdere vergelijkingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De mogelijkheid om te bepalen of een bepaalde stimulus secretie van het hormoon van de darm van belang veroorzaakt, is afhankelijk van een constante basislijn-secretie. Bovendien, indien geen reactie is op de prikkel wordt waargenomen, een robuuste secretoire reactie op de positieve controle moet duidelijk zijn om uit te sluiten dat het gebrek aan respons op de test prikkel niet met een algemeen gebrek aan respons overeenkomt. Figuur 2A en 2B ziet u een voorbeeld van de gegevens van goede kwaliteit; GLP-1 secretie van de geïsoleerde geperfundeerd rat dunne darm worden getoond 1-min tussenpozen (middelen ± SEM). Onder basale omstandigheden is de secretie stabiel; zowel vóór als na toediening van de test stimulus (insuline), en een robuuste secretoire reactie op de positieve is controle (Bombesine (BBS)) duidelijk. Bovendien gemiddeld secretie van de GLP-1 op basale voorwaarden (tijdens de respectieve basislijn periodes voorafgaand aan insuline of BBS administratie) en gemiddelde secretie tijdens insuline en BBS stimulatie staan als bar grafieken (middelen ± SEM). Secretie werd getest voor statistische significantie door one-way ANOVA voor herhaalde metingen. Op basis van deze gecombineerde gegevens, kan worden geconcludeerd dat intra-arteriële insuline niet de secretie van de GLP-1 uit de geïsoleerde geperfundeerd rat dunne darm stimuleert.
Figuur 2C en 2D ziet u een voorbeeld van GLP-1 secretie van de geïsoleerde geperfundeerd rat dunne darm. In tegenstelling tot figuur 2A en 2Bzijn deze gegevens van slechte kwaliteit; de afscheiding is onvast op basale voorwaarden en hele naar boven drijft op een manier die lijkt te zijn niets te maken met testen stof overheidsdiensten (intra-luminal en intra-arteriële fructose, respectievelijk) en de positieve controle, BBS, resulteert niet in statistisch significant verhoogd secretie van GLP-1. Het is dus onmogelijk om af te sluiten of de fructose stimulaties aanleiding geven tot GLP-1 secretie, b.v. is de toegenomen afscheiding van de GLP-1 aan het eind van de vasculaire fructose stimulatie een fructose-gemedieerde antwoord of niet.
Figuur 1: een voorbeeld van een setup perfusie. Het systeem bestaat uit een plexiglas stand, een verwarmde operatietafel, een warmtewisselaar met ingebouwde Waterventiel, manometer en een spindel pomp voor perfusie druk aanpassing. De perfusie-systeem is aangesloten op een thermostatische rondpompthemostaat die de getankte (95% O2, 5% CO2 verwarmt) perfusie buffer tot 37 ° C. Bovendien, is perfusie druk continu geregistreerd en getransduceerde door de opname van de drukopnemer gevisualiseerd en opgeslagen op een PC met de geschikte software. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: gegevens uit de dunne darm van geïsoleerde geperfundeerd rat. (A, B) een voorbeeld van een goed uitgevoerde experimenten en betrouwbare gegevens, (C, D) een voorbeeld van sub-optimale gegevens waar perfusie druk toegenomen, en perfusie uitvoer daalde dramatisch in de tijdsverloop van de studie. (A) GLP-1 (totaal) uitgang (fmol/min) is afgebeeld op de basale voorwaarden en in reactie op intra-arteriële insuline toediening (200 en 1000 pM, zoals aangegeven). Bombesine (BBS), een bekende, krachtige secretagogue van GLP-1, was tijdens arterially toegediend aan het einde van het experiment om te bepalen voor de reactiesnelheid (pos. control). Gegevens worden gepresenteerd zoals betekent ± SEM, n = 4. