Summary
Vi presenterer en prosedyre for voksende flere stammer av Magnetospirillum i to forskjellige typer av veksten medier. Magnetospirillum gryphiswaldense belastning MSR-1 er vokst både flytende og O2 konsentrasjon gradient halvfaste media mens M. magneticum belastning AMB-1 og M. magnetotacticum belastning MS-1 er dyrket i flytende medium.
Abstract
Magnetotactic bakterier er Gram-negative, motile, hovedsakelig akvatiske prokaryoter allestedsnærværende i ferskvann og marine habitater. De er preget av deres evne til å biomineralize magnetosomes, som er magnetisk nanometer store krystaller av magnetitt (Fe3O4) eller greigite (Fe3S4) omgitt av en lipid bilayer membran, innen deres cytoplasma. For de fleste kjente magnetotactic bakterier, er magnetosomes samlet i kjeder i cytoplasma, og dermed overdragelse et permanent magnetisk dipol øyeblikk til cellene og forårsaker dem til å justere passivt med eksterne magnetfelt. På grunn av disse funksjonene har magnetotactic bakterier et stort potensial for kommersielle og medisinsk bruk. Men de fleste arter er gram-negative og har bestemt O2 konsentrasjon krav, noe som gjør dem vanskelig å vokse rutinemessig enn mange andre bakterier som Escherichia coli. Her presenterer vi detaljerte protokoller for voksende tre av de mest studerte stammene av magnetotactic bakterier, alle tilhører slekten Magnetospirillum. Disse metodene tillater presis kontroll over O2 konsentrasjonen gjort tilgjengelig for bakterier, slik at de avle normalt og syntetisere magnetosomes. Økende magnetotactic bakterier for videre studier med disse fremgangsmåtene krever ikke experimentalist å være ekspert i mikrobiologi. De generelle metodene i denne artikkelen kan også brukes til å isolere og kultur andre magnetotactic bakterier, selv om det er sannsynlig at vekst medier kjemiske sammensetning må endres.
Introduction
Magnetotactic bakterier (MTB) representerer et bredt spekter av Gram-negative prokaryoter allestedsnærværende i ferskvann og hav vannhabitater1. Disse bakteriene dele evnen til å produsere magnetiske krystaller av magnetitt (Fe3O4) eller greigite (Fe3S4), som er i de fleste tilfeller samlet inn kjeder innenfor cellene. Dette bestemte strukturelle motivet er tilstedeværelsen av flere spesifikke proteiner opptrer både i cytoplasma av bakterier og lipid membranen som omgir hver krystall2. Hver enkelt krystall og dens omkringliggende membran vesicle kalles en magnetosome og er varierer i størrelse fra ca 30 til 50 nm i Magnetospirillum arter3. På grunn av kjeden ordningen med magnetosomes har disse bakteriene en permanent magnetisk dipol øyeblikk som gjør dem justere passivt med eksternt anvendt magnetfelt. Derfor disse bakteriene aktivt svømme langs magnetfelt linjer, opptrer som selvdrevne mikro-kompass antagelig til mer effektivt finne gunstige forhold (f.eks., O2 konsentrasjon) for vekst.
En interessant egenskap av MTB er deres evne til å regulere både kjemi og krystallografi av deres magnetosome krystaller. De fleste stammer produsere relativt høy renhetsgrad krystaller magnetitt eller greigite, selv om noen biomineralize begge mineraler4. I alle tilfeller er bakterier i stand til nettopp styre størrelsen og form av deres enkelt magnetisk domene krystaller. Dette forklarer hvorfor en stor mengde forskning er gjennomført for å utvikle en bedre forståelse av hvordan MTB utføre denne biomineralization prosessen. Forstå denne prosessen kan gi forskerne å skreddersy magnetiske nanokrystaller for mange kommersielle og medisinske programmer.
Et betydelig hinder for omfattende forskning på MTB har vært problemer med voksende dem i laboratoriet. De fleste arter, inkludert påkjenningen brukes i dette arbeidet er obligately gram-negative når vokst med O2 som en terminal elektron acceptor. Dette forklarer hvorfor disse bakteriene finnes oftest i sonen overgangen mellom oksisk og anoksisk forhold (oksisk-anoksisk grensesnittet, OAI). Dette viser tydelig at MTB har presis O2 konsentrasjon krav som åpenbart må tas i betraktning når utforme vekst medier for disse organismene. Dessuten, det eksisterende yrende MTB innebærer at ulike stammer trenger forskjellige typer kjemiske graderinger og næringsstoffene for å oppnå optimal vekst.
