Summary
여기, 우리는 기본 창 자 호르몬 분 비 및 장내 흡수 분자 메커니즘 연구에 강력 하 고 생리 적 모델 제시-격리 끼얹는다 쥐 소장.
Abstract
용기는 식욕과 음식 섭취, 소화, 영양소의 흡수와 분포, 및 포스트 높은가격순 포도 여행 15 개 이상의 다른 펩 티 드 호르몬을 생산 하는 신체의 가장 큰 내 분 비 기관 이다. 창 자 호르몬 분 비를 조절 하는 분자 메커니즘을 이해 하는 것은 이해 하 고 소화 관 호르몬 생리학 번역에 대 한 기본적 이다. 전통적으로, 기본 창 자 호르몬 분 비 메커니즘 (실험 동물 또는 인간)에서 vivo에서 공부 하거나 또는 문화 셀 또는 셀 라인 점 막 창 자 호르몬 분 비 기본을 사용 하 여. 여기, 창 자 호르몬 분 비를 공부 하기 위한 대체 방법으로 격리 된 끼얹는다 쥐 소장을 소개 합니다. 이 모델의 미 덕은 그것은 생리 적으로 중요 한 매개 변수 vivo에서 학문, 점 막 분극, paracrine 관계의 노선 등에서 분 비에 대 한 책임의 대부분을이 의미 그대로 직감에 의존 관류/자극 노출입니다. 또한, 그리고 vivo에서 연구와는 달리 거의 완전 한 실험 제어 및 분 비의 직접 평가 대 한 격리 끼얹는다 쥐 소장 수 있습니다. 달리 생체 외에서 학문, 그것은 크기와 주소 중요 한 질문, 어떤 자극 원인 용기 (luminal 또는 혈관)의 측면에서 분 비는 다른 소화 관 호르몬의 분 비와 분 비의 역학을 공부 하 자극, 분 비 응답 기본 세부 분자 센서에서 분석 하 고. 또한, 준비 책임 전송기를 포함 하 여 장내 흡수의 역학에 관한 내용과 장내 흡수의 연구에 대 한 강력한 모델입니다.
Introduction
용기는1식욕 조절 영양소의 흡수 및 영양 처리, 장 성장 규제 15 개 이상의 다른 펩 티 드 호르몬을 생산 하는 신체의 가장 큰 내 분 비 기관 이다. 창 자 호르몬, 따라서, 많은 기본적인 생리 적 과정에 참여 이며 분 비와 각 호르몬의 분 비를 제어 하는 분자 세부의 이러한 패턴을 이해 따라서 우리의 기본 생리에 대 한 중요 한 이해 하 고 소화 관 호르몬 작업;의 변환 측면을 해결 하기 위한 하지만 어떻게 하나 밑에 창 자 호르몬 분 비 분자 감지 메커니즘을 공부할 수 있습니다? 일반적으로, 호르몬 분 비 절연된 용기 준비 또는 창 자 호르몬 분 비 1 차 셀 문화에서 그대로 유기 체 (인간 또는 실험 동물), 공부 될 수 있다 또는 셀 문화2,3, 를 불멸 하 게 4 , 5 , 6. 우리의 선호 모델은 격리 끼얹는다 쥐 소장, 최적의 시간 해상도 (분 비 속도 든 지도 결정 될 수 있다 자세히 공부 창 자 호르몬의 분 비를 허용 하는 생리 적으로 관련 모델 두 번째도 기본), 결과 가능성이 vivo에서 상황7양도. 여기, 우리이 절차를 수행 하는 방법에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하지만 먼저 우리는 창 자 호르몬 분 비, 혜택 및 분리 끼얹는다 쥐 소장에 비해이 모델의 한계를 포함 하 여 공부를 위한 다른 방법을 논의할 예정 이다.
만약 하나의 소원을 특정 화합물 특정 창 자 호르몬의 분 비 조절 여부 설정, 연구 인간의 궁극적인 목표는. 따라서, 화합물 비보 나 (perfusions)에 설치류에 하나 또는 여러 개의 창 자 호르몬의 분 비에 좋은 효과 보여줍니다 또는 호르몬에서 분 비 세포 (세포 선 또는 1 차 셀),이 효과만 의학 및 인간 생리학에 관련 된 경우 확인할 수 있습니다. 인간. 그러나, 인간에서 수행할 수 있는 연구의 유형에 대 한 명확한 한계가 있다 그리고 vivo에서 연구 실험 동물에는, 따라서, 종종 이러한 연구에 대 한 최고의 두 번째 옵션. 생쥐와 쥐가 그들의 편리한 크기, 저렴 한 비용 및 유전자의 구체적인 연구 질문에 참여 하 고 의심 하는 유전자를 변경 하는 옵션 때문에 아마도 가장 자주 사용 된 실험 동물 (예를 들어, 특정 전송 밖 노크 또는 수용 체)입니다. 일반적으로, vivo에서 모델 순수 그대로 되 혜택 하지만 몇 가지 제한이 있다. 가장 중요 한 것은, 작은 설치류, 특히 마우스의 크기가 제한 요소, 창 자 호르몬 정량화에 대 한 대부분의 분석 요구 20 µ L 플라즈마 (그리고 종종 훨씬 더), 적어도 의미의 혈액의 100 µ L 복제 철회 되어야 하는 정량화입니다. 따라서, 그건 단지 거의 샘플 해당 기준선 샘플 하 고 하나 또는 두 개의 후 자극 샘플 (20 g의 마우스에 총 혈액 량은 ~1.4 mL)을 얻을 수 있습니다. 따라서, 잠재적인 분 비 응답 (예를 들어, 빠르게 또는 늦게 발생 응답) 따라서 놓칠 수 있습니다.
