Summary
Nous présentons ici un modèle puissant et physiologique pour étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la sécrétion de l’hormone intestinale et l’absorption intestinale, l’intestin grêle de rat isolé et perfusé.
Abstract
L’intestin est le plus grand organe endocrinien du corps, produisant plus de 15 hormones peptidiques différents qui régulent l’appétit et l’alimentation, digestion, absorption des nutriments et distribution et excursions de la glycémie post-prandiale. Comprendre les mécanismes moléculaires qui régulent la sécrétion de l’hormone intestinale est fondamental pour comprendre et traduire gut hormone physiologie. Traditionnellement, les mécanismes qui sous-tendent la sécrétion de l’hormone intestinale sont bien étudiés in vivo (chez les animaux ou les humains) ou l’utilisation primaire de sécrétant des hormones du tube digestif muqueux cultures de cellules ou lignées de cellules. Ici, nous introduisons un intestin grêle de rat perfusée isolé comme une méthode alternative pour l’étude de la sécrétion de l’hormone intestinale. Les vertus de ce modèle sont qu’il repose sur l’intestin intact, ce qui signifie qu’il récapitule la plupart des paramètres physiologiquement importants responsables de la sécrétion des études in vivo, y compris les muqueuse polarisation, relations paracrine et itinéraires de exposition de perfusion/stimulation. En outre et contrairement aux études in vivo, l’intestin grêle de rat perfusée isolé permet un contrôle expérimental presque complet et une évaluation directe de la sécrétion. Contrairement aux études in vitro, il est possible d’étudier l’ampleur et la dynamique de la sécrétion et à poser des questions importantes, telles que quels stimuli provoquent la sécrétion d’hormones différentes gut, de quel côté du tube digestif (luminal ou vasculaire) est la sécrétion Ils sont stimulés et d’analyser dans les capteurs moléculaires de détail qui sous-tendent la réponse sécrétoire. En outre, la préparation est un modèle puissant pour l’étude de l’absorption intestinale et des détails sur la dynamique de l’absorption intestinale, y compris les transporteurs responsables.
Introduction
L’intestin est le plus grand organe endocrinien du corps, produisant plus de 15 hormones peptidiques différents qui régulent l’absorption des nutriments et de disposition des éléments nutritifs, de croissance intestinale et modulent l’appétit1. Hormones du tube digestif sont, par conséquent, impliqués dans de nombreux processus physiologiques fondamentaux, et de comprendre ces schémas de sécrétion et les détails moléculaires qui contrôlent la sécrétion des hormones respectifs est donc importante pour notre physiologiques de base compréhension et pour traiter des aspects translationnelles des actions de l’hormone intestinale ; Mais comment on peut étudier les mécanismes moléculaires de détection qui sous-tendent la sécrétion de l’hormone intestinale ? En général, la sécrétion de l’hormone peut être étudiée dans les organismes intacts (les humains ou les animaux de laboratoire), de préparations d’intestin isolé ou de cultures de cellules primaires de tube digestif sécrétant des hormones ou immortalisé cell cultures2,3, 4 , 5 , 6. notre modèle préféré est l’intestin grêle de rat isolé et perfusé, qui est un modèle physiologiquement pertinent qui permet la sécrétion d’hormones du tube digestif à étudier en détail avec une résolution temporelle optimal (sécrétion taux peuvent être déterminés avec n’importe quel moment base à la seconde), et les résultats sont probables transférable à une situation in vivo7. Ici, nous fournissons un protocole détaillé sur la façon d’effectuer cette procédure, mais tout d’abord nous allons discuter d’autres méthodes pour étudier la sécrétion de l’hormone intestinale, y compris les avantages et les limites de ces modèles par rapport à l’intestin grêle de rat isolé et perfusé.
Si l'on veut établir si un composé spécifique régule la sécrétion de certaines hormones du tube digestif, les études chez l’humain sont le but ultime. Ainsi, si un composé montre des effets considérables sur la sécrétion d’une ou plusieurs hormones intestinale chez les rongeurs (in vivo ou perfusions) ou d’hormones sécrétant des cellules (lignées cellulaires ou cellules primaires), cet effet est uniquement pertinent à la médecine et de physiologie humaine si elle peut être confirmée chez l’homme. Cependant, il y a des limites claires pour le type d’études qui peuvent être effectuées chez l’humain, et des études in vivo sur les animaux de laboratoire sont donc souvent la deuxième-meilleure option pour de telles études. Souris et les rats sont les animaux de laboratoire le plus souvent utilisés sans doute en raison de leur taille pratique, faible coût et la possibilité de modifier génétiquement les gènes soupçonnés d’implication dans les questions de l’étude spécifique (par exemple, frapper hors certains transporteur ou récepteurs). En général, les modèles in vivo gagnerait à être physiologiquement intact, mais aussi présentent plusieurs limites. Surtout, la petite taille des rongeurs, en particulier les souris, est un facteur limitant, comme la plupart dosages pour la quantification d’hormone intestinale nécessitent au moins 20 µL de plasma (et souvent beaucoup plus), ce qui signifie qu’au moins 100 µL de sang doit être retirée pour faire un duplicata quantification. Par conséquent, il n’est possible d’obtenir de très peu d’échantillons correspondant aux échantillons de départ et un ou deux échantillons après stimulation (le volume sanguin total chez une souris de 20 g est ~1.4 mL). Par conséquent, les réponses sécrétrices potentiels (par exemple, rapidement ou réponses tardive survenant) peut donc manquer.
