Summary
ここでは、消化管ホルモンの分泌と消化管吸収の分子機構を研究する強力な生理学的モデルを提案-単離灌流ラット小腸。
Abstract
腸は、食欲と食物摂取、消化、栄養の吸収と配布、および食後血糖値ツアーを規制する 15 以上の異なるペプチド ホルモンを作り出す体の最大の内分泌臓器です。消化管ホルモンの分泌を調節する分子機構の解明、理解し、消化管ホルモンの生理学の翻訳のための基礎。従来、消化管ホルモン分泌のメカニズム (実験動物または人間) の in vivo 研究されているいずれかまたは粘膜腸ホルモン分泌プライマリを使用して細胞培養細胞します。消化管ホルモン分泌の研究のための代替方法として単離灌流ラット小腸を紹介します。このモデルの美徳は、それはほとんどの重要な生理学的パラメーター粘膜偏波、パラクリン関係のルートなど生体内での研究での分泌を担当を繰り返す意味、そのまま腸に依存します。灌流/刺激の露出。さらに、生体内での研究とは異なり、単離灌流ラット小腸、ほぼ完全に実験的制御と分泌を直接評価します。In vitro 試験と対照をなしてそれは大きさと分泌の重要な質問、どのような刺激を引き起こす腸内腔 (血管) のどちらの側からの分泌は、異なる消化管ホルモンの分泌などに力学の両方を研究することが可能刺激、分泌反応の基になる詳細分子センサーで分析します。さらに、準備は、腸管吸収および責任のトランスポーターを含む腸管の吸収動態に関する詳細の調査のための強力なモデルです。
Introduction
腸は、体の養分吸収と栄養素の処分、腸の成長を調節し、食欲1を調節する 15 以上の異なるペプチド ホルモンの生産最大の内分泌臓器です。消化管ホルモンは多くの基本的な生理学的なプロセスに関与している、したがってと我々 の基本的な生理学的に重要な分泌の分子の詳細はそれぞれのホルモンの分泌を制御するこれらのパターンを理解すること、理解と腸ホルモン操作の並進の側面に対処するためしかし、どのように 1 つは消化管ホルモンの分泌分子センシング機構を学ぶことができますか。一般に、ホルモン分泌の分離腸準備や消化管ホルモン分泌一次電池文化からそのまま生物 (人間または動物実験) で学ぶことができますまたは不死化細胞文化2,3,4,5,6私たちの推奨モデルが最適な時間分解能 (任意の時間で料金を決定ことができます分泌物を詳細に検討する消化管ホルモンの分泌ができる関連する生理学的モデルは、単離灌流ラット小腸。基本秒単位まで) な結果になると体内の状況7に譲渡。ここでは、この手順を実行する方法の詳細なプロトコルを提供して我々 が、利点および単離灌流ラット小腸と比較してこれらのモデルの制限を含む消化管ホルモンの分泌を勉強するための他の方法に説明します。
1 つは、特定の化合物が特定の消化管ホルモンの分泌を調節するかどうかを確立したい、人間の調査が究極の目標です。したがって、化合物 (生体または perfusions) で齧歯類の 1 つまたはいくつかの消化管ホルモンの分泌に大きな効果を示して 場合、ホルモンから分泌細胞 (細胞または細胞) この効果のみ医学と人体生理学に関連する場合が確認できます。人間。ヒトでは、実行することができます研究のタイプの明確な限界があるし、実験動物の生体内での研究は、したがって、多くの場合このような研究の 2 番目の最高のオプションです。マウスやラットは、便利なサイズ、低コスト、特定の調査の質問に関与している疑いがある遺伝子を遺伝的に変更するためのオプションのためにおそらく最も頻繁に使用される実験動物 (など特定の運送者のノックアウトまたは受容体)。一般に、体内のモデルは、生理学的にそのままであることから恩恵を受けるもいくつかの制限があります。齧歯動物、特にマウスの小型は制限要因である腸ホルモン定量化のためほとんどの試金は少なくとも 20 μ L を必要と最も重要なは、少なくとも意味プラズマ (、はるかに多く) 複製を作り撤退するが血の 100 μ L定量化。したがって、基準サンプルに対応する非常に少数のサンプルと (20 g のマウスの総血液量は ~1.4 mL) 1 つまたは 2 つの後刺激サンプルを入手することが可能です。その結果、潜在的な分泌応答 (例えば、急速にまたは遅く起こる応答) 乗り遅れたことがあります。
