Summary
Qui, presentiamo un modello fisiologico ed efficace per studiare i meccanismi molecolari sottostanti la secrezione dell'ormone intestinale e l'assorbimento intestinale — piccolo intestino irrorato isolato del ratto.
Abstract
L'intestino è il più grande organo endocrino del corpo, producendo più di 15 ormoni peptidici differenti che regolano l'assunzione di cibo e di appetito, digestione, assorbimento dei nutrienti e distribuzione ed escursioni di glucosio post-prandiale. Comprensione dei meccanismi molecolari che regolano la secrezione dell'ormone dell'intestino è fondamentale per comprendere e tradurre la fisiologia dell'ormone dell'intestino. Tradizionalmente, i meccanismi di secrezione dell'ormone dell'intestino sono sia studiati in vivo (in animali da esperimento o esseri umani) o utilizzando primaria di disecrezione intestinale mucoso colture cellulari o linee cellulari. Qui, presentiamo un piccolo intestino irrorato isolato del ratto come metodo alternativo per lo studio della secrezione dell'ormone dell'intestino. Le virtù di questo modello sono che essa si basa sull'intestino intatto, significato che ricapitola la maggior parte dei parametri fisiologicamente importanti responsabili della secrezione negli studi in vivo, tra cui polarizzazione della mucosa, paracrine relazioni e percorsi di esposizione di aspersione/stimolo. Inoltre a differenza di studi in vivo, l'intestino tenue irrorato isolato del ratto consente quasi completo controllo sperimentale e la valutazione diretta della secrezione. In contrasto con gli studi in vitro, è possibile studiare sia la grandezza e la dinamica della secrezione e per affrontare le questioni importanti, come ad esempio causano quello che stimoli la secrezione degli ormoni dell'intestino diverse, da che parte dell'intestino (luminal o vascolare) è la secrezione stimolato e analizzare in sensori molecolari dettaglio sottostante la risposta secretiva. Inoltre, la preparazione è un potente modello per lo studio dell'assorbimento intestinale e i dettagli riguardanti le dinamiche di assorbimento intestinale, tra cui i trasportatori responsabili.
Introduction
L'intestino è il più grande organo endocrino del corpo, producendo più di 15 ormoni peptidici differenti che regolano l'assorbimento dei nutrienti e la disposizione dei nutrienti, la crescita intestinale e modulano l'appetito1. Ormoni dell'intestino sono, pertanto, coinvolti in molti processi fisiologici fondamentali, e la comprensione di questi pattern di secrezione e i dettagli molecolari che controllano la secrezione degli ormoni rispettivi è così importante per la nostra base fisiologica comprensione e per affrontare aspetti traslazionali delle azioni di ormone intestinale; ma come uno può studiare i meccanismi molecolari rilevamento secrezione dell'ormone dell'intestino? In generale, la secrezione dell'ormone può essere studiata in intatti organismi (esseri umani o animali da esperimento), dalle preparazioni di intestino isolato o da colture cellulari primarie di disecrezione intestinale o immortalato cell culture2,3, 4 , 5 , 6. il nostro modello preferito è il piccolo intestino irrorato isolato del ratto, che è un modello fisiologicamente rilevante che permette la secrezione degli ormoni dell'intestino per essere studiato nei minimi dettagli con risoluzione temporale ottimale (secrezione tariffe possono essere determinate con qualsiasi tempo base giù al secondo), e i risultati sono probabilmente trasferibile a una situazione in vivo7. Qui forniamo un protocollo dettagliato su come eseguire questa procedura, ma in primo luogo discuteremo altri metodi per lo studio della secrezione dell'ormone intestinale, compresi i vantaggi e le limitazioni di questi modelli rispetto al piccolo intestino irrorato isolato del ratto.
Se si vuole stabilire se un composto specifico regola la secrezione di alcuni ormoni dell'intestino, gli studi in esseri umani sono l'obiettivo finale. Così, se un composto mostra grandi effetti sulla secrezione di uno o più ormoni dell'intestino nei roditori (in vivo o le aspersioni) o da ormone secernente cellule (linee cellulari o cellule primarie), questo effetto è rilevante solo per medicina e fisiologia umana se può essere confermata in esseri umani. Tuttavia, ci sono dei limiti chiari per il tipo di studi che possono essere eseguite in esseri umani, e studi in vivo su animali da esperimento sono, pertanto, spesso la seconda migliore opzione per tali studi. Topi e ratti sono animali sperimentali utilizzati più di frequente presumibilmente dovuto il loro formato conveniente, basso costo e la possibilità di alterare geneticamente i geni sospettati di essere coinvolti nelle questioni studio specifico (ad es., bussare fuori un certo trasportatore o recettore). In generale, modelli in vivo beneficiano di essere fisiologicamente intatto, ma abbiamo anche diverse limitazioni. La cosa più importante, le piccole dimensioni dei roditori, in particolare topi, sono un fattore limitante, come la maggior parte delle analisi per la quantificazione dell'ormone dell'intestino richiedono almeno 20 µ l di plasma (e spesso molto di più), che significa che almeno 100 µ l di sangue deve essere ritirato per fare un duplicato quantificazione. Pertanto, è solo possibile ottenere pochissimi campioni corrispondenti ai campioni della linea di base e uno o due campioni post-stimolazione (il volume totale del sangue in un topo di 20g è ~1.4 mL). Di conseguenza, potenziali risposte secretive (ad es., rapidamente o ritardo che si verificano risposte) pertanto può essere mancata.