I dette arbeidet vi beskriver metodene for voksende tre av de mest studerte MTB: Magnetospirillum magneticum (belastning AMB-1), M. magnetotacticum (MS-1) og M. gryphiswaldense (MSR-1). Disse artene phylogenetically tilhører Alphaproteobacteria klassen i Proteobacteria rekken, er spiralformede i morfologi og ha en polar flagell i hver ende av cellen. Vi tilbyr protokollene for økende press MSR-1 i både flytende og O2 konsentrasjon gradient halvfaste media, basert på tidligere publiserte middels oppskrifter5,6. Vi presenterer også en detaljert protokoll for voksende stammer AMB-1 og MS-1 i endret magnetiske Spirillum vekst Medium (MGSM)7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. installasjon av den N2 stasjonen
Merk: Velg den indre diameteren på slangen slik at den kan kobles til gasstanken med minimum lekkasje og slik at sylinderen av en 1 mL plastsprøyte tett passer i denne slangen. En illustrasjon av fullstendig N2 gassing stasjon finnes i figur 1.
- Trygg installere en N2 gasstanken nær en benk det er nok plass til å sette opp den N2 stasjonen (en lengde på ca 50 cm).
- Koble til tanken et stykke rør lenge nok å nå området hvor stasjonen skal bygges. Eventuelt bruk Teflon tape på utgangen av tanken å unngå noen.
- For å bygge en stasjon kan boblende fem flasker med middels samtidig, kuttet fire stk rør på ca 5 cm i lengde.
- Samle bitene av rør på en linje med tre treveis T-formet plast beslag. Koble en ende av denne linjen til stykke rør på utgangen av N2 tank gjennom en ekstra T-formet passende. Legge til en 90-graders albue passer i den andre enden.
- Bruk tape knytte strukturen til en vannrett metall stang plassert ca 30 cm over benken.
- Koble fem stykker av rør (ca 20 cm i lengde) til gratis utganger modulbasert installert i trinn 1.4.
- Fjern stempler fra fem 1,0 mL plast sprøyter og kutte den lille enden av disse sprøyter (dvs., motsatt side til nålen), holde bare uteksaminert delen. Fylle disse sprøyter med bomull, ikke for hardt.
- Sett inn sprøyter i 20 cm lang vertikal stykker av rør og bruke såpevann for å sikre at det ikke er noen lekkasje når N2 strømmer.
- Fjerne dekslene fem 25 G nåler (0,5 mm x 25 mm) og sett pinnene inn 10 cm biter av tynne rør. Kontroller at nålene tett passer slangen.
Advarsel: Det er en risiko for knivstikking i dette trinnet. Gjør det sakte og forsiktig. - Fest nålene forberedt i trinn 1,9 å sprøyter N2 stasjonen. Kontroller at N2 strømmer gjennom alle fem linjer og holde stasjonen på stand-by.
2. vekst Medium forberedelse
Merk: Det er mulig å justere middels forberedt, som forklart i fremgangsmåten 2.1.2, 2.2.2 og 2.3.8. Mengden av vann og kjemikalier brukes bare behov justeres proporsjonalt. Rollen til alle mellomstore komponenter er beskrevet i supplerende tabell 1.
- Utarbeidelse av flytende oppblomstringen medium for MSR-1
- Forberede en 10 mM ferric citrate løsning ved å legge 0.245 g av ferric citrate til 100 mL destillert deionisert vann. Varme og hisse for å oppløse, til en gul til oransje klar løsning oppnås. Autoclave løsningen bruker et standard syklus (minst 15 min eksponering ved 121 ° C) og deretter lagre denne lager løsningen ved romtemperatur i mørket.
Merk: Kaste ferric citrate løsningen når en utløse blir tydelig. - I et beaker som inneholder 1 L destillert deionisert vann, legger du til følgende i rekkefølge under omrøring: 1,0 mL av sporstoffer mineral supplement løsning, 0.1 g KH2PO4, 0.15 g av MgSO4.7 H2O, 2,38 g av HEPES, 0.34 g NaNO3 , 0.1 g gjær ekstrakt, 3.0 g av soya bean pepton 4,35 mL av kalium laktat (60% w/w løsning) og 5 mL av 10 mM Fe(III) citrate lagerløsning.
NB: Tilpass antallene proporsjonalt hvis en mindre mengde oppblomstringen medium er nødvendig. For en N2 stasjon kan boblende fem flasker samtidig, slik som den i trinn 1 i denne protokollen, forberede 300 mL av medium.
FORSIKTIG: Spor mineraler og Fe(III) citrate lager løsninger må holdes sterilt. For å unngå forurensning, bruker standard steril teknikk når du bruker dem (flamme åpne topper av flasker med en Bunsen brenner) og bruke sterilt pipette-spisser for utlevering. Lagre den mineral løsningen i kjøleskap på 4 ° C. - Etter at alle kjemikalier, justere pH 7.0 med 1 M NaOH løsning. Dispensere nylagde mediet i 125 mL serum flasker. Hell 60 mL medium i hver flaske.