灌流モデルでこの問題を克服するため、大規模なサンプルとしてボリュームが得られる (流量: 7.5 mL/分)、短期間の急速な応答が逃されないということを確認するため必要に応じて、収集間隔を調整ことができます (我々 の収集分毎サンプル)7.別の問題齧歯動物の生体内研究ではほとんどの消化管ホルモンがさらに多く急速に削除または人間8,9,10、その後の生化学的分析を複雑にするかもしれないより代謝します。例えば、我々 は示した GLP 1 は人間のよりもさらに高速の速度でマウスで代謝されること (T1/2 1-2 分11) より重要なは、N 末端で胸の谷間だけでなく、GLP 1 のマウスの胸の谷間を含むジペプチジルペプチダーゼ-ペプチダーゼ-4 (DPP4) (ある主要な人間の GLP-1 分解酵素)、酵素の中性エンドペプチダーゼ 24.1112で胸の谷間をさらに。その結果、GLP-1 (7 36amide) のままのアイソ フォームまたは DPP 4 切断アイソ フォーム (9-39amide) に基づいているか、GLP-1 の定量化のため現在商業の試金は大幅にマウスにおける GLP 1 分泌を過小評価および結果の12. 単離灌流ラット小腸で分泌されたホルモンの代謝のほとんどは削除またはプラズマによる劣化は避け、肝臓、腎臓、肺抽出/劣化防止 (ので、著しく減少しています。出納を回収して腸から離れるにつれて)。
もちろん、遺伝子組み換え動物、例えば、ナトリウム-グルコース輸送体 1 ノックアウト マウス13の使用によって生成される重要な洞察が、しばしば分泌に関与する分子センサーの詳細な評価が必要です。細胞内タンパク質を異なる G タンパク質共役受容体からイオン チャネル分子の輸送に至るまで、複数の分子サイトの考察。たとえば、9 つの異なる分子サイトの活動は、分子センサー グルコース刺激 GLP 1 分泌7担当を解くとき対象と。同様の調査は、できるだけ体内の化合物のいくつかが非特異的または有害/致死効果ないでしょう。例えば、灌流の腸を使用している場合は、役割と同様に、2-4-ジニトロフェノール7,14 ATP 形成をブロックすることにより GLP 1, ニューロテンシンの分泌の細胞内グルコース代謝の役割を評価することが可能だった胆汁酸の電位依存性カルシウム チャネルは、GLP 1、NT および PYY の分泌3を刺激しました。確かに、灌流研究の非常に有毒なナトリウム チャネルのブロッカー テトロドトキシンを正常に適用できます。最後に、灌流モデルで直接評価できます。 どこ腸内で特定の化合物分泌を刺激するある特定のホルモンの調査官が単に選択し、灌流して目的の地域を準備し、同時に調べることができます。かどうか刺激は腸3,15,16の内腔または血管側から分子センサーの活性化によって分泌を引き起こします。
基になる消化管ホルモンの分泌は、によって学ぶことができる分泌のメカニズムは (人間の組織を含む)、腸組織部分の腸によって (、マウス、または人間の起源)、細胞を分泌不死化 (マウス) から通常のプライマリ腸の文化ホルモンを使用します。組織では、Ussing 室、(最も頻繁にマウスからの両方) organoids2,3,4,5,6,17,18をマウントされています。もちろん腸の部分の研究新鮮な人間の腸内へのアクセスが必要ですが、ひと腸内作品, 一次電池文化および細胞株に関する技術的に簡単に実行する、データを生成するより速くより安い方法腸 perfusions と比較して、標本。しかし、これらのモデルで、腸内の正常な細胞の分極は本質的に失われ、分子センサーの通常の活性化を評価するためにこれらのモデルを使用ことはできません吸収過程も調査することができないことを意味します。さらに、このような研究は通常静的な孵化を採用 (のいくつかの時間まで) は生理学的高度と分泌製品は削除されず、このようにフィードバックに影響を与える可能性がありますので、細胞の通常の分泌動態とは何もして、ホルモンの分泌。対照的に、灌流腸内分泌および吸収分子効率的に削除され、粘膜の微小循環体内、吸収と分泌の正常な率で発生することがので、経勾配が維持されていることを確認彼らは。つまりネイティブ細胞ペプチド コンテンツ面での代表的な分子センサーの表現であるもはや彼らはまだ可能性がありますが、ネイティブの enteroendocrine 細胞の起源から培養細胞がさらに、脱分化型問題のホルモンを分泌します。これは、例えば、GLP 1 分泌細胞ライン19のためのケースです。