관류 모델에서이 문제를 극복, 볼륨 큰 샘플으로 가져온 (유량: 7.5 mL/min) 컬렉션으로 빠르고 짧은 지속 응답은 보고 되지 보장 하기 위해 필요에 따라 조정 될 수 있다 (우리는 수집 모든 분 샘플)7 . 또 다른 문제 설치류에서 vivo 연구에서 대부분 소화 관 호르몬은 더욱 빠르게 제거 또는 보다 인간8,9,10, 이후 생 화 확 적인 분석을 복잡 하 게 수 있는 대사. 예를 들어, 우리가 보여준 GLP-1은 인간에서 보다 더 빠른 속도로 쥐에서 물질 대사로 변화 (T1/2 는 1-2 분11)와, 더 중요 한 것은 N 맨끝 분열에 의해 뿐만 아니라 쥐에 GLP-1의 분열을 포함 하 dipeptidyl-peptidase-4 (DPP4) (이 인 간에 있는 주요 GLP-1 타락 효소), 효소 중립 endopeptidase 24.1112분열을 추가. 도 GLP-1 (7-36amide)의 그대로 isoform 또는 기반 DPP-4 죽 습 isoform (9-39amide), GLP-1의 정량화에 대 한 현재 상업적인 분석 훨씬 쥐 분 비 GLP-1를 과소 평가 하 고 결과 오해의 소지가 발생할 따라서, 12. 격리 끼얹는다 쥐 소장에서 분 비 호르몬의 대사 대부분 제거 또는 현저 하 게 감소, 플라즈마 중재 저하를 피할 수 있기 때문에 (때문에 간/신장/폐 추출/저하를 방지 perfusate는 수집 용기를 떠날 때).
물론, 중요 한 통찰력은 유전자 변형된 동물, 예를 들어, 나트륨 포도 당 운송업 자 1 녹아웃 쥐13의 사용에 의해 생성 될 수 있습니다 하지만 종종 분 비에 관여 하는 분자 센서의 상세한 평가 필요 이온 채널 분자 전송기 및 다른 G 단백질 결합 된 수용 체 세포내 단백질에 이르기까지 여러 분자 사이트의 고려 사항. 예를 들어, 우리는 9 다른 분자 사이트의 활동 분자 센서 GLP-1 분 비 포도 당 자극7에 대 한 책임을 탈피 할 때 대상. 유사한 조사 가능한 vivo에서 사용 하는 화합물 중 일부는 불특정 또는 유해한 치명적인 효과 않을 것 이다. 예를 들어, perfused 용기를 사용할 때는 가능 했다의 역할 뿐 아니라 2-4-dinitrophenol7,14 ATP 형성을 차단 하 여 neurotensin GLP-1의 분 비에 대 한 세포내 포도 당 대사의 역할을 평가 하 담 즙 산에 대 한 전압 개폐 칼슘 채널 자극 GLP-1, NT 및 PYY 분 비3. 실제로, 높게 유독한 나트륨 채널 차단제 테트로도톡신 관류 연구에 성공적으로 적용할 수 있습니다. 마지막으로, 관류 모델에 그것 평가 될 수 있다 직접 어디에 특정 화합물 자극 특정 호르몬의 분 비로 탐정 수 있습니다 간단 하 게 선택 하 고 perfuse, 원하는 영역을 준비 하 고 동시에 그것은 조사 수 있습니다. 여부는 자극 분자 센서의 활성화에 의해 내장3,,1516의 luminal 또는 혈관에서 분 비를 발생합니다.
기본 창 자 호르몬 분 비에 의해 공부 또한 수 분 비 메커니즘 사용 (인체 조직 포함), 창 자 조직 조각의 불후의 명작 (쥐)에서 일반적으로 기본 장 문화 호르몬 셀 라인 (마우스 또는 인간의 기원), 창 자에 의해 은닉 조직은 Ussing 약 실에서 또는 organoids (마우스에서 가장 자주 둘 다)2,3,,45,6,,1718거치. 장 perfusions에 비해, 인간의 직감 조각, 기본 세포 배양 및 세포에 대 한 연구 수행을 기술적으로 쉽게 데이터를 생성 하는 빠르고 저렴 방법 하지만 직감 조각의 연구 신선한 인간의 창 자에 대 한 액세스를 필요로 하는 물론 표본입니다. 그러나,이 모델에는 정상 세포의 양극 화 현상이 용기 분자 센서의 정상적인 활성화를 평가 하기 위해이 모델을 사용할 수 없습니다 고 흡수 프로세스 또한 공부 될 수 있는 본질적으로 손실 됩니다. 또한, 이러한 연구 결과 일반적으로 정적 외피 고용 (에 대 한 여러 h)는 매우 비 생리 적 이며 상관이 세포의 정상적인 분 비 역학, secreted 제품 제거 되지 않습니다 및 따라서 피드백 영향을 미칠 수 있기 때문에 호르몬의 분 비 반면, perfused 소장에서 분 비 및 흡수 분자는 효율적으로 제거 점 막 미세 혈관에 의해 vivo에서, transmucosal 그라디언트 흡수와 분 비는 정상 속도로 발생할 수 있습니다 그래서 유지 됩니다 보장은. 또한, 셀 문화 그들의 네이티브 enteroendocrine 셀 근원, 그들은 여전히 수 있지만 그들은 더 이상 펩 티 드 콘텐츠 측면에서 네이티브 셀의 대표 분자 센서, 표현의 의미에서 dedifferentiated 할 수 없습니다. 질문에 호르몬 분 비. 이것은, 예를 들어, GLP-1 은닉 세포 라인19에 대 한 경우입니다.