Dans le modèle de la perfusion, ce problème est surmonté, comme échantillon de grand volumes sont obtenues (débit : 7,5 mL/min) et les intervalles de la collection peuvent être ajustés selon les besoins pour s’assurer que les réponses rapides et de courte durée ne sont pas ratés (nous recueillir les échantillons toutes les min)7 . Un autre problème avec études in vivo chez les rongeurs est que la plupart des hormones intestin sont encore plus rapidement éliminé ou métabolisé que chez les humains8,9,10, ce qui peut compliquer l’analyse biochimique qui. Par exemple, nous avons montré que le GLP-1 est métabolisé chez les souris à un rythme encore plus rapide que chez les humains (où T1/2 est 1-2 min11) et, plus important encore, que le clivage du GLP-1 chez les souris implique, outre un clivage N-terminale de dipeptidyl-peptidase-4 (DPP4) (qui est l’enzyme dégradant majeur de GLP-1 chez l’homme), plus le clivage par l’enzyme endopeptidase neutre 24.1112. En conséquence, les tests commerciaux actuellement pour la quantification du GLP-1, qui reposent soit sur l’isoforme intact du GLP-1 (7-36amide) ou l’isoforme de la DPP-4 clivé (9-39amide), largement sous-estiment la sécrétion de GLP-1 chez les souris et entraînent trompeuse des résultats 12. dans l’intestin grêle de rat isolé et perfusé, la plupart du métabolisme des hormones sécrétées est éliminé ou sensiblement réduit, puisque la dégradation induite par le plasma est évitée, et extraction de foie/rein/poumon/dégradation est empêchée (parce que perfusat est perçue comme il laisse le tube digestif).
Bien sûr, un aperçu important peut être généré par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés, par exemple, sodium-glucose transporteur-1 knockout souris13, mais nécessite une évaluation détaillée des sondes moléculaires impliqués dans la sécrétion souvent examen des sites moléculaires multiples, allant des transporteurs moléculaires de canaux ioniques et des différents récepteurs couplés aux protéines G de protéines intracellulaires. Par exemple, nous avons ciblé l’activité des neuf sites moléculaires différentes lors de démêler les capteurs moléculaires responsables de la sécrétion de GLP-1 stimulée par le glucose7. Une enquête similaire ne serait pas possible in vivo, comme certains des composés utilisés imprécise ou effets nocifs/létaux. Par exemple, lorsque vous utilisez l’intestin perfusé, il a été possible d’évaluer le rôle du métabolisme du glucose intra-cellulaire de la sécrétion de GLP-1 et la neurotensine en bloquant la formation d’ATP avec 2-4-dinitrophénol7,14 , mais aussi le rôle de canaux voltage-dépendants de calcium des acides biliaires stimulent de la sécrétion de GLP-1, NT et PYY3. En effet, la tétrodotoxine de bloqueur de canal sodium hautement toxique peut être appliquée avec succès dans les études de perfusion. Enfin, dans le modèle de perfusion il peut être directement évaluée où dans le tube digestif un certain composé stimule la sécrétion d’une hormone de certains, que l’enquêteur peut simplement choisir et préparer la région souhaitée pour perfuse, et en même temps, elle peut être étudiée Si un stimulus provoque la sécrétion par l’activation des capteurs moléculaires du côté luminal ou vasculaire de l’intestin3,15,16.
Les mécanismes de sécrétion sécrétion intestinale sous-jacente peut également être étudiée par utilisent des morceaux de tissu de tube digestif (y compris les tissus humains), hormone de cultures primaires intestinale (habituellement des souris), immortalisés sécrétant des lignées cellulaires (de souris ou d’origine humaine), de l’intestin tissu monté dans des chambres de Ussing ou en organoïdes (à la fois plus souvent des souris)2,3,4,5,6,17,18. Par rapport aux perfusions intestinales, études sur les pièces de l’intestin humain, cultures de cellules primaires et des lignées cellulaires sont techniquement plus faciles à réaliser et sont un moyen plus rapide et moins coûteux de produire des données, mais bien sûr l’étude des morceaux de tube digestif requiert l’accès à l’intestin humain frais spécimens. Toutefois, dans ces modèles la polarisation normale des cellules de l’intestin est intrinsèquement perdue, ce qui signifie que ces modèles ne peuvent servir à évaluer l’activation normale de sondes moléculaires, et processus d’absorption ne peuvent également être étudiés. En outre, ces études utilisent habituellement des incubations statiques (pour jusqu'à plusieurs h) qui est hautement non physiologiques et n’a rien à voir avec dynamique de sécrétion normale LiPo, parce que le produit sécrété n’est pas supprimé et donc vos commentaires peuvent influencer le sécrétion d’hormones. En revanche, dans l’intestin perfusé, molécules sécrétées et absorbés sont efficacement éliminés par la microcirculation muqueuse de car ils sont in vivo, respecter les gradients transmuqueux donc absorption et sécrétion peuvent se produire à un rythme normal. En outre, cultures de cellules peuvent avoir dedifferentiated de leur origine de cellules entéroendocrines native, ce qui signifie qu’ils ne sont plus représentant des cellules natives en termes de contenu de peptide et l’expression des sondes moléculaires, même si elles peuvent encore sécrètent l’hormone en question. Par exemple, c’est le cas pour le GLP-1 sécrétrices cellules lignes19.