それは、したがって、我々 の意見を一次電池文化またはセル行研究、スクリーニング目的のため生体内で実行することはできませんの種類の実験を実行するためや分離の灌流腸内で最も適しています。例えば、一次電池文化および培養細胞ラインの真の強さはその細胞内二次メッセンジャー (例えば Ca2 +キャンプ、NAD(P)H) をリアルタイムで監視できるし、ホルモン分泌細胞の電気信号は、20,21,22を調べた。さらに、その特異的阻害剤が利用可能な20,21,22,23,24ではない場合に特に便利である、siRNA の打撃が実行できます。Ussing 室でマウントされているマウスから腸のティッシュは、(マウス) から腸 organoids 中、胆汁酸刺激 GLP 1 分泌の分子機構を研究するため最近使用されており、人間の腸内の作品は、勉強のため使用されている、消化管ホルモン分泌17,25の分子の詳細。2円偏波であることから元の利点に対しすべてのこれらのモデルは静的な孵化を含みます。ただし、組織 7TM 受容体発現における種差以来重要である齧歯動物というよりも、人間のティッシュを使用して恩恵を人間の腸内の作品に関する研究、分子トランスポーター可能性があります異なる分子センシング経路種。実際には、このフィールドのほとんどのデータは、ブタ、マウス、ラットのいずれかに関する研究によって生成されている、これらの知見は、人間に転送できるかどうか、それはとらえどころのないまま。です、ただし、グルコース刺激 GLP 1 分泌の根底にある分子の検出機構は、マウス、ラット、男、間に似ている、安心とトランスクリプトームと peptidomic のプロファイリング マウス L 細胞の明らかに強いグローバル2 種7,18,26,27間の類似点。
単離灌流ラット小腸しかし、考慮すべきいくつかの制限があります。最も重要なは、標的ホルモン産生細胞の被験物質で直接活性化は、間接メカニズムによってというか原因が与えられた分泌反応に起因するかどうかを確認するは不可能です。例えば、KCl は即座に7の灌流腸から GLP 1 分泌を増加させるが、この L 細胞の直接脱分極の結果や L 細胞に近いニューロンの脱分極またはの効果に起因かどうか不明のままパラクリン刺激/阻害剤を同時発売。灌流の腸を使用して分泌の分子機構の解明を目指す研究から生じるデータする必要があります、したがって、常にコンテキストに配置するを確立する能力を高めるための他のより特定のモデルから取得したデータで因果関係。例えば、GLP 1 分泌細胞株 GLUTag28,29とプライマリ マウス L 細胞からのグルコース刺激 GLP 1 分泌はブドウ糖の運送者 (SGLT1、GLUT2) のアクティビティに依存します。分泌20L 細胞のグルコースの直接行動による主グルコース刺激 GLP 1 分泌する可能性があることを意味を減衰も灌流ラット小腸におけるこれらのトランスポーターをブロックします。灌流、腸のもう一つの重要な制限は、脂質の一部が、疎水性のための勉強は難しいことです。脂質消化 (脂肪酸、前記ジアシル リン、lysophosphatidylglycerols、等) の最終製品を調査することはできますが、準備が再エステル化することがありますが、脂質内 cellularly、おそらくそれらをパックにチロミクロン、細胞とその後続 lacteals 絨毛の吸収、チロミクロンの輸送が中断される分離腸のリンパの流れを確保できないので。ほとんどの場合、したがって、吸収製品が細胞内に蓄積する始めれば、脂質吸収が停止しました。体外電池システムは、偏波の欠如のためさらに少ない脂質研究に適しています。明らかに、この制限は、脂質吸収され、lacteals 経由にのみ関連、それらは腸の血管を介して吸収されるに対し、正常に処理される可能性があります。
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Protocol
デンマークの動物実験局 (2013-15-2934-00833) とデンマーク規制が動物実験 (1987 年)、国のガイドラインに従い、ローカル倫理委員会の許可を得てすべての研究を行った衛生研究所 (文書番号 85-23)。
1. 実験動物
- Wistar ラット (250 g) を入手、ケージ、標準的な食事と水へのアドリブあたり 2 をハウスし、維持、12:12 時間の明暗サイクル。私たちの動物施設は、非処理水と Alrtromin 齧歯動物の食事 (1319 フォルティ、Brogaarden、リンゲ デンマーク) を使用します。
注: 許可動物順化の少なくとも 1 週間。
2. 術前の準備
