Summary
نقدم إجراء لزراعة سلالات العديد من ماجنيتوسبيريلوم في نوعين مختلفين من وسائط النمو. سلالة جريفيسوالدينسي ماجنيتوسبيريلوم MSR-1 يزرع في السائل والانحدار تركيز O2 وسائل الإعلام شبه صلبة بينما تزرع ماجنيتيكوم م. سلالة السفير-1 وسلالة M. magnetotacticum MS-1 في المتوسط السائل.
Abstract
يتم ماجنيتوتاكتيك البكتيريا سلبية الغرام، متحركة، أساسا المائية بدائيات النوى في كل مكان في موائل المياه العذبة والبحرية. أنها تتميز بقدرتها على ماجنيتوسوميس بيومينيراليزي، والمغناطيسية نانومتر الحجم بلورات من أكسيد الحديد الأسود (Fe3س4) أو جريجيتي (Fe3ق4) يحيط بها غشاء بلير دهن، داخل بهم السيتوبلازم. لمعظم البكتيريا المعروفة ماجنيتوتاكتيك، ويتم تجميع ماجنيتوسوميس في سلاسل داخل السيتوبلازم، مما يمنح لحظة ثنائي القطب مغناطيسي دائم للخلايا وتسبب لهم بمحاذاة صورة سلبية مع المجالات المغناطيسية الخارجية. وبسبب هذه الميزات المحددة، البكتيريا ماجنيتوتاكتيك على إمكانيات كبيرة للتطبيقات التجارية والطبية. ومع ذلك، معظم الأنواع ميكروايروفيليك وقد س2 تركيز المتطلبات المحددة، يجعلها أكثر صعوبة تنمو بشكل روتيني من العديد من البكتيريا الأخرى مثل الإشريكيّة القولونية. نقدم هنا بروتوكولات مفصلة لزراعة ثلاثة سلالات درس على نطاق واسع من البكتيريا ماجنيتوتاكتيك، ينتمون إلى جنس ماجنيتوسبيريلومجميعا. تسمح هذه الطرق لمراقبة دقيقة من تركيز2 س تتاح للبكتيريا، بغية ضمان أن ينمو بشكل طبيعي وتوليف ماجنيتوسوميس. زراعة البكتيريا ماجنيتوتاكتيك لإجراء المزيد من الدراسات باستخدام هذه الإجراءات لا تتطلب experimentalist إلى أن يكون خبيراً في علم الأحياء المجهرية. كما يمكن استخدام الأساليب العامة الواردة في هذه المقالة لعزل والثقافة الأخرى البكتيريا ماجنيتوتاكتيك، على الرغم من أنه من المرجح أن التركيب الكيميائي وسائط النمو سوف تحتاج إلى تعديل.
Introduction
بكتيريا ماجنيتوتاكتيك (MTB) تمثل نطاقا واسعاً من الغرام بدائيات النوى في كل مكان في الموائل المائية في المياه العذبة والبحرية1. حصة هذه البكتيريا القدرة على إنتاج بلورات مغناطيسية مصنوعة من أكسيد الحديد الأسود (Fe3س4) أو جريجيتي (Fe3ق4)، التي في معظم الحالات تجميعها في سلاسل داخل الخلايا. هذا الحافز الهيكلي خاصة نظراً لوجود عدة بروتينات محددة تتصرف في السيتوبلازم من البكتيريا والغشاء الدهني الذي يحيط بكل كريستال2على حد سواء. كل كريستال الفردية وحويصله الأغشية المحيطة به يسمى ماجنيتوسومي وهي تتراوح في حجمها من حوالي 30 إلى 50 نانومتر في الأنواع ماجنيتوسبيريلوم 3. بسبب ترتيب سلسلة ماجنيتوسوميس، تمتلك هذه البكتيريا لحظة ثنائي القطب مغناطيسي دائم يجعلها في محاذاة صورة سلبية مع المجالات المغناطيسية تطبيق خارجياً. ولذلك، هذه البكتيريا السباحة بنشاط على طول خطوط الحقل المغناطيسي، بوصفها البوصلات الصغيرة ذاتية يفترض أن أكثر فعالية تحديد الظروف المواتية الأكثر (مثلاً.، تركيز O2 ) للنمو.
خاصية مثيرة لاهتمام للمواضيع المتميزة هي قدرتها على تنظيم الكيمياء وعلم البلورات من بلورات ماجنيتوسومي بهم. معظم سلالات إنتاج بلورات نقاء عالية نسبيا من أكسيد الحديد الأسود أو جريجيتي، على الرغم من أن بعض بيومينيراليزي كل المعادن4. وفي جميع الحالات، البكتيريا قادرة على التحكم بدقة في الحجم وشكل بلورات مفردة المجال المغناطيسي بهم. وهذا يفسر لماذا يجري قدرا كبيرا من البحث التوصل إلى فهم أفضل لكيفية أداء MTB هذه العملية بيومينيراليزيشن. فهم هذه العملية قد تمكن الباحثون خياط--جعل نانوكريستالس المغناطيسي للعديد من التطبيقات التجارية والطبية.
وقد يشكل عقبة كبيرة لبحوث مستفيضة في المواضيع المتميزة صعوبة متزايدة منهم في المختبر. معظم الأنواع، بما في ذلك السلالات المستخدمة في هذا العمل، أوبليجاتيلي ميكروايروفيليك عندما نمت مع س2 يقبلون إلكترون المحطة طرفية. وهذا يفسر لماذا توجد هذه البكتيريا في أغلب الأحيان في منطقة انتقالية بين ظروف أوضاع مؤكسدة ووصول (واجهة أوضاع مؤكسدة وصول، OAI). وهذا يبين بوضوح أن MTB دقيقة س2 متطلبات التركيز الذي من الواضح أنه يحتاج إلى أن تؤخذ في الاعتبار عند وضع وسائط النمو لهذه الكائنات. وعلاوة على ذلك، يعني التنوع الكبير الموجود في المواضيع المتميزة أن سلالات مختلفة سوف تحتاج إلى أنواع مختلفة من التدرجات الكيميائية والمواد الغذائية لتحقيق النمو الأمثل.