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De geïsoleerde geperfundeerd rat dunne darm is een krachtige onderzoeksinstrument waarmee de dynamiek en de moleculaire mechanismen ten grondslag liggen aan de darm hormoon afscheiding tot in detail worden bestudeerd. De meest kritische stap voor de succesvolle productie van gegevens met dit model is de chirurgische ingreep. Behandeling van de darm zal onvermijdelijk wat schade aan de darm veroorzaken en moet daarom worden beperkt tot een absoluut minimum. De snelheid van werking is zelfs nog belangrijker, sleutel, met name ten aanzien van de tijd voor de plaatsing van de katheter in de mesenterische slagader. Onze ervaring is dat de katheter met succes moet worden geplaatst, en de perfusie moet worden ingeleid binnen een paar minuten na het gat in het vaartuig hebben gesneden. De plaatsing van de katheters is het meest uitdagende deel van de operatie wordt bemoeilijkt door de kleine omvang van de mesenterische slagader en de dunne wand van de ader van de portal en deze stap vereist enige oefening. Snelle opname van de veneuze katheter is, echter niet zo urgent als bij de mesenterische slagader, als de darm is nu geperfundeerd en levend gehouden. De volgende kritieke stap is het uitvoeren van het experiment. Als de bewerking met succes is uitgevoerd, de perfused darm zal meestal gedijen en ontvankelijk voor maximaal 3 h en perfusie druk en uitvoer zal meestal constant blijft over het hele experiment. De belangrijkste factor voor een succesvol experiment in dit stadium is te vermijden bubbels krijgen in het systeem, omdat dit zorgt ervoor dat lucht embolisatie kan leiden die ofwel direct vermindert of de perfusie-output elimineert. Zoals de perfusie buffer BSA bevat en om te zorgen voor voldoende zuurstof levering aan de perfused gut is vergast, is het moeilijk om volledig te voorkomen dat de vorming van luchtbellen. Bubbels moet echter gevangen in de systemen Waterventiel, maar dit geleidelijk leegt na verloop van tijd (de meer bubbels, de sneller leeg) en daarom is het belangrijk om te houden nauwlettend in de gaten op de waterventiel en het vullen met perfusie buffer wanneer nodig. Het is ook belangrijk om te houden van de pH van de perfusaat minder dan 7,5 — op het verhogen van pH, calciumcarbonaat precipitaten kunnen uitmaken, capillaire stroom te belemmeren en veroorzaken een ernstige toename van de druk van de perfusie.
De perfused darm is een vrij robuuste voorbereiding, maar het tolereert geen hoge concentraties van detergentia zoals galzuren, ethanol en DMSO. Daarom is het gebruik van detergentia dient bij voorkeur vermeden te worden maar is soms nodig om slecht oplosbare stoffen in oplossing. De perfused darm in het algemeen tolereert detergentia toegediend intra-luminally beter dan tijdens vascularly. Bijvoorbeeld, werd beheer van 1 mM taurodeoxycholic zuur (een secundaire, geconjugeerd gal-zuur) getolereerd goed wanneer intraluminally toegediend maar direct in geblokkeerde perfusie uitgang resulteerde wanneer geleverd tijdens arterially2. Voor vasculaire stimulaties, houden de eindconcentratie van DMSO minder dan 1% te vermijden van aspecifieke secretoire Reacties (DMSO stimuleert, bijvoorbeeld, de secretie van de GLP-1) en verpakkingseenheid weefselschade wat resulteert in verhoogde perfusie druk en daalde perfusie uitgang. Experimenten moeten buiten beschouwing worden gelaten als de perfusie output met meer dan 20% in de loop van de studie, daalt als de perfusie druk stijgt met meer dan 20% of als oedeem ontwikkelt. Naleving van deze succescriteria van de macroscopische (met inbegrip van snelle inbrengen van de katheter in de mesenterische slagader) resulteert gewoonlijk in goede kwaliteit in ~14/15 experimenten.