Nel modello di aspersione, è superare questo problema, come campioni di grandi volumi sono ottenuti (tasso di flusso: 7,5 mL/min) e gli intervalli di raccolta possono essere regolati come necessario per garantire che le risposte rapide e di breve durata non sono mancate (abbiamo raccogliere campioni ogni min)7 . Un altro problema con in vivo studi nei roditori è che la maggior parte dei ormoni dell'intestino sono ancor più rapidamente eliminato o metabolizzato più esseri umani8,9,10, che può complicare l'analisi biochimica successiva. Per esempio, abbiamo dimostrato che il GLP-1 è metabolizzato nei topi a un ritmo addirittura superiore a quello in esseri umani (dove T1/2 è 1-2 min11) e, cosa ancora più importante, che coinvolge la fenditura del GLP-1 nei topi, oltre alla scissione del N-terminale di della dipeptidil-peptidasi-4 (DPP4) (che è il principale enzima degradante di GLP-1 in esseri umani), ulteriore scissione dal enzima endopeptidasi neutrale 24.1112. Di conseguenza, attuale test commerciali per la quantificazione di GLP-1, che si basano sia sull'isoforma intatto di GLP-1 (7-36amide) o l'isoforma di DPP-4 spaccati (9-39amide), notevolmente sottovalutare la secrezione di GLP-1 nei topi e portare a risultati falsi 12. nel piccolo intestino irrorato isolato del ratto, la maggior parte del metabolismo degli ormoni secreti è eliminato o ridotto notevolmente, poiché degradazione mediata dal plasma è evitato, e fegato/rene/polmone estrazione/degradazione è impedito perché ( perfusato raccolti come lascia l'intestino).
Naturalmente, comprensione importante può essere generato tramite l'uso di animali geneticamente modificati, ad esempio, sodio-glucosio transporter-1 knockout mice13, ma richiede una valutazione dettagliata dei sensori molecolari coinvolti nella secrezione spesso considerazione di più siti molecolari, che vanno da trasportatori molecolari di canali ionici e da diversi ricevitori G-proteina-accoppiati a proteine intracellulari. Per esempio, siamo presi di mira l'attività di nove siti molecolari diversi quando dipanare i sensori molecolari responsabili della glucosio-stimolato di secrezione di GLP-17. Un'indagine simile non sarebbe possibile in vivo come alcuni dei composti utilizzati sono aspecifici o effetti nocivi/letali. Per esempio, quando si utilizza l'intestino irrorato, è stato possibile valutare il ruolo del metabolismo intracellulare del glucosio per la secrezione di GLP-1 e neurotensina bloccando la formazione di ATP con 2-4-dinitrofenolo7,14 , nonché il ruolo di canali del calcio voltaggio-dipendenti per acidi biliari stimolata di secrezione di GLP-1, NT e PYY3. Infatti, la tetrodotossina di bloccanti del canale sodio altamente tossico può essere applicata con successo negli studi di perfusione. Infine, nel modello di aspersione possa essere direttamente valutato dove nell'intestino un certo composto stimola la secrezione di un ormone di alcuni, come lo sperimentatore può semplicemente scegliere e preparare la regione desiderata per irrorare, e allo stesso tempo possono essere analizzato Se uno stimolo provoca secrezione dall'attivazione dei sensori molecolari dal lato luminal o vascolare dell'intestino3,15,16.
I meccanismi secretivi sottostante la secrezione dell'ormone dell'intestino può essere studiata anche da usare dei pezzi di tessuto di intestino (compreso il tessuto umano), colture primarie intestinale (di solito da topi), immortalate ormone secernente linee cellulari (di origine umana o mouse), gut Tessuto montato negli alloggiamenti di Ussing o da organoids (entrambi più spesso dai topi)2,3,4,5,6,17,18. Rispetto per le aspersioni intestinale, studi su pezzi di intestino umano, colture primarie e linee cellulari sono tecnicamente più facili da eseguire e sono un modo più veloce e più conveniente di generazione di dati, ma naturalmente lo studio di pezzi di intestino richiede l'accesso a intestino umano fresco esemplari. Tuttavia, in questi modelli la polarizzazione delle cellule normali dell'intestino è intrinsecamente perduta, significato che questi modelli non possono essere utilizzati per valutare la normale attivazione di sensori molecolari, e non possono essere studiati anche i processi di assorbimento. Inoltre, tali studi solitamente impiegano le incubazioni statiche (per fino a diverse ore) che è altamente non-fisiologica e non ha nulla a che fare con dinamiche secretivo normale delle cellule, perché il prodotto secreto non viene rimosso e così il feedback possono influenzare la secrezione di ormoni. Al contrario, nell'intestino irrorato, molecole secrete e assorbite in modo efficiente sono rimosse tramite la microcircolazione mucosa come sono vivo, assicurando che i gradienti transmucosale sono mantenuti così assorbimento e secrezione possono accadere ad un tasso normale. Inoltre, colture cellulari possono avere dedifferenziate dalla loro origine delle cellule enteroendocrine nativo, che significa che non sono più rappresentante delle cellule native in termini di contenuto di peptide e l'espressione di sensori molecolari, anche se essi possono ancora secernono l'ormone in questione. Questo è, per esempio, il caso per GLP-1 che secerne cella linee19.
