Summary
우리는 성장 하는 두 가지 유형의 성장 매체에서 Magnetospirillum 의 여러 변종에 대 한 절차를 제시. MSR-1 Magnetospirillum gryphiswaldense 긴장은 성장 액체와 O2 농도 기온 변화도에 반 고체 미디어 M. magneticum AMB 1 긴장과 M. magnetotacticum 변형 MS-1 액체 매체에서 성장 하는 동안.
Abstract
Magnetotactic 박테리아는 그람 음성, 운동, 주로 수생 원핵생물 유비 쿼터 스 담 수 및 해양 서식 지에서. 그들은 biomineralize magnetosomes는 자석 나노미터 크기의 결정의 자 철 광 (철3O4) 또는 greigite (Fe3S4) 내 지질 bilayer 막으로 둘러싸여 있는 그들의 능력에 의해 특징은 그들의 세포질입니다. 대부분 알려진된 magnetotactic 박테리아, magnetosomes 체인 함으로써 셀에 영구 자석 쌍 극 자 모멘트를 부여 하 고 수 동적으로 외부 자기장에 맞게 그들을 일으키는 원인이 되는 세포질 내에 조립 된다. 이 특정 기능으로 인해 magnetotactic 박테리아 상업 및 의료 응용 프로그램에 대 한 큰 잠재력이 있다. 그러나, 대부분의 종은 microaerophilic 이며 특정 O2 농도 요구, 그들 더 어렵게 대장균등 다른 많은 박테리아 보다 정기적으로 성장 하. 여기 선물이 3 Magnetospirillum속에 속하는 모든 magnetotactic 박테리아의 가장 널리 공부 긴장의 성장에 대 한 상세한 프로토콜. 이러한 방법을 이용할 박테리아, 그들은 일반적으로 성장 하 고 합성 magnetosomes 있도록 O2 농도의 정확한 제어를 위한 수 있습니다. 이 절차를 사용 하 여 추가 연구 magnetotactic 박테리아 성장 미생물학에 전문가 experimentalist이 필요 하지 않습니다. 비록 그것이 성장 미디어 화학 성분 수정 될 필요가 있을 것 이다 가능성이이 문서에 제공 된 일반 방법 또한 분리 하 고 다른 magnetotactic 박테리아 문화 사용할 수 있습니다.
Introduction
Magnetotactic 박테리아 (MTB) 그람 음성 원핵생물 담 수 및 해양 수 중 서식 지1에서 유비 쿼터 스의 넓은 범위를 나타냅니다. 대부분의 경우는 셀 안에 체인으로 조립에 있는 자 철 광 (철3O4) 또는 greigite (Fe3S4), 자기 결정을 생산 하는 능력을 공유 하는 이러한 박테리아. 이 특정 구조상 주제 및 각 크리스탈2를 포위 하는 지질 막에 박테리아의 세포질에서 둘 다 행동 몇 가지 특정 단백질의 존재 때문 이다. 각 개별 크리스탈과 그 주변 막 소포는 magnetosome 이라고 하며 크기는 약 30에서 50에 이르기까지 Magnetospirillum 종3nm. Magnetosomes의 체인 배열 때문에 이러한 박테리아 그들 정렬 수 동적으로 외부에서 인가 되는 자기장은 영구 자석 쌍 극 자 모멘트를 소유한 다. 따라서, 이러한 박테리아 적극적으로 행동 하는 자기 추진된 마이크로-나침반을 아마도 효과적으로 찾아 가장 유리한 조건으로 자기장 라인을 따라 수영 (예., O2 농도) 성장을 위한.
MTB의 재미 있는 재산 모두 화학 및 그들의 magnetosome 결정의 결정학 그들의 능력입니다. 대부분 종자 생산의 자 철 광 또는 greigite, 상대적으로 고 순도 결정 몇몇 biomineralize 모두 미네랄4. 모든 경우에, 박테리아는 크기와 그들의 단일 마그네틱 도메인 결정의 모양을 정확 하 게 제어할 수 있습니다. 이 MTB이 biomineralization 프로세스를 수행 하는 방법의 더 나은 이해를 개발 하기 위해 연구의 큰 금액은 착수 하는 왜 설명 한다. 이 프로세스를 이해을 재단사-마그네틱 나노 많은 상업 및 의료 응용 프로그램에 대 한 연구 수 있습니다.
MTB에 대 한 광범위 한 연구에 상당한 장애물이 실험실에서 성장 하는 그들의 어려움을 하고있다. 대부분,이 작품에 사용 된 긴장을 포함 하 여 종은 obligately microaerophilic O2 터미널 전자 수락자로 성장 하는 때 이다. 이 이러한 박테리아 oxic 무산 소 조건 (oxic 무산 소 인터페이스 오) 사이의 전이 영역에서 가장 자주 발견 왜 설명 한다. 이 명확 하 게 MTB 분명히 이러한 생물에 대 한 성장 매체를 고안 하는 때 고려 될 필요가 있는 정확한 O2 농도 요구 보여줍니다. 또한, MTB의 위대한 기존 다양성 다른 긴장 다른 유형의 화학 기온 변화도 및 최적의 성장을 달성 하기 위해 영양분 필요 합니다 의미 합니다.
