Summary
Presentiamo una procedura per la coltivazione di diversi ceppi di Magnetospirillum in due diversi tipi di crescita media. Ceppo di Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1 viene coltivato in sia liquido e gradiente di concentrazione di O2 terreni semi-solidi mentre M. magneticum ceppo AMB-1 e M. magnetotacticum ceppo MS-1 sono coltivate in terreno liquido.
Abstract
I batteri magnetotattici sono Gram-negativi, mobili, prevalentemente acquatiche procarioti onnipresente in habitat d'acqua dolce e marini. Sono caratterizzati dalla loro capacità di magnetosomes di biomineralize, che sono magnetici dimensioni nanometriche cristalli di magnetite (Fe3O4) o di grigite (Fe3S4) circondati da una membrana lipidica a doppio strato, nelle loro citoplasma. Per la maggior parte dei batteri magnetotattici noto, magnetosomes sono assemblati in catene all'interno del citoplasma, quindi conferendo un momento di dipolo magnetico permanente alle cellule e causando loro di allineare passivamente con campi magnetici esterni. A causa di queste caratteristiche specifiche, batteri magnetotattici hanno un grande potenziale per applicazioni mediche e commerciali. Tuttavia, la maggior parte delle specie sono microaerofili e hanno requisiti specifici O2 concentrazione, che li rende più difficile a crescere regolarmente rispetto a molti altri batteri come Escherichia coli. Qui presentiamo protocolli dettagliati per la coltivazione di tre dei più ampiamente studiati ceppi di batteri magnetotattici, tutti appartenenti al genere Magnetospirillum. Questi metodi consentono un controllo preciso della concentrazione2 O reso disponibile ai batteri, al fine di garantire che si sviluppano normalmente e sintetizzare magnetosomes. Crescita di batteri magnetotattici per ulteriori studi utilizzando queste procedure non richiede lo sperimentalista di essere un esperto in microbiologia. I metodi generali presentati in questo articolo possono anche essere utilizzati per isolare e cultura altri batteri magnetotattici, anche se è probabile che la composizione chimica media di crescita dovrà essere modificato.
Introduction
I batteri magnetotattici (MTB) rappresentano una vasta gamma di procarioti gram-negativi onnipresente in habitat acquatici d'acqua dolce e marini1. Questi batteri condividono la capacità di produrre magnetici cristalli di magnetite (Fe3O4) o grigite (Fe3S4), che sono nella maggior parte dei casi assemblati in catene all'interno delle cellule. Questo particolare motivo strutturale è dovuta alla presenza di numerose proteine specifiche che agiscono sia nel citoplasma dei batteri e sulla membrana del lipido che circonda ogni cristallo2. Ogni singolo cristallo e sua circostante delle vescicole di membrana viene chiamato un magnetosoma ed è che variano nel formato da circa 30 a 50 nm in Magnetospirillum specie3. A causa della disposizione di catena di magnetosomes, questi batteri possiedono un momento di dipolo magnetico permanente che li rende allineare passivamente con campi magnetici applicati esternamente. Di conseguenza, questi batteri nuotano attivamente lungo linee di campo magnetico, che agiscono come semovente micro-Compasso presumibilmente a più efficacemente individuare le condizioni più favorevoli (ad es., concentrazione di O2 ) per la crescita.
Una proprietà interessante della MTB è la loro capacità di regolare sia la chimica e la cristallografia dei loro cristalli magnetosoma. Maggior parte dei ceppi produrre relativamente elevata purezza cristalli di magnetite o greigite, anche se alcuni biomineralize entrambi minerali4. In tutti i casi, i batteri sono in grado di controllare con precisione le dimensioni e la forma dei loro cristalli di singolo dominio magnetico. Questo spiega perché una grande quantità di ricerca è impegnata a sviluppare una migliore comprensione di come MTB eseguire questo processo biomineralization. Comprensione di questo processo potrebbe consentire ai ricercatori di adattare-fare nanocristalli magnetici per molte applicazioni mediche e commerciali.
Un ostacolo sostanziale al ricerche approfondite su MTB è stata la difficoltà della loro coltivazione in laboratorio. Maggior parte delle specie, tra cui i ceppi utilizzati in questo lavoro, sono obligately microaerofili se coltivata con O2 come un accettore terminale di elettroni. Questo spiega perché questi batteri si trovano più spesso la zona di transizione tra condizioni ossidanti e anossiche (l'interfaccia ossica-anossico, OAI). Ciò dimostra chiaramente che la MTB hanno precise esigenze di concentrazione di O2 che ovviamente deve essere presa in considerazione quando si concepisce la crescita media per questi organismi. Inoltre, la grande varietà esistente di MTB implica che diversi ceppi saranno necessari diversi tipi di gradienti chimici e sostanze nutrienti per ottenere una crescita ottimale.