그것은, 그러므로, 우리의 의견 1 차 셀 문화 또는 셀 라인 연구는 심사 목적 및 수행 vivo에서 수 없는 형식 실험을 수행 하기 위한 또는 고립 된 perfused에 가장 적합. 예를 들어, 기본 세포 배양 및 세포 선 문화의 진정한 힘은 그 세포내 이차 메신저 (예: 캘리포니아2 +, 캠프, NAD(P)H)는 실시간으로 모니터링할 수 있습니다 그리고 수 있습니다 세포를 은닉 하는 호르몬의 전기 신호 20,,2122조사. 또한, siRNA 최저 할 수 있습니다, 특정 억제제 사용할 수20,,2122,,2324없는 경우에 특히 유용. 창 자 조직 Ussing 챔버에 장착 하는 쥐에서 최근 사용 되었습니다 담 즙 산 자극된 GLP-1 분 비, 장 organoids (쥐)에서 동안 기본 분자 메커니즘을 공부 하 고 인간의 직감 조각 또한 공부에 대 한 사용 되었습니다는 창 자 호르몬 분 비17,25의 분자 세부 사항. 반면 되 전 혜택 편광2 이러한 모델의 모든 정적 외피를 포함 한다. 그러나 인간의 직감 조각에 대 한 연구는, 설치류, 보다는 오히려 인간, 조직 7TM 수용 체의 조직 식에서 종 차이부터 중요 한을 사용 하 여 혜택 및 분자 운송업 자 다른 분자 감지 경로 사이 발생할 수 있습니다. 종입니다. 사실,이 분야에서 대부분 데이터 돼지, 쥐 또는 쥐에 대 한 연구에 의해 생성 되었습니다 하 고 이러한 연구 결과 인 간에 게 전송 될 수 있습니다 여부 애매 남아. 그러나 그것은,, 기초가 GLP-1 분 비를 자극 하는 포도 당 분자 감지 메커니즘 마우스, 쥐, 사람, 사이 비슷한 것 처럼 안심 하 고 transcriptomic 및 마우스 및 인간의 L-셀 프로 파일링 peptidomic 공개 강한 글로벌 2 개의 종의7,18,,2627사이의 유사성.
그러나 끼얹는다 고립 된 쥐 작은 창 자,, 또한 고려해 야 하는 몇 가지 제한이 있다. 가장 중요 한 것은, 주어진된 분 비 응답 결과에서 대상된 호르몬 생성 세포의 시험 물질에 의해 직접 활성화 또는 오히려은 인해 발생 하는지 확인 간접 메커니즘 수 아니다. 예를 들어, KCl는 즉시 perfused 내장7, GLP-1의 분 비를 증가 하지만 알 수 없는 남아 여부이 직접 도발은 L 셀의 결과 또는 L-세포 주변 신경의 도발은 또는 효과의 결과 paracrine 자극/저 해제를 동시에 발표 했다. Perfused 내장을 사용 하 여 기본 분 비 하는 분자 메커니즘을 명료 하 게 하는 연구에서 발생, 따라서 항상 넣을 수 컨텍스트 설정 하는 기능을 증가 하기 위하여 다른 더 구체적인 모델에서 얻은 데이터와 인과 관계입니다. 예를 들어, 포도 당 자극 GLP-1 분 비 및 기본 마우스 L 세포 GLP-1 은닉 셀 라인 GLUTag,2829 에서 포도 당 운송업 자 (SGLT1 및 GLUT2)의 활동에 따라 달라 집니다. 분 비20, GLP-1 분 비 포도 당 자극은 크게 L 셀에 포도의 직접 행동에 의해 중재 가능성이 다는 것을 의미를 약하게 또한 끼얹는다 쥐 소장에이 전송기를 차단. 격리 perfused 내장의 또 다른 중요 한 한계 지질 중 일부 그들의 hydrophobicity 인해 공부 하기 어려운 것입니다. 지질 소화 (지방산, diacyl glycerols, lysophosphatidylglycerols, 등)의 최종 제품을 조사 하 고 준비 다시 esterify 수 있습니다 있지만 지질 intra-cellularly 그리고 아마도 그들을 팩을로 chylomicrons, 세포와 그들의 후속 글귀는 villi의 lacteals에 의해 chylomicrons 전송 중단 됩니다 때문에 격리 된 림프 흐름을 보안 수 없습니다. 대부분, 따라서 지질 흡수 중단 됩니다 일단 흡수 제품 셀에 축적 하는 시작. 생체 외에서 셀 시스템은 지질 연구에도 덜 적합 분극의 그들의 부족 때문에. 물론,이 제한만 흡수 되 고는 lacteals 통해 전송 하는 지질에 대 한 관련, 그 창 자 혈관을 통해 흡수 하는 반면 정상적으로 처리 될 가능성이 있다.