- 灌流のバッファーを作る: クレブス リンガー炭酸バッファー添加 0.1 %bsa (分数 V) 5% デキストラン T-70、3.5 ミリ モル/L グルコースと 5 ミリ モル/L のピルビン酸、フマル酸、グルタミン酸 (必要なら);pH 7.4。
- フィルター フィルターの適切なサイズを灌流バッファーの十分な量を準備し、5 M の塩酸を滴下することによって ~7.5 に pH を調整します。
- 3-イソブチル-1-メチルキサンチン (IBMX) (必要な) 場合直接バッファーに追加 10 μ M の最終的な集中に研究の日。
注:IBMX はホスホジエステラーゼ阻害剤 [キャンプ]私を増加させ、それによって感度と分泌刺激ホルモンを分泌の面で腸の応答性が復元されます。 - テスト ソリューションを準備します。フィルター処理と pH 調整の灌流のバッファーに必要な最終濃度よりも高い濃度 x 20 血管刺激を準備します。最終濃度の等張生理食塩水で内腔テスト刺激を準備します。
- 100% ジメチルスルホキシド (DMSO) で容易に溶解しない化合物を溶解し、希釈灌流バッファーまたは等張生理食塩水でさらに。血管刺激の最終の DMSO 濃度 1% 以下の濃度上これは腸を損傷し、非特異的腸ホルモン分泌につながる可能性がありますまま。PH を測定し、必要な場合 ~7.5 に調整します。
3. 操作と血流
注:灌流セットアップの図は、図 1で提供しています。
- Hypnorm/ミダゾラムで 30-40 分の鎮痛と麻酔に耐えることができる麻酔法を用いてラットを麻酔 (1 ml あたり 0.3 ml/100 g 体重: Hypnorm: 0.08 mg のフェンタニル、0.45 mg メチル Parahydroxybenzoate、0.05 mg 2.5 mg fluanisoneプロピル Parahydroxybenzoate、ミダゾラム: 1.25 mg、マトリックスの医薬品、ヘレルプ、デンマーク)
- 反射 (つま先ピンチ) の不足のためチェック温水オペレーティング テーブルの上、ラットを場所し、腸を公開する皮膚の切開を行います。
-
可能な限り脇の小腸を移動することによって大腸の末端部を公開します。小腸への移動、大腸の末端部から始まって徐々 にコロンと消費税に血管供給のネクタイ。
- 灌流 (上の半分) の必要な小腸の特定の部分だけである場合は、血管の供給を拘束した後不要なセグメントを消費税します。組織の損傷を最小限に抑える、等張生理食塩水で腸に潤いを与えるし、結合組織を除去する綿棒を使用します。
- プラスチック製のチューブを挿入 (長さ: ~ 15 cm、外側の直径: ~0.4 cm) (近位部) の腸管にネクタイを使って適切に縫合糸します。じゅくの内腔を空に等張生理食塩水 (常温) で慎重にフラッシュします。
- 0.25 mL/min の流量で等張生理食塩水で内腔を灌流、10 mL の注射器を使用して注射器ポンプに接続されています。
- 上腸間膜動脈がアクセスできるように腸を脇へ移動し、動脈を公開する結合および脂肪組織を削除します。
- 細かい点鉗子; を使用して、上腸間膜動脈の下で 2 つの縫合糸を配置します。縫合糸の 1 つは、動脈の動脈が切れているし、は動脈にはカテーテルを保護するため、一度出血制御を持ち上げるためです。穿孔動脈に注意してください。
- 門脈は静脈灌流廃水のコレクションのために起こっている金属のカテーテルを保護するための下で 2 つの縫合糸を配置します。
- 上腸間膜動脈に穴を切断する前に起こっている動脈に挿入したカテーテルは灌流バッファー空気塞栓形成を防ぐために満ちていることを確認します。
- 外科はさみのペアを使用して腸間膜動脈に小さな穴をカットし、プラスチック製のカテーテルを挿入した直後に。
- カテーテルを確保すると、直後はローラー ポンプを起動することによって、腸の血流を開始 (流量 = 7.5 mL/分)。
- 数秒では、腸の血管が青く門脈が青ざめてを確認します。
- 門脈内に穴を開ける、適切な血流が確立された後すぐに金属のカテーテルを挿入し、縫合糸で固定します。
注:カテーテルは場所がもっとも近位縫合助けを慎重に引いて、静脈を持ち上げにくくすることができます。 - カテーテルは、場所、灌流出力は満足のいく、一度カテーテルをリッピングしないように注意して横隔膜穿孔によるラットを殺します。
- 1 分の灌流出力を収集し、体積を測定します。圧力記録プログラムでクリック実行実験によって灌流圧の集録/録音を開始します。