In questo lavoro descriviamo i metodi per la coltivazione di tre di MTB più ampiamente studiati: Magnetospirillum magneticum (ceppo AMB-1), M. magnetotacticum (MS-1) e M. gryphiswaldense (MSR-1). Queste specie filogeneticamente appartengono alla classe di Alphaproteobacteria , nel phylum Proteobacteria , sono elicoidale nella morfologia e possiedono un flagello polare a ciascuna estremità della cella. Forniamo i protocolli per la coltivazione di ceppo MSR-1 sia liquido e O2 gradiente di concentrazione media semi-solido, basato su ricette medie precedentemente pubblicate5,6. Inoltre presentiamo un protocollo dettagliato per la crescita di ceppi AMB-1 e MS-1 nelle modificate magnetico Spirillum crescita medio (MGSM)7.
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Protocol
1. installazione della stazione2 N
Nota: Scegliere il diametro interno del tubo di modo che può essere collegato al serbatoio con perdita minima e in modo che il cilindro di una siringa di plastica da 1 mL si adatta strettamente in questo tubo. Un'illustrazione del completo N2 stazione di gas è fornita nella Figura 1.
- Tranquillamente installare un serbatoio di gas N2 nei pressi di una panchina su cui c'è spazio sufficiente per impostare la stazione di2 N (una lunghezza di circa 50 cm).
- Collegare al serbatoio un pezzo di tubo abbastanza a lungo per raggiungere l'area dove sorgerà la stazione. Se necessario, applicare il nastro di Teflon all'uscita del serbatoio per evitare eventuali perdite.
- Per costruire una stazione in grado di bubbling cinque bottiglie di mezzo allo stesso tempo, tagliate quattro pezzi di tubo di circa 5 cm di lunghezza.
- Assemblare i pezzi di tubo in una linea con tre raccordi in plastica a forma di T di tre vie. Collegare un'estremità di questa linea per il pezzo di tubo all'uscita del serbatoio2 N attraverso un raccordo a T extra. Aggiungere un raccordo all'estremità opposta del gomito di 90°.
- Utilizzare nastro per fissare la struttura di un'asta metallica orizzontale posizionato circa 30 cm sopra la panca.
- Collegare cinque pezzi di tubi (circa 20 cm di lunghezza) alle uscite libera degli accessori installati nel passo 1.4.
- Rimuovere i pistoni da cinque siringhe di plastica 1,0 mL e tagliare l'estremità più grande di queste siringhe (cioè., il fronte lato all'ago), mantenendo solo la parte graduata. Riempire queste siringhe con cotone, non troppo strettamente.
- Inserire le siringhe nei pezzi di tubi verticali lunghe 20 cm e utilizzare acqua saponata per garantire che non vi siano perdite quando N2 sta fluendo.
- Rimuovere i tappi di cinque aghi 25g (0,5 x 25 mm) e inserire questi aghi 10 cm pezzi di tubi sottili. Accertarsi che gli aghi misura strettamente nella tubazione.
Attenzione: Esiste un rischio di accoltellamento durante questo passaggio. Fatelo lentamente e con attenzione. - Attaccare gli aghi preparati nel passaggio 1,9 per le siringhe della stazione2 N. Assicurarsi che N2 è che fluisce attraverso tutte le cinque linee e tenere la stazione in stand-by.
2. crescita media preparazione
Nota: È possibile regolare la quantità di terreno preparato, come spiegato nella procedura 2.1.2, 2.2.2 e 2.3.8. La quantità di acqua e prodotti chimici utilizzati appena ha bisogno di essere regolato proporzionalmente. Il ruolo di tutti i componenti di media è descritto in supplementari nella tabella 1.
- Preparazione del terreno di coltura liquido per MSR-1
- Preparare una soluzione di citrato ferrico 10mm aggiungendo 0,245 g di citrato ferrico a 100 mL di acqua distillata deionizzata. Riscaldare e mescolare per sciogliere, fino al giallo all'arancione chiaro soluzione è ottenuta. Autoclave la soluzione utilizzando uno standard ciclo (almeno 15 min di esposizione a 121 ° C) e quindi conservare questa soluzione madre a temperatura ambiente al buio.
Nota: Eliminare la soluzione di citrato ferrico quando un precipitato diventa evidente. - In un becher contenente 1 L di acqua distillata e deionizzata, aggiungere quanto segue nell'ordine mescolando: 1,0 mL del minerale traccia supplemento soluzione, 0,1 g di KH2PO4, 0,15 g di MgSO4,7 H2O, 2,38 g di HEPES, 0,34 g di NaNO3 , Estratto di 0,1 g di lievito, 3,0 g di peptone di fagioli di soia, 4,35 mL di lattato di potassio (soluzione al 60% w/w) e 5 mL di soluzione madre di Fe (III) citrato da 10 mM.
