Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Strukturelle studier av makromolekyler i løsning med liten vinkel X-Ray spredning

Published: November 5, 2018 doi: 10.3791/58538
Automatic Translation
1, 2, 2,4, 1,3,4
1Alberta RNA Research and Training Institute, Department of Chemistry and Biochemistry, University of Lethbridge, 2Department of Biochemistry, University of Alberta, 3Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 4DiscoveryLab, Faculty of Medicine & Dentistry, University of Alberta

Summary

Her presenterer vi hvor liten vinkel X-Ray spredning (SAXS) kan brukes til å få informasjon om lav oppløsning konvolutter representerer macromolecular strukturer. Når den brukes sammen med høy oppløsning strukturelle teknikker som Røntgenkrystallografi og kjernefysiske magnetisk resonans, kan SAXS gi detaljert innblikk i replikasjonen proteiner og macromolecular komplekser i-løsning.

Abstract

Protein-protein interaksjoner med proteiner med flere globular domener presentere tekniske utfordringer for å bestemme hvordan slik komplekser form og hvor de er orientert/plassert. Her, er en protokoll med potensial for Klargjørende hvilke bestemte domener megle interaksjoner i multicomponent systemet gjennom ab initio modellering beskrevet. En metode for å beregne løsning strukturer av makromolekyler og samlingene er gitt som involverer integrere data fra liten vinkel X-ray spredning (SAXS) og kromatografi atomic oppløsning strukturer sammen i en hybrid tilnærming. Et konkret eksempel er komplekset av full lengde nidogen-1, som samler ekstracellulær matrix proteiner og danner en utvidet, buede nanostructure. En av sine globular domener festes til laminin γ-1, som strukturer kjelleren membranen. Dette gir et grunnlag for å fastslå nøyaktig strukturene av fleksible replikasjonen protein komplekser og aktiveres som synchrotron kilder kombinert med robotikk og størrelse utelukkelse kromatografi sikkerhetssystemer. Denne kombinasjonen muliggjør rask analyse der flere oligomeric stater skilles like før SAXS datainnsamling. Analysen gir informasjon om radius gyration, partikkel dimensjon, molecular form og interdomain sammenkobling. Protokollen for å generere 3D-modeller av komplekser omrisset høyoppløselig strukturer av komponenten proteiner er også gitt.

Introduction

Celler inneholder intrikate nettverk av proteiner som molekylær maskiner å gjennomføre cellulære funksjoner som signaliserer cascades og opprettholde strukturell integritet. Som disse ulike komponenter flytte og arbeide i et tredimensjonalt rom gir opphav til bestemte funksjoner av macromolecules. Betydningen av proteinstruktur, dynamikk og interaksjoner å bestemme funksjonen har gitt behovet for kontinuerlig utvikling, komplekse teknikker å måle disse egenskapene. Av disse kjernefysiske magnetisk resonans (NRM), Røntgenkrystallografi (XRC) og mer nylig Cryo-elektron mikroskopi (CEM) gir høy oppløsning strukturinformasjon. Men XRC og CEM gi strukturer av en av mange biomolecular stater og mangler informasjon om dynamikken av protein, mens 3D proteinstrukturer av NMR er vanligvis begrenset til mindre globular proteiner. En måte å overvinne disse begrensningene er å utnytte liten vinkel X-Ray spredning (SAXS) for å generere molekylær konvolutter stor trafikk og kompleksbundet systemer, og kombinerer høy oppløsning stive macromolecular strukturer for å belyse den globale arkitektur og dynamiske funksjoner.