- 実験中に乾燥からそれを防ぐために湿らせたティッシュで腸内をカバーします。
- 内腔の排水が終了することが、腸が膨潤されますそれ以外の場合、浮腫を開発、灌流圧が増加し、灌流出力が低下しますので、腸の遠位端がブロックされていないことを確認します。
- 実験を開始する前に約 30 分のための準備を残します。
注:消化管ホルモンの分泌の出力は灌流の最初の 15 分の非常に安定したこの平衡ステップが安定したベースラインを取得する必要があります。
4. 実験
- 灌流の約 30 分後、一部コレクターを使用して最初のベースライン サンプルを収集することにより実験を開始します。目的の時間間隔でサンプルを収集 (例えば、毎分、6.5 7.5 mL は収集通常) といくつかの分内の氷の上に置きます。
-
バブル トラップを定期的に検査し、空の場合は、灌流バッファーでそれを補充します。
- 器官に入る前にすぐに、(後でそれは器官を介して灌流されている) でも、器官が代謝活性を確認する門脈内に挿入したカテーテルから、三方コック バルブを通じてバッファーを収集します。開始時と実験中の生存率を評価するために実験の最後のサンプルを収集します。
- サンプルすぐ測定、自動血液ガス分析とほとんどのプラスチックが含まれています/注射器は完全に密閉ではないと大気中の空気と交換に上昇を与えます。
- ベースライン コレクションの 10-15 分後、最初のテスト物質を刺激します。三方活栓から注射器のポンプを動脈内刺激を管理 (フロー = 0.350 mL/分)。
- 初期のボーラス注入 (最初の 5 分で 2.5 mL/分) による内腔の刺激を実行、テスト ソリューションの管理低流量 (0.5 mL/分)、ルーメン内にある等張生理食塩水を置換する後します。
- 内腔は被験物質の迅速に空に内腔刺激周期が終わるためには、上記と同じ流量を適用することで等張生理食塩水で腸管をフラッシュします。
- 次の被験物質の投与前に 15-30 分のためのベースライン サンプルを収集します。プロトコルによって 2-3 テスト刺激通常含んでいる実験することができます。実験的プロトコルには、特定の分泌促進剤の投与と同時に与えられた分子サイトの活性化/抑制が含まれている場合、常に前を刺激活性化/抑制剤とする分泌促進剤の投与前に 10-15 分分子のサイト、分泌促進剤注入の非常に初めに抑制されることを確認します。
- プロトコルの最後に、刺激周期後準備の応答性をテストし、10-15 分基準サンプルを収集する (5-10 分) 適切な肯定的な制御を管理します。
注:いくつかのテスト物質をポジティブ コントロールとしてなどに使用できます、増加 [キャンプ]私(例えばフォルスコリン、IBMX)、[Ca2 +]私(例えば産生を検討、ニューロメジン C) のための刺激剤を脱分極 (例えば, 30-50 mM KCl) 以上栄養素など生理学的関連性の高い刺激: グルコース、ペプトン、アミノ酸など。ただし、陽性対照の選択は実験の結果に依存します。産生を検討ではなくグルコース依存性インスリン分泌刺激ペプチド (GIP) 分泌30堅牢な分泌促進物質、例えばグルコースは貧しいコレシストキニン (CCK) の分泌促進剤です。 - 実験終了後灌流の腸を切除、それの重量を量る、その長さを測定します。パラホルムアルデヒドで言えばし、H & E 染色によって例えば潜在的な組織の整合性・損傷の組織化学的解析を後でそれ (4 ° C) を格納します。
5 生化学的測定
- 社内や市販測定 (RIA) を用いて静脈の排水に分泌されるペプチドの濃度を定量化するまたは ELISA アッセイ。腸管吸収の調査研究、静脈の排水で,グルコースやアミノ酸など興味の分子を定量化します。
注:液は通常 (glucoseoxidase 法によるグルコースの定量) などの酵素反応に依存するアッセイを含むほとんどの解析の良い基底バッファーです。
6. データの分析
- 例えば実際の分泌出力を示す時間濃度グラフとしてさまざまな方法でデータを提示 (流濃度 x) とベースラインと応答期間 (通常 10-15 時点) 出力合計分泌を描いた列プロットとして。
- それぞれのホルモンの濃度の単位としての実際測定濃度をプロットします。(pmol/L)、