في هذا العمل، يمكننا وصف أساليب زراعة ثلاثة من المواضيع المتميزة على نطاق واسع أهم درس: ماجنيتيكوم ماجنيتوسبيريلوم (سلالة السفير-1) و M. magnetotacticum (MS-1) م. جريفيسوالدينسي (MSR-1). هذه الأنواع تنتمي إلى فئة الفابروتيوباكتيريا في الأسرة في اللغات بروتيوباكتيريا فيلوجينيتيكالي وهي حلزونية في التشكل، وامتلاك السوط قطبي في نهاية كل من الخلية. نحن نقدم البروتوكولات لزراعة سلالة MSR-1 في كل من السائل ويا2 الانحدار تركيز شبه صلبة وسائل الإعلام، استناداً إلى وصفات متوسطة المنشورة سابقا5،6. ونقدم أيضا بروتوكول مفصل لزراعة سلالات السفير-1 و 1-مرض التصلب العصبي المتعدد في المعدل المتوسط النمو الوشيقي المغناطيسي (مجسم)7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-تركيب محطة2 ن
ملاحظة: اختيار القطر الداخلي للأنبوب حيث أنه يمكن ربطه بخزان الغاز مع الحد الأدنى من التسرب، وحيث يناسب الاسطوانة لحقنه بلاستيكية 1 مل محكم في هذا الأنبوب. ويرد مثال على كامل N2 محطة الغاز في الشكل 1.
- أمان تثبيت خزان غاز2 ن قريبة من مقاعد البدلاء التي يوجد مساحة كافية لإقامة محطة2 ن (بطول حوالي 50 سم).
- الاتصال إلى الخزان قطعة من أنابيب طويلة بما يكفي للوصول إلى المنطقة حيث سيتم بناء المحطة. إذا لزم الأمر، تطبيق تفلون الشريط في إخراج خزان لتجنب أي تسرب.
- لبناء محطة قادرة على السطح خمس زجاجات من المتوسطة وفي الوقت ذاته، قص أربع قطع من الأنابيب لحوالي 5 سم في الطول.
- قم بتجميع قطع الأنابيب في خط مع الثلاثية ثلاثة على شكل T من التجهيزات البلاستيكية. الاتصال واحدة من نهاية هذا السطر بقطعة الأنبوب في إخراج الدبابة2 ن من خلال تركيب إضافية على شكل T. إضافة كوع 90° المناسب في الطرف الآخر.
- استخدام الشريط لإرفاقها الهيكل قضيب معدني أفقي وضع حوالي 30 سم فوق مقاعد البدلاء.
- قم بتوصيل خمس قطع من الأنابيب (حوالي 20 سم في الطول) إلى النواتج خالية من التركيبات المثبتة في "الخطوة 1، 4".
- إزالة بيستونز من خمسة مل 1.0 المحاقن البلاستيكية وقطع نهاية أكبر من هذه المحاقن (أي.، مقابل الجانب بالإبرة)، حفظ الجزء تخرج فقط. ملء هذه المحاقن بالقطن، ولا مسرف.
- إدراج الحقن في القطع عمودي طويل 20 سم من الأنابيب واستخدام الماء والصابون للتأكد من أنه لا يوجد أي تسرب عندما يتدفق ن2 .
- إزالة قبعات خمس إبر ز 25 (0.5 مم × 25 مم) وإدراج هذه الإبر في قطع 10 سم من أنابيب رقيقة. تأكد من أن الإبر تناسب محكم في الأنبوب.
تنبيه: هناك خطر لطعنة أثناء هذه الخطوة. تفعل ذلك ببطء وبعناية. - إرفاق الإبر أعد الخطوة 1.9 للمحاقن محطة2 ن. التأكد من أن ن2 يتدفق عبر كافة الأسطر الخمسة وتبقى المحطة على أهبة الاستعداد.
2-نمو إعداد متوسطة
ملاحظة: من الممكن لضبط كمية متوسطة على استعداد، كما هو موضح في الخطوات 2.1.2 و 2.2.2 و 2.3.8. كمية المياه والمواد الكيميائية المستخدمة فقط الاحتياجات الواجب تعديلها نسبيا. هو وصف دور جميع مكونات المتوسطة التكميلية الجدول1.
- إعداد متوسطة النمو السائلة للأبحاث العلمية البحرية-1
- تعد حلاً سترات الحديديك 10 ملم بإضافة ز 0.245 سترات الحديديك إلى 100 مل مياه المقطرة. الحرارة ويقلب إلى حل، حتى أصفر إلى البرتقالي واضح هو الحصول على الحل. اﻷوتوكﻻف الحل باستخدام معيار دورة (على الأقل 15 دقيقة التعرض في 121 درجة مئوية) ومن ثم تخزين هذا الحل الأسهم في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
ملاحظة: تجاهل الحل سترات الحديديك عندما يصبح من الواضح ترسبات. - في كوب يحتوي على 1 لتر مياه المقطرة، يضاف ما يلي بالترتيب أثناء التحريك: 1.0 مل المعادن تتبع تكملة الحل، 0.1 غرام من خ2ص4، ز 0.15 مجسو4.7 ح2س، ز 2.38 من حبيس، ز 0.34 نانو3 ، استخراج 0.1 غرام خميرة، ز 3.0 من ببتون فول الصويا، 4.35 مل من لاكتات البوتاسيوم (60% w/w الحل) و 5 مل من 10 ملم من سترات Fe(III) حل الأسهم.
ملاحظة: ضبط الكميات نسبيا إذا كانت هناك حاجة إلى كمية أقل من متوسط النمو. N2 محطة قادرة على خمس زجاجات محتدما مثل تلك التي بنيت في الخطوة 1 من هذا البروتوكول، في الوقت نفسه، تعد 300 مل متوسطة.
