Summary
Здесь мы представляем мощный и физиологические модель для изучения молекулярных механизмов лежащие в основе гормона кишки и кишечной абсорбции — изолированной перфузии крыса тонкой кишки.
Abstract
Кишечник является крупнейшим эндокринных органов тела, производит более 15 различных пептидные гормоны, которые регулируют аппетит и приема пищи, пищеварения, всасывания питательных веществ и распределения и глюкозы натощак после экскурсии. Понимание молекулярных механизмов, которые регулируют секрецию гормона кишки имеет основополагающее значение для понимания и перевода гормон физиологии кишечника. Традиционно лежащие в основе кишки гормона либо изучаются in vivo (в экспериментальных животных или человека) или механизмы с использованием слизистой оболочки кишки секреции гормона начальных клеточные культуры или мобильных линий. Здесь мы представляем кишечник изолированной перфузии крыса как альтернативный метод для обучения гут гормона. Достоинства данной модели являются, что он опирается на нетронутыми кишечник, означает, что он резюмирует наиболее физиологически важных параметров, ответственных за секрецию в в-vivo исследований, включая слизистой поляризации, паракринными отношения и маршруты Перфузионный/стимул экспозиции. Кроме того и в отличие от в-vivo исследований изолированной перфузии крыса тонкой кишки позволяет почти полный контроль экспериментальных и прямой оценки секреции. В отличие от исследования in vitro он позволяет изучить масштабы и динамику секреции и на важные вопросы, например какие раздражители вызывают секрецию гормонов различных кишечник, с какой стороны кишечника (люминал или сосудистая) является секреции стимулирует и для анализа в деталях молекулярных сенсоров, лежащие в основе секреторная реакция. Кроме того подготовка является мощная модель для изучения кишечного поглощения и деталей относительно динамики кишечного поглощения, включая ответственность перевозчиков.
Introduction
Кишечник является крупнейшим эндокринных органов тела, производит более 15 различных пептидные гормоны, которые регулируют всасывание питательных веществ и утилизации питательных веществ, кишечные роста и модулировать аппетит1. Таким образом, кишечнике гормоны участвуют во многих основных физиологических процессах, и понимание этих моделей секреции и молекулярных детали, контролирующие секрецию гормонов, соответствующих таким образом важно для наших основных физиологических понимание и для решения трансляционная аспектов действия гормона кишки; но как одно исследование молекулярных механизмов зондирования лежащие в основе кишки гормона? В общем гормона можно изучать в нетронутыми организмов (людей или экспериментальных животных), от изолированных кишечнике препаратов или кишки секреции гормона начальных клеточных культур или увековечен клетки культуры2,3, 4 , 5 , 6. наши предпочтительной моделью является изолированной перфузии крыса тонкой кишки, который является физиологически соответствующую модель, которая позволяет секреции гормонов кишки необходимо изучить в деталях с оптимальным временем резолюции (секреции, ставки могут быть определены с любое время Базовый вплоть до второй), и результаты, вероятно, передаваемой в естественных условиях положение7. Здесь мы предоставляем подробный протокол о том, как выполнить эту процедуру, но сначала мы будем обсуждать другие методы для обучения гут гормона, включая преимущества и ограничения этих моделей, по сравнению с изолированной перфузии крыса тонкой кишки.
Если один хочет, чтобы установить ли конкретного соединения регулирует выделение гормонов, некоторых кишки, исследования в организме человека являются конечной целью. Таким образом если соединение показывает большое влияние на выделение одного или нескольких гормонов кишки в грызунов (в естественных условиях или орошений) или от гормон секретирующих клеток (линии клетки или клетки первичной), этот эффект относится только к медицине и физиологии человека если оно может быть подтверждено в организме человека. Однако существуют четкие ограничения для типов исследований, которые могут быть выполнены в организме человека, и в естественных условиях исследования на подопытных животных, таким образом, часто второй лучший вариант для таких исследований. Мыши и крысы являются наиболее часто используемые подопытных животных, предположительно, по причине их удобный размер, низкая стоимость и возможность генетически изменить гены, подозреваемых в участии в конкретные исследования вопросов (например, выбить из определенных автофургона или рецептор). В целом в естественных условиях модели выгоду от того физиологически нетронутыми, но также имеют несколько ограничений. Самое главное, небольшой размер грызунов, особенно мышей, является ограничивающим фактором, поскольку большинство анализов кишки гормон количественной оценки требуют по меньшей мере 20 мкл плазмы (и зачастую намного больше), что означает, что по крайней мере 100 мкл крови должен быть снят, чтобы сделать дубликат количественная оценка. Таким образом это возможно только для получения очень мало проб соответствующих базовых образцов и один или два после стимуляции (общего объема крови в мыши 20 g-~1.4 мл). Следовательно потенциальные секреторной ответы (например, быстро или поздно происходит ответов) поэтому могут быть пропущены.