Nota: Regolare le quantità proporzionalmente se è necessaria una minore quantità di mezzo di crescita. Per una stazione di2 N capace di bubbling cinque bottiglie allo stesso tempo, come quella costruita nel passaggio 1 del presente protocollo, preparare 300 mL di terreno.
Attenzione: Traccia minerale e Fe (III) citrato stock soluzioni devono essere mantenuti sterili. Per evitare contaminazioni, utilizzare una tecnica sterile standard quando utilizzarli (fiamma aperta cime delle bottiglie utilizzando un bruciatore di Bunsen) e Puntali sterili per l'erogazione. Conservare la soluzione minerale in frigorifero a 4 ° C. - Dopo l'aggiunta di tutte le sostanze chimiche, regolare il pH a 7.0 con soluzione di NaOH 1 M. Dispensare il mezzo preparato in flaconi da 125 mL del siero. Versare 60 mL di terreno in ogni bottiglia.
- Bolla N2 nel medium per 30 min rimuovere il disciolto O2, utilizzando il piccolo tubo collegato alla stazione2 N descritta nel passaggio 1. Mettere un tappo di gomma butilica sopra ogni bottiglia, lasciando una piccola apertura per consentire al gas in eccesso di uscire la bottiglia.
Attenzione: Schiuma potrebbe formare mentre spumeggiante con N2. Regolare di conseguenza il flusso di gas per evitare la produzione di schiuma. - A crimpare sigillare ogni bottiglia con il tappo preparato e un sigillo in alluminio. Il sigillo di alluminio assicura che la bottiglia rimane sigillata durante il resto del protocollo.
- Scollegare gli aghi e il tubo sottile dalla stazione2 N e sostituirli con aghi puliti (1 pollice, ≤ 23 G). Regolare le valvole del serbatoio2 N in modo che un delicato flusso continuo di gas esce il serbatoio (circa 50 mL/min).
Nota: Maggiore di 23G aghi possono lasciare permanente unsealable fori nel tappo. - Inserire uno degli aghi collegati al serbatoio2 N in una bottiglia di mezzo, attraverso il tappo di gomma. Inserire immediatamente un altro ago pulito nella stessa bottiglia. Ripetere questo passaggio per le altre bottiglie e lasciate scorrere2 N per circa 30 min sostituire l'aria nelle bottiglie di N2.
- Scollegare una bottiglia dalla stazione2 N rimuovendo l'ago corrispondente. Attendere per alcuni secondi fino a quando la pressione nella bottiglia di terreno diminuisce a pressione atmosferica e rimuovere il secondo ago. Ripetere questo passaggio per tutte le bottiglie rimanenti.
Attenzione: Per evitare O2 da immettere nuovamente le bottiglie di terreno di coltura dopo passo 2.1.4, eseguire passaggi 2.1.4 - 2.1.8 in rapida successione. Se tutte le bottiglie non possono essere collegate alla stazione2 N allo stesso tempo, procedere con passaggi 2.1.4-2.1.8 per il primo set di bottiglie e quindi ripetere questi passaggi per le bottiglie rimanenti. - Autoclave le bottiglie. Lasciate raffreddare fino a temperatura ambiente durante la notte e conservarle a temperatura ambiente in seguito.
- Preparare una soluzione di citrato ferrico 10mm aggiungendo 0,245 g di citrato ferrico a 100 mL di acqua distillata deionizzata. Riscaldare e mescolare per sciogliere, fino al giallo all'arancione chiaro soluzione è ottenuta. Autoclave la soluzione utilizzando uno standard ciclo (almeno 15 min di esposizione a 121 ° C) e quindi conservare questa soluzione madre a temperatura ambiente al buio.
- Preparazione del terreno di coltura liquido per AMB-1 e MS-1
- Preparare una soluzione di chinato ferrico di 10 mM. Prima sciogliere 0,19 g di acido chinico in 100 mL di acqua distillata o deionizzata, quindi aggiungere 0,27 g di FeCl3.6h2O. mescolare per sciogliere, fino ad ottenuta una soluzione di rossa, chiara scuro. Sterilizzare in autoclave la soluzione utilizzando un ciclo standard (almeno 15 min di esposizione a 121 ° C).
Nota: Conservare la ferrica soluzione chinato a temperatura ambiente al buio come una soluzione sterile. Scartare la soluzione quando un precipitato diventa evidente. - In un becher contenente 1 L di acqua distillata e deionizzata, aggiungere quanto segue nell'ordine mescolando: 10,0 mL della soluzione di supplemento di vitamina, 5,0 mL della soluzione di integratore minerale traccia, 0,68 g di KH2PO4, 0,848 g del succinato del sodio bibasico esaidrato, 0,575 g di-sodio tartrato diidrato, 0,083 g di sodio acetato triidrato, 0,45 mL di 0,1% Resazurin acquosa, 0,17 g di NaNO3, 0,04 g di acido ascorbico e 3,0 mL della soluzione di riserva chinato di Fe (III) da 10 mM.