이 작품에서는, 우리는 성장 하는 가장 널리 공부 MTB의 3 방법을 설명: Magnetospirillum magneticum (스트레인 자녀-1), M. magnetotacticum (MS-1)와 M. gryphiswaldense (MSR-1). 이러한 종 phylogenetically Proteobacteria 문에서 Alphaproteobacteria 클래스에 속하고, 형태학에 헬리컬 있으며 셀의 각 끝에 극 지 편 소유. 우리는 변형 MSR-1 액체와 O2 농도 기온 변화도 세미 솔리드 미디어, 이전에 게시 중간 조리법5,6에 따라 성장에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 우리는 또한 수정된 자석 Spirillum 성장 매체 (MGSM)7에 성장 하는 자녀-1와 MS 1 긴장 상세한 프로토콜을 제시.
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Protocol
1. 설치 N2 역
참고: 최소 누설 가스 탱크에 연결 될 수 있으며 1 mL 플라스틱 주사기의 실린더는 밀접 하 게이 튜브에 맞는 튜브의 내부 직경을 선택 합니다. 가스 역 완벽 한 N2 의 그림은 그림 1에 제공 됩니다.
- 안전 하 게 설치에 충분 한 공간이 N2 역 (약 50 cm의 길이)을 설정 하는 벤치에 가까운 N2 가스 탱크.
- 역 건설 될 지역에 도달 충분히 튜브의 조각 탱크에 연결 합니다. 필요한 경우, 어떤 누설을 방지 하기 위해 탱크의 출력에 테 플 론 테이프를 적용 합니다.
- 동시에 역 중간의 버블링 5 병의 능력을 구축, 길이 약 5 cm의 튜빙의 4 조각 잘라.
- 3 3 방향 T-모양의 플라스틱 피팅 라인에 배관의 조각을 조립. 여분의 T-모양의 피팅을 통해 N2 탱크의 출력에서 튜브의 조각에이 라인의 한쪽 끝을 연결 합니다. 90 ° 팔꿈치 피팅 다른 끝에 추가 합니다.
- 수평 금속 막대 구조를 연결할 사용 테이프는 벤치 위에 약 30 cm 배치.
- 튜빙 (길이 약 20 cm) 단계 1.4에서 설치 피팅 무료 출력의 5 개를 연결 합니다.
- 5 1.0 mL 플라스틱 주사기에서 피스톤을 제거 하 고 이러한 주사기의 더 큰 끝을 잘라 (즉., 반대 측 바늘), 졸업된 부분만 유지. 면, 너무 밀접 하 게 이러한 주사기를 채우십시오.
- 튜빙의 20 cm 긴 수직 조각에 주사기를 삽입 하 고 N2 흐르는 때 누설을 비눗물을 사용 합니다.
- 5 25 G 바늘 (0.5 m m x 25 m m)의 모자를 제거 하 고 얇은 튜브 10 cm 조각으로이 바늘을 삽입. 바늘 튜브에 밀접 하 게 맞는 확인 하십시오.
주의:이 단계 동안 찔 러의 위험이 있다. 그렇게 천천히, 그리고 신중 하 게. - 준비 단계 1.9에서 N2 역의 주사기 바늘을 연결 합니다. N2 모든 5 개의 라인을 통해 흐르는 지 확인 하 고 대기중에 역을 유지.
2. 성장 매체 준비
참고: 그것은 2.1.2, 2.2.2 2.3.8 단계에 설명 된 대로 준비, 매체의 크기를 조정할 수 있습니다. 물과 화학 물질의 양을 비례 조정 그냥 요구를 사용. 모든 중간 부품의 역할은 보조 표 1에 설명 되어 있습니다.
- MSR-1 액체 성장 매체의 준비
- 이온을 제거 된 증류수 100 mL에 제 2 철 구 연산 염의 0.245 g를 추가 하 여 10 m m 제 2 철 구 연산 염 해결책을 준비 합니다. 가 열 하 고 솔루션을 얻은 분명 오렌지에 노란색까지 해산 저 어. 오토 클레이 브는 표준을 사용 하 여 솔루션 (121 ° C에 적어도 15 분 노출)를 주기 고 어둠 속에서 실 온에서이 재고 솔루션을 저장 합니다.
참고: 때는 침전 되 고 명백한 제 2 철 구 연산 염 해결책을 삭제 합니다. - 비 커에 교 반 하면서 순서 대로 다음 추가 포함 하는 이온을 제거 된 증류수 1 L: 1.0 mL 추적 미네랄의 보완 솔루션, KH2포4의 0.1 g, MgSO4.7 H2O의 0.15 g, HEPES, 2.38 g 나노3 의 0.34 g 0.1 g의 효 모 추출 물, 콩 콩 펩의 3.0 g 칼륨 젖 산 염 (60 %w / w 솔루션) 및 10 m m Fe(III) 시트르산 재고 솔루션의 5 mL 4.35 mL.