В модели перфузии, преодолеть этот вопрос, как большой образец получаются томов (скорость потока: 7,5 мл/мин) и коллекции интервалы могут быть скорректированы, как необходимо для обеспечения не пропустили быстрый и недолго ответы (мы собирать образцы каждые мин)7 . Еще одна проблема с в vivo исследования на грызунах что большинство кишки гормоны являются даже более быстро ликвидированы или метаболизируется чем люди8,9,10, которая может затруднить последующее биохимический анализ. К примеру, мы показали, что GLP-1 метаболизируется в мышей еще более быстрыми темпами, чем в организме человека (где T1/2 -1-2 мин11) и, что более важно, что предполагает расщепления GLP-1 в мышей, в дополнение к N-терминальный расщепления по dipeptidyl пептидазой-4 (DPP4) (который является основных GLP-1 унижающее достоинство ферментов в организме человека), далее расщепления фермента нейтральной эндопептидазы 24.1112. Следовательно текущих коммерческих анализов для количественной оценки GLP-1, которые основаны либо на нетронутыми изоформы GLP-1 (7-36amide) или DPP-4 расщепляется изоформы (9-39amide), значительно недооценивать GLP-1 секреции у мышей и привести в заблуждение результаты 12. в тонком кишечнике изолированной перфузии крыса, большая часть метаболизм гормонов выделяется ликвидированы или заметно уменьшается, так как избежать плазмы опосредованной деградации, и функции печени/почек/легкого извлечения/деградации предотвращается (потому что perfusate собирается как листья кишечнике).
Конечно важно понимание могут быть получены путем использования генетически модифицированных животных, например, натрия глюкозы транспортер-1 нокаут мышей13, но подробной оценки молекулярных сенсоров, участвующих в секреции часто требует рассмотрение нескольких молекулярной сайтов, начиная от молекулярных транспортеры для ионных каналов и от разных сочетании с G-белком рецепторов внутриклеточные белки. Например мы ориентированы деятельность девяти различных молекулярных сайтов когда распутывая молекулярных сенсоров, ответственных за глюкозы стимулирует секрецию GLP-17. Подобные расследования не будет возможно в естественных условиях как некоторые из соединений, используемых неспецифическим или вредных/смертоносные последствия. Например при использовании перфузии кишечник, можно было оценить роль метаболизма глюкозы внутри сотовой за секрецию GLP-1 и neurotensin, блокируя образование АТФ с 2-4-динитрофенола7,14 , а также роли напряжение закрытый кальциевых каналов для желчных кислот стимулировали GLP-1, NT и PYY секреции3. Действительно Тетродотоксин блокатор канала высокотоксичных натрия может успешно применяться в перфузионные исследования. Наконец в перфузии модели она может непосредственно оценивать где в кишечнике определенные соединения стимулирует секрецию гормона, как следователь может просто выбрать и подготовить желаемый регион для perfuse, и в то же время она может быть исследована ли стимул вызывает секрецию активации молекулярные датчики со стороны Люминал или сосудов кишечника3,,1516.
Ею основных гормона кишки могут быть изучены также секреторную механизмов использования кусков ткани кишечника (включая тканей человека), гормон основной кишечных культур (обычно от мышей), увековечен секретирующих клеток линии (мышь или человеческого происхождения), в кишечнике ткани установлен в Ussing камерах или organoids (оба чаще всего от мышей)2,3,4,5,6,17,18. По сравнению с кишечных орошений, исследования на кишечнике человека штук, начальных клеточных культур и клеточных линий технически проще выполнять и быстрее и дешевле способ получения данных, но конечно исследование кишечника штук требуется доступ к свежей кишечнике человека образцы. Однако в этих моделях поляризации нормальной клетки кишечника теряется по сути, означает, что эти модели не могут использоваться для оценки нормального активации молекулярных сенсоров, и процессы абсорбциы также не могут быть изучены. Кроме того, такие исследования обычно используют статические инкубаций (для до нескольких h) которая очень не физиологические и имеет ничего общего с нормальной секреторной динамикой клетки, потому что выделяется продукт не удаляется, и таким образом может повлиять обратной связи секреция гормонов. Напротив в перфузии ЖКТ, секретируемые и поглощается молекулами эффективно удаляются слизистой микроциркуляции как они находятся в естественных условиях, обеспечение чресслизистого градиентов так поглощения и секреции может произойти с нормальной скоростью. Кроме того может dedifferentiated клеточных культур от их родной enteroendocrine ячеек происхождения, означает, что они больше не представитель родной клеток с точки зрения содержания пептида и проявление молекулярных сенсоров, хотя они могут по-прежнему выделяют гормон в вопросе. Это, например, в случае GLP-1 секреции клеток линии19.