تنبيه: تتبع المعدنية والأوراق المالية سترات Fe(III) الحلول بحاجة إلى أن تظل عقيمة. لتجنب التلوث، استخدام تقنية تعقيم القياسية عند استخدامها (قمم اللهب فتح الزجاجات باستخدام موقد بنسن) واستخدم التلميحات ماصة معقمة للاستغناء. مخزن الحل المعدنية في ثلاجة عند 4 درجة مئوية. - بعد إضافة جميع المواد الكيميائية، ضبط درجة الحموضة 7.0 بمحلول هيدروكسيد الصوديوم 1 متر. الاستغناء عن المتوسط المحضرة في زجاجات المصل 125 مل. من أجل 60 مل متوسط في كل زجاجة.
- استخدام أنابيب صغيرة متصلة فقاعة ن2 إلى متوسطة لمدة 30 دقيقة لإزالة س المذاب2, N2 المحطة المذكورة في الخطوة 1. ضع سداده بوتيل مطاط على رأس كل زجاجة، ترك فتحه صغيرة للسماح بالغاز الزائدة للخروج من القمقم.
تنبيه: قد تشكل رغوة حين محتدما مع ن2. ضبط تدفق الغاز وبناء على ذلك لتجنب إنتاج الرغاوي. - تجعيد ختم كل زجاجة بسداده استعداد وختم ألومنيوم. ختم الألومنيوم يضمن أن الزجاجة لا تزال مختومة خلال الفترة المتبقية البروتوكول.
- قطع الاتصال الإبر والأنابيب رقيقة من محطة2 ن واستبدالها بالإبر النظيفة (1 بوصة، ≤ ز 23). ضبط صمامات الدبابة2 ن بحيث يخرج لطيف استمرار تدفق الغاز للدبابات (حوالي 50 مل/دقيقة).
ملاحظة: قد ترك الإبر أكبر من 23 ز ثقوب أونسيالابل الدائمة في السدادة. - إدراج أحد الإبر متصلة بخزان2 ن في زجاجة من المتوسطة، من خلال السدادة المطاطية. فورا إدراج إبرة نظيفة آخر في نفس الزجاجة. كرر هذه الخطوة للزجاجات الأخرى والسماح لتدفق2 ن لحوالي 30 دقيقة ليحل محل الهواء في الزجاجات من ن2.
- قطع زجاجة واحدة من محطة2 ن بإزالة الإبرة المقابلة. انتظر بضع ثوان حتى ينخفض الضغط في زجاجة المتوسطة إلى الضغط الجوي وإزالة الإبرة الثانية. كرر هذه الخطوة لكل زجاجات المتبقية.
تنبيه: لمنع إعادة إدخال زجاجات المتوسطة النمو بعد الخطوة 2.1.4 س2 , نفذ الخطوات 2.1.4-2.1.8 في تتابع سريع. إذا كان لا يمكن توصيل جميع الزجاجات إلى المحطة2 ن في نفس الوقت، المضي قدما في خطوات 2.1.4-2.1.8 لأول مجموعة من الزجاجات وثم كرر هذه الخطوات للزجاجات المتبقية. - اﻷوتوكﻻف الزجاجات. السماح لهم بارد وصولاً إلى درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها، وتخزينها في درجة حرارة الغرفة بعد ذلك.
- تعد حلاً سترات الحديديك 10 ملم بإضافة ز 0.245 سترات الحديديك إلى 100 مل مياه المقطرة. الحرارة ويقلب إلى حل، حتى أصفر إلى البرتقالي واضح هو الحصول على الحل. اﻷوتوكﻻف الحل باستخدام معيار دورة (على الأقل 15 دقيقة التعرض في 121 درجة مئوية) ومن ثم تخزين هذا الحل الأسهم في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- إعداد متوسطة النمو السائلة للسفير-1 ومرض التصلب العصبي المتعدد-1
- تعد حلاً كينيت الحديديك 10 ملم. أولاً حل ز 0.19 حمض كوينيك في 100 مل مياه المقطرة، ثم إضافة ز 0.27 فيكل3.6H2إثارة O. حل، حتى يتم الحصول على حل الظلام حمراء واضحة. اﻷوتوكﻻف الحل باستخدام دورة قياسية (على الأقل 15 دقيقة التعرض في 121 درجة مئوية).
ملاحظة: تخزين الحل كينيت الحديديك في درجة حرارة الغرفة في الظلام كحل أسهم عقيمة. تجاهل الحل عندما يصبح من الواضح ترسبات. - في كوب يحتوي على 1 لتر مياه المقطرة، يضاف ما يلي بالترتيب أثناء التحريك: 10.0 مل الحل الملحق فيتامين، 5.0 مل الحل تتبع الملحق المعدنية، 0.68 ز خ2ص4، ز 0.848 من الصوديوم سوكسيناتي مائي سداسي هيدرات، 0.575 ز من الصوديوم دي طرطرات ثنائي هيدرات، 0.083 ز ثلاثي اسيتات الصوديوم، مل 0.45 من 0.1% مائي ريسازورين، ز 0.17 نانو3، 0.04 غ من حمض الأسكوربيك و 3.0 مل من 10 ملم من حل الأسهم كينيت Fe(III).
ملاحظة: ضبط الكميات نسبيا إذا كانت هناك حاجة إلى كمية أقل من متوسط النمو. N2 محطة قادرة على خمس زجاجات محتدما مثل تلك التي بنيت في الخطوة 1 من هذا البروتوكول، في الوقت نفسه، تعد 300 مل متوسطة.
تنبيه: فيتامين والمعادن التتبع وحلول الأسهم كينيت Fe(III) بحاجة إلى أن تظل عقيمة. لتجنب التلوث، استخدام تقنية تعقيم القياسية ونصائح ماصة معقمة عند الاستغناء. تخزين الحلول المعادن والفيتامينات في ثلاجة عند 4 درجة مئوية. - بعد إضافة جميع المواد الكيميائية، ضبط درجة الحموضة إلى 6.75 استخدام حل هيدروكسيد الصوديوم 1 متر.
- الرجوع إلى الخطوات 2.1.3-2.1.9 لبقية البروتوكول.