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Protocol
모든 연구는 덴마크 동물 실험 검사자 (2013-15-2934-00833)와 덴마크 입법 동물 실험 (1987 년)와 국가 통치의 지침에 따라 지역 윤리 위원회 허가 실시 했다 건강 (출판물 번호 85-23)의 학회.
1. 실험 동물
- 남성 Wistar 쥐 (250 g)와 가져오고, ad libitum 액세스 표준 차 우와 물를 가진 감 금 소 당 2 집 12시 12분에 유지 h 빛 어두운 주기에. 우리의 동물 시설 처리 비 물 및 Alrtromin 설치류 차 (1319 크고, Brogaarden, Lynge, 덴마크)를 사용 합니다.
참고: 수 동물 순응의 최소한 1 주일.
2. 수술 전 준비
- 관류 버퍼 확인: Krebs 벨소리 중 탄산염 버퍼 보충 0.1 %BSA (분수 V), 5% dextran T-70, 3.5 mmol/L 포도 당, 및 5 mmol/L pyruvate, 롤, 그리고 조미료 (필요한 경우); 산도 7.4입니다.
- 필터의 적절 한 크기를 통해 필터링 하 여 적절 한 양의 관류 버퍼를 준비 하 고 5 M HCl의 dropwise 추가 의해 ~7.5에 pH를 조정.
- 추가 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (필요한 경우) 버퍼에 직접 10 µ M의 최종 농도에 연구의 날에.
참고: IBMX [캠프]나 증가 및 그로 인하여 감도 및 응답성의 분 비 자극 호르몬을 분 비 하는 점에서 용기를 복원 포스 억제제 이다. - 테스트 솔루션을 준비 합니다. 필터링 된 및 pH 조정 관류 버퍼에 원하는 최종 농도 보다 높은 농도 x 20에 혈관 자극을 준비 합니다. 최종 농도 isotonic 식 염 수에 luminal 테스트 자극을 준비 합니다.
- 100% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 쉽게 녹는 화합물을 녹이 고 희석 관류 버퍼 또는 isotonic 식 염 수에 추가. 혈관 자극에 대 한 1%에서 최종 DMSO 농도 유지 또는 아래, 위의 농도로이 소장 손상 난다 창 자 호르몬 분 비로 이어질 수 있습니다. PH를 측정 하 고 필요 하다 면 ~7.5를 조정 합니다.
3. 운영 및 관류
참고: 관류 설치의 그림은 그림 1에 제공 됩니다.
- 수술 마 취와 진통 Hypnorm/Midazolam에 의해 30-40 분 동안 지속할 수 있는 마 취 처방 사용 하 여 쥐를 anesthetize (ml 당 0.3 ml/100 g 체중: Hypnorm: 0.08 밀리 그램 펜타닐, 2.5 mg fluanisone, 0.45 mg 메 틸 Parahydroxybenzoate, 0.05 mg 틸 Parahydroxybenzoate, Midazolam: 1.25 mg, 매트릭스 제약, 헬 레 루프, 덴마크)
- 반사 (발가락 핀치) 부족 확인 하 고 온수 운영 테이블에 쥐를 놓고 내장을 노출에 피부 절 개를 수행.
-
소장 가능한 만큼 옆으로 이동 하 여 콜론의 터미널 부분을 노출 합니다. 콜론, 작은 창 자 쪽으로 이동의 터미널 부분에서 시작 하 고 점차적으로 그것은 콜론 및 소비 세를 맥 관 구조를 공급의 넥타이.
- 단지 소장의 특정 부분을 관류 (윗부분)에 필요한 경우, 맥 관 구조를 공급을 묶는 후 비 필요한 세그먼트를 삭제할. 조직 피해를 최소화 하기 위해 보습 isotonic 식 염 수와 함께 소장 하 고 면봉을 사용 하 여 제거 하는 결합 조직.
- 플라스틱 튜브를 삽입 (길이: ~ 15 cm, 외경: ~0.4 cm) 봉합 제대로 사용 하 여 (근 부분)에서 창 자 루멘에 넥타이. Chyme 루멘을 isotonic 식 염 수 (실내 온도)와 신중 하 게 플러시.
- Perfuse 0.25 mL/min의 흐름에서 isotonic 식 염 수와 루멘, 주사기 펌프에 연결 된 10 mL 주사기를 사용.
- 그래서 위 mesenteric 동맥은 소장을 옆으로 이동 하 고 노출 동맥을 연결 하 고 지방 조직을 제거.
- 좋은 포인트 집게;를 사용 하 여 mesenteric 동맥에서 장소 2 봉합 하나는 봉합의 제어는 동맥을 자르고 다른 동맥에 배치 하는 카 테 터 고정입니다 일단 출혈 동맥을 해제입니다. 하지 동맥을 꿰뚫기 위하여 주의 가져가 라.
- 금속 테 관류 폐수의 수집에 대 한 정 맥에 배치 하는 것을 보호 하기 위한 포털 정 맥 아래 두 봉합을 배치 합니다.