Это, таким образом, наше мнение, что культуры главной ячейки или ячейки линии исследования наиболее подходят для скрининга целей и для выполнения типы экспериментов, которые не могут быть выполненной в естественных условиях или в изолированной перфузии кишечнике. Например, истинная сила первичного клеточных культур и культур клеток линии находится внутри клеточной среднее посыльных (например Ca2 +, лагерь, NAD(P)H) можно контролировать в режиме реального времени, и электрической сигнализации гормона, секретирующих клеток может быть расследование20,21,22. Кроме того сногсшибательно малых интерферирующих РНК может быть сделано, что особенно полезно, если специфичные ингибиторы не доступны20,21,22,,2324. Гут ткани от мышей, монтируется в Ussing камерах недавно был использован для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе стимулировали GLP-1 секрецию желчных кислот, при кишечных organoids (от мышей) и кишечнике человека штук также были использованы для изучения молекулярные детали кишки гормональной секреции17,25. В то время как бывший выгоды от того, поляризованных2 все эти модели включают статические инкубаций. Исследования на куски в кишечнике человека, однако, извлечь выгоду из использования человеческих, а не грызун, ткани, которая имеет важное значение, поскольку видов разница в ткани экспрессии рецепторов 7TM и молекулярных перевозчиков может привести к различных молекулярных зондирования пути между видов. В самом деле большая часть данных в этой области был сформирован путем исследования на свиней, мышей или крыс, и она остается неуловимым ли эти выводы могут быть переданы для людей. Это, однако, обнадеживает, что молекулярные зондирования механизмы, которые лежат в основе глюкозы стимулирует секрецию GLP-1, как представляется, подобные между мыши, крысы, человек, и транскриптомики и peptidomic профилей мыши и L-клетки человека показал сильный глобальный сходство между двумя видами7,18,,2627.
Однако, изолированной перфузии крыса тонкой кишки, также имеет некоторые ограничения, которые должны быть рассмотрены. Самое главное невозможно определить, связана ли данный ответ секреторной результаты от прямой активации испытываемого вещества целевых гормон продуцирующих клеток или скорее косвенные механизмом. К примеру KCl мгновенно увеличивает секрецию GLP-1 от перфузии кишечника7, но она остается неизвестным, является ли это следствием прямого деполяризации клеток L или результатом деполяризации нейронов недалеко от L-клетки или эффекты одновременно выпустили паракринными стимуляторы/ингибиторов. Данных, вытекающих из исследований с использованием перфузии intestine с целью выяснения молекулярные механизмы лежащие в основе секрецию следует таким образом, всегда ставится в контекст с данными, полученными из других более конкретных моделей для повышения способности установить Причинность. К примеру глюкоза стимулирует секрецию GLP-1 от линии секреции ячейки GLP-1 GLUTag28,29 и от мыши L-клетки зависит от активности транспортеры глюкозы (SGLT1 и GLUT2). Блокирование этих перевозчиков в тонком кишечнике перфузии крыса также ослабляет секрецию20, что означает, что вполне вероятно, что глюкоза стимулирует секрецию GLP-1 значительной степени опосредовано прямого действия глюкозы на L-cell. Другим важным ограничением изолированной перфузии кишечника является, что некоторые из липидов, трудно учиться из-за их гидрофобность. Хотя это можно исследовать окончательные продукты переваривания липидов (жирные кислоты, diacyl glycerols, lysophosphatidylglycerols и т.д.) и подготовка может иметь возможность повторно эстерифицировать липиды внутри cellularly и возможно упаковать их в хиломикроны, перевозки хиломикроны из клетки и их последующего поглощения lacteals Вилли нарушается, поскольку лимфотока в изолированных кишечник не может быть обеспечена. Скорее всего таким образом, липидов поглощения прекращается после всасывается продукты начинают накапливаться в клетках. В пробирке клеток системы даже меньше подходят для исследования липидов из-за их отсутствия поляризации. Очевидно это ограничение относится только к липиды, которые поглощаются и транспортируются через lacteals, тогда как те всасывается через кровеносные сосуды кишечника могут обрабатываться как правило.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования были проведены с разрешения датского инспекции экспериментов животных (2013-15-2934-00833) и местные этического Комитета, в соответствии с руководящими принципами датского законодательства, регулирующего экспериментов на животных (1987) и национальном Институты здравоохранения (публикация № 85-23).
1. подопытных животных
- Получать самцов крыс Wistar (250 g) и дом 2 на клетку, с ad libitum доступ к стандартным Чоу и воде и поддерживать в 12:12 h свето тени цикла. Наши животные зал использует не лечить вода и Чоу Alrtromin грызунов (1319 ФОРТИ, Brogaarden, Линге, Дания).
Примечание: Разрешить животных по крайней мере одной недели акклиматизации.
2. предоперационная подготовка
- Сделать перфузии буфера: Кребса-звонарь бикарбонат буфера дополнена 0,1% BSA (часть V), T-70, 3,5 ммоль/Л глюкозы и 5 ммоль/Л пируват, фумарата 5% декстрана и глутамата (при необходимости); рН 7,4.
- Подготовить достаточное количество перфузии буфера путем фильтрации через соответствующий размер фильтра и скорректировать рН до ~7.5 по каплям добавления 5 М HCl.
- Добавьте 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX) (при необходимости) непосредственно в буфер в день исследования до конечной концентрации 10 мкм.
Примечание: IBMX является ингибитор фосфодиэстеразы, что увеличивает [лагерь],я и таким образом восстанавливает чувствительность и оперативности кишки с точки зрения секреции гормонов на секреторную раздражитель. - Подготовка теста заинтересовавшим. Подготовьте сосудистой раздражителей на 20 x более высокой концентрации, чем желаемого конечная концентрация в буфере отфильтрованных и рН скорректирована перфузии. Подготовьте Люминал тест раздражителей в изотонический солевой раствор в конечной концентрации.
- Распустить не легко растворимых соединений в 100% диметилсульфоксида (ДМСО) и развести в буфер перфузии или изотоническим физиологическим. Для сосудистой раздражители сохранить окончательный концентрации ДМСО на 1% или ниже, как концентрации выше это повреждение кишечника и может привести к неспецифическим кишки гормона. Измеряют рН и приспособиться к ~7.5, если это необходимо.