Pertanto, è nostra opinione che colture cellulari primarie o cella linea studi sono più adatti ai fini dello screening e per eseguire esperimenti di tipi che non possono essere eseguite in vivo o nell'intestino irrorato isolato. Per esempio, un vero punto di forza delle colture cellulari primarie e colture cellulari linea è quello intra-cellulare secondario messaggeri (ad esempio Ca2 +, cAMP, nad possono essere monitorati in tempo reale, e segnali elettrici dell'ormone che secerne le celle possono essere studiato20,21,22. Inoltre, può essere fatto siRNA atterramento, che è particolarmente utile se gli inibitori specifici non sono disponibili20,21,22,23,24. Tessuto dell'intestino dai topi montati in alloggiamenti di Ussing recentemente è stato usato per studiare i meccanismi molecolari sottostanti la secrezione di GLP-1 stimolata dell'acido di bile, mentre organoids intestinale (da topi) e pezzi di intestino umano inoltre sono stati usati per studiare il dettagli molecolari di intestino ormone secrezione17,25. Considerando che l'ex beneficia di essere polarizzati2 tutti questi modelli coinvolgono le incubazioni di statiche. Studi su pezzi di intestino umano, tuttavia, trarre vantaggio dall'utilizzo del tessuto umano, piuttosto che del roditore, che è importante poiché la differenza di specie in espressione tissutale dei recettori 7TM e trasportatori molecolari possono comportare diversi percorsi di telerilevamento molecolare tra specie. Infatti, la maggior parte dei dati in questo campo è stata generata dagli studi su maiali, topi o ratti, e rimane inafferrabile se questi risultati possono essere trasferiti agli esseri umani. È, tuttavia, rassicurante che i meccanismi di rilevamento molecolari che sono alla base della secrezione glucosio-stimolata di GLP-1 sembrano essere simili tra mouse, ratto, uomo, e trascrittomica e peptidomica profilatura di mouse e L-cellule umane hanno rivelato forte globale somiglianze tra le due specie7,18,26,27.
Il piccolo intestino irrorato isolato del ratto, tuttavia, ha anche alcune limitazioni che devono essere considerati. La cosa più importante, è Impossibile determinare se una determinata risposta secretiva risultati da attivazione diretta dalla sostanza in esame delle cellule producono ormoni mirate o piuttosto è causato da un meccanismo indiretto. Per esempio, KCl istantaneamente aumenta la secrezione di GLP-1 dalla dell'intestino irrorato7, ma rimane sconosciuto se questa è una conseguenza della depolarizzazione diretta della cellula L o risultati dalla depolarizzazione dei neuroni vicino L-cellule o effetti di rilasciato contemporaneamente paracrine stimolatori/inibitori. Dati derivanti da studi utilizzando l'intestino irrorato che mirano a delucidare i meccanismi molecolari alla base di secrezione pertanto, dovrebbero sempre essere messo in contesto con i dati ottenuti da altri modelli più specifici per aumentare la capacità di stabilire causalità. Per esempio, secrezione di GLP-1 glucosio-stimolata dalla linea cellulare che secerne GLP-1 GLUTag28,29 e dal primario del mouse L-cellule dipendono dall'attività dei trasportatori del glucosio (SGLT1 e GLUT2). Bloccando questi trasportatori nel piccolo intestino irrorato del ratto inoltre attenua la secrezione20, significa che è probabile che la secrezione di GLP-1 glucosio-stimolata in gran parte è mediata da azioni dirette del glucosio sulla cellula L. Un'altra limitazione importante dell'intestino irrorato isolato è che alcuni dei lipidi sono difficili da studiare a causa della loro idrofobicità. Anche se è possibile indagare i prodotti finali della digestione dei lipidi (acidi grassi, diacil glicerolo, lysophosphatidylglycerols, ecc.) e anche se la preparazione può essere in grado di ri-esterificare i lipidi intra-cellularly e forse imballarli in chilomicroni, il trasporto dei chilomicroni fuori le cellule e il loro successivo assorbimento di lacteals dei villi è interrotto, dato che il flusso della linfa nell'intestino isolato non può essere protetto. Molto probabilmente, di conseguenza, l'assorbimento dei lipidi viene interrotta una volta che i prodotti assorbiti iniziano ad accumularsi nelle cellule. I sistemi cellulari in vitro sono ancor meno adatti per gli studi dei lipidi a causa della loro mancanza di polarizzazione. Ovviamente, questa limitazione è rilevante solo per i lipidi che sono assorbiti e trasportati tramite il lacteals, mentre quelli assorbiti attraverso i vasi sanguigni intestinali sono suscettibili di essere gestite normalmente.