C’est, par conséquent, nous estimons que les cultures de cellules primaires ou cellule ligne études sont plus adaptés pour fins de sélection et pour réaliser des expériences de types qui ne peuvent être exécutées en vivo ou dans l’intestin perfusé isolé. Par exemple, une véritable force des cultures de cellules primaires et cultures de cellules de ligne est que secondaire intra-cellulaire messagers (p. ex. Ca2 +, cAMP, NAD(P)H) peut être surveillé en temps réel et signalisation électrique de la cellules qui sécrètent l’hormone peut être étudié le20,21,22. En outre, knockdown de siARN peut être fait, ce qui est particulièrement utile si des inhibiteurs spécifiques ne sont pas disponibles20,21,22,23,24. Tissu d’intestin des souris montés dans des chambres de Ussing a récemment été utilisé pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents situé sur la sécrétion stimulée acides biliaires de GLP-1, tout en organoïdes intestinale (de souris) et morceaux d’intestin humain ont également été utilisés pour étudier les détails moléculaires du tube digestif sécrétion de l’hormone17,25. Alors que les premières prestations d’être polarisé2 tous ces modèles comportent des incubations statiques. Études sur des bouts de l’intestin humain, cependant, bénéficient de l’utilisation de tissus humains, plutôt que de rongeurs, ce qui est important comme différence des espèces dans l’expression de tissu de 7mc récepteurs et transporteurs moléculaires peuvent entraîner différentes voies moléculaires de détection entre espèces. En fait, la plupart des données dans ce domaine a été générées par des études sur des porcs, de souris ou de rats, et il reste insaisissable, si ces résultats peuvent être transférées aux humains. Toutefois, il est rassurant que les mécanismes de détection moléculaires qui sous-tendent la sécrétion stimulée par le glucose du GLP-1 semblent être comparables entre souris, rat, man, et transcriptomique et peptidomic identification des souris et de L-cellules humaines a révélé fort global similitudes entre les deux espèces7,18,26,27.
L’intestin grêle de rat isolé et perfusé, cependant, a aussi des limites qui devraient être considérés. Plus important encore, il est impossible de déterminer si une réponse sécrétoire donnée résulte d’une activation directe de la substance d’essai des cellules productrices de l’hormone ciblées est ou plutôt causée par un mécanisme indirect. Par exemple, KCl instantanément augmente la sécrétion de GLP-1 de l' intestin perfusé7, mais on ne sait toujours pas si c’est une conséquence de la dépolarisation directe de la L-cellule ou résulte de la dépolarisation des neurones à proximité des L-cellules ou des effets de publié simultanément paracrine stimulateurs/inhibiteurs. Données issues d’études utilisant l’intestin perfusé, qui visent à élucider les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la sécrétion, par conséquent, toujours soient mises en contexte avec les données obtenues à partir d’autres modèles plus spécifiques pour augmenter la capacité d’établir lien de causalité. Par exemple, la sécrétion de GLP-1 stimulée par le glucose de la lignée de cellules sécrétrices du GLP-1 GLUTag28,29 et de souris primaire L-cellules dépendent de l’activité des transporteurs de glucose (SGLT1 et GLUT2). Blocage de ces transporteurs dans l’intestin grêle de rat perfusée atténue également la sécrétion20, ce qui signifie qu’il est probable que la sécrétion de GLP-1 stimulée par le glucose est largement médiatisée par les actions directes du glucose sur la cellule de L. Une autre limitation importante de l’intestin isolé perfusé est que certains des lipides sont difficiles à étudier en raison de leur hydrophobicité. Bien qu’il soit possible d’étudier les produits finaux de la digestion des lipides (acides gras, diacyl glycérols, lysophosphatidylglycerols, etc.) et même si la préparation peut être en mesure de re-estérifier les lipides intra- intracellulaires et peut-être les emballer dans les chylomicrons, le transport des chylomicrons hors des cellules et leur adoption ultérieure par les lacteals des villosités est perturbée, puisque la circulation de la lymphe dans l’intestin isolé ne peut pas être sécurisée. Très probablement, par conséquent, absorption des lipides est interrompue une fois que les produits absorbés commencent à s’accumuler dans les cellules. Les systèmes cellulaires in vitro sont encore moins adaptés aux études de lipides en raison de leur manque de polarisation. Évidemment, cette limitation s’applique uniquement des lipides qui sont absorbés et transportés par les lacteals, tandis que ceux absorbé via les vaisseaux sanguins intestinaux sont susceptible d’être traitées normalement.
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Protocol
Toutes les études ont été effectuées avec l’autorisation de l’inspection d’expériences animales danois (2013-15-2934-00833) et le Comité d’éthique local, conformément aux directives de la réglementation danoise concernant l’expérimentation animale (1987) et le National Instituts de la santé (numéro de publication 85-23).
1. des animaux
- Obtenir des rats Wistar mâles (250 g) et 2 par cage, avec un accès ad libitum à chow standard et de l’eau, la maison et maintenir dans un 12:12 h cycle lumière-obscurité. Nos installations d’animaux utilise de l’eau non traitée et Alrtromin rongeur chow (1319 FORTI, Brogaarden, Lynge, Danemark).
Remarque : Laissez des animaux au moins une semaine d’acclimatation.
2. préopératoires préparations
- Faire le tampon de perfusion : tampon bicarbonate Krebs-Ringer additionné de 0,1 % de BSA (fraction V), le dextran 5 % T-70, 3,5 mmol/L de glucose et de 5 mmol/L pyruvate, fumarate et glutamate (si nécessaire) ; pH de 7,4.
- Préparer une quantité suffisante de tampon de perfusion en filtrant à travers une taille appropriée du filtre et ajuster le pH à ~7.5 par l’addition de goutte à goutte 5 M HCL.
- Ajoutez 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) (si nécessaire) directement dans la mémoire tampon sur le jour de l’étude à une concentration finale de 10 µM.
Remarque : IBMX est un inhibiteur de la phosphodiestérase qui augmente [cAMP]j’ai et restaure ainsi la sensibilité et la réactivité de l’intestin en sécrétant des hormones à un stimulus sécrétoire. - Préparer la solution d’essai (s). Préparer des stimuli vasculaires à un 20 x concentration plus élevée que la concentration finale souhaitée dans le tampon de perfusion filtré et pH ajusté. Préparer des stimuli luminaux test dans une solution saline isotonique dans la concentration finale.