참고: 성장 매체의 작은 금액은 필요한 경우 수량을 비례적으로 조정 합니다. 이 프로토콜의 1 단계에서에서 만든 것과 같은 동시에 버블링 5 병 수 역 N2 에 대 한 매체의 300 mL를 준비 합니다.
주의: 추적 미네랄 및 Fe(III) 시트르산 재고 솔루션 무 균 유지 될 필요가. 오염 방지, 그들 (분 젠 버너를 사용 하 여 병의 불꽃 오픈 정상)을 사용 하는 경우 표준 무 균 기술을 사용 하 여 사용 하 살 균 피 펫 팁 분배 합니다. 4 ° c.에 냉장고에는 미네랄 솔루션 저장 - 모든 화학 제품의 추가 후 1m NaOH 솔루션 7.0에 pH를 조정 합니다. 갓된 매체 125 mL 혈 청 병으로 분배. 각 병에는 중간의 60 mL를 붓으십시오.
- 버블 N2 용된 O2를 제거 하려면 30 분 중간에, 작은 튜브를 사용 하 여 1 단계에에서 설명 된 N2 역에 연결 됩니다. 병 종료를 초과 하는 가스를 수 있도록 작은 개통을 두고 각 병 위에 부 틸 고무 마 개를 놓습니다.
주의: N2버블링 하는 동안 거품 형성 수 있습니다. 거품 생산을 피하기 위해 가스 흐름을 적절 하 게 조정 합니다. - 주름 각 병 준비 스 토퍼와 알루미늄 인감 인감. 알루미늄 인감 병 프로토콜의 나머지 기간 동안 봉인 유지 보장 합니다.
- N2 역에서 바늘과 얇은 튜브를 분리 하 고 깨끗 한 바늘 (1 인치, ≤ 23 G)와 함께 그들을 대체. 가스의 부드러운 연속 흐름 종료 (약 50 mL/min) 탱크 N2 탱크의 밸브를 조정 합니다.
참고: 바늘 23 G 보다 큰 마 개에 영구 unsealable 구멍을 떠날 수 있습니다. - 고무 마 개를 통해 매체의 병에 N2 탱크에 연결 된 바늘 중 하나를 삽입 합니다. 즉시 동일한 병에 다른 깨끗 한 바늘을 삽입 합니다. 다른 병에 대 한이 단계를 반복 하 고 약 30 분 N2에 의해 병에 공기를 대체 하기 위하여 N2 흐름을 보자.
- 해당 주사 바늘을 제거 하 여 N2 역에서 한 병을 분리 합니다. 대기 압력 매체의 병에 압력 감소 때까지 몇 초 동안 기다립니다 고 두 번째 바늘을 제거 합니다. 나머지 모든 병에 대 한이 단계를 반복 합니다.
O2 단계 2.1.4 후 성장 매체의 병을 다시 입력 하지 않도록 주의: 단계 2.1.4-2.1.8 빠른 승계에서 수행 합니다. 모든 병은 N2 역에 동시에 연결할 수 없습니다, 병의 첫 번째 집합에 대 한 단계 2.1.4-2.1.8와 함께 진행 하 고 나머지 병에 대 한 다음이 단계를 반복. - 오토 클레이 브는 병. 하룻밤 실 온까지 멋진 그들을 보자 그리고 이후에 그들을 상 온에서 저장.
- 이온을 제거 된 증류수 100 mL에 제 2 철 구 연산 염의 0.245 g를 추가 하 여 10 m m 제 2 철 구 연산 염 해결책을 준비 합니다. 가 열 하 고 솔루션을 얻은 분명 오렌지에 노란색까지 해산 저 어. 오토 클레이 브는 표준을 사용 하 여 솔루션 (121 ° C에 적어도 15 분 노출)를 주기 고 어둠 속에서 실 온에서이 재고 솔루션을 저장 합니다.
- 자녀 1 및 MS-1 액체 성장 매체의 준비
- 10 m m 제 2 철 quinate 솔루션을 준비 합니다. 먼저 0.19 g quinic 산 이온 증류수 100 mL에의 해산 다음 FeCl3.6H2를 해산, 어두운 빨간색, 명확한 솔루션을 얻을 때까지 저 어 오 0.27 g를 추가 합니다. 표준 사이클 (121 ° C에 적어도 15 분 노출)를 사용 하 여 솔루션 압력솥.