3. Эксплуатация и перфузии
Примечание: Иллюстрация перфузии установки приводится на рисунке 1.
- Анестезировать крыс использованием анестезии режима, который может выдержать хирургического наркоза и обезболивания для 30-40 мин на Hypnorm/мидазоламом (вес тела 0,3 мл/100 г, мл: Hypnorm: 0,08 мг фентанила, 2,5 мг fluanisone, 0,45 мг метил парагидроксибензоат, 0,05 мг Пропил парагидроксибензоат, мидазолама: 1,25 мг, матрица, Фармацевтика Хеллерупа, Дания)
- Проверить из-за отсутствия рефлексов (мыс сжатие), место крысы на операционном столе с подогревом и выполнять разрез кожи подвергать кишечника.
-
Разоблачить терминала часть толстой кишки, перемещая тонкий кишечник сторону как можно больше. Галстук поставки сосудистую толстой кишки и акцизных постепенно начиная от терминала части толстой кишки, переход к тонкой кишки.
- Если определенная часть тонкой кишки требуется только для перфузии (верхняя половина), акциза необязательные сегментов после связывания от поставки сосудистую. Чтобы свести к минимуму повреждения тканей, увлажняет кишечник с изотонический солевой раствор и использовать тампоны для удаления соединительной ткани.
- Вставьте пластиковую трубку (длина: ~ 15 см, диаметр: ~0.4 см) в просвете кишечника (в проксимальной части) и галстук должным образом с помощью зашивает. Тщательно промойте изотонический солевой раствор (комнатной температуры) очистить люмен химуса.
- Perfuse люмен с изотонический солевой раствор на поток 0,25 мл/мин, используя шприц 10 мл, подключенных к шприцевый насос.
- Двигаться в сторону кишечника, так что верхняя верхней брыжеечной артерии доступен и удаление жира и соединительной ткани, чтобы разоблачить артерии.
- Место два швов под верхней брыжеечной артерии с помощью тонкой точке щипцами; один из швов предназначен для подъема артерии контролировать кровотечение после того, как сократить артерия и другой — для обеспечения катетер, который должен быть помещен в артерии. Соблюдайте осторожность, чтобы не перфорировать артерии.
- Место два швов под воротной вены для обеспечения металлический катетер, который собирается быть помещены в Вену для сбора стоков перфузии.
- Перед вырезанием отверстий в верхней брыжеечной артерии, убедитесь, что катетер, который идет к вставленной в артерию наполнен перфузии буфер для предотвращения образования воздушных эмболии.
- Вырезать небольшое отверстие в верхней брыжеечной артерии, используя хирургические ножницы и вставить катетера сразу после.
- Сразу же после того, как было обеспечено катетер, инициировать перфузии кишки, начав Роликовый насос (скорость потока = 7,5 мл/мин).
- Убедитесь, что кровеносные сосуды в кишечнике повернуть бледно в течение нескольких секунд, и воротной вены поворачивает бледно.
- Сразу же после того, как был создан надлежащий перфузии, вырезать отверстие в воротной вены, Вставьте металлический катетер и закрепите его с швом.
Примечание: Катетер может быть трудно место но подняв Вену, осторожно потянув наиболее проксимальной помогает шовный материал. - После того как катетеры находятся на месте и вывода перфузии является удовлетворительным, убить крыса, перфорация диафрагмы, соблюдая осторожность, чтобы не вырывать катетеры.
- Собирать перфузии вывода за 1 мин и измерения объема. Запустите перфузионного давления приобретение/записи, нажмите кнопку Выполнить эксперимент в программе записи давления.
- Обложка кишки с смоченной ткани, чтобы предотвратить его от пересыхания во время эксперимента.
- Убедитесь, что дистального конца кишки не заблокирован, так что Люминал стоков может выйти, иначе будет зыбь кишечника, отек будет развиваться, перфузионного давления будет увеличиваться, и перфузии вывода упадет.
- Оставьте подготовки для примерно 30 минут до начала эксперимента.
Примечание: Секреторный выходы кишки гормонов очень нестационарных за первые 15 мин перфузии, поэтому этот шаг уравновешивания, чтобы получить стабильный базовый.
4. эксперимент
- После примерно 30 мин перфузии запустите эксперимент, собирая первый базовый пример с помощью коллектор фракций. Сбор образцов на желаемый временной интервал (например, каждые мин, 6,5-7,5 мл обычно собирают) и поместите их на льду в течение нескольких минут.
-
Регулярно проверяйте Пузырь ловушки и, если опорожняется, пополнить его с буфером перфузии.
- Собирайте буфер через трехходовой кран клапан непосредственно перед поступлением органа и из катетера, вставляется в воротной вены (после того как он был увлажненную через орган) для подтверждения, что орган является метаболически активные. Сбор образцов в начале и в конце эксперимента оценить жизнеспособность на протяжении всего эксперимента.
- Измерьте образцы быстро, с автоматизированной крови-газоанализаторы, как самые пластиковые содержит/шприцы не полностью герметичные, рождая обмен с атмосферного воздуха.