SAXS produserer lav konvolutter av macromolecular komplekser med en oppløsning på omtrent 10-20 Å 1, gi innsikt ikke bare i strukturen, men også dynamiske egenskapene som komplekset viser. Selv SAXS benytter røntgenbilder for å avdekke molekylære strukturen, er det i motsetning til XRC at tilfeldig isotropic retningen på partikler i løsningen ikke føre til Diffraksjon, men heller til spredning, som kan gi Atom løsning. I stedet genereres et elektron "konvolutten" av Makromolekyl som representerer et gjennomsnitt av konformasjonen som Makromolekyl viser. Denne informasjonen kan brukes i direkte montering av tidligere løst atomic oppløsning strukturer for å antyde regioner av fleksibilitet i en enkelt protein eller delenhet organisasjon eller dynamikk i et større, flere protein kompleks. SAXS data samles på synchrotrons med høy energi monokromatisk røntgenstråler eller fra interne kilder, som tilbyr en svakere røntgenstråler kilde som krever timer i stedet for sekunder av prøven eksponeringstid (figur 1). SAXS data samles ofte fra flere prøver med et enkelt eksperimentelle oppsett og buffer, krever en utvidet tid til å samle en rekke nyttige data på et system. Prøver bør derfor være stabile og ikke-samles i minst et par timer basert på verifiserbar kvalitetskontroll metoder som dynamisk lysspredning (DLS) og/eller analytisk ultracentrifuge (AUC) analyse å få høy kvalitet SAXS data2 , 3. her vi gir en praktisk beskrivelse av SAXS, prinsippene bak sin bruk, fordeler, begrensninger og eksempel forberedelse og fokusere tungt på innsamling og analyse, sammen med rørende kort på ab initio modellering bruker den ekstracellulær matrix proteiner nidogen-1 og laminin γ-1 eksperimentelle eksempel.

Prinsipper, fordeler og begrensninger av SAXS:

Den styrende principle(s) bak SAXS er relativt enkel: en løsning for den monodispersed macromolecule(s) rundt er plassert i en kapillære og er utsatt for en høy energi monokromatisk røntgenbilde stråle. Fotoner gjøre elektroner av atomic skallet begynner oscillerende, resulterer i en sfærisk bølge som slippes ut av samme energi og bølgelengde. Siden hver elektron vil svinge, en konstant bakgrunn vil oppnås, og resulterende elektron tetthet i Makromolekyl kontrasteres til bakgrunnen. Resulterende spredning intensiteten samles som en funksjon av spredning vinkelen, 2Θ (figur 1).

Mens andre teknikker som XRC, NMR og CEM gir strukturell informasjon til Atom-nivå, det er flere fordeler til SAXS som andre teknikker ikke kan gi. SAXS kan utføres i nesten alle buffer og krever ikke noen spesielle eksempel forberedelser. Dette er spesielt viktig i å studere atferd og strukturen i makromolekyler under varierende forhold, for eksempel tilstedeværelse eller fravær av mono - eller divalent kasjoner eller endringer i pH4,5. SAXS har muligheten til å gi informasjon om fleksibel områder en Makromolekyl6, noe de andre børsnoterte teknikkene kan sliter med. Derfor kan SAXS brukes som en sterk gratis teknikk med den stabile delen av en Makromolekyl blir studert med XRC, NRM eller CEM og hele Makromolekyl eller komplekse analysert i lav oppløsning med SAXS og kombinert med forskjellige analyseverktøy som slike som FoXSDock7 eller CRYSOL8. Siden SAXS er en løsning teknikk, brukes det ofte å bekrefte hvis statiske strukturer som de fra XRC er konsekvente i løsning6. SAXS har også fordelen av å være en teknikk som krever en relativt liten mengde eksempel investeringer (vanligvis 50-100 µL) og en relativt liten mengde eksperiment tid (30 min - 1 h).

Den største begrensningen av SAXS er prøven aggregering og/eller fornedrelse, som kan føre til feilaktige strukturelle spådommer. En samling, så lav som 5%, kan spre lys i svært høye mengder, fører til en overvurdering av maksimal partikkel dimensjon (DMaks) og radius av gyration (Rg). På den annen side, kan prøve fornedrelse føre til lavt molekylær egenskaper. Dette sikkerhetsproblemet oppstår fra SAXS blir en snitt teknikk, som betyr at prøven homogenitet er kritisk for å oppnå pålitelige og reproduserbar. Noen eksempler som skal analyseres av SAXS bør derfor gjennomgå flere metoder for rensing og homogenitet sjekker, som denaturing og innebygd gel geleelektroforese, størrelse utelukkelse Ture, dynamisk lys spredning, og analytisk ultracentrifugation. Ofte kjører SAXS beamlines prøver gjennom høy ytelse flytende kromatografi som en siste kvalitetssikring trinn før SAXS (S-SAXS)3,9. SAXS data skal samles i flere konsentrasjoner og de Rg hvert datasett skal sammenlignes, sikrer en nær likhet for å unngå interparticle vekselsvirkningene og aggregering, som resulterer i en overvurdering av partikkel dimensjoner, fører til unøyaktige dataanalyse og modellering. Siden spredning er avhengig av både konsentrasjon og størrelse, kan mindre makromolekyler kreve en mer spesifikk optimalisering av området konsentrasjon. Dette skyldes Gjensidighet teoremet, hvor store størrelser scatter mot små vinkler og små størrelser mot store vinkler. Dette manifesterer i datainnsamling, der IO er proporsjonal med R6, der R er radius partikkel. Et siste begrensning av SAXS er potensialet for stråling skader prøven under eksponering, som kan føre til forvrengning av dataene. Det er lurt å sammenligne prøve kvalitet før og etter SAXS eksempel eksponering å sikre dette ikke skjer.