- Boble N2 til medium i 30 min fjerne oppløste O2, liten slangen er koblet til den N2 stasjonen beskrives i trinn 1. Plass en butylgummi stopper på hver flaske, la en liten åpning slik at overflødig gass avslutte flasken.
FORSIKTIG: Skum kan danne mens bobler med N2. Justere gasstrømmen tilsvarende for å unngå skum produksjon. - Crimp forsegle hver flaske med forberedt stopperen og en aluminium segl. Aluminium segl sikrer at flasken forblir lukket resten av protokollen.
- Koble fra den N2 stasjonen nålene og den tynne rør og erstatte dem med rene sprøytespisser (1 tomme, ≤ 23 G). Juster ventilene av N2 tanken slik at en mild kontinuerlig strøm av gass avslutter tanken (ca 50 mL/min).
Merk: Nåler større enn 23G kan la permanent unsealable hull i stopperen. - Setter inn et av pinnene koblet til N2 tank i en flaske med medium, gjennom gummipropp. Umiddelbart inn en annen ren nål den samme flasken. Gjenta dette trinnet for andre flasker og la N2 flyte i ca 30 min å erstatte luften i flaskene av N2.
- Koble en flaske fra N2 stasjonen ved å fjerne tilsvarende nålen. Vent noen sekunder til trykket i flaske medium reduseres til lufttrykk og fjerne andre nålen. Gjenta dette trinnet for alle gjenværende flasker.
Advarsel: For å forhindre O2 kommer inn flaskene av vekstmediet etter trinn 2.1.4, utfører du trinn 2.1.4 - 2.1.8 i rask rekkefølge. Hvis alle flasker ikke kan kobles til N2 stasjonen samtidig, Fortsett med trinn 2.1.4-2.1.8 for det første settet av flasker og deretter gjenta trinnene for gjenværende flaskene. - Autoclave flaskene. La dem avkjøles til romtemperatur over natten og lagre dem ved romtemperatur etterpå.
- Forberede en 10 mM ferric citrate løsning ved å legge 0.245 g av ferric citrate til 100 mL destillert deionisert vann. Varme og hisse for å oppløse, til en gul til oransje klar løsning oppnås. Autoclave løsningen bruker et standard syklus (minst 15 min eksponering ved 121 ° C) og deretter lagre denne lager løsningen ved romtemperatur i mørket.
- Utarbeidelse av flytende oppblomstringen medium for AMB-1 og MS-1
- Forberede en 10 mM ferric quinate løsning. Først oppløse 0,19 g quinic syre i 100 mL destillert deionisert vann, deretter legge 0,27 g FeCl3.6H2O. røre å oppløse, til en mørk rød, klar løsning er oppnådd. Autoclave løsningen ved å benytte en standard syklus (minst 15 min eksponering ved 121 ° C).
Merk: Lagre ferric quinate løsningen ved romtemperatur i mørket som en steril lagerløsning. Kast løsningen når en utløse blir tydelig. - I et beaker som inneholder 1 L destillert deionisert vann, legger du til følgende i rekkefølge under omrøring: 10,0 mL av vitamin supplement løsning, 5.0 mL av spor mineraltilskudd løsningen, 0.68 g KH2PO4, 0.848 g av natrium succinate dibasic hexahydrate, 0.575 g di natrium tartrate dihydrate, 0.083g av natrium acetate trihydrate, 0,45 mL 0,1% vandig Resazurin, 0,17 g NaNO30.04 g av askorbinsyre og 3.0 mL av 10 mM Fe(III) quinate lagerløsning.
NB: Tilpass antallene proporsjonalt hvis en mindre mengde oppblomstringen medium er nødvendig. For en N2 stasjon kan boblende fem flasker samtidig, slik som den i trinn 1 i denne protokollen, forberede 300 mL av medium.
FORSIKTIG: Vitamin, sporstoffer mineral og Fe(III) quinate lager løsninger må holdes sterilt. For å unngå forurensning, Bruk standard steril teknikk og sterile pipette-spisser når utleveringen. Lagre mineral og vitamin løsningene i kjøleskap på 4 ° C. - Etter at alle kjemikalier, justere pH til 6,75 bruker 1 M NaOH løsning.
- Se trinn 2.1.3-2.1.9 for resten av protokollen.
- Forberede en 10 mM ferric quinate løsning. Først oppløse 0,19 g quinic syre i 100 mL destillert deionisert vann, deretter legge 0,27 g FeCl3.6H2O. røre å oppløse, til en mørk rød, klar løsning er oppnådd. Autoclave løsningen ved å benytte en standard syklus (minst 15 min eksponering ved 121 ° C).
- Utarbeidelse av halvfaste oppblomstringen medium for MSR-1
- Forbered en 0,5 M fosfat buffer løsning pH 7.0 ved oppløsning 3.362 g K2HPO4 og 4.178 g KH2PO4 i 100 mL destillert deionisert vann. PH er 7.0 og justere pH litt med KH2PO4 eller NaOH hvis nødvendig. Lagre løsningen i en forseglet glassflaske (fortrinnsvis til plast for å unngå oksygen exchange).