- تعد حلاً كينيت الحديديك 10 ملم. أولاً حل ز 0.19 حمض كوينيك في 100 مل مياه المقطرة، ثم إضافة ز 0.27 فيكل3.6H2إثارة O. حل، حتى يتم الحصول على حل الظلام حمراء واضحة. اﻷوتوكﻻف الحل باستخدام دورة قياسية (على الأقل 15 دقيقة التعرض في 121 درجة مئوية).
- إعداد متوسطة النمو شبه صلبة للأبحاث العلمية البحرية-1
- إعداد 0.5 M فوسفات المخزن مؤقت حل pH 7.0 بتذويب 3.362 ز ك2هبو4 و 4.178 ز خ2ص4 في 100 مل مياه المقطرة. تحقق إذا كانت درجة الحموضة 7.0 وضبط درجة الحموضة قليلاً مع خ2بو4 أو هيدروكسيد الصوديوم إذا لزم الأمر. تخزين الحل في زجاجة زجاجية مختومة (أفضل للبلاستيك لتجنب تبادل الأوكسجين).
- تحضير 100 مل حل الهيدروكلوريك 0.02 م. إضافة 0.2 جم من فيكل2.4H2س لهذا الحل وآثاره إلى حل بغية الحصول على حل كلوريد حديد 10 ملم. تخزين الحل في الظلام في زجاجة زجاج محكمة الإغلاق.
- تحضير حل بيكربونات الصوديوم 0.8 م بتذويب ز 6.72 ناكو3 في 100 مل مياه المقطرة. تخزين الحل في زجاجة زجاج محكمة الإغلاق.
- اﻷوتوكﻻف الحلول التي أعدت في الخطوات 2.2.1-2.2.3 استخدام دورة قياسية (على الأقل 15 دقيقة التعرض في 121 درجة مئوية). تخزين هذه الحلول العقيمة الأسهم في الظلام.
- في كوب يحتوي على 1 لتر مياه المقطرة، يضاف ما يلي بالترتيب أثناء التحريك: 5 مل من تتبع الملحق المعدنية الحل، مل 0.2 من محلول مائي ريسازورين 1%، 0.4 غ من كلوريد الصوديوم، غ 0.3 NH4Cl، 0.1 غرام من مجسو4.7H2 س، ز 0.05 من كاكل استخراج2.2H2س، 1 غرام من الصوديوم succinate، ز 0.5 من خلات الصوديوم، 0.2 جم خميرة وز 1.6 من أجار.
- تغطية الكأس برقائق الألومنيوم والاوتوكلاف الحل أعد الخطوة 2.3.5.
- قبل نهاية دورة اﻷوتوكﻻف، تعد نسبة % 4 جديدة ل-cysteine· HCl· ح2س الحل بتذويب 0.8 غرام من ل-cysteine· HCl· ح2س في 20 مل مياه المقطرة. تحييد الحل على درجة الحموضة 7.0 بمحلول هيدروكسيد الصوديوم 5 أمتار.
تنبيه: من المهم أن الحل سيستين مستعدة الطازجة لتجنب الأكسدة السيستين. مخزن الحل المعدنية في ثلاجة عند 4 درجة مئوية. - بعد التعقيم، السماح لتبرد المتوسط وصولاً إلى 50 – 60 درجة مئوية وإخضاع الكأس شعلة الموقد بنسن. إزالة رقائق الألومنيوم و بسرعة إضافة التالية بالترتيب مع التحريك بلطف: 0.5 مل حل فيتامين، 2.8 مل العازلة الفوسفات العقيمة الحل الأسهم، 3 مل من كلوريد الحديد العقيمة الحل الأسهم، 1.8 مل المخزون العقيمة بيكربونات الصوديوم الحل و 10 مل من محلول تعقيم تصفية سيستين.
ملاحظة: ضبط الكميات نسبيا إذا كانت هناك حاجة إلى كمية أقل من متوسط النمو. أنها عادة ما تكون مريحة لإعداد دفعة من 120 مل متوسطة.
تنبيه: يجب أن تبقى جميع الحلول العقيمة لاستخدامها في المستقبل. نفذ الخطوة 2.3.8 استخدام تقنية تعقيم القياسية وماصة معقمة ونصائح عند الاستغناء. - بعد إضافة جميع المواد الكيميائية، نقل متوسطة الحارة إلى 16 مل ملولبة العقيمة هونجاتي الأنابيب. نقل 12 مل المتوسط في كل أنبوب وختم الأنابيب.
تنبيه: لتفادي التلوث، نفذ الخطوة 2.3.9 تحت شعلة الموقد بنسن. تنفيذ ذلك قبل أجار يتصلب، بينما يكون المتوسط عند 40 درجة مئوية أو أعلى. - اترك هذه الأنابيب دون عائق لعدة ساعات حتى يتصلب أجار و OAI يصبح واضحا، تجسيد وردي إلى واجهة عديم اللون، وحوالي 1 إلى 3 سم تحت سطح المتوسط.
ملاحظة: ينبغي ببطء تشغيل المتوسطة عديم اللون في الأنبوب. مقدار الوقت اللازم لهذا الانتقال هو متغير ويعتمد على مقدار س2 حلت مبدئياً في الأجل المتوسط.
3-التطعيم للمواضيع المتميزة
ملاحظة: ثقافات سلالات السفير-1، مرض التصلب العصبي المتعدد-1 و MSR-1 يمكن الحصول عليها تجارياً (جدول المواد).
تنبيه: إجراء كافة الخطوات التالية في ظروف معقمة، تحت شعلة الموقد بنسن.
- تلقيح سلالات MSR-1، السفير-1 و 1 مللي ثانية في المتوسط السائل
- ختم زجاجة فارغة 125 مل مصل مع سداده مطاطية بوتيل وختم تجعيد ألومنيوم. إدراج اثنين الإبر في الزجاجة من خلال السدادة، وتوصيل حقنه على استعداد كما هو الحال في الخطوة 1.7 إلى واحد منهم. قم بتوصيل المحاقن اسطوانة س2 عن طريق نفس النوع من الأنابيب كتلك المستخدمة في محطة2 ن.