Protocol

1. SAXS prøve forberedelse og datainnsamling

  1. Eksempel forberedelse:
    1. SAXS eksperimenter krever homogen, stabil og ikke-aggregering protein prøver; observere stabilitet og oligomeric tilstand med størrelse utelukkelse kromatografi (S), DLS og/eller AUC før datainnsamlingen.
    2. Underlagt prøver (nidogen-1 og laminin γ-1 i dette tilfellet) til DLS analyse og tricine SDS side å visualisere eksempel renhet10.
      Merk: Utvalg kan dekke en rekke konsentrasjoner (1-4 mg/mL) avhengig av sin størrelse, sin løsning atferd som selv association og aggregering sammen med stabilitet; her, fem konsentrasjoner av nidogen-1, (139 kDa), tre av laminin γ-1 (109 kDa) og fire av S-renset ekvimolare komplekset ble utarbeidet som beskrevet tidligere10.
  2. Datainnsamling:
    1. Samle inn SAXS data bruker et internt system eller synchrotron, i henhold til produsentens eller anlegg retningslinjer.
      Merk: Dataene som brukes i dette arbeidet ble samlet inn med et internt system (se Tabell for materiale) som inneholder en 3-pinhole kameraet utstyrt med + 002 microfocus forseglet tube (Cu Kα skjermens 1,54 Å) og AC Confocal Max-Flux (CMF) optikk opererer på 40 W. Systemet er også utstyrt med en 200 nm multi wire 2D detektor for datainnsamling. Men med tilgjengeligheten av moderne synchrotrons i Frankrike, Tyskland, Storbritannia, USA og andre land, som gir tilgang til en S-SAXS oppsett som muliggjør separasjon av en monodispersed forberedelse fra mulig aggregering/fornedrelse, vi nå rutinemessig samle inn data på synchrotron anlegg. En nylig publisert artikkel på en DNA G-quadrapleksbilder11 er et eksempel på en S-SAXS data samling strategi. I dette tilfellet SAXS dataene ble samlet i størrelsesorden 0,08 ≤ q ≤ 0.26 Å i 3 timer for nidogen-1 (2.0, 2.5, 3.0, 3.5 og 4.0 mg/mL); den laminin γ-1 (1.5, 2.0 og 2,5 mg/mL) og deres kompleks (0,8, 1.0, 1,25 og 1.5 mg/mL).
    2. Redusere data for bufferen og prøver ved prosessering programvare spesifikke for systemet. Trekk buffer bidraget fra protein data ved hjelp av et program som PRIMUS/qt12 (figur 2A).

2. dataanalyse

Merk: I dag er det noen programvarepakker som er nyttige for SAXS analyse: ScÅtter43 (nedlasting tilgjengelig på www.bioisis.net) og bioXtas rå44ATSAS suite13. Denne delen gir en oversikt over generelle trinn tas når analysere rå SAXS dataene med ATSAS program suite og bestemt skritt er tatt fra ATSAS 2.8.1 nedlasting. Andre programmer kan brukes og er kort omtalt senere.