- Forberede 100 mL en 0.02 M saltsyre løsning. Legg 0.2 g FeCl2.4H2O til denne løsningen og hisse for å oppløse for å få en 10 mM jern chloride løsning. Lagre løsningen i mørket i en forseglet glassflaske.
- Forbered en 0,8 M natriumbikarbonat løsning ved oppløsning 6.72 g NaHCO3 i 100 mL destillert deionisert vann. Lagre løsningen i en forseglet glassflaske.
- Autoclave løsningene forberedt trinnene 2.2.1 - 2.2.3 bruker en standard syklus (minst 15 min eksponering ved 121 ° C). Lagre dem som sterilt lager løsninger i mørket.
- I et beaker som inneholder 1 L destillert deionisert vann, legger du til følgende i rekkefølge under omrøring: 5 mL av spor mineraltilskudd løsningen, 0,2 mL 1% vandig resazurin løsning, 0.4 g NaCl, 0,3 g av NH4Cl, 0.1 g MgSO4.7H2 O, 0,05 g CaCl2.2H2O, 1 g av natrium succinate, 0,5 g av natrium acetate, 0.2 g gjær ekstrakt og 1.6 g av agar.
- Dekk begeret med aluminiumsfolie og autoklav løsningen i trinn 2.3.5.
- Like før slutten av autoklav syklusen, forberede en frisk 4% L-cysteine· HCl· H2O løsning ved å løse opp 0,8 g av L-cysteine· HCl· H2O i 20 mL destillert deionisert vann. Nøytralisere løsningen pH 7.0 med 5 M NaOH løsning.
Advarsel: det er viktig at cystein løsningen er tilberedt ferske å unngå oksidasjon av cystein. Lagre den mineral løsningen i kjøleskap på 4 ° C. - Etter autoklavering, la middels kjøle ned til 50-60 ° C og bringe begeret under flammen i en Bunsen-brenner. Fjerne aluminiumsfolie og raskt legge til følgende i rekkefølge mens forsiktig røring: 0,5 mL av vitamin løsningen, 2,8 mL steril fosfat buffer lager løsningen, 3 mL steril jern klorid lager løsningen, 1,8 mL steril natriumbikarbonat aksjen løsning og 10 mL av filter-steriliseres cystein løsning.
NB: Tilpass antallene proporsjonalt hvis en mindre mengde oppblomstringen medium er nødvendig. Er det vanligvis nyttig å forberede en bunke med 120 mL av medium.
Advarsel: Alle løsninger må forblir sterilt for fremtidig bruk. Utføre trinn 2.3.8 ved hjelp av standard steril teknikk og sterile pipette tips ved utlevering. - Etter at alle kjemikalier, overføre varme mediet til 16 mL steril skrukork hvor Hungate rør. Overføre 12 mL av mediet til hver rør og forsegle rørene.
FORHOLDSREGEL: For å unngå forurensning, utføre trinn 2.3.9 under flammen i en Bunsen-brenner. Utføre det før agar stivner, mens mediet på 40 ° C eller over. - La rør uforstyrret i flere timer før agar stivner og OAI blir tydelig, materializing som en rosa fargeløs grensesnitt, ca 1-3 cm under overflaten av mediet.
Merk: Medium bør langsomt slå fargeløs i røret. Tiden nødvendig for denne overgangen er variabel og avhenger av hvor mye O2 utgangspunktet oppløst i mediet.
3. vaksinasjon av MTB
Merk: Kulturer av stammene AMB-1, MS-1 og MSR-1 kan fås kommersielt (Tabell for materiale).
FORHOLDSREGEL: Utføre alle følgende trinn i sterile forhold, under flammen i en Bunsen-brenner.
- Vaksinering av stammer MSR-1, AMB-1 og MS-1 i flytende medium
- Forsegle en tom 125 mL serum flaske med en butylgummi stopper og en aluminium crimp segl. Sette inn to nåler i flaske gjennom stopperen, og koble en sprøyte forberedt som trinn 1.7 til en av dem. Koble sprøyten til en sylinder av O2 til samme type rør som brukes for den N2 stasjonen.
- La O2 strømme gjennom flasken i ca 30 min, for å sikre at alle luft i flasken er erstattet av O2. Fjerne pinner, slik at for en liten overtrykk i flasken og deretter autoclave. Kan flasken for å kjøle ned til romtemperatur før bruk.
Merk: For å spare tid, kan du utføre trinn 3.1.1 og 3.1.2 under middels forberedelse og autoklav flasken med mediet eller lager løsninger. - Sterilisere toppen av stoppers frisk middels flasken og O2 flasken ved å bruke noen dråper av 70% etanol løsning oppå og passerer dem gjennom flammen i en Bunsen-brenner.