- Mesenteric 동맥에 구멍을 절단 하기 전에에 삽입 된 동맥으로 카 테 테 르 air embolus 형성을 방지 관류 버퍼 가득 확인 합니다.
- 수술가 위를 사용 하 여 mesenteric 동맥에 작은 구멍을 삭감 하 고 플라스틱 카 테 터를 삽입 후 즉시.
- 카 테 터를 확보 한 후에 바로 롤러 펌프를 시작 하 여 소화 관의 재 관류를 시작 (유 속 = 7.5 mL/min).
- 몇 초 이내에 혈관 차례 창백한 포털 정 맥 회전 창백한 확인 합니다.
- 적절 한 관류 포털 정 맥에 구멍을 뚫고 설정 된 후에 즉시 금속 카 테 터를 삽입 하 고 봉합을 확보.
참고: 카 테 터는 곳 하지만 정 맥 가장 인접 봉합 도움이 됩니다 조심 스럽게 당겨서 해제 어려울 수 있습니다. - 일단은 카 자리에 관류 출력은 만족, 횡 경 막의 구멍 뚫 기, 되는 카 테 터를 찾아다니면서 하지 않도록 주의 하 여 쥐를 죽 일.
- 1 분 동안 관류 출력을 수집 하 고 볼륨을 측정. 클릭 실행 실험 압력 레코딩 프로그램에 의해 관류 압력 수집/녹음을 시작 합니다.
- 실험 기간 동안 밖으로 건조에서 그것을 방지 하기 위해 moistened 조직으로 용기를 커버.
- 내장의 선단부 luminal 방류 수 종료, 그렇지 않으면 창 자 팽창 것입니다, 부 종 개발, 관류 압력 증가, 고 관류 출력 떨어질 것 이다 차단 되지 않습니다 확인 하십시오.
- 실험을 시작 하기 전에 약 30 분 동안 준비를 둡니다.
참고: 창 자 호르몬의 분 비 출력 되므로 하지 관류의 첫번째 15 분에 대 한 집념이 평형 단계 꾸준한 기준선을 얻을 하는 데 필요한.
4입니다. 실험
- 관류의 약 30 분, 후 분수 수집기를 사용 하 여 첫 번째 기준선 샘플을 수집 하 여 실험을 시작 합니다. 원하는 시간 간격에서 샘플을 수집 (예를 들어, 모든 분, 6.5-7.5 mL 보통 수집) 얼음 몇 분 이내에 그들을 배치.
-
거품 트랩을 정기적으로 검사 하 고, 비우지 관류 버퍼와 그것을 리필.
- 바로 전에 그것은 기관 및 기관 metabolically 활성 상태 인지 확인 하는 문맥에서 (후에 그것은 장기를 통해 끼얹는다 되었습니다) 삽입 카 테 터에서 3 방향 수 탉-밸브를 통해 버퍼를 수집 합니다. 시작 하 고 실험을 통해 생존 능력을 평가 하는 실험의 끝에 샘플을 수집 합니다.
- 측정 샘플 신속 하 게 자동화 된 혈액 가스 분석기와 함께 가장 플라스틱 포함/주사기는 완전히 밀폐 기한 대기 공기와 교환 하.
- 기준 컬렉션의 10-15 분, 후 첫 번째 테스트 물질 자극. 3-방법으로 자 지를 통해 주사기 펌프 내부 동맥 stimulations를 관리 (흐름 = 0.350 mL/min).
- 초기 bolus 주사 (2.5 mL/min 첫 번째 5 분 동안), isotonic 식 염 수를 대체 하기 위하여 루멘, 테스트 솔루션 낮은 유량 (0.5 mL/min)의 뒤에 이미 있는 luminal stimulations를 수행 합니다.
- 일단 luminal 자극 기간 끝나면 시험 물질의 루멘 비운 신속 하 게 보장 하기 위해, 위와 같은 흐름 율을 적용 하 여 isotonic 식 염 수와 창 자 루멘을 플러시.
- 다음 시험 물질 투여 전에 15-30 분에 대 한 초기 샘플을 수집 합니다. 프로토콜에 따라 2-3 시험 자극 보통 실험 당 포함할 수 있습니다. 실험 프로토콜에 주어진된 간접적인의 관리와 동시에 주어진된 분자 사이트의 활성화/저해 있으면 항상 미리 자극 활성/억제 물에 간접적인 관리 하기 전에 10-15 분 간접적인 주입의 바로 처음부터 분자 사이트 저해입니다 확인 하십시오.
- 프로토콜의 끝에, 자극 기간 후 테스트 하는 준비의 응답에 대 한 고 10-15 분 기준 샘플을 수집 (5-10 분) 적합 한 긍정적인 제어를 관리 합니다.