  1. Buffer subtraksjon
    Merk: Disse trinnene er relevante for statisk SAXS prøver bare.
    1. Velg alternativet "Åpne" i PRIMUS/qt og velger datafilene av interesse. Vær oppmerksom på at datafiler må være i ASCII-format, der den første kolonnen er s-vector aksen og den andre kolonnen er intensiteten. Gjenta dette trinnet for samlet inn bufferen selv ved å sette inn dataene i den samme menyen.
    2. Velg "SUBTRAKSJON" i vinduet behandling som vil generere en trukket fra spredning kurve som representerer bare spredning fra Makromolekyl rundt. Gjenta dette trinnet for hver konsentrasjon.
  2. Guinier analyse
    1. For å utføre Guinier analyse, Legg en buffer trukket scatter kurve i PRIMUS/qt som beskrevet tidligere i trinn 2.1.1.
    2. Klikk "Radius av Gyration" som fortsetter i åpningen Primus Guinier veiviseren. en tomt ln(I) vs q2 vises.
    3. For å få bruker en foreløpig Rg funksjonen "AUTORG", som er en ekstern modul bygget inn PRIMUS/QT finne knappen "Autorg" og klikk på den.
    4. Angi flere filer samtidig ved å merke dem og sette dem inn på menyen på høyre side, ligner 2.1.1.
    5. Bruke Guinier handlingen skapt tidligere å vurdere datakvaliteten; den grønne linjen under Guinier handlingen viser resterende tomten som representerer en linearitet av passer. Vær oppmerksom på at ikke-linearitet i Guinier analyse kan være et tegn for eksempel aggregasjon og videre analyse bør ikke utføres i dette tilfellet.
      Merk: En lineær Guinier plass gir en Rg med mindre feil (< 5%) og foreslår et førsteklasses utvalg.
  3. Kratky analyse
    1. Laste dataene bli visualisert på en lignende måte som beskrevet ovenfor.
    2. Klikk på "Velg BOKSEN" ved datafilnavnet. Dette vil tegne inn dataene i et eget vindu.
    3. Klikk på "TOMTEN"-knappen etterfulgt av "Kartky tomten" utvalg på rullegardinmenyen.
    4. Dette vil tegne inn dataene som "q2 x L(q) vs q". Vær oppmerksom på at globular proteiner viser en Gaussian topp, mens ufalsede proteiner viser et platå i stedet for en topp og ligne en hyperbolsk tomten17.
  4. Data sammenslåing
    1. Last buffer trukket dataene for hver konsentrasjon i PRIMUS/qt igjen, som i trinn 2.1.1.
    2. Hvis du vil flette dataene, klikk på knappen "Flette" i vinduet behandling.
    3. Kontroller hver kurve og I skala nummer, som korrelerer til fortynninger av den opprinnelige prøven.
      Merk: Eksempler på høyere konsentrasjon vise mindre støy i regionen halen av kurver.
  5. P(r) distribusjon
    1. Vil generere P(r) tomten, Legg flettede data kurver i PRIMUS/qt som beskrevet tidligere.
    2. Klikk på knappen "Avstand fordeling" åpne et nytt vindu presenterer de flettede dataene av intensiteten av spredte lys vs q og par-avstand distribusjon funksjonen tomten på høyre side.
      Merk: Informasjonen på høyre side viser den generelle kvaliteten på par-avstand distribusjon funksjonen beregningene.
    3. Justere data på de flettede dataene å unngå betydelig støy på halen slutten av rådata.
    4. Utelate datapunkter nær strålen stopp i regionen low-q.
    5. Å avgjøre DMaks, start med en rekke ~ 5 ganger Rg fra Guinier analysen. Gradvis redusere denne verdien til P(r) tomten ikke slipp brått til null på y-aksen og ikke har en lang hale før nærmer null.
    6. Kontroller at den eksperimentelle Rg/jeg0 (avledet fra Guinier tilnærming) og P(r) Rg/jeg0tallene er lignende.
      Merk: I noen tilfeller videre manipulasjon på området, datapunkter og ALPHA (en regularisering parameter som forteller programmet forholdet mellom hvor mye oppmerksomhet til jevne fordelingen sammenlignet med passende eksperimentelle data) er også nødvendig21 å få en god kvalitet P(r) tomt.