참고: 균 재고 솔루션으로 어둠 속에서 실 온에서 제 2 철 quinate 솔루션을 저장 합니다. 때는 침전 되 고 확실 한 솔루션을 삭제 합니다. - 비 커에 교 반 하면서 순서 대로 다음 추가 포함 하는 이온을 제거 된 증류수 1 L: 비타민 보충 솔루션의 10.0 mL, 추적 미네랄 보충 솔루션, KH2포4, 염기 나트륨 호박의 0.848 g의 0.68 g의 5.0 mL hexahydrate, 디 나트륨 주석산이 수화물, 나트륨 아세테이트 안, 0.1%의 0.45 mL의 0.083 g의 0.575 g 수성 Resazurin, 나노3, 0.04 g 의약품 및 10 m m Fe(III) quinate 재고 솔루션 3.0 mL 0.17 g.
참고: 성장 매체의 작은 금액은 필요한 경우 수량을 비례적으로 조정 합니다. 이 프로토콜의 1 단계에서에서 만든 것과 같은 동시에 버블링 5 병 수 역 N2 에 대 한 매체의 300 mL를 준비 합니다.
주의: 비타민, 추적 미네랄과 Fe(III) quinate 재고 솔루션 살 균 보관을 해야 합니다. 오염 방지를 사용 하 여 표준 메 마른 기술 및 소독 피 펫 팁 분배 때. 4 ° c.에 냉장고에는 미네랄과 비타민 솔루션 저장 - 모든 화학 제품의 추가 후에 6.75 1m NaOH 솔루션을 사용 하 여 pH를 조정 합니다.
- 프로토콜의 나머지 부분에 대 한 단계 2.1.3-2.1.9를 참조 하십시오.
- 10 m m 제 2 철 quinate 솔루션을 준비 합니다. 먼저 0.19 g quinic 산 이온 증류수 100 mL에의 해산 다음 FeCl3.6H2를 해산, 어두운 빨간색, 명확한 솔루션을 얻을 때까지 저 어 오 0.27 g를 추가 합니다. 표준 사이클 (121 ° C에 적어도 15 분 노출)를 사용 하 여 솔루션 압력솥.
- MSR-1 반 고체 성장 매체의 준비
- K2HPO4 3.362 g와 KH2포4 이온 증류수 100 mL에의 4.178 g을 용 해 하 여 0.5 M 인산 염 버퍼 솔루션 pH 7.0을 준비 합니다. PH 7.0 인지 확인 하 고 KH2포4 와 NaOH 필요한 경우 약간 pH를 조정. 밀폐 유리병 (산소 교류를 피하기 위해 플라스틱 바람직)에서 솔루션을 저장 합니다.
- 100 mL 0.02 M 염 솔루션의 준비. 이 솔루션에 FeCl2.4H2O의 0.2 g을 추가 하 고 10 m m 철 염화 물 해결책을 얻기 위하여 해산 저 어. 밀폐 유리병에 어둠 속에서 솔루션을 저장 합니다.
- 6.72 g NaHCO3 이온 증류수 100 mL에 용 해 하 여 0.8 M 탄산 솔루션을 준비 합니다. 밀폐 유리병에 솔루션을 저장 합니다.
- 고압 솔루션 단계 2.2.1-표준 주기 (121 ° C에 적어도 15 분 노출)를 사용 하 여 2.2.3에서에서 준비. 어둠 속에서 그들로 살 균 재고 솔루션 저장 합니다.
- 비 커에 교 반 하면서 순서 대로 다음 추가 포함 하는 이온을 제거 된 증류수 1 L: 추적 미네랄 보충 솔루션 1% 수성 resazurin 솔루션, 0.4 g의 NaCl, NH4Cl, MgSO4.7H2의 0.1 g의 0.3 g의 0.2 mL의 5 mL O, CaCl2.2H2O, 1 g의 나트륨 호박, 0.5 g의 나트륨 아세테이트, 0.2 g의 효 모 추출의 0.05 g, 한 천의 1.6 g.
- 알루미늄 호 일 및 고압 솔루션 단계 2.3.5에서에서 준비 비 커를 커버.
- 바로 압력솥 사이클의 끝 전에 준비 신선한 4 %L-cysteine· HCl· L-cysteine·의 0.8 g을 용 해 하 여 H2O 솔루션 HCl· H2O 이온 증류수 20 ml. 5 M NaOH 솔루션 pH 7.0에 솔루션을 무력화.
주의: 시스테인 솔루션은 cysteine의 산화 방지에 신선한 준비는 중요 하다.입니다. 4 ° c.에 냉장고에는 미네랄 솔루션 저장 - 압력가 마로 소독, 후 50-60 ° c 중간 식 고 분 젠 버너의 불꽃에서 비 커를가지고. 알루미늄 호 일을 제거 하 고 신속 하 게 부드럽게 저 어 하는 동안에 다음을 추가: 비타민 솔루션, 2.8 mL의 멸 균 인산 염 버퍼 재고 솔루션, 메 마른 철 염화 재고 솔루션, 살 균 탄산 주식의 1.8 mL의 3 mL의 0.5 mL 솔루션 및 필터 소독 시스테인 솔루션의 10 mL
참고: 성장 매체의 작은 금액은 필요한 경우 수량을 비례적으로 조정 합니다. 매체의 120 mL의 배치를 준비 하는 일반적으로 편리 하다.