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Protocol
Tutti gli studi sono stati condotti con autorizzazione da parte dell'Ispettorato di esperimenti di animale (2013-15-2934-00833) danese e comitato etico locale, conformemente agli orientamenti della legislazione danese sulla sperimentazione animale (1987) e la nazionale Istituti di salute (numero di pubblicazione 85-23).
1. sperimentali animali
- Ottenere i ratti maschii di Wistar (250 g) e casa 2 per gabbia, con ad libitum accesso a cibo standard e acqua e mantenere in un 12:12 h ciclo luce-buio. Le nostre strutture di animali utilizza acqua non trattata e Alrtromin roditore chow (1319 FORTI, Brogaarden, Lynge, Danimarca).
Nota: Gli animali ammessi almeno una settimana di acclimatazione.
2. preoperative preparazioni
- Rendere l'aspersione buffer: soluzione tampone del bicarbonato della Krebs-soneria completati con 0.1% BSA (frazione V), 5% Destrano T-70, 3,5 mmol/L glucosio e piruvato 5 mmol/L, fumarato e glutammato (se necessario); pH 7,4.
- Preparare una quantità adeguata di buffer di aspersione filtrandola attraverso una dimensione appropriata del filtro e regolare il pH a ~7.5 da 5 M HCl aggiunta goccia a goccia.
- Aggiungere 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (se necessario) direttamente al buffer il giorno dello studio a una concentrazione finale di 10 µM.
Nota: IBMX è un inibitore della fosfodiesterasi che aumenta [cAMP]io e quindi Ripristina la sensibilità e la reattività dell'intestino in termini che secerne ormoni ad uno stimolo secretivo. - Preparare soluzione/i test. Preparare gli stimoli vascolari a una concentrazione più elevata rispetto alla concentrazione finale desiderata nel buffer di aspersione filtrata e pH-regolato di 20x. Preparare test luminal stimoli in soluzione fisiologica alla concentrazione finale.
- Sciogliere i composti non prontamente solubili in 100% dimetilsolfossido (DMSO) e diluire ulteriormente nel buffer di aspersione o soluzione fisiologica. Per stimoli vascolari, mantenere la concentrazione di DMSO finale a 1% o inferiore, come le concentrazioni sopra ciò danneggiare l'intestino e può portare alla secrezione di ormone intestinale aspecifica. Misurare il pH e se necessario regolare per ~7.5.
3. funzionamento e perfusione
Nota: Un'illustrazione di un setup di perfusione è fornita nella Figura 1.
- Anestetizzare i ratti dall'uso di un regime anestetico che possa sostenere l'anestesia chirurgica e analgesia per 30-40 min di Hypnorm/Midazolam (peso corporeo di 0,3 ml/100 g, al ml: Hypnorm: 0,08 mg di fentanil, 2,5 mg fluanisone, 0,45 mg metil paraidrossibenzoato, 0,05 mg Propile paraidrossibenzoato, Midazolam: 1,25 mg, Matrix Pharmaceuticals, Hellerup, Danimarca)
- Verifica per mancanza di riflessi (pizzico di punta), posizionare il topo sul tavolo operatorio riscaldato ed effettuare un'incisione della pelle per esporre l'intestino.
-
Esporre la parte terminale del colon spostando il piccolo intestino da parte quanto possibile. Cravatta di fornitura sistema vascolare per il colon e accise gradualmente a partire dalla parte terminale del colon, muovendo verso l'intestino tenue.
- Se solo una certa parte dell'intestino tenue è richiesta per la perfusione (metà superiore), è possibile asportare segmenti non necessari dopo la legatura fuori fornitura sistema vascolare. Per ridurre al minimo i danni ai tessuti, idratare l'intestino con soluzione fisiologica e utilizzare tamponi per rimuovere il tessuto connettivo.
- Inserire un tubo di plastica (lunghezza: ~ 15 cm, diametro esterno: ~0.4 cm) nel lume intestinale (nella parte prossimale) e cravatta correttamente utilizzando suture. Sciacquare accuratamente con soluzione fisiologica (temperatura ambiente) per svuotare il lume di chimo.
- Irrorare il lume con soluzione fisiologica a un flusso di 0,25 mL/min, utilizzando una siringa da 10 mL collegata ad una pompa a siringa.
- Spostare l'intestino da parte quindi l'arteria mesenterica superiore è accessibile e rimuovere il tessuto connettivo e grasso per esporre l'arteria.
- Posizionare due suture sotto l'arteria mesenterica usando il forcipe punta fine; uno delle suture è per il sollevamento dell'arteria per controllare lo spurgo una volta che è stato tagliato l'arteria e l'altro è per il fissaggio del catetere che deve essere posizionato nell'arteria. Fare attenzione non per perforare l'arteria.