- После 10-15 мин базовой коллекции стимулировать с первого теста веществом. Управлять внутри артериальной стимуляцию с шприцевый насос через трехходовой кран (поток = 0,350 мл/мин).
- Люминал стимуляцию для выполнения первоначального болюса инъекции (2,5 мл/мин за первые 5 минут), для замены изотонический солевой раствор, который уже находится в просвете, следуют администрация тестовое решение ниже скорости потока (0,5 мл/мин).
- Чтобы гарантировать, что просвета быстро очищается от испытываемого вещества после периода Люминал стимуляции, флеш просвета кишечника с изотонический солевой раствор, применяя же скорости потока, как указано выше.
- Соберите базовые образцы для 15-30 мин до следующего испытываемого вещества осуществляется. В зависимости от протокола 2-3 испытания раздражители обычно могут быть включены в эксперимент. Если экспериментальный протокол включает активации/торможение молекулярной сайта одновременно с администрацией данного secretagogue, всегда предварительно стимулировать с ингибитора активатора 10-15 мин до отправления secretagogue для Убедитесь, что молекулярные сайт тормозится в самом начале инфузии secretagogue.
- В конце протокола администрирование (5-10 мин) подходит положительный контроль для проверки для оперативности подготовки и сбора исходных образцов 10-15 мин после периода стимуляции.
Примечание: Несколько испытаний вещества может быть использована как позитивный элемент управления, например, стимулы для увеличения [лагерь]я (например, foskolin или IBMX), [Ca2 +]я (например, бомбезина или neuromedin C), расшатывания агентов (например, 30-50 мм KCl) или больше физиологически соответствующих раздражители, такие как макроэлементы: глюкоза, Пептоны, аминокислоты и т.д. Однако выбор позитивного управления зависит от экспериментальных результатов. Глюкоза является например secretagogue бедных холецистокинин (CCK), тогда как бомбезина является не надежный secretagogue для зависящих от глюкозы insulinotropic пептид (GIP) секрецию30. - После окончания эксперимента акцизный перфузии кишечник, взвесить его и измерить его длину. Положите его в параформальдегида и хранить его (4 ° C) для потенциальных позднее гистохимический анализ целостности/повреждения тканей, например, H & E пятнать.
5. биохимические измерения
- Количественно концентрации секретируемые пептидов в венозной сточных вод с использованием собственных или коммерчески доступных Радиоиммуноанализы (RIA) или ELISA assays. Для исследований, которые расследуют кишечного поглощения количественно молекулы интерес, например, глюкозы или аминокислот, в венозной стоков.
Примечание: Perfusate обычно является хорошим базальной буфер для большинства анализов, включая анализы, которые полагается на ферментативных реакций (например, количественного определения глюкозы методом glucoseoxidase).
6. анализ данных
- Представлять данные различными способами, например как время концентрация график, показывающий фактический выход секреторной (поток x концентрации) и как столбец сюжет с изображением всего секреторной вывода периоды базовых и реагирования (обычно 10-15 время очков).
- Участка фактическая измеренная концентрация соответствующих гормонов как концентрация единиц. (пмоль/Л),
Примечание: Это предпочтительнее вместо Экспресс данные вывода (фмоль/мин), потому что с этой моделью, в отличие от в-vivo исследований, полученные значения выводятся фактические секреторной (из-за постоянной коллекции перфузии сточных вод). - В зависимости от количества групп статистически проанализированы использовать двустороннюю паре t тест (две группы) или односторонний дисперсионный анализ для повторных измерений (более чем две группы), после чего соответствующий пост Специальный тест для нескольких сравнений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Возможность определить ли заданный стимул вызывает секрецию гормона кишки интерес опирается на стабильный базовый секрецию. Кроме того если наблюдается не ответ на раздражитель, надежные секреторной ответ положительный контроль должен быть очевидным, чтобы исключить, что отсутствие реакции на тест раздражитель не отражает общее отсутствие оперативности. Рисунок 2A и 2B показывает пример хорошего качества данных; GLP-1 секреции из тонкой кишки изолированной перфузии крыса отображаются промежутки (средства ± SEM) 1-мин. В базальных условиях секрецию устойчивый; как до, так и после введения тест стимул (инсулина) и надежные секреторной ответ положительный контроль (бомбезина (BBS)) очевидна. Кроме того в среднем GLP-1 секреции в базальных условиях (в периоды соответствующих базовых предшествующих инсулина или администрации BBS) а также усредненной секрета во время инсулина и BBS стимуляции отображаются в виде гистограммы (средства ± SEM). Секреция была протестирована на статистическую значимость односторонний дисперсионный анализ для повторных измерений. Основываясь на этих комбинированных данных, можно сделать вывод, что внутри артериальной инсулина не стимулируют секрецию GLP-1 от изолированной перфузии крыса тонкой кишки.
Рисунок 2 c и 2D показывает пример GLP-1 секрета из изолированной перфузии крыса тонкой кишки. В отличие от рисунок 2A и 2Bэти данные имеют низкое качество; секрецию унитазы в базальных условиях и дрейфует вверх по всему в манере, которая появляется быть несвязанными проверить вещество администраций (Интра просветный и внутри артериальной фруктоза, соответственно) и положительный контроль, BBS, не приводит к статистические значительное увеличение секреции GLP-1. Это, таким образом, невозможно заключить стимуляцию фруктозы вызывает секрецию GLP-1, например, ли увеличение секреции GLP-1 в конце стимуляции сосудистой фруктоза фруктоза опосредованной ответ или нет.