참고: 여러 테스트 물질 예: 긍정적인 컨트롤로 사용할 수 있습니다, 자극 증가 [캠프]나 (예: foskolin 또는 IBMX), [캘리포니아2 +]나 예: bombesin (neuromedin C), depolarizing 에이전트 (예:, 30-50 m m KCl) 이상 macronutrients 같은 순수 관련 자극: 포도 당, 유도체, 아미노산, 등등. 그러나, 긍정적인 제어의 실험 결과에 따라 달라 집니다. 포도 당은 이다 예를 들어 가난한 cholecystokinin (CCK) 간접적인 bombesin은 포도 당 의존 insulinotropic 펩 티 드 (GIP) 분 비30에 대 한 강력한 간접적인 반면. - 실험 종료 후 perfused 용기를 삭제할 하 고 그것의 무게의 길이 측정 한다. 그것 paraformaldehyde에 넣고 저장 (4 ° C) 잠재적인 나중 조직화 학적인 분석을 위한 조직 무결성/손상, 예를 들어 H & E 염색에 의해.
5. 생 화 확 적인 측정
- 사내 또는 상용 방사 (RIA)의 사용에 의해 분 비 정 맥 유출에 펩 티 드의 농도 정량 또는 ELISA 분석 실험. 장 흡수를 조사 하는 연구에 대 한 관심, 예:, 포도 당 이나 아미노산, 정 맥 유출에의 분자 계량.
참고: Perfusate는 일반적으로 (예: glucoseoxidase 메서드에 의해 포도의 정량화) 효소 반응에 의존 하는 분석 실험을 포함 한 대부분의 분석에 대 한 좋은 기초 버퍼입니다.
6. 데이터 분석
- 다른 방법으로, 예를 들어 실제 분 비 출력을 보여주는 시간 농도 그래프로 데이터를 제시 (흐름 농도 x) 및 총 분 비 기준 및 응답 기간 (보통 10-15 시간 점) 동안 출력을 묘사한 열 플롯.
- 농도 단위는 해당 호르몬의 실제 측정 된 농도 플롯 합니다. (pmol/L),
참고: Vivo에서 학문, 달리이 모델 획득된 값이 (관류 유출의 일정 한 수집) 때문에 실제 분 비 출력 때문에 대신 출력 (fmol/min)으로 데이터를 표현 하는 것이 바람직합니다. - 통계적으로 분석 하는 그룹의 수에 따라 사용 양측 쌍 t-검정 (2 개 그룹) 또는 반복된 측정 (두 개 이상의 그룹)에 대 한 단방향 ANOVA 뒤 여러 비교에 대 한 적절 한 게시물-특별 시험.
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Representative Results
주어진된 자극 하면 관심의 창 자 호르몬의 분 비 여부를 결정 하는 기능 꾸준한 기준선 분 비에 의존 합니다. 또한, 자극에 대 한 응답이 관찰 되는 경우 긍정적인 통제에 대 일 분 비 응답 분명 테스트 자극에 응답의 부족 응답의 일반적인 부족을 반영 하지 않는다는 것을 제외 하 여야 합니다. 그림 2A 와 2B 좋은 품질 데이터;의 예를 보여 줍니다. 격리 끼얹는다 쥐 소장에서 GLP-1 분 1 분 간격 (수단 ± SEM) 표시 됩니다. 기저 상태에서 분 비는 꾸준한; 테스트 자극 (인슐린), 그리고 긍정에 대 일 분 비 응답의 관리 전후에 둘 다 컨트롤 (bombesin (BBS))은 분명 하다. 또한, 인슐린 동안 평균된 분 비 뿐만 아니라 GLP-1 (인슐린 또는 게시판 관리 앞 각각 기준 기간) 동안 기저 조건에서 분 비를 평균 하 고 게시판 자극 막대 그래프 (수단 ± SEM)으로 표시 됩니다. 분 비는 반복된 측정을 위한 일방통행 ANOVA에 의해 통계적 의미에 대 한 테스트 되었습니다. 이러한 결합 된 데이터를 바탕으로, 그것은 결론 수 있습니다 수 간 동맥 인슐린 GLP-1 절연된 끼얹는다 쥐 소장에서 분 비를 자극 하지 않습니다.
그림 2C 및 2D 격리 끼얹는다 쥐 소장에서 분 비 GLP-1의 예를 보여 줍니다. 그림 2A 및 2B와 달리 이러한 데이터는 가난한 품질; 비 기저 조건에서 안정 이며 물질 행정 테스트 관련이 없는 것으로 나타나는 방식으로 위쪽으로 통해 나타난다 (내부 luminal 및 간 동맥과 당, 각각)와 긍정적인 통제, 게시판, 귀착되 지 않는다 통계 중요 한 GLP-1 분 비 증가. 그것은 불가능, 따라서,과 당 stimulations GLP-1 분을 일으키 다, 예를 들어, 인지 혈관과 자극과 당 중재 응답의 끝에서 증가 GLP-1 분 비 하지 결론을 합니다.