- Posizionare due suture sotto la vena portale per fissare il catetere in metallo che sta per essere inserito nella vena per la raccolta dell'effluente di aspersione.
- Prima di tagliare il foro nell'arteria mesenterica, assicurarsi che il catetere che sta andando a inserito nell'arteria è riempito con buffer di perfusione per evitare la formazione di embolo di aria.
- Tagliare un piccolo foro nell'arteria mesenterica usando un paio di forbici chirurgiche e inserire il catetere di plastica subito dopo.
- Immediatamente dopo il catetere è stato protetto, avviare la perfusione dell'intestino avviando la pompa roller (portata = 7,5 mL/min).
- Confermare che i vasi sanguigni nell'intestino impallidire in pochi secondi, e la vena portale impallidisce.
- Immediatamente dopo adeguata perfusione è stata stabilita, praticare un foro nella vena portale, inserire il catetere in metallo e fissarlo con la sutura.
Nota: Il catetere può essere difficile a posto ma alzando la vena tirando con cautela l'aiuta di sutura più prossimale. - Una volta che i cateteri sono a posto e perfusione output è soddisfacente, è possibile uccidere il ratto da perforazione della membrana, facendo attenzione a non strappare i cateteri.
- Raccogliere l'output di perfusione per 1 min e misurare il volume. Avviare l'acquisizione/registrazioni di pressione di aspersione di scatto Eseguire esperimento nel programma di registrazione di pressione.
- Coprire l'intestino con panno inumidito per evitare che si secchino durante l'esperimento.
- Assicurarsi che l'estremità distale dell'intestino non sia bloccato affinché l'effluente luminal può uscire, altrimenti si gonfia l'intestino, l'edema si svilupperà, aumenterà la pressione di aspersione e cadrà con l'uscita di aspersione.
- Lasciare la preparazione per circa 30 minuti prima dell'inizio dell'esperimento.
Nota: Le uscite secretive degli ormoni dell'intestino sono molto instabile per i primi 15 min di aspersione, quindi questo passaggio di equilibrazione è necessaria per ottenere una linea di base stabile.
4. esperimento
- Dopo circa 30 min di aspersione, iniziare l'esperimento di raccolta del primo campione basale usando un collettore di frazione. Raccogliere campioni all'intervallo di tempo desiderato (ad esempio, sono normalmente raccolti ogni min, 6.5-7.5 mL) e metterli su ghiaccio entro pochi minuti.
-
Ispezionare regolarmente il ferma-bolle e, se svuotato, riempirlo con buffer di aspersione.
- Raccogliere il buffer attraverso il gallo-valvola a tre vie immediatamente prima che entri l'organo e dal catetere inserito nella vena portale (dopo esso è stato irrorato attraverso l'organo) per confermare che l'organo è metabolicamente attivo. Raccogliere campioni all'inizio e alla fine dell'esperimento per valutare la vitalità in tutto l'esperimento.
- Misurare campioni rapidamente, con un analizzatore automatizzato di gas del sangue, come più plastica contiene/siringhe non sono completamente ermetiche, dando luogo per lo scambio con l'aria atmosferica.
- Dopo 10-15 min di raccolta della linea di base, stimolare con la sostanza in esame prima. Amministrare le stimolazioni intra-arteriose con una pompa a siringa attraverso un rubinetto a tre vie (flusso = 0,350 mL/min).
- Eseguire stimolazioni luminal di un'iniezione del bolo iniziale (2,5 mL/min oltre i primi 5 min), per sostituire la soluzione fisiologica che è già nel lume, seguito dalla somministrazione della soluzione da analizzare una portata minore (0,5 mL/min).
- Per garantire che il lume viene rapidamente svuotato della sostanza in esame una volta che il periodo di stimolazione luminal, irrigare il lume intestinale con soluzione salina isotonica applicando tassi di flusso stesso come sopra.
- Raccogliere campioni di baseline per 15-30 min prima che la sostanza in esame successiva viene somministrata. A seconda del protocollo, stimoli di 2-3 test di solito possono essere inclusi per esperimento. Se il protocollo sperimentale include attivazione/inibizione di un determinato sito molecolare simultaneamente con la somministrazione di un secretagogo determinato, sempre pre-stimolare con l'inibitore dell'attivatore/10-15 min prima dell'amministrazione di secretagogo per Accertarsi che il sito molecolare è bloccato all'inizio dell'infusione di secretagogo.
- Alla fine del protocollo, è necessario amministrare (5-10 min) un controllo positivo adatto per testare per la reattività della preparazione e raccogliere campioni di riferimento di 10-15 min dopo il periodo di stimolazione.