Рисунок 1: пример установки перфузии. Система состоит из оргстекла стенд, подогреваемый операционный стол, теплообменник с построением в пузырь ловушки, манометр и шпинделя насос для регулировки давления перфузии. Перфузии системы связано с термостатическим термостат, который нагревает газированные (95% O2, 5% CO2) перфузии буфера до 37 ° C. Кроме того перфузионного давления регистрироваться непрерывно и преобразованы в записи датчика давления и визуализировать и сохраняются на ПК с подходящего программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: данные из тонкой кишки изолированной перфузии крыса. (A, B) пример хорошо выполненных экспериментов и достоверных данных, (C, D) пример субоптимальных данных где перфузии давление повышается, и перфузии вывода резко снизились в течение времени исследования. (A) показан результат GLP-1 (всего) (фмоль/мин) на базальных условиях и в ответ на внутри артериальной инсулина администрации (200 и 1000 часов, как указано). Бомбезина (BBS), хорошо известных, potent GLP-1 secretagogue, был внутри arterially вливаются в конце эксперимента, чтобы контроль за отзывчивость (поз. контроль). Данные представлены как средства ± SEM, n = 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Тонкая кишка изолированной перфузии крыса является мощный исследовательский инструмент, который позволяет динамика и молекулярные механизмы лежащие в основе кишки гормонов необходимо изучить в деталях. Наиболее важным шагом для успешного производства данных с этой моделью является хирургическая операция. Обработка кишечнике неизбежно вызовет некоторые повреждения кишечника и поэтому должны храниться в на абсолютный минимум. Еще более важно скорость работы является ключевым, особенно в том, что касается времени для размещения катетера в верхней брыжеечной артерии. Наш опыт, что катетер должен быть успешно помещен, и перфузии следует начать в течение нескольких минут после вырезать отверстие в сосуде. Размещение катетеры является наиболее сложной частью операции и осложняется небольшой размер верхней брыжеечной артерии и тонкие стены воротной вены, и этот шаг требует некоторой практики. Быстрая вставка венозного катетера является, однако, не как срочные, как в случае верхней брыжеечной артерии, как кишечник теперь увлажненную и оставлял в живых. Следующим важнейшим шагом является выполнение эксперимента. Если операция была успешно выполнена, перфузии кишки обычно процветают и реагировать до 3 часов, и перфузионного давления и вывода обычно останется постоянным в течение всего эксперимента. Наиболее важным фактором для успешного эксперимента на данном этапе, чтобы избежать пузырей, попадая в системе, так как это вызывает эмболизации воздуха, который мгновенно уменьшает или устраняет перфузии вывода. Как перфузии буфер содержит BSA и газом для обеспечения достаточной доставки кислорода к перфузии кишечник, трудно полностью предотвратить образование пузырьков. Пузырьки должны однако, быть в ловушке в системах Пузырь ловушки, но это постепенно очищает со временем (больше пузырьков, быстрее опорожнения) и поэтому важно, чтобы внимательно следить на пузырь ловушки и пополнить его с буфером перфузии при необходимости. Важно также сохранить perfusate рН ниже 7,5 — на повышение рН, могут образовывать преципитаты карбонат кальция, препятствуют капиллярной потока и вызывая серьезное увеличение перфузионного давления.
Перфузии кишечника является довольно надежная подготовка, но она не переносят высокие концентрации моющих средств как желчных кислот, этанола и ДМСО. Таким образом использование моющих средств следует предпочтительно избегать, но иногда нужно, чтобы получить малорастворимых соединений в раствор. Перфузии кишки обычно допускает моющих средств под интра luminally лучше, чем внутри vascularly. Например администрация 1 мм taurodeoxycholic кислоты (среднее, конъюгированных желчных кислот) был переносится хорошо, когда проникнуты intraluminally, но мгновенно привела к заблокированных перфузии вывода при доставке внутри arterially2. Для сосудистой стимуляции Держите конечная концентрация ДМСО ниже 1% чтобы избежать неспецифических секреторной ответы (ДМСО стимулирует, например, секрецию GLP-1) и избегать причинения повреждения тканей, что приводит к увеличению перфузионного давления и снижение перфузии выход. Эксперименты должны быть пренебрежены если перфузии вывода уменьшается более чем на 20% в течение этого исследования, если перфузионного давления увеличивается более чем на 20% или если развивается отек. Соблюдение этих критериев макроскопических успеха (включая быстрое введение катетера в верхней брыжеечной артерии) обычно приводит к хорошим качеством в ~14/15 экспериментов.