Na het voltooien van het experiment, is de volgende kritische procedure om te kiezen van de juiste methode en assay voor de kwantificering van de hormone(s) van belang. Hoge via-put keuring van peptide hormonen kan worden uitgevoerd met behulp van immunoassay: radioimmuunbepaling of ELISA. In ieder geval, is het sterk aanbevolen om het valideren van de respectieve testen voordat u ze gebruikt voor monster kwantificering, terwijl niet alle commercieel beschikbare tests op bevredigende wijze met betrekking tot de gevoeligheid, specificiteit en nauwkeurigheid uitvoeren (bijvoorbeeld met betrekking tot GLP-131). Met betrekking tot de specificiteit is Kruisallergie, zoals altijd, een punt van zorg. Aspecifieke inmenging en matrix effecten worden over het algemeen minder uitgesproken met kunstmatige perfusates in vergelijking met plasma. Met betrekking tot de gevoeligheid, het is vaak veel makkelijker te verkrijgen van betrouwbare gegevens van perfusions dan van in vivo studies als de peptide concentraties vaak hoger zijn omdat het perfusie effluent wordt niet verdund in de systemische circulatie en omdat eliminatie processen (door de lever/Long/nier) worden vermeden. Typisch, basislijn concentraties in veneuze effluenten liggen binnen de lagere werkbereik van de meeste tests (in het geval van GLP-1 (totaal), neurotensin (totaal) en PYY (totaal): 8-15 pmol/L) terwijl gestimuleerd reacties zo hoog als 200-300 pmol/L3 bereiken kunnen.
Ter vergelijking: de waarden volgens de basislijn van de dezelfde hormonen in plasma van gezonde mensen, ratten of muizen zijn meestal en 5-10 pmol/L overwegende dat responswaarden 15-30 pmol/L3,32.
Als de vooraf gedefinieerde succescriteria in acht worden genomen, de gegenereerde perfusie-gegevens zijn meestal van goede kwaliteit en de statistische analyse is dan eenvoudig. In vergelijking met de secretie van insuline, glucagon en Somatostatine van de geïsoleerde geperfundeerd rat of muis alvleesklier, de basale secretie van gut hormonen is stabiel, en eerder vergelijkbaar tussen experimenten met betrekking tot de gemeten concentraties, en de afscheiding is niet duidelijk Pulsatiele. Collectief, de variatie in de gegevensset is daarom minimaal en zo laag als drie perfusie experimenten op de grootte van een steekproef is vaak voldoende statistische significantie. De grootte van een steekproef van zes tot acht wordt echter aanbevolen om te standaardiseren en type-2-fouten voorkomen, alsmede om de mogelijkheid van het minder goed uitgesproken reacties met uitzicht op.
Kortom is de geïsoleerde geperfundeerd rat dunne darm een belangrijk, fysiologisch relevant, experimentele model dat kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de directe effecten van een bepaalde stof op gut hormoon afscheiding. Belangrijke fundamentele vragen, zoals waar in de darm een secretagogue stimuleert de secretie, of het stimuleert secretie door activering van luminally of basolaterally gelegen sensoren, en welke moleculaire sensoren zijn geactiveerd en dus verantwoordelijk voor de afscheiding kan worden aangesproken in detail met dit model. Het moet, echter, worden erkend dat het afkoppelen van de darm van het donordier, voor sommige studie vragen, wellicht van belang. Bijvoorbeeld, de darm nauw samenwerkt met de lever (de darm-lever-as) en de hersenen (de gut-brain-as), en mechanismen die afhankelijk zijn van deze cross-talk daarom kunnen niet met dit model worden onderzocht. De kwaliteit van de operatie is de kritische factor voor de kwaliteit van de gegevens en de belangrijkste factoren voor een succesvolle operatie zijn te houden hanteren van de darm tot een minimum te beperken en te snel beginnen perfusie van de darm zodra de mesenterische slagader heeft verlaagd. Het is onze ervaring dat het duurt 2-4 maanden van praktijk voordat gegevens van goede kwaliteit worden geproduceerd. Echter, zodra de techniek is geleerd, de mogelijkheden van deze methode zijn bijna eindeloos en alleen beperkt door de oplosbaarheid van de teststoffen en eventuele schadelijke effecten teststoffen op het perfused weefsel hebben kunnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs van dit werk verklaren geen potentiële belangenconflicten relevant voor dit artikel.