- Dissoudre des composés non solubles à 100 % le diméthylsulfoxyde (DMSO) et diluer plus loin dans la mémoire tampon de perfusion ou une solution saline isotonique. Pour des stimuli vasculaires, garder la concentration finale de DMSO à 1 % ou moins, en concentrations ci-dessus cela endommager l’intestin et peut conduire à la sécrétion de l’hormone intestinale non spécifique. Mesurer le pH et ajuster à ~7.5 si nécessaire.
3. fonctionnement et Perfusion
Remarque : Une illustration d’une installation de perfusion est fournie à la Figure 1.
- Anesthésier les rats par utilisation d’un régime d’anesthésique qui peut supporter l’anesthésie chirurgicale et analgésie pendant 30-40 min par Hypnorm/Midazolam (0,3 ml/100 g de poids corporel, par ml : Hypnorm : fentanyl 0,08 mg, 2,5 mg fluanisone, 0,45 mg Parahydroxybenzoate de méthyle, 0,05 mg Parahydroxybenzoate de propyle, Midazolam : 1,25 mg, matrice Pharmaceuticals, Hellerup, Danemark)
- Vérifier par manque de réflexes (pincement de l’orteil), placez le rat sur la table d’opération chauffée et effectuer une incision de la peau pour exposer l’intestin.
-
Exposer la partie terminale du côlon en déplaçant le petit intestin côté autant que possible. Cravate de fournir la vascularisation du côlon et de l’accise progressivement à partir de la partie terminale du côlon, se déplaçant vers l’intestin grêle.
- Si seulement une certaine partie de l’intestin grêle est nécessaire pour la perfusion (la moitié supérieure), exciser les segments non requis après un score nul hors fourniture de système vasculaire. Pour minimiser les lésions tissulaires, hydrater l’intestin avec une solution saline isotonique et utiliser des écouvillons pour enlever les tissus conjonctifs.
- Insérer un tube en plastique (longueur : environ 15 cm, diamètre extérieur : ~0.4 cm) dans la lumière intestinale (dans la partie proximale) et la cravate correctement à l’aide de sutures. Rincer soigneusement avec une solution saline isotonique (température ambiante) pour vider le lumen du chyme.
- Perfuse la lumière avec la solution saline isotonique à un débit de 0,25 mL/min, à l’aide d’une seringue de 10 mL reliée à une pompe à seringue.
- Écarter l’intestin donc l’artère mésentérique supérieure est accessible et enlever le tissu conjonctif et de graisse pour exposer l’artère.
- Placer deux sutures sous l’artère mésentérique à l’aide de pinces à pointe fine ; une des sutures est levée l’artère pour contrôler le saignement une fois que l’artère a été coupée et l’autre pour fixer le cathéter qui doit être placé dans l’artère. Prenez attention de ne pas perforer l’artère.
- Placez deux sutures sous la veine pour fixer le cathéter métallique qui va être placé dans la veine de collecte des effluents de la perfusion.
- Avant de couper le trou dans l’artère mésentérique, veiller à ce que le cathéter qui va en inséré dans l’artère est rempli avec le tampon de perfusion pour empêcher la formation d’embolie air.
- Découper un petit trou dans l’artère mésentérique, à l’aide d’une paire de ciseaux chirurgicaux et insérer le cathéter en plastique immédiatement après.
- Immédiatement après que le cathéter a été obtenu, ouvrir la perfusion intestinale par le démarrage de la pompe à rouleaux (débit = 7,5 mL/min).
- Confirmer que les vaisseaux sanguins dans le tube digestif pâlissent en quelques secondes, et la veine devient pâle.
- Immédiatement après qu’une perfusion correcte a été établie, découper un trou dans la veine porte, insérer le cathéter métallique et le fixer avec la suture.
Remarque : Le cathéter peut être difficile de lieu mais soulevant la veine en tirant prudemment l’aide de suture plus proximal. - Une fois que les cathéters sont en place et sortie de perfusion est satisfaisante, tuer le rat par perforation de la membrane, en veillant à ne pas arracher les cathéters.
- Récupérer la sortie de perfusion pendant 1 min et mesurer le volume. Commencer aux pression de perfusion acquisition/enregistrements en cliquant sur Exécuter expérience dans le programme d’enregistrement de la pression.
- Couvrir le tube digestif avec un tissu humide pour l’empêcher de se dessécher pendant l’expérience.
- Veiller à ce que l’extrémité distale de l’intestin n’est pas bloquée pour que l’effluent Luminale peut sortir, sinon l’intestin vont gonfler, œdème mettra au point, augmenter la pression de perfusion et sortie de perfusion va baisser.
- Laisser la préparation pendant environ 30 min avant de commencer l’expérience.
Remarque : Les sorties de sécrétion d’hormones du tube digestif sont très instables pendant les 15 premières min de perfusion, donc cette étape d’équilibration est nécessaire pour obtenir une ligne de base stable.
4. expérience
- Après environ 30 min de perfusion, lancer le test en recueillant le premier échantillon de référence à l’aide d’un collecteur de fraction. Prélever des échantillons à l’intervalle de temps souhaité (par exemple, toutes les minutes, 6,5 et 7,5 mL sont habituellement perçue) et placez-les sur la glace dans quelques minutes.
-
Inspecter le barboteur régulièrement et si vide, remplissez-le avec le tampon de perfusion.
- Recueillir la mémoire tampon par la robinet-vanne à trois voies immédiatement avant d’entrer dans l’orgue et du cathéter inséré dans la veine porte (une fois elle a été perfusée par l’orgue) pour confirmer que l’orgue est métaboliquement active. Prélever des échantillons en début et en fin d’expérience visant à évaluer la viabilité tout au long de l’expérience.