Nota: Diversi test sostanze possono essere utilizzati come controllo positivo, per esempio, stimoli per crescente [cAMP]io (ad es., foskolin o IBMX), [Ca2 +]i (ad es., bombesina o Neuromedina C), depolarizzanti agenti (per esempio, 30-50 mM KCl) o più stimoli fisiologicamente rilevanti quali macronutrienti: glucosio, peptoni, amminoacidi, ecc. Tuttavia, la scelta di controllo positiva dipende dal risultato sperimentale. Glucosio è per esempio un secretagogo povero colecistochinina (CCK) mentre bombesina non è un robusto secretagogue per insulinotropico glucosio-dipendente del peptide (GIP) secrezione30. - Al termine dell'esperimento, asportare l'intestino irrorato, pesare e misurare la sua lunghezza. Metterlo in paraformaldeide e conservarla (4 ° C) per potenziale più tardi analisi istochimica di integrità/danni ai tessuti, per esempio da H & E che macchia.
5. biochimiche misure
- Quantificare le concentrazioni di peptidi secreti nell'effluente venoso mediante uso di un in-House o commercialmente disponibili metodiche radioimmunologiche (RIA) o analisi di ELISA. Per gli studi che indagano l'assorbimento intestinale, quantificare la molecola di interesse, ad esempio, del glucosio o aminoacidi, nell'effluente venoso.
Nota: Il perfusato è di solito un buon buffer basale per la maggior parte delle analisi, tra cui le analisi che si basa su reazioni enzimatiche (ad esempio di quantificazione di glucosio dal metodo glucoseoxidase).
6. analisi dei dati
- Presentare i dati in diversi modi, ad esempio come un grafico di tempo-concentrazione visualizzando l'output effettivo secretiva (flusso x concentrazione) e come trama di colonna raffigurante il totale secretivo uscita durante i periodi della linea di base e la risposta (solitamente punti di tempo di 10-15).
- Tracciare la concentrazione misurata effettiva dei rispettivi ormoni come unità di concentrazione. (pmol/L),
Nota: È preferibile invece esprimere dati come output (fmol/min), perché con questo modello, in contrasto con gli studi in vivo, i valori ottenuti sono l'output effettivo secretiva (a causa di costante raccolta di effluente di perfusione). - A seconda del numero di gruppi per essere analizzati statisticamente, uso due code accoppiato t-test (due gruppi) o One-way ANOVA per misure ripetute (due o più gruppi) seguita da un test post-hoc appropriato per i confronti multipli.
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Representative Results
La capacità di determinare se un dato stimolo provoca la secrezione dell'ormone dell'intestino di interesse si basa su una secrezione basale costante. Inoltre, se nessuna risposta allo stimolo è osservata, una robusta risposta secretiva per il controllo positivo deve essere evidente per escludere che la mancanza di risposta allo stimolo test non riflette una generale mancanza di reattività. Figura 2A e 2B Mostra un esempio di dati di buona qualità; Secrezione di GLP-1 dal piccolo intestino irrorato isolato del ratto sono indicati ad intervalli di 1-min (mezzi ± SEM). Alle condizioni basali secrezione è costante; sia prima che dopo la somministrazione di test di stimolo (insulina) e una robusta risposta secretiva al positivo controllo (bombesina (BBS)) è evidente. In aggiunta, una media di secrezione di GLP-1 alle condizioni basali (durante i periodi di rispettiva linea di base precedente insulina o amministrazione di BBS) così come una media secrezione durante l'insulina e stimolazione BBS vengono visualizzati come grafici a barre (mezzi ± SEM). La secrezione è stata testata per la significatività statistica di One-way ANOVA per misure ripetute. Basato su questi dati combinati, si può concludere che l'insulina intra-arteriosa non stimola la secrezione di GLP-1 dal piccolo intestino irrorato isolato del ratto.
2D e la Figura 2 Mostra un esempio di secrezione di GLP-1 dal piccolo intestino irrorato isolato del ratto. A differenza di Figura 2A e 2B, questi dati sono di scarsa qualità; la secrezione è instabile in condizioni basali e derive verso l'alto in tutto in un modo che sembra essere indipendente da amministrazioni di sostanza di prova (fruttosio intra-luminale e intra-arteriosa, rispettivamente) e il controllo positivo, BBS, non si traduca in statistica significativa aumentata secrezione di GLP-1. Di conseguenza, è Impossibile concludere se le stimolazioni di fruttosio danno luogo alla secrezione di GLP-1, ad esempio, è l'aumentata secrezione di GLP-1 alla fine della stimolazione vascolare fruttosio fruttosio-mediata risposta o non.