- اسمحوا يا2 التدفق من خلال زجاجة لمدة حوالي 30 دقيقة، لضمان أن يتم استبدال جميع الهواء في الزجاجة س2. إزالة كل الإبر، والسماح لَيَرْكَبُ طفيف في زجاجة ثم اﻷوتوكﻻف. تسمح زجاجة يبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستعمال.
ملاحظة: لتوفير الوقت، نفذ الخطوات 3.1.1 و 3.1.2 أثناء إعداد متوسطة والاوتوكلاف زجاجة جنبا إلى جنب مع المتوسطة أو حلول الأسهم. - تعقيم قمم سدادات زجاجة متوسطة طازجة وزجاجة2 س بتطبيق بضع قطرات من محلول الإيثانول 70% فوقهم وتمريرها من خلال شعلة الموقد بنسن.
- استخدام المحاقن معقمة وابرة، استخراج 1 مل من س2 من الزجاجة2 س وتحويلها إلى زجاجة متوسطة جديدة. تأكد من أن الإبرة يناسب محكم في المحاقن أثناء هذه الخطوة لتفادي أي الهواء في المحاقن.
- في حالة استخدام العدوى من ثقافة أخرى تزرع في زجاجة زجاج، تعقيم سدادات زجاجة متوسطة طازجة وزجاجة الثقافة القديمة بتطبيق بضع قطرات من محلول الإيثانول 70% فوقهم وتمريرها من خلال شعلة الموقد بنسن. إذا كان استخدام العدوى من أنبوب الثقافة المجمدة، مجرد السماح لها الاحماء لدرجة حرارة الغرفة مع أنبوب مختومة تحت شعلة الموقد بنسن.
- في حالة استخدام العدوى من ثقافة أخرى تزرع في زجاجة زجاج، تطعيم 1 مل الثقافة القديمة في المتوسط الطازجة. في حالة استخدام إينوكولاتي من الأوراق المالية مجمدة، تطعيم فقط 0.1 مليلتر تمييع سلفوكسيد والغليسيرول أو ثنائي ميثيل ([دمس]) المستخدمة في عملية التجميد. وفي كلتا الحالتين، استخدام إبرة معقمة والمحاقن معقمة.
- احتضان ثقافة عند 32 درجة مئوية، وتطعيم في متوسطة جديدة بعد 4 إلى 7 أيام.
- تلقيح MSR-1 في س2 التدرج شبه الصلبة المتوسطة
- تحقق من أن تعرض أنبوب متوسطة جديدة OAI محددة تحديداً جيدا، تتحقق بوردي إلى واجهة عديم اللون.
- إذا العدوى قادمة من آخر س2 الانحدار تركيز الثقافة شبه صلبة، حصاد البكتيريا قبل ميليلتر 50 بيبيتينج للثقافة مع تلميح ماصة معقمة على الفرقة التي شكلتها البكتيريا. تطعيم ببطء هذه البكتيريا في OAI في المتوسط الطازجة (واجهة الوردي/عديم اللون)، تجنب الإخلال بالواجهة. إذا كان يأتي العدوى من ثقافة مجمدة، المضي قدما بنفس الطريقة مع 100 ميليلتر من العدوى بدلاً من ذلك.
- إغلاق الأنبوب واسمحوا البكتيريا تنمو بين 25 درجة و 30 درجة مئوية. نقل إلى متوسطة جديدة باستخدام نفس الإجراء قبل وصول فرقة البكتيريا إلى سطح المتوسط.
4-المراقبة للبكتيريا
- تعقيم سداده الزجاجة الثقافة بتطبيق الحل الإيثانول 70% على أعلى من ذلك ويمر من خلال شعلة الموقد بنسن. للمتوسطة وشبه الصلبة، فتح الأنبوب تحت شعلة الموقد بنسن. استخدام إبرة معقمة والمحاقن معقمة لاستخراج البكتيريا.
- استخدام معلقة إسقاط أسلوب8 التأكد من وجود البكتيريا المغنطيسية ومتحركة على حد سواء.
ملاحظة: الطوري يعطي نتائج عظيمة ولكن ليس إلزامياً. تكبير تتراوح بين 10 X 60 X مناسبة. - استخدام مجهر إلكتروني (TEM) لمراقبة هيكل الخلية وماجنيتوسوميس في التفصيل8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمكن تقييم الإعداد الناجح من وسائط النمو كما يلي. في نهاية العملية، امسح الحلول (أي.، وخالية من أي ترسبات) ينبغي الحصول عليها (وهذا صحيح بالنسبة لوسائل الإعلام السائلة والمتوسطة يا شبه صلبة التدرج2 ). صورة عرض الجانب المرتقبة للمتوسطة السائل MSR-1 قبل التطعيم يمكن أن ينظر في الشكل 2 ألف. يتم signaled ناجحة س2 الانحدار تركيز شبه صلبة متوسطة بتشكيل OAI بعد بضع ساعات، وأشارت إلى وجود 1 – 3 سم متوسطة الوردي في الجزء العلوي من الأنبوب (الشكل 3، أنبوب A). باقي المتوسط ينبغي أن يكون عديم اللون. وسيط كل الوردي قبل التطعيم علامة على أكسدة كاملة ريسازورين وذلك إعداد غير الناجحة التدرج تركيز2 س.
النمو الناجح في المتوسط السائل يمكن التحقق من حوالي 48 ساعة بعد التطعيم (أو بعد بضعة أيام إذا كان يأتي العدوى من ثقافة مجمدة) ببساطة عن طريق دراسة الثقافات التعكر باستخدام مصدر ضوء أو جهاز المطياف الضوئي. ويؤكد النمو الناجح التعكر تثبت أن البكتيريا نما فعلياً (الشكل 2). إذا كان المتوسط لا يزال واضحا بعد 48 ساعة، لم تنم البكتيريا. لثقافة متوسطة سائل المتزايد عادة، يمكن التحقق وجود البكتيريا توليف ماجنيتوسوميس بعد 48 ساعة عن طريق وضع زجاجة المتوسطة على طبق من إثارة مغناطيسية، وإلقاء الضوء عليه مع مصباح يدوي. بسرعة إثارة منخفضة، المتوسطة ينبغي فلاش "، يبحث بالتناوب أكثر قتامة وأكثر إشراقا تبعاً لاتجاه المغناطيس إثارة فيما يتعلق بموقف experimentalist. لثقافة غير مغناطيسية، وكثافة الضوء متناثرة في الخلايا نحو experimentalist سوف تظل ثابتة.