3.b initio perle modellering og snitt

  1. Når dataene samles inn i flere konsentrasjoner er slått sammen, eller data som samles inn ved hjelp av S-SAXS er minimert og Kratky plot, P(r) plot og Guinier analyse er bekreftet, beregne lavoppløselig strukturer av makromolekyler og deres komplekser. Denne rørledningen kan brukes til å studere løsning strukturer og interaksjoner nucleic syrer, proteiner og nukleinsyrer protein eller protein-protein komplekser10,11,21,22,23 ,24,25,26,27,28,29,30,31,32 ,33,34. En av de mest populære programmene er DAMMIN, utviklet av Svergun35 og en del av den ATSAS pakke13, som sysselsetter simulert annealing protokoller med foreløpig inndatainformasjon Rg og Dmax . Ab initio modellering tilnærminger og prinsipper er beskrevet i detalj andre steder18,36.

Representative Results

Data analyse tilnærming beskrevet ovenfor ble benyttet for å beregne Rg og DMaks for nidogen-1, laminin γ-1 og deres komplekse funksjonen P(r). Vi fikk Rg verdiene 7.20 (±0.10)-nm, 8.10 (±0.20)-nm og 10,9 (±0.4)-nm for nidogen-1, laminin γ-1 og deres komplekse henholdsvis (figur 2A-B). I tillegg DMaks verdier av 24 nm, 26 nm og 35 nm for nidogen-1, laminin γ-1 og deres komplekse henholdsvis (figur 2)10 ble innhentet. DAMMIF programmet ble brukt til å få lav strukturer av nidogen-1 og laminin γ-1, som foreslo at begge proteiner vedta en utvidet figur i løsningen. X og NSD verdiene for nidogen-1 (~ 1 og 0,8) og laminin γ-1 (~0.9 og 0,8 henholdsvis) var også i det godkjente verdiområdet. Justering av høyoppløselige strukturer, to domener av nidogen-1 og to av laminin γ-1, på deres lav strukturer får SAXS tillatt identifikasjon deres N - og C-terminalen regioner10.

Nidogen-1 ble identifisert som laminin γ-139,40 samspill partner og samhandling området ble tilordnet bruker Røntgenkrystallografi til C-terminalen domener41. Men involvert høy oppløsning strukturer bare samhandlende domener og ikke full lengde nidogen-1 eller hele laminin γ-1 armen. Derfor renset vi en kompleks som inneholder nidogen-1 (full lengde) og laminin γ-1 armen å identifisere samspill regionene også for å studere relative retningen til N-terminal domener av begge proteiner. SAXS dataene for komplekset gitt en Rg 10,9 nm (±0.4) og en DMaks 35 nm. Vi anvende MONSA for å få lav strukturen i hele komplekset, som foreslo at faktisk bare regionen C-terminalen i begge proteiner delta på formidling interaksjoner, mens resten av domenene er langt fra hverandre ( Figur 3, Video 1).

Figure 1
Figur 1. Skjematisk av SAXS oppsett. En monodispersed forberedelse av biomolecules eller deres komplekser er forberedt, etterfulgt av eksponering for røntgenstråler høy energi. Energien i røntgen og prøve å kilde avstand kan variere avhengig av kilden (f.eks, interne g. synchrotron). Det x-utstråler spredning mønster (avhenger av størrelsen og formen på biomolecules) registreres og radielt gjennomsnitt for å få en 1-dimensjonal tomt (1D) som inneholder informasjon om intensiteten av spredte lys forhold til spredning vinkelen. Som buffer molekyler også spre lys, er bidragene fra disse molekylene trukket for å få en spredning mønster av biomolecules rundt. På synchrotron, før SAXS datainnsamling, utføres også vanligvis en ekstra rensing trinn med innebygd størrelse utelukkelse/høy-gjennomførelse kromatografi (ovenfra). Dette trinnet er avgjørende for å fjerne akkumulert og/eller dårligere produkter også som for å fjerne eventuelle ubundet biomolecules fra komplekset. 1D spredning tomten konverteres til electron par-avstand distribusjon handlingen (P(r) plot), som gir radius av gyration og maksimal partikkel dimensjonen av biomolecules. Denne tomten brukes som inndatafilen for den ab initio modellering pakkene (dvs. DAMMIN/DAMMIF) for å få lav strukturer av biomolecules, eller andre pakker (dvs. SASREF/CORAL) om høyoppløselige strukturen i deler av den biomolecules eller personlige biomolecules av komplekset er kjent.  Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. (A) en tomt på en intensitet for spredte lys vs spredning vinkel (q = 4πsinθ/λ, nm-1) antyder kvaliteten på biomolecules (lav område) og formen (høy region) på biomolecules. (B) elektron par-avstand distribusjon P(r) bestemmes av spredning dataene antyder en avlang form av biomolecules under etterforskning (laminin γ-1, nidogen-1 og deres komplekse). (C) Kratky handlingen antyder at nidogen-1 og laminin γ-1 proteiner er ikke utbrettet. (D) Guinier handlingen for nidogen-1, laminin γ-1 og deres komplekse, som angir den lineære regionen for fastsettelse av radius av gyration bruker data i lav-spredning vinkel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Lav oppløsning struktur av kompleks av nidogen-1 og laminin γ-1 oppnås ved analyse av flettede datasett ved hjelp av programmet MONSA. Fargevalget er det samme som tallet 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Movie 1
Video 1. Lav oppløsning strukturen av nidogen-1 og laminin γ-1 komplekset. Denne filmen ble tilberedt med PYMOL for å visualisere ulike strukturelle funksjoner av komplekset. Krystallstruktur av laminin-nidogen komplekset (PDB-ID: 1NPE) er vist som båndet tegneserier, fremhever den samspill nettsteder for dette komplekset. Fargevalget er det samme som tallet 2. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Discussion