주의: 모든 솔루션 미래 사용을 위해 무 균 유지 되어야 합니다. 수행 단계 2.3.8 표준 메 마른 기술 및 소독 피 펫을 사용 하 여 팁을 분배 하는 경우. - 모든 화학 제품의 추가 후 16 mL 살 균 스크류 캡 Hungate 튜브로 따뜻한 매체를 전송. 각 관으로 매체의 12 mL를 전송 하 고 튜브 인감.
주의: 오염을 방지 하려면 단계 2.3.9 분 젠 버너의 불꽃에서 수행 합니다. 전에 agar 굳은, 매체는 40 ° C 이상 수행 합니다. - 튜브는 agar 고형화 하 고는 오 된다 명백한, 무색 인터페이스, 매체의 표면 아래 약 1 ~ 3 cm에 분홍색으로 구체화 될 때까지 몇 시간 동안 그대로 둡니다.
참고: 매체 튜브에 무색 차례 천천히 해야 합니다. 이 전환에 필요한 시간의 양을 변수 이며 처음 매체에 녹아 있는 O2 의 금액에 따라 달라 집니다.
3입니다. MTB의 접종
참고: 긴장, 자녀-1 MS-1 및 MSR-1의 문화는 상업적으로 얻을 수 있습니다 (자료 테이블).
주의: 무 균 조건, 분 젠 버너의 화 염에에서 모든 다음 단계를 수행 합니다.
- MSR-1, 자녀-1 MS 1 변종 액체 매체에서의 접종
- 부 틸 고무 마 개 및 알루미늄 주름 인감 빈 125 mL 혈 청 병을 봉인. 마 개를 통해 병에 두 바늘을 삽입 하 고 그들 중 하나를 단계 1.7에서 준비 하는 주사기를 연결. O2 N2 역 사용으로 배관의 같은 종류의 실린더에 주사기를 연결 합니다.
- 병에 모든 공기 O2로 대체 됩니다 것을 보장 하기 위해 약 30 분, 병을 통해 O2 흐름을 보자. 병 그리고 압력솥에서 약간의 압력에 대 한 수 있도록 두 바늘을 제거 합니다. 사용 하기 전에 실내 온도에 아래로 냉각 하기 위하여 병을 수 있습니다.
참고: 시간을 절약 하려면 중간 준비 및 고압 매체 또는 재고 솔루션 병 단계 3.1.1 3.1.2를 수행 합니다. - 그들의 위에 70% 에탄올 용액 몇 방울을 적용 분 젠 버너의 불꽃을 통해 그들을 전달 하 여 신선한 중간 병의 O2 병 stoppers의 꼭대기를 소독.
- 멸 균 주사기와 바늘을 사용 하, O2 병에서 O2 의 1 mL를 추출 하 고 신선한 중간 병으로 그것을 전송. 그 바늘 밀접 하 게 맞는 주사기에이 단계 동안 주사기에서 공기를 방지 하기 다는 것을 확인 하십시오.
- 유리 병에서 재배 하는 다른 문화에서 inoculum을 사용 하 여, 그들의 위에 70% 에탄올 용액 몇 방울을 적용 분 젠 버너의 불꽃을 통해 그들을 전달 하 여 신선한 중간 병의 오래 된 문화 병 stoppers를 소독. 냉동 문화 관에서 inoculum을 사용 하는 경우 그냥 하자 실내 온도까지 따뜻한 분 젠 버너의 불꽃에서 밀봉 된 튜브와 함께.
- 유리 병에서 재배 하는 다른 문화에서 inoculum을 사용 하 여, 신선한 매체에 이전 문화의 1 mL를 접종. 냉동된 재고에서 inoculate를 사용 하는 경우는 글리세롤 또는 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 냉동 법에 사용 된 희석만 0.1 mL 접종. 두 경우 모두에서 무 균 바늘과 멸 균 주사기를 사용 합니다.
- 32 ° C에서 문화를 품 어와 4 ~ 7 일 후 신선한 매체에 접종.
- O2 그라데이션 반 고체 매체에 MSR-1의 접종
- 신선한 매체의 튜브 핑크 무색 인터페이스에 의해 구체화 정의 오 표시 확인 합니다.
- 경우는 inoculum 다른 O2 농도 기온 변화도 세미 단단한 문화에서 오고 있다, 박테리아에 의해 결성 된 밴드에 살 균 피 펫 팁 문화의 pipetting 50 µ L에 의해 박테리아를 수확. 천천히 인터페이스 방해를 피하고 신선한 매체 (핑크/무색 인터페이스), 오에이 박테리아를 예방. 경우는 inoculum 언된 문화에서 오고 있다, 대신 inoculum의 100 µ L와 같은 방법으로 진행 합니다.