注:このモデルでは、生体内での研究とは対照的に得られた値が実際の分泌出力 (灌排水の定数のコレクション) のためので、代わりに出力 (fmol/分) としてデータを表現することをお勧めします。 - 統計学的に分析するグループの数、に応じて 2 尾使用対応のある t 検定 (2 グループ) または繰り返し測定 (3 つ以上のグループ) の一方向の分散分析は続いて複数の比較のための適切な事後テスト。
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Representative Results
与えられた刺激に関心の消化管ホルモンの分泌が原因かどうかを判断することは、安定したベースラインの分泌に依存します。さらに、刺激への応答は認められなかったが、肯定的な制御に堅牢な分泌応答が明らかにテスト刺激への応答の欠乏に応答性の一般的な不足が反映していないことを除外する必要があります。図 2Aおよび2B良い品質データの例を示しています。単離灌流ラット小腸から GLP 1 分泌が 1 分間隔 (平均 ± SEM) で表示されます。基底状態で分泌が安定です。テスト刺激 (インスリン) とポジティブに堅牢な分泌反応の管理の前後にコントロール (産生を検討 (BBS)) は明らかです。さらに、平均インスリン分泌だけでなく、GLP 1 分泌基底状態 (インスリン又は掲示板管理それぞれの基準期間) の平均し、掲示板刺激、棒グラフ (平均 ± SEM) として表示されます。分泌は、統計的有意性の繰り返し測定のための一方向の分散分析によってテストされました。これらの結合されたデータに基づき、考えられる動脈内インスリンが単離灌流ラット小腸から GLP 1 分泌を刺激しません。
図 2および2 D単離灌流ラット小腸から GLP 1 分泌の例を示します。図 2 aと2 bと違ってこれらのデータが質の悪い;分泌が基底状態で安定しており試験物質の投与に関連すると思われる方法で上向きに全体でドリフト (内管腔と動脈内の果糖それぞれ) 肯定的な制御、掲示板がされないと統計的有意な増加 GLP 1 分泌。それは、したがって、かどうか果糖刺激は GLP 1 分泌を生じ、例えば、血管果糖刺激果糖を介した応答の終わりに増加した GLP 1 分泌を締結することが可能。
図 1: 灌流セットアップの例。システムは、プレキシ ガラス スタンド、温水オペレーティング テーブル、バブル トラップ、圧力計および灌流圧調整用スピンドル ポンプで構築すると熱交換器で構成されています。酔った (95% O25% CO2) を加熱するサーモスタット サーキュレータに灌流システムが接続されている 37 ° c. に灌流バッファーまた、灌流圧は連続記録し圧力記録計による導入し可視化、適切なソフトウェアを搭載した PC に保存されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 単離灌流ラット小腸からデータ。(A, B) よく行った実験例と信頼性の高いデータ、(C, D) 灌流圧が増加し、研究の時間にわたって灌流出力が劇的に減少したサブ最適なデータの例です。(A) 基底条件と動脈内インスリン投与 (200 〜 1000 午後、示されているように) への応答で、GLP-1 (合計) 出力 (fmol/分) が表示されます。産生を検討 (BBS)、よく知られている、強力な GLP 1 分泌促進は気管動脈内投与 (順位コントロール) の応答性の制御実験の終わりに注入しました。データを提示する ± SEM は、 nの手段として 4 を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
単離灌流ラット小腸は、ダイナミクスと分子機構の詳細に検討する消化管ホルモンの分泌を可能にする強力な研究ツールです。このモデルを使用してデータの巧妙な生産の最も重要なステップは、手術操作です。腸の処理は、必然的に腸にいくつかの損傷を引き起こすし、そのために維持されるべき絶対最小。さらに重要なは、操作の速度は上腸間膜動脈内カテーテル留置のための時間に関しては、特に重要です。我々 の経験はカテーテルを正常に配置する必要があります、容器の穴を切った後いくつか分の内灌流を開始必要があります。カテーテルの配置操作の最も困難な部分は、上腸間膜動脈のサイズが小さいと、門脈の薄肉で複雑なこのステップにいくつかの練習が必要です。静脈カテーテルの迅速な挿入は、しかし、上腸間膜動脈のためのケースとして、緊急、消化管としては今灌流されているし、保持します。次の重要なステップは、実験を実行することです。