Figura 1: un esempio di un programma di installazione di aspersione. Il sistema è costituito da un basamento di plexiglass, un tavolo operatorio riscaldato, uno scambiatore di calore con build nel gorgogliatore, un manometro e pompa di mandrino per la regolazione della pressione di perfusione. Il sistema di perfusione è collegato a un circolatore termostatico che riscalda il gasato (95% O2, 5% CO2) buffer di aspersione a 37 ° C. Inoltre, pressione di aspersione è registrata continuamente e trasdotte il registrazione mediante trasduttore di pressione e visualizzata e salvata su un PC con software adatto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: dati dal piccolo intestino irrorato isolato del ratto. (A, B) un esempio di un ben condotti esperimenti e dati affidabili, (C, D) un esempio di dati sub-ottimali dove la pressione di aspersione aumentata e uscita di perfusione è diminuito drasticamente nel corso tempo dello studio. (A) uscita di GLP-1 (totale) (fmol/min) è mostrato in condizioni basali e in risposta alla somministrazione di insulina intra-arteriosa (200 e 1.000 pM, come indicato). Bombesina (BBS), un ben noto, potente secretagogo GLP-1, è stato infuso intra-arterialmente alla fine dell'esperimento di controllo per una reattività (controllo positivo). I dati sono presentati come mezzi ± SEM, n = 4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il piccolo intestino irrorato isolato del ratto è un potente strumento di ricerca che permette le dinamiche e i meccanismi molecolari alla base di secrezione dell'ormone dell'intestino per essere studiato nei minimi dettagli. Il punto più critico per il successo della produzione di dati con questo modello è l'intervento chirurgico. Manipolazione dell'intestino causerà inevitabilmente qualche danno all'intestino e dovrà perciò essere mantenuto per un assoluto minimo. Ancora più importante, la velocità di funzionamento è la chiave, soprattutto per quanto riguarda il tempo per il posizionamento del catetere nell'arteria mesenterica. La nostra esperienza è che il catetere deve essere posizionato con successo, e la perfusione deve essere iniziata entro un paio di min dopo aver tagliato il foro nel serbatoio. Il posizionamento dei cateteri è la parte più impegnativa dell'operazione è complicato dalle piccole dimensioni dell'arteria mesenterica e la sottile parete della vena portale e questo passaggio richiede una certa pratica. Rapido inserimento del catetere venoso è, tuttavia, non più urgente che il caso per l'arteria mesenterica, come l'intestino è ora essere irrorati e mantenuto in vita. Il prossimo passaggio fondamentale è quello di eseguire l'esperimento. Se l'operazione è stata eseguita correttamente, l'intestino irrorato sarà solitamente prosperare ed essere reattivo per fino a 3 h e la pressione di aspersione e uscita in genere rimarrà costante sopra l'intero esperimento. Il fattore più importante per un esperimento riuscito in questa fase è quello di evitare bolle ottenere nel sistema, poiché in questo modo il embolization aria che istantaneamente riduce o Elimina l'output di aspersione. Come il buffer di aspersione contiene BSA ed è gassificato per garantire sufficiente apporto di ossigeno all'intestino irrorato, è difficile prevenire la formazione di bolle interamente. Bolle dovrebbero, tuttavia, essere intrappolati nel gorgogliatore i sistemi, ma questo si svuota gradualmente nel tempo (più bolle, il più veloce svuotamento) e pertanto è importante mantenere una stretta vigilanza sulla trappola bolla e riempirlo con buffer di aspersione quando necessario. È anche importante mantenere il pH di perfusato inferiore a 7,5 — all'aumento del pH, possono formare precipitati di carbonato di calcio, ostruendo il flusso capillare e causando un grave aumento della pressione di perfusione.
L'intestino irrorato è una preparazione piuttosto robusta, ma non tollera alte concentrazioni di prodotti detergenti acidi biliari, etanolo e DMSO. Pertanto, l'uso di detergenti preferibilmente dovrebbe essere evitato, ma a volte è necessario per ottenere composti scarsamente solubili in soluzione. L'intestino irrorato generalmente tollera detergenti amministrati intra-luminally meglio di intra-vascularly. Per esempio, la somministrazione di 1 millimetro di acido taurodeoxycholic (un acido biliare secondario, coniugato) è stata tollerata bene quando infuso intraluminally ma ha provocato immediatamente bloccato aspersione output quando consegnato intra-arterialmente2. Per stimolazioni vascolare, mantenere la concentrazione di DMSO finale inferiore all'1% per evitare risposte secretive aspecifiche (DMSO stimola, ad esempio, la secrezione di GLP-1) e per evitare di causare danno tissutale conseguente pressione di aspersione aumentata e una diminuita perfusione uscita. Gli esperimenti dovrebbero essere ignorati se l'output di perfusione diminuisce di più del 20% nel corso dello studio, se la pressione di perfusione aumenta più del 20% o se l'edema si sviluppa. L'aderenza a questi criteri di successo macroscopico (tra cui il rapido inserimento del catetere nell'arteria mesenterica) solitamente si traduce in buona qualità negli esperimenti di ~14/15.