Nota: Regolare le quantità proporzionalmente se è necessaria una minore quantità di mezzo di crescita. Per una stazione di2 N capace di bubbling cinque bottiglie allo stesso tempo, come quella costruita nel passaggio 1 del presente protocollo, preparare 300 mL di terreno.
Attenzione: Vitamina, minerali traccia e soluzioni di riserva chinate di Fe (III) devono essere mantenuti sterili. Per evitare contaminazioni, utilizzare una tecnica sterile standard e Puntali sterili durante l'erogazione. Conservare le soluzioni minerali e vitamina in frigorifero a 4 ° C. - Dopo l'aggiunta di tutte le sostanze chimiche, regolare il pH a 6,75 utilizzando la soluzione di NaOH 1 M.
- Fare riferimento alla procedura 2.1.3-2.1.9 per il resto del protocollo.
- Preparare una soluzione di chinato ferrico di 10 mM. Prima sciogliere 0,19 g di acido chinico in 100 mL di acqua distillata o deionizzata, quindi aggiungere 0,27 g di FeCl3.6h2O. mescolare per sciogliere, fino ad ottenuta una soluzione di rossa, chiara scuro. Sterilizzare in autoclave la soluzione utilizzando un ciclo standard (almeno 15 min di esposizione a 121 ° C).
- Preparazione del terreno di coltura semisolido per MSR-1
- Preparate un 0,5 M tampone fosfato soluzione pH 7.0 sciogliendo 3,362 g di K2HPO4 e g 4,178 di KH2PO4 in 100 mL di acqua distillata deionizzata. Controllare se il pH è 7.0 e regolare il pH leggermente con KH2PO4 o NaOH se necessario. Conservare la soluzione in una bottiglia di vetro tappata (preferibile alla plastica al fine di evitare scambio di ossigeno).
- Preparare 100 mL di una soluzione di acido cloridrico 0,02 M. Aggiungere 0,2 g di FeCl2.4h2O questa soluzione e mescolare per sciogliere al fine di ottenere una soluzione di cloruro di ferro di 10 mM. Conservare la soluzione al buio in una bottiglia di vetro tappata.
- Preparare una soluzione di bicarbonato di sodio 0,8 M sciogliendo 6,72 g di NaHCO3 in 100 mL di acqua distillata deionizzata. Conservare la soluzione in una bottiglia di vetro tappata.
- Autoclave le soluzioni preparate in passaggi 2.2.1 - 2.2.3 usando un ciclo standard (almeno 15 min di esposizione a 121 ° C). Memorizzarli come sterile soluzioni di riserva nel buio.
- In un becher contenente 1 L di acqua distillata e deionizzata, aggiungere quanto segue nell'ordine continuando a mescolare: 5 mL della soluzione di integratore minerale traccia, 0,2 mL di soluzione acquosa resazurin 1%, 0,4 g di NaCl, 0,3 g di NH4Cl, 0,1 g di MgSO4.7h2 O, 0,05 g di CaCl2.2h2O, 1 g di sodio succinato, 0,5 g di acetato di sodio, 0,2 g di lievito di estrarre e 1,6 g di agar.
- Coprire il recipiente con carta stagnola e autoclave la soluzione preparata al punto 2.3.5.
- Poco prima della fine del ciclo di autoclave, preparare un fresco 4% L-cysteine· HCl· H2O soluzione sciogliendo 0,8 g di L-cysteine· HCl· H2O in 20 mL di acqua distillata deionizzata. Neutralizzare la soluzione a pH 7.0 con soluzione di NaOH 5m.
Attenzione: è importante che la soluzione di cisteina è preparata fresco per evitare l'ossidazione della cisteina. Conservare la soluzione minerale in frigorifero a 4 ° C. - Dopo la sterilizzazione in autoclave, lasciare raffreddare la media fino a 50 – 60 ° C e portare il becher sotto la fiamma di un becco Bunsen. Rimuovere il foglio di alluminio e aggiungere rapidamente le seguenti in ordine mentre mescolando delicatamente: 0,5 mL di soluzione di vitamine, 2,8 mL di soluzione tampone fosfato sterile stock, 3 mL di soluzione madre di sterile ferro cloruro, 1,8 mL di brodo sterile bicarbonato di sodio soluzione e 10 mL di soluzione di cisteina filtro-sterilizzato.