После завершения эксперимента, следующий критический процедура является выбрать соответствующий метод и assay для количественной оценки hormone(s) интерес. Высокая через положить опробование пептидных гормонов может осуществляться с помощью иммуноанализа: радиоиммуноанализ или ELISA. В любом случае, настоятельно рекомендуется проверить соответствующие анализы перед их использованием для количественной оценки образцов, поскольку не все коммерчески доступных анализов удовлетворительного выполнения отношении чувствительность, специфичность и точность (для примеров относительно GLP-131). Что касается специфики перекрестной реактивности это, как всегда, беспокойство. Неспецифические эффекты вмешательства и матрица обычно менее выраженными с искусственным перфузатов, по сравнению с плазмы. Что касается чувствительности, это часто гораздо легче получить надежные данные от орошений, чем в vivo исследований как пептид концентрации часто выше, потому что стоков перфузии не разбавляется в системный кровоток и потому, что избежать ликвидации процессов (по печени/легких/почек). Как правило, базовые концентрации в венозной стоков лежат в нижнем диапазоне рабочей Большинство анализов (в случае GLP-1 (всего), neurotensin (общая) и PYY (всего): 8-15 пмоль/Л) в то время как стимулируется ответов может достигать как высокий как 200-300 пмоль/Л3.
В сравнении, базовые значения же гормонов в плазме крови от здоровых людей, обычно являются крыс или мышей и 5-10 пмоль/Л в то время как ответ значения являются 15-30 пмоль/Л3,32.
Если соблюдаются критерии предопределенные успеха, сгенерированный перфузии данных, как правило, хорошего качества и статистический анализ затем проста. По сравнению с секрецию инсулин и глюкагон, соматостатин изолированной перфузии крыса или мыши поджелудочной железы, базальной секреции гормонов кишки устойчивым и довольно аналогичные между эксперименты в отношении измеренных концентраций, и секрецию не явно пульсирующего. Коллективно различия в наборе данных поэтому является минимальным, и размер выборки, как низко как три перфузии эксперименты часто достаточно для достижения статистической значимости. Однако чтобы стандартизировать и избежать ошибок типа 2, а также уменьшить возможность игнорирования менее хорошо выраженной реакции, рекомендуется размер выборки от шести до восьми.
В целом изолированной перфузии крыса тонкой кишки является важным, физиологически соответствующих, Экспериментальная модель, которая может использоваться для изучения непосредственного воздействия данного вещества на кишечнике гормона. Важные фундаментальные вопросы, как где в кишечнике secretagogue стимулирует секрецию, ли он стимулирует секрецию через активацию luminally или basolaterally расположены датчики, и какие молекулярные датчики активированные и таким образом ответственных за секрецию могут быть рассмотрены в деталях с этой моделью. Следует, однако, признать, что расцеплять кишечник от доноров животного может на некоторые вопросы исследования, отношение. К примеру кишечнике тесно взаимодействует с печени (ось кишечник печень) и мозг (оси кишки мозг), и механизмов, которые полагаются на этот крест talk поэтому не может быть расследованы с этой моделью. Качество работы является критическим фактором для качества данных и наиболее важными факторами для успешного функционирования чтобы сохранить обработки кишки до минимума и быстро начать перфузии кишечника после того, как сократить верхней брыжеечной артерии. Это наш опыт, который она занимает 2-4 месяцев практики, прежде чем производятся данных хорошего качества. Однако после того, как стало известно, техника, возможности этого метода являются почти бесконечные и только ограниченной растворимости веществ испытания и любых потенциальных повреждающего воздействия, испытываемого вещества могут иметь на перфузии тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы этой работы объявить отношение к этой статье не потенциальные конфликты интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана неограниченный Грант Профессор Йенс Юуль холста от Ново Нордиск центра фундаментальных исследований метаболизма (Ново Нордиск фонд, Дания), отдельный грант от Ново Нордиск фонда для этого грызуна перфузионные исследования (Грант нет. NNF15OC0016574), Грант Профессор холста из Европейского исследовательского совета (Grant no.695069) и Европейского союза в седьмой рамочной программы научных исследований, TechnologicalDevelopment и демонстрационной деятельности (Грант № 266408), а также постдока Грант в Руне Kuhre E. Lundbeck фонда (R264-2017-3492). Мы благодарим Дженна E. Хант и Каролин F. склизки для тщательного корректуры.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for perfusion buffer | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 1.12018.0500 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O) | Merck | 102382 | |
| Dextran 70 | Pharmacosmos | 40014 | |
| Fumaric acid disodium salt (C44H2Na2O4) | Sigma Aldrich | F9642 | |
| Glucose (C6H12O6) | Merck | 108342 | |
| Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4) | Merck | 105886 | |
| Potasium chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck | 104873 | |
| Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4) | Merck | 106619 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | ||
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O) | Merck | 106445 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion equitment | |||
| Universial perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | |
| BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834 | Harvard Bioscience, Inc. | ||
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Cannula with basked, OD = 2.0 mm, ID = 1.0 mm | Harvard Bioscience, Inc. | 733313 |
References
- Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
- Brighton, C. A., et al. Bile Acids Trigger GLP-1 Release Predominantly by Accessing Basolaterally Located G Protein-Coupled Bile Acid Receptors. Endocrinology. 156, 3961-3970 (2015).
- Kuhre, R. E., et al. Bile acids are important direct and indirect regulators of the secretion of appetite- and metabolism-regulating hormones from the gut and pancreas. Molecular Metabolism. , (2018).
- Roberge, J. N., Brubacker, P. L. Secretion of Proglucagon-Derived Peptides in Response to Intestinal Luminal Nutrients. Endocrinology. 128, 3169-3174 (1991).