그림 1: 관류 설치의 예. 플 렉 시 글라스 스탠드, 온수 운영 테이블, 빌드 거품 트랩, 압력 게이지 및 관류 압력 조정 스핀 들 펌프와 열 교환기 시스템에 의하여 이루어져 있다. 서 모스 탯 circulator는 기름된 (95% O2, 5% CO2)가 열에 연결 된 관류 시스템 관류 버퍼 37 ° c 또한, 관류 압력 지속적으로 기록 하 고 압력 기록 트랜스듀서에 의해 불리고 및 시각 이며 적당 한 소프트웨어와 함께 PC에 저장 된. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 데이터 격리 끼얹는다 쥐 소장에서. (A, B) 잘 수행된 실험의 예를 들어 신뢰할 수 있는 데이터, (C, D) 최적의 데이터 관류 압력 증가, 및 관류 출력 연구의 시간 동안 극적으로 감소의 예. (A) 기저 상태에 및 간 동맥 인슐린 관리 (200과 1000 오후, 표시 된 대로)에 대 한 응답 GLP-1 (총) 출력 (fmol/min) 표시 됩니다. Bombesin (게시판), 유명한, 강력한 GLP-1 간접적인 intra-arterially 응답 (게재 순위 컨트롤)에 대 한 제어 하는 실험의 끝에 주입 했다. 데이터는 ± SEM, n 을 의미 하는 대로 표시 됩니다 = 4. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
격리 된 끼얹는다 쥐 소장 역학과 분자 메커니즘을 자세히 공부 하는 창 자 호르몬 분 비를 기본 허용 하는 강력한 연구 공구 이다. 이 모델을 사용 하 여 데이터의 성공적인 생산을 위한 가장 중요 한 단계는 수술입니다. 용기의 처리는 필연적으로 내장에 손상을 발생 하 고 그러므로 지켜져야 한다 절대 최소. 심지어 더 중요 한 것은, 작업의 속도 mesenteric 동맥에 카 테 테 르 배치에 대 한 시간에 관해서는 특히 키. 우리의 경험은 카 테 터를 성공적으로 두어야 한다는 관류 혈관에 구멍을 삭감 하는 데 후 분 이내에 시작 되어야 합니다. 카 테 터의 배치 작업의 가장 어려운 부분 이다 mesenteric 동맥의 작은 크기와 포털 정 맥의 얇은 벽에 의해 복잡 하 고이 단계 약간 연습을 요구 한다. 그러나 정 맥 카 테 터의 빠른 삽입은,, 하지 mesenteric 동맥에 대 한 경우 처럼 긴급, 용기로는 지금 끼얹는다 고 유지. 다음 중요 한 단계는 실험을 수행 하는. 작업이 성공적으로 수행 되었다, perfused 용기 일반적으로 번성 하 고 최대 3 h 및 관류 압력에 대 한 응답 고 출력은 일반적으로 일정 하 게 유지 전체 실험 동안. 그러면 즉시 감소 하거나 제거 하는 관류 출력 공기 색전술 이후 시스템에 지 고 거품을 피하기 위해이 단계에서 성공적인 실험에 대 한 가장 중요 한 요소가입니다. 관류 버퍼 BSA를 포함 하 고 perfused 창에 충분 한 산소 공급을 보장 하기 위해 기름, 거품 형성을 완전히 방지 하기 어렵습니다. 그러나 거품,, 해야 시스템 거품 트랩에 갇혀 하지만이 점차적으로 (더 많은 거품, 빨리 emptying) 시간이 지남에 비우고 이며 따라서 거품 트랩에 가까운 시계를 유지 하 고 관류 버퍼 필요할 때 그것을 리필 하는 것이 중요. 그것은 또한 perfusate pH 7.5 아래에 유지 하는 것이 중요-pH 증가, 탄산 칼슘 침전 형성 수 있습니다, 모 세관 흐름을 방해 하 고 관류 압력에 심각한 상승 원인이.
Perfused 소장 오히려 강력한 준비, 하지만 그것은 담 즙 산, 에탄올, DMSO 등 세제의 높은 농도 용납 하지 않습니다. 따라서, 세제를 사용 하 여 가급적 피해 야 한다 하지만 가끔 솔루션으로 가난 하 게 녹는 화합물을 받이 필요가. Perfused 용기는 일반적으로 관리 세제 허용 내부 luminally intra-vascularly 보다 더 나은. 예를 들어, 1 mM taurodeoxycholic 산 (보조, 활용 된 담 즙 산)의 관리는 intraluminally 주입 하지만 즉시 귀착되 었 다 intra-arterially2전달 될 때 출력 차단된 관류 하는 때에 잘 용납 되었다. 혈관 stimulations 계속 1% 최종 DMSO 농도 (DMSO 자극, 예를 들어, GLP-1 분 비)는 불특정 분 비 응답을 방지 하 고 조직의 손상을 증가 관류 압력의 결과로 및 관류 감소를 초래 하지 않도록 출력입니다. 관류 압력이 증가 20% 이상 관류 출력 연구의 과정을 통해 20% 이상 감소 하거나 부 종 개발 실험을 무시 한다. (Mesenteric 동맥에 카 테 터의 빠른 삽입을 포함 하 여) 이러한 거시적인 성공 기준 준수 ~14/15 실험에서 좋은 품질에 있는 보통 결과.