Nota: Regolare le quantità proporzionalmente se è necessaria una minore quantità di mezzo di crescita. È solitamente conveniente preparare un lotto di 120 mL di terreno.
Attenzione: Tutte le soluzioni devono rimanere sterili per uso futuro. Eseguire il passaggio 2.3.8 utilizzando una tecnica sterile standard e pipetta sterile suggerimenti durante l'erogazione. - Dopo l'aggiunta di tutte le sostanze chimiche, è possibile trasferire il mezzo caldo in provette Hungate di 16 mL tappo a vite sterile. 12 mL di terreno di trasferimento in ogni provetta e sigillare i tubi.
Attenzione: Per evitare contaminazioni, eseguire il passaggio 2.3.9 sotto la fiamma di un becco Bunsen. Eseguire prima l'agar solidifica, mentre il mezzo è a 40 ° C o sopra. - Lasciare riposare i tubi per diverse ore fino a quando l'agar si solidifica e l'OAI diventa apparente, materializzando come una rosa al interfaccia incolore, circa 1 a 3 cm sotto la superficie del mezzo.
Nota: Il mezzo dovrebbe girare lentamente incolore nel tubo. La quantità di tempo necessario per questa transizione è variabile e dipende dalla quantità di O2 inizialmente disciolto nel mezzo.
3. inoculazione di MTB
Nota: Le colture di ceppi AMB-1, MS-1 e MSR-1 possono essere ottenute in commercio (Tabella materiali).
Attenzione: Eseguire le seguenti operazioni in condizioni sterili, sotto la fiamma di un becco Bunsen.
- Inoculazione di ceppi MSR-1, AMB-1 e MS-1 in mezzo liquido
- Sigillare una bottiglia di siero vuoto 125 mL con un tappo di gomma butilica e un sigillo di alluminio a crimpare. Inserire due aghi in bottiglia attraverso il tappo e collegare una siringa preparata come 1.7 passaggio ad uno di loro. Collegare la siringa in un cilindro di O2 attraverso lo stesso tipo di tubazione come quello utilizzato per la stazione di2 N.
- Lasciate che attraversa2 O la bottiglia per circa 30 min, per garantire che tutta l'aria nella bottiglia è sostituito da O2. Rimuovere entrambi gli aghi, consentendo una leggera sovrapressione in bottiglia e quindi autoclave. Consentire la bottiglia raffreddare a temperatura ambiente prima dell'uso.
Nota: Per risparmiare tempo, eseguire i passaggi 3.1.1 e 3.1.2 durante la preparazione media e autoclave la bottiglia con il mezzo o le soluzioni di riserva. - Sterilizzare le cime dei tappi di sia il fresca bottiglia e la bottiglia di2 O applicando alcune gocce di soluzione di etanolo 70% sopra di essi e passarli attraverso la fiamma di un becco Bunsen.
- Utilizzando un ago e una siringa sterile, estrarre 1 mL O2 dalla bottiglia O2 e trasferirlo nella bottiglia media fresca. Assicurarsi che l'ago sia strettamente sulla siringa durante questo passaggio per evitare qualsiasi aria nella siringa.
- Se si utilizza l'inoculo da un'altra cultura cresciuta in una bottiglia di vetro, sterilizzare i tappi il fresca bottiglia media sia il più vecchio flacone di coltura applicando alcune gocce di soluzione di etanolo 70% sopra di essi e passarli attraverso la fiamma di un becco Bunsen. Se si utilizza l'inoculo da un tubo della cultura congelato, basta lasciarlo caldo fino a temperatura ambiente con il tubo sigillato sotto la fiamma di un becco Bunsen.
- Se si utilizza l'inoculo da un'altra cultura cresciuta in una bottiglia di vetro, inoculare 1 mL della cultura più anziane nel medium fresco. Se si utilizza l'inoculare da azione congelate, inoculare solo 0,1 mL per diluire il glicerolo o dimetil solfossido (DMSO) utilizzato nel processo di congelamento. In entrambi i casi, utilizzare un ago sterile e una siringa sterile.
- Incubare la coltura a 32 ° C ed e inoculare in mezzo fresco dopo 4-7 giorni.
- Inoculazione di MSR-1 in mezzo semi-solido gradiente di O2
- Verificare che il tubo di mezzo fresco Visualizza un ben definito OAI, materializzata da una rosa di interfaccia incolore.
- Se l'inoculo è proveniente da un altro O2 gradiente di concentrazione semi-solida cultura, raccogliere i batteri di pipettaggio 50 µ l della cultura con una pipetta sterile messo sulla band formata dai batteri. Inoculare lentamente questi batteri a OAI nel medium fresco (Rosa/incolore interfaccia), evitando di disturbare l'interfaccia. Se l'inoculo è proveniente da una cultura congelata, procedere nello stesso modo con 100 µ l di inoculo invece.