- Mesurer les échantillons rapidement, avec un analyseur automatisé-gaz du sang, contient plus de plastiques ou de seringues ne sont pas parfaitement étanches, donnant lieu à échanger avec l’air atmosphérique.
- Après 10-15 min de collection de base, stimuler avec la première substance d’essai. Administrer les stimulations intra-artérielle avec un pousse-seringue par un robinet à trois voies (débit = 0,350 mL/min).
- Effectuer les stimulations luminales par une injection de bolus initial (2,5 mL/min pendant les 5 premières minutes), en remplacement de la solution saline isotonique qui est déjà dans la lumière, suivie par l’administration de la solution de test un débit plus faible (0,5 mL/min).
- Afin que la lumière est rapidement vidée de substance d’essai, une fois que la période de stimulation Luminale, rincer la lumière intestinale avec une solution saline isotonique en appliquant les mêmes débits comme ci-dessus.
- Prélever des échantillons de référence pendant 15-30 min avant la prochaine substance d’essai est administrée. Selon le protocole, les 2-3 test stimulus peuvent généralement être inclus par expérience. Si le protocole expérimental comprend activation/inhibition d’un site donné moléculaire en même temps que l’administration d’un sécrétagogue donné, toujours pré stimuler avec l’inhibiteur de l’activateur/10-15 min avant l’administration de la sécrétagogue à s’assurer que le site moléculaire est inhibé au tout début de la perfusion sécrétagogue.
- À la fin du protocole, administrer (5-10 min) un témoin positif adapté afin de tester la réactivité de la préparation et de prélever des échantillons de référence de 10-15 min après la période de stimulation.
Remarque : Plusieurs test de substances peuvent être utilisés comme témoin positif, par exemple, les stimulants du croissant [cAMP]j’ai (par exemple, foskolin ou IBMX), [Ca2 +]i (p. ex., la bombésine ou neuromédine C), agents de dépolarisation (p. ex., 30-50 mM KCl) ou plus des stimuli physiologiquement pertinents tels que les macronutriments : glucose, acides aminés, peptones, etc.. Toutefois, le choix du contrôle positif dépend des résultats expérimentaux. Le glucose est par exemple un sécrétagogue pauvre cholécystokinine (CCK) considérant que la bombésine n’est pas un sécrétagogue robuste pour insulinotrope glucose-dépendant de la sécrétion du peptide (GIP)30. - Après la fin de l’expérience, d’accise l’intestin perfusé, peser et mesurer sa longueur. Mettez-le dans la paraformaldéhyde et stocker (4 ° C) pour plus tard histochimique analyse du potentiel de l’intégrité/lésions tissulaires, par exemple par une coloration H & E.
5. biochimiques
- Quantifier les concentrations de peptides sécrétés dans l’effluent veineux par utilisation d’un interne ou disponible dans le commerce des dosages radioimmunologiques (RIA) ou des tests ELISA. Pour les études qui examinent l’absorption intestinale, quantifier la molécule d’intérêt, par exemple, de glucose ou d’acides aminés, dans l’effluent veineux.
Remarque : Le perfusat est généralement un bon tampon basale pour la plupart des analyses, y compris les tests qui s’appuie sur les réactions enzymatiques (tels que le dosage du glucose par la méthode de l’oxydase).
6. analyse de données
- Présenter les données de différentes façons, par exemple comme un graphique de temps-concentration illustrant la production réelle de sécrétion (débit x concentration) et en tant que parcelle de colonne représentant le total sécrétrice de sortie pendant les périodes de référence et d’intervention (généralement 10 à 15 points dans le temps).
- Tracer la concentration réelle mesurée des hormones respectifs comme des unités de concentration. (pmol/L),
Remarque : Il est préférable d’exprimer plutôt données en sortie (fmol/min) car avec ce modèle, contrairement aux études in vivo, les valeurs obtenues sont la production de sécrétion réelle (en raison de la collection constante de l’effluent de la perfusion). - Selon le nombre de groupes à analyser statistiquement, usage bilatéral couplé t-test (deux groupes) ou ANOVA à mesures répétées (plus de deux groupes) suivie d’un test post hoc appropriées pour les comparaisons multiples.
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Representative Results
La capacité à déterminer si un stimulus donné provoque la sécrétion de l’hormone de l’intestin d’intérêt s’appuie sur une sécrétion de base stable. En outre, si aucune réponse à la stimulation n’est observé, une réponse sécrétoire robuste au témoin positif doit être évidente pour exclure que l’absence de réponse à la stimulation de test ne reflète pas le manque de réactivité. Figure 2 a et 2 b montre un exemple de données de bonne qualité ; La sécrétion de GLP-1 dans l’intestin grêle de rat perfusée isolés apparaissent à intervalles de 1 min (moyen ± SEM). Dans les conditions basales de sécrétion est stable ; avant et après l’administration de l’impulsion d’essai (insuline) et une réponse sécrétoire robuste à la positive control (bombésine (BBS)) est évident. En outre, en moyenne la sécrétion de GLP-1 dans les conditions basales (pendant les périodes de référence respectifs qui ont précédé l’insuline ou administration de BBS) ainsi que la sécrétion en moyenne au cours de l’insuline et la stimulation de BBS sont affichés sous forme de graphiques à barres (moyen ± SEM). La sécrétion a été testée pour la signification statistique par ANOVA à mesures répétées. D’après ces données combinées, on peut conclure que l’insuline intra-artérielle ne stimule pas la sécrétion de GLP-1 dans l’intestin grêle de rat isolé et perfusé.