실험을 완료 한 후 다음 중요 한 절차는 적절 한 방법과 관심의 hormone(s)의 정량화에 대 한 분석 결과 선택 하는. 펩 티 드 호르몬의 높은 통해 넣어 시 금 실시 될 수 있습니다 immunoassays를 사용 하 여: 방사 면역 검정 법 이나 ELISA. 어쨌든, 그것은 매우 권장 모든 상용 분석 실험 감도, 특이성 및 정확도 관하여 만족 스럽게 수행 각각 분석 샘플 정량화에 대 한 그들을 사용 하기 전에 유효성을 검사 하 (예에 대하여 GLP-131). 특이성에 관하여 분은, 항상, 관심사로. 난다 간섭 및 매트릭스 효과 일반적으로 덜 플라즈마에 비해 인공 perfusates로 발음 했다. 감도에 관해서는 그것은 종종 보다 vivo에서 펩 티 드로 연구에서 농도 종종 높은 관류 유출 전신 순환으로 희석 하지 때문에 하 고 있기 때문에 perfusions에서 신뢰할 수 있는 데이터를 쉽게 제거 프로세스 (간/폐/신장)에 의해 방지 됩니다. 일반적으로, 정 맥 배출물에 기준 농도 대부분 분석 실험의 낮은 작업 범위 내에서 거짓말 (GLP-1 (총), (총) neurotensin 및 PYY (총)의 경우: 8-15 pmol/L) 동안 자극된 응답으로 200-300 pmol/L3높은 도달할 수 있다.
비교, 건강 한 인간에서 플라즈마에 동일한 호르몬의 초기 계획 값 쥐 또는 생쥐는 일반적으로 5-10 pmol/l 응답 값은 15-30 pmol/L3,32반면.
미리 정의 된 성공 기준 준수는, 생성 된 관류 데이터는 일반적으로 좋은 품질의 고 통계 분석은 간단. 격리 끼얹는다 쥐 또는 마우스 췌 장 인슐린, 글 루카 곤, somatostatin의 분 비에 비해, 창 자 호르몬의 기저 분 비 안정 하 고, 오히려 유사한 측정된 농도 관한 실험 사이 이며 분 비 되지 명확 하 게 타악기. 총칭, 변화 데이터 세트에 따라서 최소 이며 3 관류 실험으로 낮은 샘플 크기는 통계적 의미에 도달 하기에 충분 한 자주. 그러나, 표준화 및 타입-2-오류를 방지 뿐 아니라 덜 잘 발음된 응답 내려다의 가능성을 줄이기 위해, 6 ~ 8의 샘플 크기는 권장 됩니다.
요약 하자면, 격리 끼얹는다 쥐 소장 창 자 호르몬 분 비에 주어진된 물질의 직접 효과 조사 하는 데 사용할 수 있습니다 중요 한, 순수 관련, 실험 모델입니다. 어디 용기는 간접적인 분 비를 자극 하 고, 여부 그것은 luminally의 활성화를 통해 분 비 자극 또는 basolaterally 중요 한 근본적인 질문, 위치 센서, 그리고 어떤 분자 센서 활성화 하 고 따라서에 대 한 책임 분 비가 모델 자세히 해결 될 수 있습니다. 그러나 그것은,, 한다 그 기증자 동물에서 직감의 분리 시 있을 수 있습니다, 몇 가지 연구 질문에 대 한 관련성의 인식. 예를 들어, 용기 (용기-뇌 축), 뇌 간 (창 자 간 축)와 밀접 하 게 상호 작용 하 고 따라서이 잡담에 의존 하는 메커니즘이 모델 조사 수 수 없습니다. 작업의 품질 데이터 품질에 대 한 중요 한 요소 이며 가장 중요 한 요소는 성공적인 작업에 대 한 최소 직감의 처리 유지 하 고 신속 하 게 mesenteric 동맥을 잘라 일단 소화 관의 재 관류를 시작 하는. 그것은 우리의 경험을 좋은 품질의 데이터를 생성 하기 전에 연습 2-4 개월 걸립니다. 그러나, 기술을 배웠다 면이 방법의 가능성은 거의 무한 하 고 유일한 시험 물질 및 잠재적인 효과 시험 물질 perfused 조직에 있을 수 있습니다 손상의 가용성에 의해 제한 합니다.
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Disclosures
이 작품의 저자는이 문서와 관련 된 잠재적인 충돌의 관심을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품에 의해 지원 되었다 무제한 그랜트 교수 옌스 Juul 홀스트 하 Novo Nordisk 센터에서 기본적인 대사 연구 (Novo Nordisk 기초, 덴마크), Novo Nordisk 설치류 관류 연구 (no를 부여 하 고 재단법인에서 별도 부여에 대 한 NNF15OC0016574), 유럽 연구 위원회 (그랜트 no.695069) 및 theEuropean 조합에서 교수 홀스트에 부여의 한 postdoc로 7 프레임 워크 및 프로그램을 위한 연구, TechnologicalDevelopment, 논증 활동 (보조금 번호 266408) Lundbeck 재단 (R264-2017-3492)에서 룬 E. Kuhre를 부여 합니다. 우리 주의 교정에 대 한 제 나 E. 헌트와 캐롤 린 F. 디 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for perfusion buffer | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 1.12018.0500 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O) | Merck | 102382 | |
| Dextran 70 | Pharmacosmos | 40014 | |
| Fumaric acid disodium salt (C44H2Na2O4) | Sigma Aldrich | F9642 | |
| Glucose (C6H12O6) | Merck | 108342 | |
| Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4) | Merck | 105886 | |
| Potasium chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck | 104873 | |
| Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4) | Merck | 106619 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | ||
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O) | Merck | 106445 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion equitment | |||
| Universial perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | |
| BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834 | Harvard Bioscience, Inc. | ||
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Cannula with basked, OD = 2.0 mm, ID = 1.0 mm | Harvard Bioscience, Inc. | 733313 |
References
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