- 튜브와 25 ° C와 30 ° C 사이 박테리아 성장 하자 인감 박테리아의 밴드는 매체의 표면에 도달 하기 전에 동일한 절차를 사용 하 여 신선한 매체에 전송 합니다.
4입니다. 박테리아의 관찰
- 그것의 위에 70% 에탄올 솔루션을 적용 하는 분 젠 버너의 불꽃을 통해 전달 하 여 문화 병의 마 개를 소독. 반 고체 매체, 분 젠 버너의 불꽃에서 튜브를 엽니다. 멸 균 바늘과 멸 균 주사기를 사용 하 여 박테리아를 추출.
- 교수형을 사용 하 여 드롭 박테리아를 모두 자기와 운동 방법8 .
참고: 단계 대조 현미경 검사 법 좋은 결과 제공 하지만 필수 아니에요. 배율 10 X 60 X까지 적당 하다. - 전송 전자 현미경 (TEM)을 사용 하 여 셀 구조와 세부8magnetosomes 관찰.
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Representative Results
성장 매체의 성공적인 준비는 다음과 같이 평가 될 수 있다. 과정의 끝에 취소 솔루션 (즉., 어떤 침전의 무료) 받아야 (이 액체 미디어와 O2 그라데이션 반 고체 매체). 그림 2a에서 접종을 볼 수 있습니다 전에 MSR-1 액체 매체의 예상된 부분을 표시 한 그림. 성공적인 O2 농도 기온 변화도 세미 단단한 매체 (그림 3, 튜브 A) 튜브의 상단에 분홍색 매체의 1-3 cm의 존재에 의해 표시 된 몇 시간 후 오 한의 형성에 의해 신호입니다. 매체의 나머지는 무색 이어야 한다. 접종 전에 resazurin의 완전 한 산화의 표시는 모든 분홍색 매체 및 따라서 O2 농도 기온 변화도의 실패 한 준비의.
액체 매체에서 성공적인 성장을 확인할 수 있습니다 약 48 h 접종 후 (또는 경우는 inoculum 언된 문화에서 오고 몇 일 후에) 단순히 광원 또는 분 광 광도 계를 사용 하 여 탁도 대 한 문화를 검사 하 여. 성공적인 성장 박테리아 (그림 2b)를 실제로 증가 함을 증명 하는 탁도 의해 확인 된다. 매체 48 h 후 명확한 남아, 박테리아는 성장 하지는. 자기 저 어 접시에 매체의 병을 배치 하 여 고 손전등 조명 성장 일반적으로 액체 매체 문화, magnetosomes 합성 박테리아의 존재 48 h 후 체크 수 있습니다. 낮은 교 반 속도에 매체 한다 "플래시", 어둡고 밝은 experimentalist의 위치에 관하여 감동적인 자석의 방향에 따라 번갈아 보고. 비-마그네틱 문화는 experimentalist 쪽으로 세포에 의해 뿌려 진 빛의 강도 일정 유지 됩니다.
반 고체 매체에 성공적인 성장 microaerophilic 밴드 핑크/무색 인터페이스에 박테리아의 형성에 의해 표시 됩니다. 박테리아와 O2 에서 변화 하 여 O2 의 소비로 인해 밴드는 천천히 따라 오 (그림 3, 튜브 B) 마이그레이션합니다.
교수형 드롭 메서드 사용 확인 박테리아는 자기와 메구미를 관찰자. 몇 분 후, MTB 증명 하는 그들은 적극적으로 (그림 4a) 자기장 라인을 따라 수영 매달려 드롭의 가장자리에 집중 해야. 셀 자기 되도록 드롭 옆에 앉아 하는 자석의 방향을 전환 됩니다. 박테리아는 반대 가장자리 (그림 4b) 쪽으로 수영을 시작 한다. 마지막으로, 가장와는 magnetosomes의 형태를 확인할 수 있습니다. Cuboctahedral 결정의 약 30-45 nm 직경에서9관찰 해야. 이러한 결정 한 긴 사슬에 일반적으로 배열 된다 또는 종에 여러 개의 짧은 체인 공부 여기 (그림 5).
그림 1 : N2 의 그림 가스 역. (한) 표현식입니다. (b)는 설치 프로그램의 그림. 프로토콜의 단계 1.9에서 설명 하는 얇은 튜빙의 끝 가스 버블링 단계 동안 매체에 잠기 다 남아 있도록 성공적인 역 크고 얇은 튜브의 적절 한 길이 가질 것 이다. 가스의 흐름 또한 조정 가능한 항상, 모든 O2 제거 되도록 하 고 매체 유출 하지 않는 해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 접종 전후 액체 성장 매체의 병. 접종 전에 (는) 분명 MSR-1 중간. (b) 탁 MSR-1 미디어의 성공적인 성장 3 일 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : O2 의 튜브 (A 관) 전에 그라데이션 반 고체 매체 및 (B 관) 접종 후 10 일. 관 B에서에서 박테리아의 밴드는 빨간색 화살표로 표시 됩니다.