تتم الإشارة إلى النمو الناجح في المتوسط شبه صلبة بتشكيل عصابة ميكروايروفيليك من البكتيريا في واجهة الوردي/عديم اللون. بسبب استهلاك س2 بواسطة البكتيريا والتغييرات في التدرج س2 ، سيتم ترحيل الفرقة ببطء لمتابعة OAI (الشكل 3، الأنبوب ب).
إسقاط المعلقة يتيح أسلوب المراقبة للتأكد من أن البكتيريا المغنطيسية ومتحركة على حد سواء. بعد بضع دقائق، ينبغي أن تركز المواضيع المتميزة في الحافة من انخفاض شنقاً، تثبت أن تسبح بنشاط على طول خطوط الحقل المغنطيسي (الشكل 4 أ). للتأكد من وجود الخلايا المغناطيسية، انعكاس اتجاه المغناطيس جالساً إلى جانب الانخفاض. يجب أن تبدأ البكتيريا السباحة نحو الحافة المقابلة (الشكل 4 باء). وأخيراً، يمكن التحقق من الشكل ماجنيتوسوميس مع تيم. بلورات كوبوكتاهيدرال من حوالي 30 – 45 نانومتر في القطر وينبغي مراعاة9. يتم ترتيب هذه البلورات عادة في سلسلة طويلة واحدة أو عدة سلاسل أقصر في الأنواع التي درست هنا (الشكل 5).
الشكل 1 : التوضيح ن2 محطة الغاز- () التمثيل التخطيطي. (ب) صورة من برنامج الإعداد. وسيكون محطة ناجحة الطول المناسب من أنابيب كبيرة ورقيقة حتى يظل نهاية الأنابيب رقيقة الموصوفة في "الخطوة 1، 9" من البروتوكول منغمسين في المتوسط خلال الخطوة محتدما الغاز. ينبغي أيضا أن تدفق الغاز قابل للتعديل في جميع الأوقات، لضمان أن تتم إزالة كافة س2 وأن لا تسرب المتوسطة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : زجاجات من متوسط النمو السائل قبل وبعد التطعيم. () واضحة MSR-1 المتوسطة قبل التطعيم. (ب) عكر MSR-1 المتوسطة بعد 3 أيام نمو الناجح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : أنابيب من س2 المتوسطة شبه صلبة التدرج قبل (أنبوب A) و 10 أيام بعد التطعيم (الأنبوب ب)- يتم الإشارة إلى فرقة البكتيريا في أنبوب ب سهم أحمر.
الشكل 4 : تجربة النتائج النموذجية لانخفاض شنقاً في 20 X التكبير باستخدام الطوري- () المواضيع المتميزة تسبح نحو القطب الجنوبي للمغناطيس وتتراكم في واجهة السائل/الهواء. (ب) 1 دقيقة بعد التقليب المغناطيس، تركت معظم الخلايا في مجال الرؤية.
الشكل 5 : المراقبة تيم خلية السفير-1- يتم الإشارة إلى سلاسل ماجنيتوسومي بالأسهم الحمراء. وترد سياط اثنين بالسهام السوداء.
التكميلية الجدول 1- اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
س2 تركيز المتطلبات المحددة المواضيع المتميزة وجعلها غير عادية تنمو في المختبر. خطوة أساسية للبروتوكول من أجل المتوسط السائل هو إزالة جميع س2 من المتوسطة الأولى بغية التحكم بتركيز نهائي عن طريق إضافة وحدة تخزين محددة من س2، فقط قبل التطعيم. فقد ثبت أن ينمو MSR-1 الظروف الهوائية كاملا تقريبا، بيد المغناطيسية للخلايا هو انخفاض جذري. وأظهرت النتائج من الدراسة نفسها أن سلالات السفير-1 ومرض التصلب العصبي المتعدد-1 لا تنمو تحت الظروف الهوائية تماما6. لثقافة شبه صلبة MSR-1، يتم تقليل جميع س2 أولاً قبل الحل سيستين وثم يظهر التدرج تركيز O2 ، مما أدى إلى تشكيل OAI. إذا كانت ثقافة لا تنمو جيدا أو لا المغناطيسية، ينبغي تركيز O2 أول شيء للتحقق.
المتوسطة النمو شبه صلبة هو خيار مثيرة لاهتمام لعزل MTB غير معروف أو زراعة الأنواع التي تعتبر حساسة للغاية لكلا س التدرجات2 والأكسدة والاختزال، كما يضمن وجود التدرجات مستقر ويسمح للبكتيريا لوضع نفسها في الموقع الذي يوفر أفضل ظروف النمو. المتوسطة السائل أكثر ملاءمة للعمل مع متى يلزم توفر كميات أعلى (مثلاً.، لاستخراج الحمض النووي)، أو عندما يحتاج مزيدا من التحليل أن تجري على الخلايا (على سبيل المثال.، الدراسات ماجنيتوسومي) كما أنها تسمح فصل الخلايا من أسهل المتوسطة النمو. أجار في المتوسط شبه صلبة قد تتداخل في الواقع مع الخلية حصاد تقنية.