2D et la figure 2 montre un exemple de la sécrétion de GLP-1 dans l’intestin grêle de rat isolé et perfusé. Contrairement à la Figure 2 a et 2 b, ces données sont de mauvaise qualité ; la sécrétion est instable dans les conditions basales et dérive vers le haut tout au long d’une manière qui semble sans rapport avec les administrations de substance d’essai (fructose intra-Luminale et intra-artérielle, respectivement) et le contrôle positif, BBS, n’entraîne pas statistiques importantes augmente la sécrétion de GLP-1. Par conséquent, il est impossible de conclure si les stimulations de fructose donnent lieu à la sécrétion de GLP-1, par exemple est la sécrétion accrue de GLP-1 à la fin de la stimulation vasculaire fructose une réponse induite par le fructose ou non.
Figure 1 : exemple d’une installation de perfusion. Le système se compose d’un stand de plexiglass, une table d’opération chauffée, un échangeur de chaleur avec la construction dans le barboteur, un manomètre et pompe hydraulique pour réglage de la pression de perfusion. Le système de perfusion est connecté à un circulateur thermostatique qui réchauffe les gazés (95 % O2, 5 % de CO2) tampon de perfusion à 37 ° C. En outre, la pression de perfusion est enregistrée en continu et transduite par le transducteur de pression enregistrement et visualisée et sauvée sur un PC avec un logiciel adapté. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : données provenant de l’intestin grêle de rat isolé et perfusé. (A, B) un exemple d’un bien effectué des expériences et des données fiables, (C, D) un exemple de données sous-optimal où la pression de perfusion a augmenté, et sortie de perfusion a diminué considérablement au cours de la durée de l’étude. (A) sortie de GLP-1 (total) (fmol/min) est indiqué dans les conditions basales et en réponse à l’administration d’insuline intra-artérielle (200 et 1 000 heures, comme il est indiqué). La Bombésine (BBS), un célèbre et puissant sécrétagogue de GLP-1, a été perfusé intra-artériellement à la fin de l’expérience pour contrôler la réactivité (contrôle pos.). Les données sont présentées comme le moyen ± SEM, n = 4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’intestin grêle de rat perfusée isolé est un outil de recherche performant qui permet la dynamique et les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la sécrétion de l’hormone intestinale à étudier en détail. L’étape la plus critique pour le succès de la production de données avec ce modèle est l’opération chirurgicale. Manipulation de l’intestin entraînera inévitablement des dommages à l’intestin et devrait donc être réduite au strict minimum. Plus important encore, la vitesse de fonctionnement est la clé, en particulier en ce qui concerne le temps pour le placement de cathéter dans l’artère mésentérique. Notre expérience est que le cathéter doit être placé avec succès, et la perfusion doit être instaurée au sein d’un couple de min après avoir débité le trou dans le bateau. La mise en place des cathéters est la partie la plus difficile de l’opération et est compliquée par la petite taille de l’artère mésentérique et la fine paroi de la veine porte, et cette étape nécessite peu de pratique. Insertion rapide du cathéter veineux est, toutefois, pas plus urgent que le cas de l’artère mésentérique, comme le tube digestif est maintenant être perfusé et maintenu en vie. La prochaine étape cruciale est pour réaliser l’expérience. Si l’opération a été effectuée avec succès, l’intestin perfusé sera généralement prospérer et être réactif pour jusqu'à 3 h et la pression de perfusion et sortie en général reste constante au cours de l’expérience entière. Le facteur le plus important pour une expérience réussie à ce stade est d’éviter les bulles d’entrer dans le système, car cela provoque embolisation d’air qui soit instantanément réduit ou élimine la sortie de la perfusion. Comme le tampon de perfusion contient BSA et est gazé pour assurer l’apport d’oxygène suffisant à l’intestin perfusé, il est difficile d’empêcher la formation de bulles entièrement. Bulles devraient, toutefois, être pris au piège dans le barboteur les systèmes, mais cela se vide peu à peu au fil du temps (les plus de bulles, la vidange plus vite) et il est donc important de surveiller de près sur le barboteur et remplissez-le avec le tampon de perfusion si nécessaire. Il est également important de garder le pH du perfusat inférieure à 7,5 — à une augmentation du pH, du carbonate de calcium précipité peut se former, entrave à la circulation capillaire et provoquant une montée sérieuse dans la pression de perfusion.
L’intestin perfusé est une préparation plutôt robuste, mais il ne tolère pas de fortes concentrations de détergents tels que les acides biliaires, l’éthanol et le DMSO. Par conséquent, l’utilisation de détergents doit préférablement être évitée mais est parfois nécessaire pour obtenir des composés peu solubles en solution. L’intestin perfusé tolère généralement les détergents administrés intra-invertis mieux qu’intra-vasculairement. Par exemple, l’administration de 1 mM taurodeoxycholic acide (un acide biliaire secondaire, conjugué) était tolérée bien quand infusé intraluminales, mais entraîné instantanément bloquée perfusion de sortie lors de livraison intra-artériellement2. Pour les stimulations vasculaires, garder la concentration finale de DMSO inférieur à 1 % afin d’éviter les réponses imprécises sécrétrices (DMSO stimule, par exemple, la sécrétion de GLP-1) et d’éviter de causer des lésions tissulaires aboutissant à la pression de perfusion accrue et une diminution de la perfusion sortie. Expériences devraient être ignorées si la sortie de perfusion diminue de plus de 20 % au cours de l’étude, si la pression de perfusion augmente de plus de 20 % ou si le œdème se développe. Respect de ces critères de réussite macroscopique (y compris l’insertion rapide du cathéter dans l’artère mésentérique) résulte généralement de bonne qualité dans les expériences de ~14/15.