Dopo aver completato l'esperimento, procedura critica successiva è quello di scegliere il metodo appropriato e saggio per la quantificazione degli ormoni di interesse. Alta fino dosaggio degli ormoni del peptide può essere effettuata mediante test immunologici: radioimmunoanalisi o ELISA. In ogni caso, si consiglia vivamente di convalidare i rispettivi saggi prima di utilizzarli per la quantificazione del campione, come non tutte le analisi disponibili in commercio eseguire in modo soddisfacente per quanto riguarda la sensibilità, specificità e accuratezza (per esempi per quanto riguarda GLP-131). Per quanto riguarda la specificità, cross-reattività è, come sempre, una preoccupazione. Effetti di interferenza e matrice aspecifici sono generalmente meno pronunciati con perfusati artificiale rispetto al plasma. Per quanto riguarda la sensibilità, spesso è molto più facile per ottenere dati affidabili dalle aspersioni che da studi in vivo come il peptide la concentrazioni sono spesso più alti perché l'effluente di aspersione non è diluito nella circolazione sistemica e perché i processi di eliminazione (dal fegato/polmone/rene) sono evitati. In genere, concentrazioni basali negli effluenti venosi si trovano all'interno del range inferiore della maggior parte dei saggi (in caso di GLP-1 (totale), neurotensina (totale) e PYY (totale): 8-15 pmol/L) mentre stimolate risposte possono raggiungere più in alto come 200-300 pmol/L3.
In confronto, i valori basali degli stessi ormoni nel plasma dagli esseri umani sani, ratti o topi sono in genere e 5-10 pmol/L considerando che i valori di risposta sono di 15-30 pmol/L3,32.
Se si rispettano i criteri di successo predefiniti i dati generati perfusione sono generalmente di buona qualità e l'analisi statistica è quindi semplice. Rispetto alla secrezione di glucagone, insulina e somatostatina dall'irrorato isolato del ratto o topo pancreas, la secrezione basale di ormoni dell'intestino è costante e piuttosto simili tra esperimenti per quanto riguarda le concentrazioni misurate, e la secrezione non è chiaramente pulsatile. Collettivamente, la variazione del set di dati è quindi minima e una dimensione di campione à partir tre esperimenti di perfusione è spesso sufficiente raggiungere significatività statistica. Tuttavia, per standardizzare ed evitare gli errori di tipo 2, come pure per ridurre la possibilità di vista meno risposte ben pronunciate, è consigliabile una dimensione campione di sei-otto.
In sintesi, l'intestino tenue irrorato isolato del ratto è un modello importante, fisiologicamente pertinente e sperimentale che può essere utilizzato per indagare gli effetti diretti di una sostanza sulla secrezione dell'ormone dell'intestino. Importanti questioni di fondo, ad esempio dove nell'intestino un secretagogo stimola la secrezione, se stimola la secrezione attraverso l'attivazione di luminally o basolaterally trovano sensori e quali sensori molecolari sono attivati e quindi responsabile per la secrezione può essere affrontata in dettaglio con questo modello. Occorre, tuttavia, essere riconosciuto che il disaccoppiamento dell'intestino da animale donatore può, per alcune domande di studio, essere di importanza. Per esempio, l'intestino interagisce strettamente con il fegato (l'asse intestino-fegato) e il cervello (l'asse intestino-cervello) e meccanismi che si basano su questo cross-talk, quindi, non possono essere studiati con questo modello. La qualità dell'operazione è il fattore critico per la qualità dei dati e sono i fattori più importanti per un corretto funzionamento per mantenere la gestione dell'intestino al minimo e avviare rapidamente aspersione dell'intestino una volta ha tagliato l'arteria mesenterica. È nostra esperienza che ci vogliono 2-4 mesi di pratica prima che vengano generati dati di buona qualità. Tuttavia, una volta che è stato appreso la tecnica, le possibilità di questo metodo sono quasi infinita e solo limitata dalla solubilità delle sostanze da testare e qualsiasi potenziali dannosi effetti di sostanze di prova possono avere sul tessuto irrorato.
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Disclosures
Gli autori di questo lavoro non dichiarano nessun potenziali conflitti di interesse rilevanti per questo articolo.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione illimitata a Prof. ssa Jens Juul Holst da Novo Nordisk centro per ricerca di base metabolica (Novo Nordisk Foundation, Danimarca), una sovvenzione separata dalla Fondazione Novo Nordisk per fare gli studi di aspersione del roditore (grant no. NNF15OC0016574), una sovvenzione a Prof. ssa Holst dal Consiglio europeo della ricerca (Grant no.695069) e Unione europea è settimo programma quadro di ricerca, TechnologicalDevelopment e attività di dimostrazione (Grant No. 266408) così come un dottore di ricerca concedere a Rune E. Kuhre dalla Fondazione Lundbeck (R264-2017-3492). Ringraziamo Jenna E. Hunt e Carolyn F. Deacon per un'attenta correzione di bozze.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for perfusion buffer | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 1.12018.0500 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O) | Merck | 102382 | |
| Dextran 70 | Pharmacosmos | 40014 | |
| Fumaric acid disodium salt (C44H2Na2O4) | Sigma Aldrich | F9642 | |
| Glucose (C6H12O6) | Merck | 108342 | |
| Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4) | Merck | 105886 | |
| Potasium chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck | 104873 | |
| Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4) | Merck | 106619 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | ||
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O) | Merck | 106445 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion equitment | |||
| Universial perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | |
| BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834 | Harvard Bioscience, Inc. | ||
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Cannula with basked, OD = 2.0 mm, ID = 1.0 mm | Harvard Bioscience, Inc. | 733313 |
References
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