그림 4 : 20 X에 매달려 하락의 전형적인 결과 실험 단계 대조 현미경 검사 법을 사용 하 여 확대. (한) MTB는 자석의 남극 쪽으로 수영과 액체/에 어 인터페이스에 축적. (b)는 자석을 대칭 이동한 후 1 분, 대부분의 세포의 시야를 두고 있다.
그림 5 : 가장 관찰의 자녀-1 셀. Magnetosome 체인 빨간색 화살표로 표시 됩니다. 두 flagella 검은색 화살표로 표시 됩니다.
보충 표 1. 이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
O2 농도의 특정 요구 사항을 MTB 특수 실험실에서 성장 하 게. 액체 매체에 대 한 프로토콜의 중요 한 단계는 O2, 접종 직전의 확실 한 볼륨을 추가 하 여 최종 농도 제어 하기 위해 모든 O2 매체에서의 초기 제거 이다. 그러나 그것은 MSR-1 거의 완벽 하 게 호 기성 조건 하에서 성장,, 세포의 자기 대폭 감소 표시 되었습니다. 같은 연구에서 결과 자녀 1 긴장과 MS-1 완벽 하 게 호 기성 조건6에서 성장 하지 않습니다 나타났다. MSR-1의 반 고체 문화에 대 한 모든 O2 시스테인 솔루션에 의해 감소 먼저 나타나고 O2 농도 기온 변화도는 오의 형성에 지도. 문화 잘 성장 하지 않습니다 또는 자석, O2 농도 확인을 먼저 해야 합니다.
반 고체 성장 매체는 알 수 없는 MTB를 분리 하거나 성장 하는 종 두 O2 와 redox 그라데이션에 매우 민감한 안정적인 기온 변화도의 존재를 보장 하 고 박테리아에 스스로를 위치를 허용에 대 한 흥미로운 선택 최상의 성장 조건을 제공 하는 위치입니다. 액체 매체는 더 높은 볼륨 필요 하 때 사용 (예., DNA 추출에 대 한), 또는 추가 분석 셀에 실시 해야 하는 때 (예., magnetosome 연구)에서 세포의 쉽게 분리에 대 한 수 성장 매체입니다. 반 고체 매체에서 agar 실제로 셀 기술을 수확 방해할 수 있습니다.
어떤 문화권에서는, 세포는 때로는 비-운동, 자연 스러운 돌연변이 때문에 가능성이 될. 비 운동 세포 생존과 성장 매체에 성장 때문에 그들은 수영을 그들의 생존을 위해 필요한 영양분을 찾이 필요가 없습니다. 표준 레이스 트랙 방법10 만 운동 셀 레이스 트랙 아래로 수영을 할 수 있기 때문에 운동 문화를 복구 다음 사용할 수 있습니다. O2 농도 최적의 자연 스러운 돌연변이11때문에 다시 하는 경우에 자기 표현 형의 손실 또한 문화에서 발생할 수 있습니다. 최상의 솔루션은 경우에 접종 신선한 매체에 야생-타입 박테리아의 주식을 냉동 하 여 새로운 문화를 시작입니다. 또는, 레이스 트랙 기술은 또한 자기 문화의 복구를 수 있습니다.
그것은 다른 유기 체에 의해 오염 문화를 피하기 위해 필수적 이며, 따라서 프로토콜의 대부분을 무 균 기술을 사용 하 여 수행 해야 합니다. 일반적으로 분 젠 버너의 화 염에서 조작 무 균 상태를 유지에 만족 스러운 결과 제공 합니다. 그러나, 문화는 오염 발생 하기 쉬운 환경에서 재배 하는 경우 추가 한다 주의 매체를 준비할 때 층 류 두건에서 근무 하 고 접종 박테리아 등. 그 오염의 위험 높다 반 고체 매체에 튜브 셀 제거 됩니다 때마다 열 필요가 주목 한다.
이러한 프로토콜 활성화 다양 한 종류의 실험, 광학 현미경12,13, 전자 현미경 이미징14,15에 따라 물리적 연구 등을 수행 하기 위해 충분 한 박테리아의 성장을 Spectromicroscopy 분석16, 게놈, 단백질 연구17,18x 선. 필요한 경우, 원심 분리에 의해 현 탁 액에 있는 박테리아의 높은 농도 얻을 수 있습니다. 또한, magnetosomes 추출 하 고 셀 펠 릿 또는 원심 분리19여 밀도 셀 정지에서 추가 응용 프로그램에 대 한 정화 될 수 있습니다.