- Bruke sterile sprøyter og en nål, ekstra 1 mL av O2 fra O2 flasken og overføre den til frisk middels flasken. Kontroller at nålen godt passer på sprøyten i dette trinnet å unngå noen luft i sprøyten.
- Hvis bruker inoculum fra en annen kultur dyrket i ett glassflaske, sterilisere stoppers frisk middels flasken og eldre kultur flasken ved å bruke noen dråper av 70% etanol løsning oppå og passerer dem gjennom flammen i en Bunsen-brenner. Hvis bruker inoculum fra en tube med frosne kultur, bare la den varmes opp til romtemperatur med røret forseglet under flammen i en Bunsen-brenner.
- Hvis bruker inoculum fra en annen kultur dyrket i ett glassflaske, vaksinere 1 mL av eldre kulturen til frisk medium. Hvis bruker inoculate fra en frossen lager, vaksinere bare 0,1 mL å fortynne den glyserol eller dimethyl sulfoxide (DMSO) brukt i frysing. I begge tilfeller bruk en steril nål og sterile sprøyter.
- Inkuber kulturen ved 32 ° C og vaksinere det til frisk medium etter 4 til 7 dager.
- Vaksinering av MSR-1 O2 gradient halvfaste medium
- Kontroller at røret frisk middels vises en veldefinert OAI, materialisert av en rosa fargeløs grensesnitt.
- Hvis inoculum kommer fra en annen O2 konsentrasjon gradient halvfaste kultur, høste bakterier av pipettering 50 µL av kultur med et sterilt pipette tips på bandet dannet av bakterier. Sakte vaksinere disse bakterier på OAI i frisk medium (rosa/fargeløs grenseflate), unngå forstyrre grensesnittet. Hvis inoculum kommer fra en frossen kultur, fortsette på samme måte med 100 µL av inoculum i stedet.
- Forsegle tunnelbane og la bakterier vokse mellom 25 ° C og 30 ° C. Overføre til frisk mediet bruker samme fremgangsmåte før bandet av bakterier når overflaten av mediet.
4. observasjon av bakterier
- Sterilisere stopperen av kultur flasken ved å bruke 70% etanol løsning på det og passerer det gjennom flammen i en Bunsen-brenner. For halvfaste medium, åpne røret under flammen i en Bunsen-brenner. Bruk en steril nål og sterile sprøyter for å ekstra bakterier.
- Bruk hengende slippe metoden8 for å sikre at bakterier både magnetiske og motile.
Merk: Fase kontrast mikroskopi gir gode resultater, men er ikke obligatorisk. Forstørrelse mellom 10 X 60 X er egnet. - Bruk overføring elektronmikroskop (TEM) for å observere cellestrukturen og magnetosomes i detalj8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket utarbeidelse av veksten mediene kan bli vurdert som følger. På slutten av prosessen, fjerner løsninger (dvs., uten noen utløse) kan skaffes (Dette gjelder for både flytende media og O2 gradient halvfaste medium). Et bilde som viser forventet aspekt av MSR-1 flytende medium før inoculation ses i figur 2a. En vellykket O2 konsentrasjon gradient halvfaste medium er signalisert av dannelsen av en OAI etter noen timer, angitt av tilstedeværelsen av 1-3 cm rosa middels øverst på røret (Figur 3rør A). Resten av mediet skal fargeløs. Et helt rosa medium før vaksinering er et tegn på komplett oksidasjon av resazurin og derfor for en mislykket O2 konsentrasjon gradient.
Vellykket vekst i flytende medium kan kontrolleres ca 48 timer etter vaksinering (eller etter noen dager hvis inoculum kommer fra en frossen kultur) ved å undersøke kulturer for turbiditet lyskilde eller et spektrofotometer. Vellykket vekst er bekreftet av turbiditet beviser at bakteriene faktisk vokste (figur 2b). Hvis mediet er klart etter 48 timer, har bakterier ikke vokst. For en flytende medium kultur vokser normalt, kan tilstedeværelse av bakterier syntetisere magnetosomes kontrolleres etter 48 timer ved å plassere flaske medium på en magnetic røre plate og lyser det opp med en lommelykt. Ved lav gripende bør medium "flash", ser vekselvis mørkere og lysere avhengig av retningen på gripende magneten med hensyn til plasseringen av experimentalist. For en ikke-magnetisk kultur forblir intensiteten av lys spredt av celler mot experimentalist konstant.
Vellykket vekst i halvfaste medium angis med dannelsen av en gram-negative gjeng bakterier på rosa/fargeløs grensesnittet. På grunn av forbruket av O2 av bakterier og endringer i O2 graderingen, vil bandet langsomt migrere for å følge OAI (Figur 3rør B).