操作が正常に実行された場合灌流の腸は通常繁栄し、応答性が 3 h までと灌流圧と出力は通常実験全体を定数まま。この段階では実験が成功の最も重要な要因は、いずれかを即座に縮小または灌流出力を排除する空気塞栓が生じるので、システムに入る泡を避けるためです。灌流バッファーは、BSA が含まれているし、灌流腸に十分な酸素供給を確保するため毒ガス、全く泡の形成を防止することは困難です。泡はただし、する必要があります、システムのバブル トラップに閉じ込められているが、これを (より多くの泡、速く空に) 時間をかけて徐々 に空にありだからバブル トラップに近い時計を維持し、必要なときの灌流バッファーを補充することが重要です。また 7.5 下液の pH を維持することが重要だ-毛管流れを妨害され、灌流圧の深刻な上昇で pH の増加、カルシウム炭酸塩沈殿物が形成可能性があります。
灌流の腸はかなり堅牢な準備が、胆汁酸、エタノール、DMSO など界面活性剤の高濃度を容認しません。したがって、洗剤の使用は、できれば避けられるべき、ソリューションに難溶性の化合物を得るために時々 必要です。灌流の腸は一般的に投与洗剤を許容内 luminally 内単よりも良い。例えば、1 mM taurodeoxycholic 酸 (二次、共役胆汁酸) の管理は、intraluminally を注入、気管動脈内投与2で配信されたときの出力ブロック潅流で即座に結果を容認されました。血管刺激の保つ最終の DMSO 濃度 1% 以下 (DMSO を刺激する、例えば、GLP 1 分泌) 不特定の分泌反応を避けるために、血流の減少し、増加の灌流圧結果組織の損傷を回避するために出力します。灌流圧は 20% 以上増加する場合灌流出力は、研究の過程で 20% 以上減少した場合、または浮腫を開発、実験を無視する必要があります。これらの巨視的成功の条件 (上腸間膜動脈内カテーテルの迅速な挿入を含む) への付着 ~14/15 実験で質の良い通常の結果します。
実験を完了すると、次の重要な手順、適切なメソッド、興味の hormone(s) の定量化のための試金を選択します。ペプチド ホルモンの高スループット試金することができます用いて行われる免疫: ラジオイムノアッセイ法や ELISA。ともあれ、強くお勧め、すべて市販の試金は感度、特異性、正確性に関して満足のいく実行サンプル定量化のためにそれらを使用する前にそれぞれの試金を検証する (例についてGLP-1 の31)。特異性、については、交差反応性は、常に、懸念事項としては。不特定の干渉と行列効果一般に顕著ではない人工 perfusates のプラズマと比較すると。感度に関してはそれはしばしば多くのペプチドとして生体内での研究から濃度が多い高い灌排水が全身循環に希釈されていないためよりも、perfusions から信頼性の高いデータを入手しやすくなります(肝臓・肺・腎臓) によって除去プロセスが回避されます。通常、ほとんどの試金の低い作業範囲内静脈の排水基準濃度のうそをつく (GLP-1 (合計)、ニューロテンシン (全体) と PYY (合計) の場合: 8-15 pmol/L) 刺激応答高として、200-300 pmol/L3に達することができる間。
健康な人間からプラズマで同じホルモンの基準値比較ではラットやマウスは通常 5-10 pmol/L と応答値が 15-30 pmol/L3,32一方。
定義済みの成功基準を遵守している場合生成された血流データは通常良質のと統計解析は簡単ですし。単離灌流ラットまたはマウスの膵臓からグルカゴン, インスリンおよびソマトスタチンの分泌と比較して、消化管ホルモンの基礎分泌は着実とむしろ測定濃度に関する実験と同様、分泌はないです。明確に拍動します。データ セットの変化は最小限をまとめて、サンプル サイズの低灌流実験はしばしば統計的有意性に到達するのに十分です。ただし、標準化し、タイプ 2 エラーを避けると同様少ないよく顕著な応答を見下ろすの可能性を減らすため、6 〜 8 のサンプル サイズをお勧めします。