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een onbeperkte subsidie aan Prof. Jens Juul Holst van de Novo Nordisk centrum voor metabole basisonderzoek (Novo Nordisk Foundation, Denemarken), een aparte subsidie van de Novo Nordisk Foundation for doet knaagdier perfusie studies (verlenen neen. NNF15OC0016574), een subsidie aan Prof. Holst van de European Research Council (Grant no.695069) en de Europese Unie is zevendekaderprogramma voor onderzoek, technologische ontwikkeling en demonstratie (Grant No. 266408) evenals een postdoc verlenen aan Rune E. Kuhre vanaf de Stichting van Lundbeck (R264-2017-3492). Wij danken Jenna E. Hunt en Carolyn F. Deacon voor zorgvuldig proeflezen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for perfusion buffer | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 1.12018.0500 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O) | Merck | 102382 | |
| Dextran 70 | Pharmacosmos | 40014 | |
| Fumaric acid disodium salt (C44H2Na2O4) | Sigma Aldrich | F9642 | |
| Glucose (C6H12O6) | Merck | 108342 | |
| Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4) | Merck | 105886 | |
| Potasium chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck | 104873 | |
| Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4) | Merck | 106619 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | ||
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O) | Merck | 106445 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion equitment | |||
| Universial perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | |
| BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834 | Harvard Bioscience, Inc. | ||
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Cannula with basked, OD = 2.0 mm, ID = 1.0 mm | Harvard Bioscience, Inc. | 733313 |
References
- Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
- Brighton, C. A., et al. Bile Acids Trigger GLP-1 Release Predominantly by Accessing Basolaterally Located G Protein-Coupled Bile Acid Receptors. Endocrinology. 156, 3961-3970 (2015).
- Kuhre, R. E., et al. Bile acids are important direct and indirect regulators of the secretion of appetite- and metabolism-regulating hormones from the gut and pancreas. Molecular Metabolism. , (2018).
- Roberge, J. N., Brubacker, P. L. Secretion of Proglucagon-Derived Peptides in Response to Intestinal Luminal Nutrients. Endocrinology. 128, 3169-3174 (1991).
- Brubaker, P. L., Schloos, J., Drucker, D. J. Regulation of glucagon-like peptide-1 synthesis and secretion in the GLUTag enteroendocrine cell line. Endocrinology. 139, 4108-4114 (1998).
- Jacobsen, S., et al. Changes in Gastrointestinal Hormone Responses, Insulin Sensitivity, and Beta-Cell Function Within 2 Weeks After Gastric Bypass in Non-diabetic Subjects. Obesity Surgery. 22, 1084-1096 (2012).
- Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine. Diabetes. 64, 370 (2014).
- Svendsen, B., Holst, J. J. Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines. Peptides. 77, 47-53 (2016).
- Ratner, C., et al. Effects of Peripheral Neurotensin on Appetite Regulation and Its Role in Gastric Bypass Surgery. Endocrinology. 157, 3482-3492 (2016).
- Wewer Albrechtsen, N. J., et al. Dynamics of glucagon secretion in mice and rats revealed using a validated sandwich ELISA for small sample volumes. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 311, E302-E309 (2016).
- Vilsboll, T., Agerso, H., Krarup, T., Holst, J. J. Similar elimination rates of glucagon-like peptide-1 in obese type 2 diabetic patients and healthy subjects. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 88, 220-224 (2003).