De avgjørende skritt av SAXS dataanalyse i delen protokollen denne papir Inkluder buffer subtraksjon, Guinier analyse, Kratky analyse, sammenslåing av data og P(r) distribusjon. Ab initio perle modellering for omfattende dekkes her i detalj og derfor bare dekket kort.

Synchrotrons (f.eks DESY i Tyskland, DIAMANT i Storbritannia og ESRF i Frankrike), er det mulig å samle inn SAXS data for en svært liten brøkdel (~ noen µL) av hvert utvalg som fraksjoner er som elut fra kolonnen s dvs koblet innebygd (se figur 1 ). Elastisk spredte SAXS dataene er radiellt gjennomsnitt bruker pakkene levert av instrumentet produsenten eller synchrotron før bufferen subtraksjon kan finne sted. 1D resultatdataene representerer mengden spredte lys (i jeg(q)) på Y-aksen og spredning vinkel (q= 4πsinθ/λ, der λ er bølgelengdeområdet av hendelsen X-stråler) og er skissert i figur 1. Programmet PRIMUS/qt12 brukes direkte trekke noen bakgrunn på grunn av buffer og er beskrevet i avsnitt 1.1. Andre programmer som; ScÅtter43 (nedlasting tilgjengelig på www.bioisis.net) med en opplæring som er tilgjengelig på https://www.youtube.com/channel/UCvFatdC5HcZOLv6OSjblfeA, og bioXtas rå44 (tilgjengelig på https:// bioxtas-raw.readthedocs.io/en/Latest/index.html) kan brukes som et alternativ til ATSAS pakken.

Guinier analysen gir informasjon om eksempel aggregering og homogenitet samt gi Radius av Gyration (Rg) for Makromolekyl på rente basert på SAXS data fra den lave s regionen14. Et plott er konstruert med PRIMUS/qt for SAXS data fra hver konsentrasjon, etterfulgt av kurven som passer med maksimal rekkevidde på opptil 1,30 for q x Rg. En monodispersed utvalg forberedelse bør gi en lineær Guinier handling i denne regionen (figur 2D), mens aggregering resultater i en lineær Guinier plot15,16. Hvis Guinier analysen er lineære, kan graden av "unfoldedness" av en Makromolekyl rundt observeres med Kratky handlingen, som er nyttig når man beslutter å utføre rigid kropp modellering eller konstruere ensembler lavoppløselig modeller. En globular protein vises i en Kratky plot har en klokkeformet kurve, mens utvidet molekyler eller falset peptider vises platået eller selv øke i større q området og mangler bell-figuren (figur 2C).