À l’issue de l’expérience, la prochaine procédure de critique est de choisir la méthode appropriée et le dosage pour la quantification de l’hormone(s) d’intérêt. Élevée à travers-put dosage d’hormones peptidiques peut être effectuée à l’aide de tests immunologiques : dosage radio-immunologique ou ELISA. En tout cas, il est fortement recommandé de valider les dosages respectifs avant de les utiliser pour la quantification de l’échantillon, que pas tous les tests disponibles dans le commerce des performances satisfaisantes en ce qui concerne la sensibilité, de spécificité et de précision (par exemple en ce qui concerne GLP-131). En ce qui concerne la spécificité, réactivité croisée est, comme toujours, un sujet de préoccupation. Effets de brouillage et matrice imprécises sont généralement moins prononcées avec perfusats artificielle par rapport au plasma. En ce qui concerne la sensibilité, il est souvent beaucoup plus facile d’obtenir des données fiables de perfusions que d’études in vivo comme le peptide concentrations sont souvent plus élevées parce que l’effluent de perfusion n’est pas diluée dans la circulation systémique et parce que processus d’élimination (par le foie/poumon/rein) sont évités. En règle générale, les concentrations initiales dans les effluents veineux se situent dans la plage inférieure de travail de la plupart des essais (dans le cas de GLP-1 (total), neurotensine (totale) et PYY (total) : 8-15 pmol/L) alors que les réponses stimulées peuvent atteindre aussi haut que 200-300 pmol/L3.
En comparaison, les valeurs de base des mêmes hormones dans le plasma chez l’homme sain, rat ou souris sont généralement et 5-10 pmol/L alors que les valeurs de réponse sont de 15-30 pmol/L3,32.
Si les critères de réussite prédéfinis sont respectées, les données générées de perfusion sont généralement de bonne qualité et l’analyse statistique est alors simple. Par rapport à la sécrétion de glucagon, l’insuline et la somatostatine de la rat perfusé isolé ou le pancréas de souris, la sécrétion basale d’hormones du tube digestif est stable et assez semblable entre les expériences concernant les concentrations mesurées et la sécrétion n’est pas clairement pulsatile. Collectivement, la variation de l’ensemble des données est donc minime et une taille d’échantillon aussi basses que trois expériences de perfusion est souvent suffisante pour atteindre la signification statistique. Toutefois, à normaliser et à éviter les erreurs de type 2, ainsi que de réduire le risque d’ignorance des moins réponses bien prononcés, un échantillon de six à huit est recommandé.
En résumé, l’intestin grêle de rat perfusée isolé est un modèle expérimental, physiologiquement pertinent et important qui peut servir à étudier les effets directs d’une substance donnée sur la sécrétion de l’hormone intestinale. Les questions de fond importantes, par exemple où dans le tube digestif un sécrétagogue stimule la sécrétion, si elle stimule la sécrétion par l’activation des invertis ou peut situé capteurs, et les sondes moléculaires sont activés et donc responsable la sécrétion peut être adressée en détail avec ce modèle. Il convient toutefois de reconnaître que le découplage de l’intestin de l’animal donneur peut, pour certaines questions de l’étude, être intéressant. Par exemple, le tube digestif interagit étroitement avec le foie (l’axe du tube digestif-foie) et le cerveau (l’axe cerveau-intestin) et les mécanismes qui dépendent de cette interférence ne peuvent donc être étudiés avec ce modèle. La qualité de l’opération est le facteur déterminant pour la qualité des données et les facteurs les plus importants pour une opération réussie sont à garder de manutention de l’intestin au minimum et à commencer rapidement perfusion intestinale, une fois que l’artère mésentérique a été coupé. C’est notre expérience qu’il faut 2 à 4 mois de pratique avant que les données de bonne qualité sont produites. Cependant, une fois qu’on a appris la technique, les possibilités de cette méthode sont presque infinies et seulement limitées par la solubilité de la substance d’essai et aucun risque de substances d’essai peuvent avoir sur les tissus perfusés d’effets nuisibles.
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Disclosures
Les auteurs de ces travaux déclarent sans conflits d’intérêts potentiels pertinents à cet article.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention sans restriction de Prof. Jens Juul Holst depuis le centre de Novo Nordisk recherche métabolique fondamentale (Novo Nordisk Foundation, Danemark), une subvention distincte de la Novo Nordisk Fondation pour faire les études de perfusion rongeur (subvention no. NNF15OC0016574), une subvention de Prof. Holst de l’European Research Council (Grant no.695069) et l’Union européenne est septième Programme-cadre de recherche, de TechnologicalDevelopment et de démonstration (Grant no 266408), mais aussi un post-doctorant accorder aux Rune E. Kuhre de la fondation de Lundbeck (R264-2017-3492). Nous remercions Jenna E. Hunt et Carolyn F. Deacon pour la relecture attentive.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for perfusion buffer | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 1.12018.0500 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O) | Merck | 102382 | |
| Dextran 70 | Pharmacosmos | 40014 | |
| Fumaric acid disodium salt (C44H2Na2O4) | Sigma Aldrich | F9642 | |
| Glucose (C6H12O6) | Merck | 108342 | |
| Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4) | Merck | 105886 | |
| Potasium chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck | 104873 | |
| Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4) | Merck | 106619 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | ||
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O) | Merck | 106445 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion equitment | |||
| Universial perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | |
| BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834 | Harvard Bioscience, Inc. | ||
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Cannula with basked, OD = 2.0 mm, ID = 1.0 mm | Harvard Bioscience, Inc. | 733313 |
References
- Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
- Brighton, C. A., et al. Bile Acids Trigger GLP-1 Release Predominantly by Accessing Basolaterally Located G Protein-Coupled Bile Acid Receptors. Endocrinology. 156, 3961-3970 (2015).