- Sigillare il tubo e lasciare che i batteri crescono tra i 25 ° C e 30 ° C. Trasferimento in mezzo fresco utilizzando la stessa procedura prima della band di batteri raggiunge la superficie del mezzo.
4. osservazione dei batteri
- Sterilizzare il tappo della bottiglia cultura applicando la soluzione di etanolo 70% su di esso e facendolo passare attraverso la fiamma di un becco Bunsen. Per mezzo di semi-solido, aprire il tubo sotto la fiamma di un becco Bunsen. Usare un ago sterile e una siringa sterile per estrarre i batteri.
- Uso l'impiccagione drop metodo8 per garantire che i batteri sono magnetici e motili.
Nota: Microscopia di contrasto di fase dà grandi risultati, ma non è obbligatoria. Ingrandimenti compresi tra 10 X 60 X sono adatti. - Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) consente di osservare la struttura delle cellule e la magnetosomes in dettaglio8.
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Representative Results
Corretta preparazione dei media crescita può essere valutato come segue. Alla fine del processo, soluzioni chiare (cioè., privo di qualsiasi precipitato) dovrebbe essere ottenuta (questo è vero sia per mezzi liquidi e la coltura di semi-solido gradiente O2 ). Un'immagine di visualizzazione l'aspetto previsto del mezzo liquido MSR-1 prima inoculazione può essere visto nella Figura 2a. Un successo mezzo semi-solido di O2 gradiente di concentrazione viene segnalato dalla formazione di un OAI dopo poche ore, indicata dalla presenza di 1 – 3 cm di rosa medio nella parte superiore del tubo (Figura 3, tubo A). Il resto del mezzo dovrebbe essere incolore. Un mezzo di tutti-rosa prima inoculazione è un segno di ossidazione completa del resazurin e quindi di una preparazione riuscita del gradiente di concentrazione di O2 .
Crescita di successo in mezzo liquido può essere controllata circa 48 h dopo l'inoculazione (o dopo pochi giorni se l'inoculo è venuta da una cultura congelata) semplicemente esaminando le culture per torbidità utilizzando una sorgente di luce o uno spettrofotometro. Crescita di successo è confermata dalla torbidità dimostrando che i batteri sono effettivamente cresciuti (Figura 2b). Se il mezzo rimane chiaro dopo 48 h, è possibile che i batteri non sono cresciuti. Per una coltura media liquida cresce normalmente, la presenza di batteri di sintetizzare magnetosomes può essere controllata dopo 48 h, posizionando la bottiglia del mezzo su una piastra magnetica e illuminando con una torcia elettrica. A una bassa velocità di agitazione, il mezzo dovrebbe "flash", guardando alternativamente più scuro e più luminoso a seconda dell'orientamento del magnete agitazione rispetto alla posizione della sperimentalista. Per una cultura non-magnetico, l'intensità della luce diffusa dalle cellule verso lo sperimentalista rimarrà costante.
Crescita di successo in mezzo semi-solido è indicata dalla formazione di una banda di microaerofili di batteri all'interfaccia Rosa/incolore. A causa del consumo di O2 dai batteri e i cambiamenti nella sfumatura O2 , la band migrerà lentamente per seguire l'OAI (Figura 3, tubo B).
L'impiccagione drop metodo consente all'osservatore di controllare che i batteri sono magnetici e motili. Dopo pochi minuti, MTB dovrebbe concentrarsi al bordo della goccia d'attaccatura, dimostrando che essi attivamente nuotare lungo le linee di campo magnetico (Figura 4a). Per garantire che le cellule sono magnetiche, capovolgere l'orientamento del magnete seduto accanto a goccia. I batteri dovrebbero iniziare nuoto verso il bordo opposto (Figura 4b). Infine, la forma della magnetosomes può essere controllata con TEM. Cristalli di cuboctahedral di circa 30 – 45 nm di diametro dovrebbe essere osservato9. Questi cristalli sono normalmente disposti in una lunga catena o catene multiple più brevi nelle specie studiate qui (Figura 5).
Figura 1 : Illustrazione di N2 stazione di gassazione. (a) rappresentazione schematica. (b) foto del setup. Modo che l'estremità del tubo sottile descritto in passaggio 1,9 del protocollo rimane immerso nel mezzo durante la fase di bubbling del gas, una stazione di successo avrà la lunghezza appropriata del tubo grande e sottile. Il flusso di gas deve essere anche regolabile in ogni momento, per garantire che tutti i O2 è stato rimosso e che il mezzo non si rovesci. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Bottiglie di liquido di coltura prima e dopo l'inoculazione. (un) Clear MSR-1 medium prima dell'inoculazione. (b) torbido MSR-1 medio dopo 3 giorni di crescita di successo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Tubi di O2 gradiente medio semi-solido prima (tubo A) e 10 giorni dopo l'inoculazione (metropolitana B). La band di batteri in tubo B è indicata da una freccia rossa.