Få Rg fra Guinier analyse vurderer bare datapunkter fra lav q regionen av 1 D spredningsdiagram (figur 2D), men det er mulig å bruke nesten hele datasettet for å utføre en indirekte Fourier transformasjon konvertere gjensidige-space informasjon om ln (I (q)) vs (q) til en ekte verdensrommet avstand fordeling (P(r)) som gir informasjon om DMaks og Rg (Figur 2B) Formen på P(r) handlingen representerer brutto løsning konformasjon av Makromolekyl rundt18,19. konvertering av gjensidig områdedata til real-områdedata er et kritisk punkt, men en detaljert beskrivelse er ikke innenfor dette papiret. Derfor se en artikkel av Svergun20 å forstå hver parameter.

Når bufferen trukket data personlige konsentrasjoner behandles gjennom Guinier analyse med en konsekvent verdi for Rg, etterfulgt av undersøke sine folding mønster Kratky analyse, disse dataene kan flettes. De flettede dataene presenteres for nidogen-1, laminin γ-1 og deres komplekset ble behandlet som beskrevet ovenfor, og den resulterende P(r) tomter i finne 2B. Ideelt sett bør man også beregne den par-avstand funksjonen P(r) for hver konsentrasjon å finne ut om SAXS samles for hver konsentrasjon gir lignende Rg og DMaks verdier. Hvis Rg og Dmax er like over en rekke konsentrasjoner, bør så du fortsette. Det bør bemerkes at avhengig av signalet, data kan bli avkortet før fletting av data. Dette er ofte tilfellet hvis den konsentrasjoner og/eller molekylvekt av macromolecules under etterforskning er lav.

Lav form analyse ved hjelp av DAMMIN kan utføres i ulike moduser (f.eks rask, sakte, ekspert modi, osv.). Rask modus er en ideelle første skrittet evaluere hvis P(r) handlingen gir god kvalitet modeller. Vanligvis kan minst 10 modeller skaffes for hver P(r) plott å sjekk hvis reproduserbar resultatene med lav oppløsning strukturen, er oppnådd, med en lav godhet av fit parameter som heter χ (en verdi på 0,5-1.0 regnes som god basert på vårt omfattende arbeid ), en verdi som beskriver en avtale mellom eksperimentelt samlet SAXS og modell-avledet data. For publikasjonen formål, vi vanligvis bruker langsom eller ekspert modus og Beregn minst 15 modeller. DAMMIN, en raskere versjon av det DAMMIF37, samt GASBOR38 er også alternativer. Videre for å studere protein-protein eller protein-nukleinsyre komplekser, er det mulig å bruke den MONSA programmet35, som muliggjør samtidige montering av de individuelle SAXS dataene for både makromolekyler samt deres komplekse. Mer om høyoppløselige modell beregninger samt for RNA-protein samhandling studier, se en nylig artikkel av Patel et al3.

SAXS er teoretisk enkel, men utvilsomt en svært utfyllende metode til andre strukturell biologi verktøy og resultater i lav oppløsning strukturelle data som kan brukes på egen hånd eller sammen med høy oppløsning teknikker for å belyse informasjon om macromolecular struktur og dynamikk. Så lenge en monodispersed forberedelse makromolekyler og deres komplekser kan oppnås, kan SAXS brukes til å studere i-løsning struktur og interaksjoner type biologiske Makromolekyl. Ved komplekset diskutert her, er det bemerkelsesverdig at mindre enn 10% av total tilgjengelig arealet av nitrogen-1 og laminin γ-1 er gravlagt i dette komplekset, mens resten av domener av begge proteiner er fritt tilgjengelig til å samhandle med andre proteiner på ekstracellulær matrix å opprettholde sin strukturell stabilitet (Figur 3). Innhenting av slik informasjon for et kompleks med ~ 240kDa ville være svært utfordrende bruker andre strukturell biologi teknikker som Røntgenkrystallografi, NMR og Cryo-EM mikroskopi.