في بعض الثقافات، وفي بعض الأحيان تصبح الخلايا غير متحركة، على الأرجح بسبب الطفرات العفوية. خلايا متحركة عدم البقاء على قيد الحياة وتنمو في الأجلين المتوسط والنمو نظراً لأنها لا تحتاج إلى السباحة إلى العثور على المواد الغذائية اللازمة للبقاء على قيد الحياة. ثم يمكن استخدام أسلوب قياسي في حلبة سباق10 لاستعادة ثقافة متحركة حيث يمكن تسبح الخلايا فقط متحركة أسفل مسار السباق. كما يمكن أن يحدث فقدان النمط الظاهري المغناطيسية في الثقافة حتى إذا كان تركيز2 س الأمثل، مرة أخرى بسبب الطفرات العفوية11. في هذه الحالة الحل الأفضل لبدء ثقافة جديدة بتطعيم تجميد الأرصدة السمكية البرية من نوع البكتيريا في متوسطة جديدة. بدلاً من ذلك، يمكن أن تسمح تقنية حلبة السباق أيضا استعادة ثقافة المغناطيسي.
من الضروري تجنب تلوث الثقافة بالكائنات الحية الأخرى وذلك يجب إجراء معظم البروتوكول باستخدام تقنيات عقيمة. التلاعب تحت شعلة الموقد بنسن عادة ما يعطي نتائج مرضية في الحفاظ على ظروف معقمة. بيد إذا الثقافة تزرع في بيئة معرضة لتلوث، إضافية ينبغي اتخاذ الاحتياطات، مثل العمل في غطاء الاندفاق الصفحي عند إعداد المتوسطة وتطعيم البكتيريا. تجدر الإشارة إلى أن خطر التلوث أعلى في المتوسط شبه صلبة كالأنابيب تحتاج إلى فتح كل مرة تتم إزالة الخلايا.
تمكين هذه البروتوكولات نمو البكتيريا ما يكفي لإجراء العديد من أنواع مختلفة من التجارب، مثل الدراسات المادية استناداً إلى الفحص المجهري الضوئي12،13، الميكروسكوب الإلكتروني التصوير14،15، الأشعة السينية سبيكتروميكروسكوبي تحليلات16، الجينوم والبروتين الدراسات17،18. إذا لزم الأمر، يمكن تحقيق تركيزات أعلى من البكتيريا في تعليق باستخدام الطرد المركزي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخراجه وتنقيته لمزيد من التطبيقات من الكريات الخلية أو تعليق خلية الكثيفة التي تم الحصول عليها باستخدام الطرد المركزي19ماجنيتوسوميس.
تركيبات وسائط النمو تستند عادة نفس المبادئ الحاكمة (انظر التكميلية الجدول 1 للاطلاع على موجز من القائمة لدور كل عنصر في وسائط النمو الموصوفة هنا). يجب أن يكون مصدر الكربون المتاحة للبكتيريا، عن طريق الأحماض العضوية (مثلاً.، سوكسيناتي، طرطرات لاكتات، خلات) أو المركبات غير العضوية مثل بيكربونات. اختيار مصدر الكربون مناسب يعتمد على التمثيل الغذائي للبكتيريا. تلزم أيضا النيتروجين الموجودة في الحمض النووي والبروتينات والفوسفور (الحمض النووي، والأغشية) وقدمتها نانو3و NH Cl4خ2ص4 في وصفات الموصوفة هنا. المخزن مؤقت (هيبيس، العازلة الفوسفات) ضروري لمقاومة تغيرات درجة الحموضة. يتضمن الحل الملحق المعدنية تتبع العوامل المساعدة للإنزيمات والفيتامينات يمكن أن تستخدمها البكتيريا الإنزيمات المساعدة أو كمجموعات وظيفية لبعض الإنزيمات. ببتون فول الصويا واستخراج الخميرة مصدرا للأحماض الأمينية والأملاح المستخدمة لإنتاج البروتين. منذ MTB الأكسدة الحساسة، واحد أو عدة وكلاء الحد كثيرا ما يجب أن يضاف إلى المتوسط (مثلاً.، سيستين، حمض الأسكوربيك، لاكتات). تشكل مصدرا رئيسيا للحديد (مثلاً.، سترات الحديديك، وكلوريد الحديديك كينيت، الحديد) يلزم في المتوسط بيومينيراليزيشن. وأخيراً، مطلوب كمية صغيرة من س2 للبكتيريا ميكروايروفيليك كما يقبلون الإلكترون المحطة الطرفية. • إلزام اللاهوائية MTB استخدام المركبات الأخرى مثل النترات أو أكسيد النيتروز بدلاً من ذلك.
القيد الرئيسي لهذه البروتوكولات هو أنه لا يوجد أي ضمان بأن يعملوا للأنواع الأخرى من المواضيع المتميزة. سلالات السفير-1، مرض التصلب العصبي المتعدد-1 و MSR-1 المياه العذبة كل المواضيع المتميزة ولذلك لا يمكن استخدام وصفات الموضحة في هذه المقالة لتنمو ماجنيتوسبيريلا البحرية مثل ثيوفيلا ماجنيتوسبيرا سلالة MMS-1 أو سلالة ماجنيتوسبيرا QH-2 MTB البحرية الأخرى، التي تتطلب أعلى تركيزات الملح. ومع ذلك، لزراعة سلالات أخرى من المواضيع المتميزة، وعزل سلالات جديدة، يمكن استخدامها الأساليب العامة الواردة في هذه المقالة لوسائل الإعلام السائلة وشبه الصلبة على حد سواء لإعداد وسائل الإعلام مع وصفات مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر ريتشارد فرانكل باء لمساعدته مع الثقافات وآدم ص هيتشكوك وإرادات تشو لتأييدهم حين إعداد ثقافات المواضيع المتميزة في جامعة ماكماستر وريد مارسيا المواضيع المتميزة للتدريب والوصول إلى مرفق الميكروسكوب الإلكتروني (جامعة ماكماستر، كلية العلوم الصحية). كان يدعمها هذا العمل في العلوم الطبيعية والهندسة بحوث المجلس من كندا (مقدمة) ومؤسسة العلوم الوطنية الأمريكية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AMB-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 700264 | |
| MS-1 | ATCC | ATCC 31632 | |
| MSR-1 | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) | DSM 6361 | |
| Ferric citrate | Sigma-Aldrich | F3388-250G | |
| Trace mineral supplement | ATCC | MD-TMS | |
| KH2PO4 | EMD | PX1565-1 | |
| MgSO4.7 H2O | EMD | MX0070-1 | |
| HEPES | BioShop Canada Inc | HEP001.250 | |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | S5506-250G | |
| Yeast extract | Fischer scientific | DF210929 | |
| Peptone | Fischer scientific | DF0436-17-5 | |
| Potassium L-lactate solution (60%) | Sigma-Aldrich | 60389-250ML-F | |
| D-(-)-Quinic acid | Sigma-Aldrich | 138622 | |
| FeCl3.6H2O | Fischer scientific | I88-100 | |
| Vitamin supplement | ATCC | MD-VS | |
| Sodium succinate hexahydrate | Fischer scientific | S413-500 | |
| Sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729-100G | |
| Sodium acetate trihydrate | EMD | SX0255-1 | |