- Brubaker, P. L., Schloos, J., Drucker, D. J. Regulation of glucagon-like peptide-1 synthesis and secretion in the GLUTag enteroendocrine cell line. Endocrinology. 139, 4108-4114 (1998).
- Jacobsen, S., et al. Changes in Gastrointestinal Hormone Responses, Insulin Sensitivity, and Beta-Cell Function Within 2 Weeks After Gastric Bypass in Non-diabetic Subjects. Obesity Surgery. 22, 1084-1096 (2012).
- Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine. Diabetes. 64, 370 (2014).
- Svendsen, B., Holst, J. J. Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines. Peptides. 77, 47-53 (2016).
- Ratner, C., et al. Effects of Peripheral Neurotensin on Appetite Regulation and Its Role in Gastric Bypass Surgery. Endocrinology. 157, 3482-3492 (2016).
- Wewer Albrechtsen, N. J., et al. Dynamics of glucagon secretion in mice and rats revealed using a validated sandwich ELISA for small sample volumes. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 311, E302-E309 (2016).
- Vilsboll, T., Agerso, H., Krarup, T., Holst, J. J. Similar elimination rates of glucagon-like peptide-1 in obese type 2 diabetic patients and healthy subjects. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 88, 220-224 (2003).
- Windelov, J. A., et al. Why is it so difficult to measure glucagon-like peptide-1 in a mouse? Diabetologia. 60, 2066-2075 (2017).
- Gorboulev, V., et al. Na+-d-glucose Cotransporter SGLT1 is Pivotal for Intestinal Glucose Absorption and Glucose-Dependent Incretin Secretion. Diabetes. 61, 187-196 (2012).
- Kuhre, R. E., Bechmann, L. E., Wewer Albrechtsen, N. J., Hartmann, B., Holst, J. J. Glucose stimulates neurotensin secretion from the rat small intestine by mechanisms involving SGLT1 and GLUT2, leading to cell depolarization and calcium influx. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 308, E1123-E1130 (2015).
- Kuhre, R. E., Christiansen, C. B., Saltiel, M. Y., Wewer Albrechtsen, N. J., Holst, J. J. On the relationship between glucose absorption and glucose-stimulated secretion of GLP-1, neurotensin, and PYY from different intestinal segments in the rat. Physiological Reports. 5, (2017).
- Svendsen, B., et al. An analysis of cosecretion and coexpression of gut hormones from male rat proximal and distal small intestine. Endocrinology. 156, 847-857 (2015).
- Goldspink, D. A., et al. Mechanistic insights into the detection of free fatty and bile acids by ileal glucagon-like peptide-1 secreting cells. Molecular Metabolism. 7, 90-101 (2018).
- Sun, E. W., et al. Mechanisms Controlling Glucose-Induced Glp-1 Secretion in Human Small Intestine. Diabetes. , (2017).
- Kuhre, R. E., et al. Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716 and STC-1 cells: a comparison to native L-cells. Journal of Molecular Endocrinology. 56, 11 (2016).
- Reimann, F., et al. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell Metabolism. 8, 532-539 (2008).
- Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, 161-175 (2005).
- Kuhre, R. E., et al. Fructose stimulates GLP-1 but not GIP secretion in mice, rats and humans. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306, G622-G630 (2014).
- Reimann, F., Tolhurst, G., Gribble, F. M. G-Protein-Coupled Receptors in Intestinal Chemosensation. Cell Metabolism. 15, 421-431 (2012).
- Parker, H. E., et al. Molecular mechanisms underlying bile acid-stimulated glucagon-like peptide-1 secretion. British Journal of Pharmacology. 165, 414-423 (2012).
- Petersen, N., et al. Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids. Diabetes. 63, 410-420 (2014).
- Parker, H., et al. Predominant role of active versus facilitative glucose transport for glucagon-like peptide-1 secretion. Diabetologia. 55, 2445-2455 (2012).
- Roberts, G. P., et al. Comparison of Human and Murine Enteroendocrine Cells by Transcriptomic and Peptidomic Profiling. Diabetes. , (2019).
- Reimann, F., Gribble, F. M. Glucose-Sensing in Glucagon-Like Peptide-1-Secreting Cells. Diabetes. 51, 2757-2763 (2002).
- Drucker, D. J., Jin, T., Asa, S. L., Young, T. A., Brubaker, P. L. Activation of proglucagon gene transcription by protein kinase-A in a novel mouse enteroendocrine cell line. Molecular Endocrinology. 8, Baltimore, Md. 1646-1655 (1994).
- Svendsen, B., et al. GLP1- and GIP-producing cells rarely overlap and differ by bombesin receptor-2 expression and responsiveness. The Journal of Endocrinology. 228, 39-48 (2016).
- Bak, M. J., et al. Specificity and sensitivity of commercially available assays for glucagon-like peptide-1 (GLP-1): implications for GLP-1 measurements in clinical studies. Diabetes, Obesity & Metabolism. 16, 1155-1164 (2014).
- Jacobsen, S. H., et al. Effects of gastric bypass surgery on glucose absorption and metabolism during a mixed meal in glucose-tolerant individuals. Diabetologia. 56, 2250-2254 (2013).