要約すると、灌流ラット小腸は消化管ホルモンの分泌の所定の物質の直接的な影響を調査するため重要な生理学的に関連する、実験的モデルです。センサーであり、分子センサーがアクティブ化このように担当、腸内に分泌促進物質は分泌を刺激する、かどうか、それは、luminally の活性化を介して分泌を刺激する basolaterally などの重要な基本的な質問分泌物は、このモデルの詳細に対処があります。それは必要があります、しかし、ドナー動物から腸の連結を解くこと、いくつかの研究の質問のことの関連性を認識します。例えば、腸は肝臓 (腸肝軸) や脳 (腸-脳の軸) と密接に対話、このクロストークに依存したメカニズムしたがってこのモデルで調査することはできません。操作の質はデータの質の重要な要素と、成功した操作の最も重要な要因は、最小限に腸の処理を維持して上腸間膜動脈が切れていると、腸の血流がすぐに。質の良いデータを生成する前に、の練習の 2-4 ヶ月かかる私たちの経験です。しかし、テクニックを学習されているこのメソッドの可能性が灌流組織に試験物質可能性があります効果を損なう潜在的な被験物質の溶解度によって制限されます。 ほとんど無限とだけ。
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Disclosures
この作品の作者を宣言しない潜在的な利害のこの記事に関連します。
Acknowledgments
この作業によって支えられた無制限で与える教授 Jens におけるホルストにノボ ノルディスク センターから基本的な代謝研究 (ノボ ノルディスク財団、デンマーク) (許可なし齧歯動物の血流の研究を行ってのノボ ノルディスク財団から別の助成金。NNF15OC0016574) 教授ホルストに欧州研究評議会 (グラント no.695069) と欧州連合からの助成金のポスドクと同様、研究、技術開発、実証活動 (許可番号 266408) に第 7 フレームワーク プログラムルンドベック財団 (R264-2017-3492) からルーン E. Kuhre に付与します。注意して校正、ジェナ e. ハントとキャロリン ・ f ・執事に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for perfusion buffer | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 1.12018.0500 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O) | Merck | 102382 | |
| Dextran 70 | Pharmacosmos | 40014 | |
| Fumaric acid disodium salt (C44H2Na2O4) | Sigma Aldrich | F9642 | |
| Glucose (C6H12O6) | Merck | 108342 | |
| Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4) | Merck | 105886 | |
| Potasium chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck | 104873 | |
| Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4) | Merck | 106619 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | ||
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O) | Merck | 106445 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion equitment | |||
| Universial perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | |
| BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834 | Harvard Bioscience, Inc. | ||
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Cannula with basked, OD = 2.0 mm, ID = 1.0 mm | Harvard Bioscience, Inc. | 733313 |
References
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