| Resazurin | Difco | 0704-13 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| K2HPO4 | Caledon | 6620-1-65 | |
| FeCl2 .4H2O | Sigma-Aldrich | 44939-250G | |
| Sodium bicarbonate | EMD | SX0320-1 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| NH4Cl | EMD | 1011450500 | |
| CaCl2.2 H2O | EMD | 1023820500 | |
| Agar A | Bio Basic Canada Inc | FB0010 | |
| L-cysteine.HCl.H2O | Sigma-Aldrich | C7880-100G | |
| 1.0 mL syringes | Fischer scientific | B309659 | |
| 25G x 1 needles | BD | 305125 | |
| 125 mL serum bottles | Wheaton | 223748 | |
| 20 mm aluminum seals | Wheaton | 224223-01 | |
| 20mm E-Z Crimper | Wheaton | W225303 | |
| Butyl-rubber stoppers | Bellco Glass, Inc. | 2048-11800 | |
| Hungate tubes | Chemglass (VWR) | CLS-4208-01 | |
| Septum stopper, 13mm, Hungate | Bellco Glass, Inc. | 2047-11600 | |
| Glass culture Tubes | Corning (VWR) | 9826-16X | |
| Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 11.6 - 12 N |
References
- Blakemore, R. P. Magnetotactic bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 36 (1), 217-238 (1982).
- Uebe, R., Schüler, D. Magnetosome biogenesis in magnetotactic bacteria. Nature Reviews Microbiology. 14 (10), 621 (2016).
- Faivre, D., Schuler, D. Magnetotactic bacteria and magnetosomes. Chemical Reviews. 108 (11), 4875-4898 (2008).
- Bazylinski, D. A., et al. Controlled biomineralization of magnetite (Fe3O4) and greigite (Fe3S4) in a magnetotactic bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 61 (9), 3232-3239 (1995).
- Lefèvre, C. T., et al. Diversity of magneto-aerotactic behaviors and oxygen sensing mechanisms in cultured magnetotactic bacteria. Biophysical Journal. 107 (2), 527-538 (2014).
- Heyen, U., Schüler, D. Growth and magnetosome formation by microaerophilic Magnetospirillum strains in an oxygen-controlled fermentor. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5-6), 536-544 (2003).
- Blakemore, R. P., Maratea, D., Wolfe, R. S. Isolation and pure culture of a freshwater magnetic spirillum in chemically defined medium. Journal of bacteriology. 140 (2), 720-729 (1979).
- Oestreicher, Z., Lower, S. K., Lin, W., Lower, B. H. Collection, isolation and enrichment of naturally occurring magnetotactic bacteria from the environment. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Pósfai, M., Lefèvre, M., Trubitsyn, C., Bazylinski, D. A., Frankel, R. Phylogenetic significance of composition and crystal morphology of magnetosome minerals. Frontiers in Microbiology. 4, 344 (2013).
- Wolfe, R. S., Thauer, R. K., Pfennig, N. A 'capillary racetrack' method for isolation of magnetotactic bacteria. FEMS Microbiology Ecology. 3 (1), 31-35 (1987).
- Schübbe, S., et al. Characterization of a spontaneous nonmagnetic mutant of Magnetospirillum gryphiswaldense reveals a large deletion comprising a putative magnetosome island. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5779-5790 (2003).
- Nadkarni, R., Barkley, S., Fradin, C. A comparison of methods to measure the magnetic moment of magnetotactic bacteria through analysis of their trajectories in external magnetic fields. PloS One. 8 (12), e82064 (2013).
- Waisbord, N., Lefèvre, C. T., Bocquet, L., Ybert, C., Cottin-Bizonne, C. Destabilization of a flow focused suspension of magnetotactic bacteria. Physical Review Fluids. 1 (5), 053203 (2016).
- Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (11), 3839-3844 (2004).
- Scheffel, A., et al. An acidic protein aligns magnetosomes along a filamentous structure in magnetotactic bacteria. Nature. 440 (7080), 110 (2006).
- Zhu, X., et al. Measuring spectroscopy and magnetism of extracted and intracellular magnetosomes using soft X-ray ptychography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (51), E8219-E8227 (2016).
- Schüler, D. Molecular analysis of a subcellular compartment: the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense. Archives of Microbiology. 181 (1), 1-7 (2004).
- Kolinko, I., et al. Biosynthesis of magnetic nanostructures in a foreign organism by transfer of bacterial magnetosome gene clusters. Nature Nanotechnology. 9 (3), 193 (2014).
- Hergt, R., et al. Magnetic properties of bacterial magnetosomes as potential diagnostic and therapeutic tools. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 293 (1), 80-86 (2005).
- Lefevre, C. T., et al. Novel magnetite-producing magnetotactic bacteria belonging to the Gammaproteobacteria. The ISME Journal. 6 (2), 440 (2012).
- Williams, T. J., Lefèvre, C. T., Zhao, W., Beveridge, T. J., Bazylinski, D. A. Magnetospira thiophila gen. nov., sp. nov., a marine magnetotactic bacterium that represents a novel lineage within the Rhodospirillaceae (Alphaproteobacteria). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 62 (10), 2443-2450 (2012).
- Zhu, K., et al. Isolation and characterization of a marine magnetotactic spirillum axenic culture QH-2 from an intertidal zone of the China Sea. Research in Microbiology. 161 (4), 276-283 (2010).