Hengende slippe metoden gjør observatøren å sjekke at bakterier er både magnetiske og motile. Etter noen minutter, bør MTB konsentrere på kanten av det hengende miste, beviser at de aktivt svømme retning magnetfelt (figur 4a). For å sikre at cellene er magnetisk, snu retningen for magnet sitter ved siden av rullegardinlisten. Bakterier skal begynne å svømme mot motsatt kant (figur 4b). Til slutt, formen på magnetosomes kan kontrolleres med TEM. Cuboctahedral krystaller av om 30-45 nm i diameter skal være observert9. Disse krystallene er normalt arrangert i en lang kjede eller flere kortere kjedene i arten studerte her (figur 5).
Figur 1 : Illustrasjon av N2 gassing stasjonen. (en) skjematisk fremstilling. (b) bilde av oppsettet. En vellykket stasjon vil ha den aktuelle lengden på store og tynne rør slik at slutten av den tynne rør som beskrevet i trinn 1,9 protokollen er oppslukt i medium under gass boblende trinnet. Flyten av gass skal justerbar hele tiden, slik at alle O2 fjernes og at mediet ikke gjør søler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Flasker av flytende vekst medium før og etter vaksinering. (en) klart MSR-1 middels før vaksinering. (b) grumset MSR-1 middels etter 3 dager for vellykket vekst. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Rør O2 gradert halvfaste medium før (rør A) og 10 dager etter (rør B) inoculation. Bandet av bakterier i rør B angis av en rød pil.
Figur 4 : Typisk resultatene av en hengende dråpe eksperimentere på 20 X forstørrelse med fase kontrast mikroskopi. (en) MTB svømme mot Sydpolen av en magnet og samle på væske/luft grensesnittet. (b) 1 min etter bla magneten, de fleste cellene har forlatt synsfelt.
Figur 5 : TEM observasjon av en AMB-1 celle. Magnetosome kjeder angis med røde piler. To flagella angis av svarte piler.
Supplerende tabell 1. Klikk her for å laste ned denne tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bestemte O2 konsentrasjon krav fra MTB gjør dem ikke-triviell å vokse i laboratoriet. Et viktig skritt for protokollen for flytende medium er første fjerning av alle O2 fra mediet for å kontrollere den endelige konsentrasjonen ved å legge til et bestemt antall O2, like før vaksinering. Det har vist at MSR-1 vokser under nesten fullstendig aerobe forhold, men magnetismen cellene reduseres drastisk. Resultatene fra samme studien viste at stammer AMB-1 og MS-1 ikke vokser under fullt aerobe forhold6. For halvfaste kultur MSR-1, alle O2 reduseres først cystein løsningen og deretter O2 konsentrasjon gradient, fører til dannelsen av OAI. Hvis en kultur ikke vokser godt eller er ikke magnetisk, bør O2 konsentrasjonen være det første du.
Halvfaste oppblomstringen medium er et interessant valg for isolere ukjent MTB eller voksende arter som er svært følsomme for begge O2 og redoks graderinger, som sikrer eksistensen av stabil graderinger og gjør at bakterier til å posisjonere seg på stedet tilbyr de beste forutsetninger for vekst. Flytende medium er enklere å arbeide med når høyere er nødvendig (f.eks., for DNA utvinning), eller når ytterligere analyse må gjennomføres på cellene (f.eks., magnetosome studier) fordi det gir en enklere skille cellene fra vekstmediet. Agar halvfaste medium kan faktisk forstyrre cellen høsting teknikk.
I noen kulturer bli cellene noen ganger ikke-motile, sannsynligvis på grunn av spontane mutasjoner. Ikke-motile celler overleve og vokse i vekstmediet siden de ikke trenger å svømme for å finne næringsstoffer som er nødvendige for å overleve. Standard racerbanen metoden10 kan deretter brukes til å gjenopprette en motile kultur siden bare motile celler kan svømme ned racerbanen. Tap av magnetiske fenotypen kan også skje i kulturen selv om O2 konsentrasjonen er optimal, igjen på grunn av spontane mutasjoner11. Den beste løsningen er i dette tilfellet å starte en ny kultur av vaksinere frosset aksjer av vill-type bakterier i frisk medium. Alternativt, racerbanen teknikken kan også tillate utvinning av en magnetisk kultur.
Det er viktig å unngå forurensning av kulturen av andre organismer og derfor de fleste av protokollen må utføres ved hjelp av sterile teknikker. Manipulere under flammen i en Bunsen brenner vanligvis gir tilfredsstillende resultater i å holde aseptiske forhold. Men hvis kulturen er vokst i en utsatt for forurensning miljø, bør forholdsregler tas, som arbeider i laminær strømning hette når forbereder mediet og vaksinere bakterier. Det bør bemerkes at risikoen for forurensning er høyere i halvfaste medium som rør må åpnes hver gang cellene er fjernet.