- Windelov, J. A., et al. Why is it so difficult to measure glucagon-like peptide-1 in a mouse? Diabetologia. 60, 2066-2075 (2017).
- Gorboulev, V., et al. Na+-d-glucose Cotransporter SGLT1 is Pivotal for Intestinal Glucose Absorption and Glucose-Dependent Incretin Secretion. Diabetes. 61, 187-196 (2012).
- Kuhre, R. E., Bechmann, L. E., Wewer Albrechtsen, N. J., Hartmann, B., Holst, J. J. Glucose stimulates neurotensin secretion from the rat small intestine by mechanisms involving SGLT1 and GLUT2, leading to cell depolarization and calcium influx. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 308, E1123-E1130 (2015).
- Kuhre, R. E., Christiansen, C. B., Saltiel, M. Y., Wewer Albrechtsen, N. J., Holst, J. J. On the relationship between glucose absorption and glucose-stimulated secretion of GLP-1, neurotensin, and PYY from different intestinal segments in the rat. Physiological Reports. 5, (2017).
- Svendsen, B., et al. An analysis of cosecretion and coexpression of gut hormones from male rat proximal and distal small intestine. Endocrinology. 156, 847-857 (2015).
- Goldspink, D. A., et al. Mechanistic insights into the detection of free fatty and bile acids by ileal glucagon-like peptide-1 secreting cells. Molecular Metabolism. 7, 90-101 (2018).
- Sun, E. W., et al. Mechanisms Controlling Glucose-Induced Glp-1 Secretion in Human Small Intestine. Diabetes. , (2017).
- Kuhre, R. E., et al. Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716 and STC-1 cells: a comparison to native L-cells. Journal of Molecular Endocrinology. 56, 11 (2016).
- Reimann, F., et al. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell Metabolism. 8, 532-539 (2008).
- Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, 161-175 (2005).
- Kuhre, R. E., et al. Fructose stimulates GLP-1 but not GIP secretion in mice, rats and humans. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306, G622-G630 (2014).
- Reimann, F., Tolhurst, G., Gribble, F. M. G-Protein-Coupled Receptors in Intestinal Chemosensation. Cell Metabolism. 15, 421-431 (2012).
- Parker, H. E., et al. Molecular mechanisms underlying bile acid-stimulated glucagon-like peptide-1 secretion. British Journal of Pharmacology. 165, 414-423 (2012).
- Petersen, N., et al. Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids. Diabetes. 63, 410-420 (2014).
- Parker, H., et al. Predominant role of active versus facilitative glucose transport for glucagon-like peptide-1 secretion. Diabetologia. 55, 2445-2455 (2012).
- Roberts, G. P., et al. Comparison of Human and Murine Enteroendocrine Cells by Transcriptomic and Peptidomic Profiling. Diabetes. , (2019).
- Reimann, F., Gribble, F. M. Glucose-Sensing in Glucagon-Like Peptide-1-Secreting Cells. Diabetes. 51, 2757-2763 (2002).
- Drucker, D. J., Jin, T., Asa, S. L., Young, T. A., Brubaker, P. L. Activation of proglucagon gene transcription by protein kinase-A in a novel mouse enteroendocrine cell line. Molecular Endocrinology. 8, Baltimore, Md. 1646-1655 (1994).
- Svendsen, B., et al. GLP1- and GIP-producing cells rarely overlap and differ by bombesin receptor-2 expression and responsiveness. The Journal of Endocrinology. 228, 39-48 (2016).
- Bak, M. J., et al. Specificity and sensitivity of commercially available assays for glucagon-like peptide-1 (GLP-1): implications for GLP-1 measurements in clinical studies. Diabetes, Obesity & Metabolism. 16, 1155-1164 (2014).
- Jacobsen, S. H., et al. Effects of gastric bypass surgery on glucose absorption and metabolism during a mixed meal in glucose-tolerant individuals. Diabetologia. 56, 2250-2254 (2013).