Figura 4 : I risultati tipici di una goccia di sospensione sperimentare alle 20 X ingrandimento utilizzando la microscopia di contrasto di fase. (un) MTB nuotare verso il polo sud di un magnete e si accumulano all'interfaccia aria/liquido. (b) 1 min dopo l'inversione del magnete, la maggior parte delle cellule hanno lasciato il campo di vista.
Figura 5 : Osservazione del TEM di una cellula di AMB-1. Magnetosoma catene sono indicate dalle frecce rosse. I due flagelli sono indicati da frecce nere.
Complementare nella tabella 1. Per favore clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
I requisiti specifici di O2 concentrazione di MTB li rendono banale a crescere in laboratorio. Un passaggio chiave del protocollo per mezzo liquido è la rimozione iniziale di tutti i O2 dal mezzo al fine di controllare la concentrazione finale aggiungendo un volume determinato di O2, appena prima dell'inoculazione. È stato dimostrato che MSR-1 cresce in condizioni aerobiche quasi completamente, tuttavia, il magnetismo delle cellule è drasticamente ridotto. I risultati dello stesso studio ha mostrato che ceppi AMB-1 e MS-1 non crescono in condizioni aerobiche completamente6. Per la cultura semi-solida di MSR-1, tutti i O2 prima è ridotta dalla soluzione di cisteina e poi appare il gradiente di concentrazione di O2 , che porta alla formazione dell'OAI. Se una cultura non cresce bene o non è magnetica, la concentrazione di O2 dovrebbe essere la prima cosa da controllare.
Terreno di coltura semisolido è una scelta interessante per isolare MTB sconosciuto o crescere le specie che sono altamente sensibili ad entrambi gradienti di O2 e redox, come assicura l'esistenza di gradienti stabile e permette ai batteri di posizionarsi a la posizione che offre le migliori condizioni di crescita. Mezzo liquido è più comodo lavorare con quando sono necessari maggiori volumi (ad es., per estrazione del DNA), o quando un'ulteriore analisi deve essere condotto sulle cellule (ad es., magnetosoma studi) quanto consente una più facile separazione delle cellule da il mezzo di crescita. L'agar-agar in mezzo semi-solido infatti potrebbe interferire con la cella di raccolta tecnica.
In alcune culture, le cellule diventano a volte non motili, probabilmente a causa di mutazioni spontanee. Le cellule non-motile sopravvivono e crescono nel mezzo di crescita dal momento che non hanno bisogno di nuotare per trovare sostanze nutritive necessarie per la loro sopravvivenza. La pista standard metodo10 consente quindi di recuperare una cultura motile, dal momento che solo le cellule mobili possono nuotare verso il basso il percorso di gara. La perdita del fenotipo magnetico può accadere anche nella cultura anche se la concentrazione di O2 è ottima, nuovamente a causa di mutazioni spontanee11. La soluzione migliore in questo caso è per iniziare una nuova cultura inoculando congelata scorte dei batteri selvaggio-tipo in mezzo fresco. In alternativa, la tecnica di pista può anche permettere il recupero di una cultura magnetico.
È essenziale per evitare la contaminazione della cultura da parte di altri organismi e pertanto la maggior parte del protocollo devono essere eseguita usando tecniche sterili. Manipolazione sotto la fiamma di un becco Bunsen di solito dà risultati soddisfacenti nel mantenere condizioni asettiche. Tuttavia, se la cultura è cresciuta in un ambiente soggetto a contaminazione, ulteriori precauzioni, ad esempio lavorando in una cappa a flusso laminare, quando si prepara il mezzo e inoculare i batteri. Si deve osservare che il rischio di contaminazione è maggiore in mezzo semi-solido, come i tubi devono essere aperte ogni volta che le cellule sono rimosse.
Questi protocolli consentono la crescita di abbastanza batteri per eseguire diversi tipi di esperimenti, quali gli studi di fisici basati su microscopia ottica12,13, microscopia elettronica imaging14,15, Raggi x Gregoratti analisi16, genomica e proteina studi17,18. Se necessario, più alte concentrazioni di batteri in sospensione possono essere realizzate mediante centrifugazione. Inoltre, magnetosomes può essere estratto e purificato per ulteriori applicazioni da palline delle cellule o sospensioni di cellule denso ottenute mediante centrifugazione19.