Disse protokollene muliggjøre vekst av nok bakterier til å utføre mange forskjellige typer eksperimenter, som fysiske studier basert på optiske mikroskopi12,13, elektronmikroskop tenkelig14,15, X-ray spectromicroscopy analyser16, genomisk og protein studier17,18. Eventuelt høyere konsentrasjoner av bakterier i suspensjon kan oppnås med sentrifugering. I tillegg kan magnetosomes trekkes ut og renset for ytterligere programmer fra cellen pellets eller tett celle suspensjoner ved sentrifugering19.
Vekst medier formuleringer er vanligvis basert på samme styrende prinsipper (se utfyllende tabell 1 for et sammendrag av rollen for hver komponent i vekst media beskrevet her). En karbon kilde må være tilgjengelig for bakterier, via organiske syrer (f.eks., succinate, acetate, tartrate, laktat) eller uorganiske forbindelser som bikarbonat. Valg av en egnet karbon kilde avhenger av metabolismen av bakterier. Nitrogen i DNA og proteiner og fosfor (DNA, membraner) kreves også og levert av NaNO3, NH4Cl og KH2PO4 i oppskrifter beskrevet her. En buffer (HEPES, fosfatbuffer) er nødvendig for å motstå endringer i pH. Spor mineraltilskudd løsningen inneholder kofaktorer for enzymer, og vitaminer kan brukes av bakterier som koenzymer eller funksjonelle grupper visse enzymer. Gjær ekstrakt og soya bean pepton gir en kilde til aminosyrer og salter brukt for protein produksjon. Siden MTB redoks følsom, én eller flere reduksjonsmidler må ofte legges til mediet (f.eks., cystein, askorbinsyre, laktat). En stor kilde til jern (f.eks., ferric citrate, ferric quinate, jern klorid) er nødvendig i medium for biomineralization. Endelig, en liten mengde O2 er nødvendig for gram-negative bakterier som terminal elektron acceptor. Forplikte anaerob MTB bruk andre forbindelser som nitrat eller lystgass i stedet.
Den viktigste begrensningen av disse protokollene er at det er ingen garanti for at de vil fungere for andre arter av MTB. Påkjenningen AMB-1, MS-1 og MSR-1 er alle ferskvann MTB og derfor oppskrifter beskrevet i denne artikkelen kan ikke brukes til å vokse marine magnetospirilla som Magnetospira thiophila belastning MMS-1, Magnetospira belastning QH-2 eller andre marine MTB, som krever høyere salt konsentrasjoner. Imidlertid for å vokse andre stammer MTB, og isolasjon av nye stammer, kan generelle metodene i denne artikkelen for både flytende og seigtflytende medier brukes til å forberede medier med forskjellige oppskrifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Richard B. Frankel for hans hjelp med MTB kulturer, Adam P. Hitchcock og Xiaohui Zhu for deres støtte under installering MTB kulturer ved McMaster University og Marcia Reid for trening og tilgang til elektronmikroskop anlegget (McMaster University, Fakultetet for helsevitenskap). Dette arbeidet ble støttet av naturfag og Engineering Research Council for Canada (NSERC) og oss National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AMB-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 700264 | |
| MS-1 | ATCC | ATCC 31632 | |
| MSR-1 | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) | DSM 6361 | |
| Ferric citrate | Sigma-Aldrich | F3388-250G | |
| Trace mineral supplement | ATCC | MD-TMS | |
| KH2PO4 | EMD | PX1565-1 | |
| MgSO4.7 H2O | EMD | MX0070-1 | |
| HEPES | BioShop Canada Inc | HEP001.250 | |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | S5506-250G | |
| Yeast extract | Fischer scientific | DF210929 | |
| Peptone | Fischer scientific | DF0436-17-5 | |
| Potassium L-lactate solution (60%) | Sigma-Aldrich | 60389-250ML-F | |
| D-(-)-Quinic acid | Sigma-Aldrich | 138622 | |
| FeCl3.6H2O | Fischer scientific | I88-100 | |
| Vitamin supplement | ATCC | MD-VS | |
| Sodium succinate hexahydrate | Fischer scientific | S413-500 | |
| Sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729-100G | |
| Sodium acetate trihydrate | EMD | SX0255-1 | |
| Resazurin | Difco | 0704-13 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| K2HPO4 | Caledon | 6620-1-65 | |
| FeCl2 .4H2O | Sigma-Aldrich | 44939-250G | |
| Sodium bicarbonate | EMD | SX0320-1 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| NH4Cl | EMD | 1011450500 | |
| CaCl2.2 H2O | EMD | 1023820500 | |
| Agar A | Bio Basic Canada Inc | FB0010 | |
| L-cysteine.HCl.H2O | Sigma-Aldrich | C7880-100G | |
| 1.0 mL syringes | Fischer scientific | B309659 | |
| 25G x 1 needles | BD | 305125 | |
| 125 mL serum bottles | Wheaton | 223748 | |
| 20 mm aluminum seals | Wheaton | 224223-01 | |
| 20mm E-Z Crimper | Wheaton | W225303 | |
| Butyl-rubber stoppers | Bellco Glass, Inc. | 2048-11800 | |
| Hungate tubes | Chemglass (VWR) | CLS-4208-01 | |
| Septum stopper, 13mm, Hungate | Bellco Glass, Inc. | 2047-11600 | |
| Glass culture Tubes | Corning (VWR) | 9826-16X | |
| Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 11.6 - 12 N |
References
- Blakemore, R. P. Magnetotactic bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 36 (1), 217-238 (1982).