- Kuhre, R. E., et al. Bile acids are important direct and indirect regulators of the secretion of appetite- and metabolism-regulating hormones from the gut and pancreas. Molecular Metabolism. , (2018).
- Roberge, J. N., Brubacker, P. L. Secretion of Proglucagon-Derived Peptides in Response to Intestinal Luminal Nutrients. Endocrinology. 128, 3169-3174 (1991).
- Brubaker, P. L., Schloos, J., Drucker, D. J. Regulation of glucagon-like peptide-1 synthesis and secretion in the GLUTag enteroendocrine cell line. Endocrinology. 139, 4108-4114 (1998).
- Jacobsen, S., et al. Changes in Gastrointestinal Hormone Responses, Insulin Sensitivity, and Beta-Cell Function Within 2 Weeks After Gastric Bypass in Non-diabetic Subjects. Obesity Surgery. 22, 1084-1096 (2012).
- Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine. Diabetes. 64, 370 (2014).
- Svendsen, B., Holst, J. J. Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines. Peptides. 77, 47-53 (2016).
- Ratner, C., et al. Effects of Peripheral Neurotensin on Appetite Regulation and Its Role in Gastric Bypass Surgery. Endocrinology. 157, 3482-3492 (2016).
- Wewer Albrechtsen, N. J., et al. Dynamics of glucagon secretion in mice and rats revealed using a validated sandwich ELISA for small sample volumes. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 311, E302-E309 (2016).
- Vilsboll, T., Agerso, H., Krarup, T., Holst, J. J. Similar elimination rates of glucagon-like peptide-1 in obese type 2 diabetic patients and healthy subjects. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 88, 220-224 (2003).
- Windelov, J. A., et al. Why is it so difficult to measure glucagon-like peptide-1 in a mouse? Diabetologia. 60, 2066-2075 (2017).
- Gorboulev, V., et al. Na+-d-glucose Cotransporter SGLT1 is Pivotal for Intestinal Glucose Absorption and Glucose-Dependent Incretin Secretion. Diabetes. 61, 187-196 (2012).
- Kuhre, R. E., Bechmann, L. E., Wewer Albrechtsen, N. J., Hartmann, B., Holst, J. J. Glucose stimulates neurotensin secretion from the rat small intestine by mechanisms involving SGLT1 and GLUT2, leading to cell depolarization and calcium influx. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 308, E1123-E1130 (2015).
- Kuhre, R. E., Christiansen, C. B., Saltiel, M. Y., Wewer Albrechtsen, N. J., Holst, J. J. On the relationship between glucose absorption and glucose-stimulated secretion of GLP-1, neurotensin, and PYY from different intestinal segments in the rat. Physiological Reports. 5, (2017).
- Svendsen, B., et al. An analysis of cosecretion and coexpression of gut hormones from male rat proximal and distal small intestine. Endocrinology. 156, 847-857 (2015).
- Goldspink, D. A., et al. Mechanistic insights into the detection of free fatty and bile acids by ileal glucagon-like peptide-1 secreting cells. Molecular Metabolism. 7, 90-101 (2018).
- Sun, E. W., et al. Mechanisms Controlling Glucose-Induced Glp-1 Secretion in Human Small Intestine. Diabetes. , (2017).
- Kuhre, R. E., et al. Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716 and STC-1 cells: a comparison to native L-cells. Journal of Molecular Endocrinology. 56, 11 (2016).
- Reimann, F., et al. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell Metabolism. 8, 532-539 (2008).
- Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, 161-175 (2005).
- Kuhre, R. E., et al. Fructose stimulates GLP-1 but not GIP secretion in mice, rats and humans. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306, G622-G630 (2014).
- Reimann, F., Tolhurst, G., Gribble, F. M. G-Protein-Coupled Receptors in Intestinal Chemosensation. Cell Metabolism. 15, 421-431 (2012).
- Parker, H. E., et al. Molecular mechanisms underlying bile acid-stimulated glucagon-like peptide-1 secretion. British Journal of Pharmacology. 165, 414-423 (2012).
- Petersen, N., et al. Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids. Diabetes. 63, 410-420 (2014).
- Parker, H., et al. Predominant role of active versus facilitative glucose transport for glucagon-like peptide-1 secretion. Diabetologia. 55, 2445-2455 (2012).
- Roberts, G. P., et al. Comparison of Human and Murine Enteroendocrine Cells by Transcriptomic and Peptidomic Profiling. Diabetes. , (2019).
- Reimann, F., Gribble, F. M. Glucose-Sensing in Glucagon-Like Peptide-1-Secreting Cells. Diabetes. 51, 2757-2763 (2002).
- Drucker, D. J., Jin, T., Asa, S. L., Young, T. A., Brubaker, P. L. Activation of proglucagon gene transcription by protein kinase-A in a novel mouse enteroendocrine cell line. Molecular Endocrinology. 8, Baltimore, Md. 1646-1655 (1994).
- Svendsen, B., et al. GLP1- and GIP-producing cells rarely overlap and differ by bombesin receptor-2 expression and responsiveness. The Journal of Endocrinology. 228, 39-48 (2016).
- Bak, M. J., et al. Specificity and sensitivity of commercially available assays for glucagon-like peptide-1 (GLP-1): implications for GLP-1 measurements in clinical studies. Diabetes, Obesity & Metabolism. 16, 1155-1164 (2014).
- Jacobsen, S. H., et al. Effects of gastric bypass surgery on glucose absorption and metabolism during a mixed meal in glucose-tolerant individuals. Diabetologia. 56, 2250-2254 (2013).