성장 미디어 공식 일반적으로 동일한 관리 원칙 ( 보충 표 1 성장 미디어에서 각 구성 요소의 역할의 목록에 대 한 요약 설명 참조) 기반으로 합니다. 탄소 소스 유기 산을 통해 박테리아를 사용할 수 있어야 합니다 (예., 젖 산, 주석산, 초 산, 호박) 또는 중 탄산염 등 무기 화합물. 박테리아의 대사에 따라 적합 한 카본 소스의 선택 합니다. DNA와 단백질, 그리고 인 (DNA, 세포 막)에 존재 하는 질소 필요 있으며 나노3, NH4Cl과 KH2포4 여기에 설명 된 조리법을 제공한. (HEPES, 인산 염 버퍼) 버퍼는 pH 변화에 저항 하는 데 필요한. 추적 미네랄 보충 솔루션 포함 cofactors 효소, 그리고 비타민 사용할 수 있습니다 박테리아 보 또는 기능 그룹으로 특정 효소에 대 한. 효 모 추출 물과 간장 콩 펩 아미노산 및 단백질 생산을 위해 사용 하는 소금의 소스를 제공 합니다. 하나 또는 여러 개의 감소 시키는 대리인 매체에 자주 추가 합니다 MTB redox 민감한 때문에, (예., 시스테인, ascorbic 산 젖이 나올). 철의 주요 소스 (예., 제 2 철 구 연산 염, quinate, 철 염화 제 2 철) biomineralization에 대 한 매체에 필요 하다. 마지막으로, 작은 양의 O2 는 터미널 전자 수락자로 microaerophilic 박테리아에 대 한 필요 합니다. 대신 혐 기성 MTB 사용 다른 화합물 질 산 이나 질소 산화물 등 의무.
이러한 프로토콜의 주요 제한은 그들이 MTB의 다른 종족에 대 한 작동 보장입니다. 자녀-1, 변종 MS 1 및 MSR-1은 모두 민물 MTB 하 고 따라서이 문서에서 설명 하는 조리법 해양 magnetospirilla Magnetospira thiophila 변형 MMS-1, Magnetospira 긴장 QH-2, 또는 다른 해양 MTB 등 성장에 사용할 수 없습니다 높은 소금 농도 요구 한다. 그러나, 다른 긴장의 MTB, 그리고 새로운 종자의 격리에 대 한 성장, 다른 조리법을 사용 하 여 미디어를 준비 하 액체와 반 고체 모두 미디어에 대 한이 문서에서 제공 하는 일반 메서드를 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 전자 현미경 시설 (McMaster 대학, 교육 및 액세스에 대 한 MTB, 아담 P. 히치콕과 Xiaohui 주 맥 매스 터 대학, MTB 문화를 설정 하는 동안 그들의 지원에 대 한 문화와 마 샤 레이드로 그의 도움에 감사 리처드 B. 프 랭 클 건강 과학의 학부)입니다. 이 작품은 자연 과학 및 캐나다 엔지니어링 연구 위원회 (NSERC)와 미국 국립 과학 재단에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AMB-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 700264 | |
| MS-1 | ATCC | ATCC 31632 | |
| MSR-1 | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) | DSM 6361 | |
| Ferric citrate | Sigma-Aldrich | F3388-250G | |
| Trace mineral supplement | ATCC | MD-TMS | |
| KH2PO4 | EMD | PX1565-1 | |
| MgSO4.7 H2O | EMD | MX0070-1 | |
| HEPES | BioShop Canada Inc | HEP001.250 | |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | S5506-250G | |
| Yeast extract | Fischer scientific | DF210929 | |
| Peptone | Fischer scientific | DF0436-17-5 | |
| Potassium L-lactate solution (60%) | Sigma-Aldrich | 60389-250ML-F | |
| D-(-)-Quinic acid | Sigma-Aldrich | 138622 | |
| FeCl3.6H2O | Fischer scientific | I88-100 | |
| Vitamin supplement | ATCC | MD-VS | |
| Sodium succinate hexahydrate | Fischer scientific | S413-500 | |
| Sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729-100G | |
| Sodium acetate trihydrate | EMD | SX0255-1 | |
| Resazurin | Difco | 0704-13 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| K2HPO4 | Caledon | 6620-1-65 | |
| FeCl2 .4H2O | Sigma-Aldrich | 44939-250G | |
| Sodium bicarbonate | EMD | SX0320-1 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| NH4Cl | EMD | 1011450500 | |
| CaCl2.2 H2O | EMD | 1023820500 | |
| Agar A | Bio Basic Canada Inc | FB0010 | |
| L-cysteine.HCl.H2O | Sigma-Aldrich | C7880-100G | |
| 1.0 mL syringes | Fischer scientific | B309659 | |
| 25G x 1 needles | BD | 305125 | |
| 125 mL serum bottles | Wheaton | 223748 | |
| 20 mm aluminum seals | Wheaton | 224223-01 | |
| 20mm E-Z Crimper | Wheaton | W225303 | |
| Butyl-rubber stoppers | Bellco Glass, Inc. | 2048-11800 | |
| Hungate tubes | Chemglass (VWR) | CLS-4208-01 | |
| Septum stopper, 13mm, Hungate | Bellco Glass, Inc. | 2047-11600 | |
| Glass culture Tubes | Corning (VWR) | 9826-16X | |
| Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 11.6 - 12 N |
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