- Uebe, R., Schüler, D. Magnetosome biogenesis in magnetotactic bacteria. Nature Reviews Microbiology. 14 (10), 621 (2016).
- Faivre, D., Schuler, D. Magnetotactic bacteria and magnetosomes. Chemical Reviews. 108 (11), 4875-4898 (2008).
- Bazylinski, D. A., et al. Controlled biomineralization of magnetite (Fe3O4) and greigite (Fe3S4) in a magnetotactic bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 61 (9), 3232-3239 (1995).
- Lefèvre, C. T., et al. Diversity of magneto-aerotactic behaviors and oxygen sensing mechanisms in cultured magnetotactic bacteria. Biophysical Journal. 107 (2), 527-538 (2014).
- Heyen, U., Schüler, D. Growth and magnetosome formation by microaerophilic Magnetospirillum strains in an oxygen-controlled fermentor. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5-6), 536-544 (2003).
- Blakemore, R. P., Maratea, D., Wolfe, R. S. Isolation and pure culture of a freshwater magnetic spirillum in chemically defined medium. Journal of bacteriology. 140 (2), 720-729 (1979).
- Oestreicher, Z., Lower, S. K., Lin, W., Lower, B. H. Collection, isolation and enrichment of naturally occurring magnetotactic bacteria from the environment. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Pósfai, M., Lefèvre, M., Trubitsyn, C., Bazylinski, D. A., Frankel, R. Phylogenetic significance of composition and crystal morphology of magnetosome minerals. Frontiers in Microbiology. 4, 344 (2013).
- Wolfe, R. S., Thauer, R. K., Pfennig, N. A 'capillary racetrack' method for isolation of magnetotactic bacteria. FEMS Microbiology Ecology. 3 (1), 31-35 (1987).
- Schübbe, S., et al. Characterization of a spontaneous nonmagnetic mutant of Magnetospirillum gryphiswaldense reveals a large deletion comprising a putative magnetosome island. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5779-5790 (2003).
- Nadkarni, R., Barkley, S., Fradin, C. A comparison of methods to measure the magnetic moment of magnetotactic bacteria through analysis of their trajectories in external magnetic fields. PloS One. 8 (12), e82064 (2013).
- Waisbord, N., Lefèvre, C. T., Bocquet, L., Ybert, C., Cottin-Bizonne, C. Destabilization of a flow focused suspension of magnetotactic bacteria. Physical Review Fluids. 1 (5), 053203 (2016).
- Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (11), 3839-3844 (2004).
- Scheffel, A., et al. An acidic protein aligns magnetosomes along a filamentous structure in magnetotactic bacteria. Nature. 440 (7080), 110 (2006).
- Zhu, X., et al. Measuring spectroscopy and magnetism of extracted and intracellular magnetosomes using soft X-ray ptychography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (51), E8219-E8227 (2016).
- Schüler, D. Molecular analysis of a subcellular compartment: the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense. Archives of Microbiology. 181 (1), 1-7 (2004).
- Kolinko, I., et al. Biosynthesis of magnetic nanostructures in a foreign organism by transfer of bacterial magnetosome gene clusters. Nature Nanotechnology. 9 (3), 193 (2014).
- Hergt, R., et al. Magnetic properties of bacterial magnetosomes as potential diagnostic and therapeutic tools. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 293 (1), 80-86 (2005).
- Lefevre, C. T., et al. Novel magnetite-producing magnetotactic bacteria belonging to the Gammaproteobacteria. The ISME Journal. 6 (2), 440 (2012).
- Williams, T. J., Lefèvre, C. T., Zhao, W., Beveridge, T. J., Bazylinski, D. A. Magnetospira thiophila gen. nov., sp. nov., a marine magnetotactic bacterium that represents a novel lineage within the Rhodospirillaceae (Alphaproteobacteria). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 62 (10), 2443-2450 (2012).
- Zhu, K., et al. Isolation and characterization of a marine magnetotactic spirillum axenic culture QH-2 from an intertidal zone of the China Sea. Research in Microbiology. 161 (4), 276-283 (2010).