Crescita media formulazioni sono solitamente basate sugli stessi principi direttivi (Vedi supplementari nella tabella 1 per un riepilogo della lista del ruolo di ogni componente nei media crescita descritto qui). Una fonte di carbonio deve essere disponibile per i batteri, tramite acidi organici (ad es., succinato, acetato, tartrato, lattato) o composti inorganici come il bicarbonato. La scelta di una fonte di carbonio adatto dipende il metabolismo dei batteri. Azoto presente nel DNA e proteine e fosforo (DNA, membrane) sono necessario e forniti da NaNO3, NH4Cl e KH2PO4 nelle ricette descritte qui. Un buffer (HEPES, tampone fosfato) è necessario per resistere alle variazioni di pH. La soluzione di integratore minerale traccia contiene cofattori degli enzimi e le vitamine possono essere utilizzate dai batteri come coenzimi o come gruppi funzionali per alcuni enzimi. Peptone di fagiolo di soia e di Estratto di lievito forniscono una fonte di aminoacidi e sali utilizzati per la produzione di proteine. Poiché MTB sono redox sensibili, uno o più agenti riducenti spesso deve essere aggiunta al medium (ad es., cisteina, acido ascorbico, lattato). Delle principali fonti di ferro (ad es., citrato ferrico, cloruro ferrico chinato, stirare) è necessario in media per biomineralization. Infine, una piccola quantità di O2 è necessaria per i batteri microaerofili come accettore terminale di elettroni. Obbligare anaerobica uso MTB altri composti quali nitrato o protossido di azoto invece.
La principale limitazione di questi protocolli è che non esiste alcuna garanzia che funzionerà anche per altre specie di MTB. Ceppi di AMB-1, MS-1 e MSR-1 sono MTB tutta l'acqua e pertanto le ricette descritte in questo articolo non possono essere usate per coltivare Marina magnetospirilla come Magnetospira thiophila ceppo MMS-1, ceppo Magnetospira QH-2 o altri MTB marine, che richiedono le più alte concentrazioni di sale. Tuttavia, per far crescere altri ceppi di MTB e per l'isolamento di nuovi ceppi, i metodi generali presentati in questo articolo per media semi-solidi e liquidi utilizzabile per preparare il supporto con diverse ricette.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Richard B. Frankel per il suo aiuto con MTB culture, Adam P. Hitchcock e Xiaohui Zhu per il loro supporto durante la configurazione delle culture MTB presso la McMaster University e Marcia Reid per la formazione e l'accesso alla struttura di microscopia elettronica (McMaster University, Facoltà di Scienze della salute). Questo lavoro è stato supportato da scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio del Canada (NSERC) e la US National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AMB-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 700264 | |
| MS-1 | ATCC | ATCC 31632 | |
| MSR-1 | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) | DSM 6361 | |
| Ferric citrate | Sigma-Aldrich | F3388-250G | |
| Trace mineral supplement | ATCC | MD-TMS | |
| KH2PO4 | EMD | PX1565-1 | |
| MgSO4.7 H2O | EMD | MX0070-1 | |
| HEPES | BioShop Canada Inc | HEP001.250 | |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | S5506-250G | |
| Yeast extract | Fischer scientific | DF210929 | |
| Peptone | Fischer scientific | DF0436-17-5 | |
| Potassium L-lactate solution (60%) | Sigma-Aldrich | 60389-250ML-F | |
| D-(-)-Quinic acid | Sigma-Aldrich | 138622 | |
| FeCl3.6H2O | Fischer scientific | I88-100 | |
| Vitamin supplement | ATCC | MD-VS | |
| Sodium succinate hexahydrate | Fischer scientific | S413-500 | |
| Sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729-100G | |
| Sodium acetate trihydrate | EMD | SX0255-1 | |
| Resazurin | Difco | 0704-13 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| K2HPO4 | Caledon | 6620-1-65 | |
| FeCl2 .4H2O | Sigma-Aldrich | 44939-250G | |
| Sodium bicarbonate | EMD | SX0320-1 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| NH4Cl | EMD | 1011450500 | |
| CaCl2.2 H2O | EMD | 1023820500 | |
| Agar A | Bio Basic Canada Inc | FB0010 | |
| L-cysteine.HCl.H2O | Sigma-Aldrich | C7880-100G | |
| 1.0 mL syringes | Fischer scientific | B309659 | |
| 25G x 1 needles | BD | 305125 | |
| 125 mL serum bottles | Wheaton | 223748 | |
| 20 mm aluminum seals | Wheaton | 224223-01 | |
| 20mm E-Z Crimper | Wheaton | W225303 | |
| Butyl-rubber stoppers | Bellco Glass, Inc. | 2048-11800 | |
| Hungate tubes | Chemglass (VWR) | CLS-4208-01 | |
| Septum stopper, 13mm, Hungate | Bellco Glass, Inc. | 2047-11600 | |
| Glass culture Tubes | Corning (VWR) | 9826-16X | |
| Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 11.6 - 12 N |
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