Avdekke proteinstruktur via Røntgenkrystallografi eller NMR er en iboende tidkrevende prosess. Denne flaskehals i proteinstrukturer er et område hvor SAXS viser sin styrke som en strukturell teknikk; datainnsamling for ett enkelt SAXS eksperiment kan ta mindre enn en time, og med hjelp av strømlinjeformet analyseprogramvare, analyse kan gjøres raskt og effektivt. SAXS har potensial til å øke gjennomstrømming strukturelle studier som en frittstående teknikk fordi det tilbyr en lav oppløsning modell av macromolecular før høyoppløselig data er tilgjengelige. En barriere til andre strukturelle teknikker er behovet for en svært ren, konsentrert utvalg for datainnsamling, som nødvendiggjør høy protein uttrykk og stabilitet over lang tid. Mens SAXS prøver også måtte være ren og konsentrert, prøve volumene er omtrent 100 µL gjør SAXS en relativt rimelig metode for analyse sammenlignet med andre strukturelle teknikker. Videre er SAXS kombinert med størrelse utelukkelse kromatografi stadig mer vanlig som gir et ekstra kvalitetskontroll skritt. Nylig har det vært sterke fremskritt i kombinasjonen av NMR og SAXS data ved hjelp av Ensemble optimalisering metoden (EOM)45,46 for å belyse fleksibel systemer. I en nyere artikkel av Mertens og Svergun47beskriver forfatterne flere nyere eksempler på EOM SAXS i kombinasjon med NMR, sammen med mange andre eksempler på SAXS data brukes i forbindelse med NMR. Fremskritt blir stadig blir gjort innen SAXS, og nye teknikker blir utviklet for SAXS som skal brukes sammen med, ikke bare gratis til andre strukturelle teknikker. Vi tror derfor at etterspørselen etter SAXS bare vil øke over tid, spesielt i forbindelse med NMR å karakterisere dynamiske systemer der funksjoner er definert av fleksibilitet.

Disclosures

Forfatterne har ingen avsløringer å erklære.

Acknowledgments

Dette prosjektet har blitt støttet av NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta innovasjon Program (RCP-12-002 C) og Alberta Prion Research Institute / Alberta fornyer Bio løsninger (201600018) tilskudd tildeles M.O. TRP er en Canada forskning stol i RNA & Protein biofysikk (201704) og erkjenner NSERC Discovery grant (RGPIN-2017-04003). TM er finansiert av NSERC funnet stipendet til TRP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK 293 EBNA Cell Line In-Lab availability - Cell line used to overexpress protein(s)
Ni Sepharose High Performance histidine-tagged protein purification resin GE Healthcare 17524801 Affinity protein purification resin
Superdex 200 Increase 10/300 GE Healthcare 28990944 SEC Column
ÄKTA Pure FPLC GE Healthcare - FPLC System
Nanodrop Nanodrop - Spectrophotometer
Basic Reagents (NaCl, Tris-HCl etc.)
S-MAX3000 Rigaku - SAXS Pinhole Camera System
Zetasizer Nano-S Malvern Instruments Ltd - Dynamic Light Scattering instrument
0.1µm Filter Millipore JVWP04700 Used to Concentrate Sample Prior to DLS
Thrombin cleavage kit abcam ab207000 Thrombin cleavage to remove His tag
Strep-Tactin Sepharose Column IBA 2-1201-010 Strep-Tag Affinity Purification
D-desthiobiotin Sigma-Aldrich 533-48-2 Elution of Strep Tag Protein
Software
SAXGUI Rigaku - Data Collection for SAXS and data reduction
ATSAS Suit Franke et al., 2017 - SAXS Data Analysis Software program suite
PRIMUS Konarev et al., 2003 - Buffer Subtraction
GNOM Svergun, 1992 - Rg, Dmax and p(r) Calculation
DAMMIF Franke and Svergun, 2009 - Ab initio model calculation
DAMAVER Volkov and Svergun, 2003 - Averaged Solution Conformation calculations
MONSA Svergun, 1999 - Simultaneous model fitting for the complex
GASBOR Svergun et al., 2001 - Alternative Ab initio model calculations
DTS Software V6.20 Malvern Instruments Ltd - DLS supplied instrument software
PyMOL Schrodinger, LLC. - The PyMOL Molecular Graphics System V2.0
The Protein Data Bank Berman et al., 2000 - PDB ID: 1NPE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Advances in structure analysis using small-angle scattering in solution. Current Opinion in Structural Biology. 12 (5), 654-660 (2002).
  2. Patel, T. R., Chojnowski, G., Koul, A., McKenna, S. A., Bujnicki, J. M. Structural studies of RNA-protein complexes: A hybrid approach involving hydrodynamics, scattering, and computational methods. Methods. 118, 146-162 (2017).
  3. Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
  4. Uversky, V. N., Gillespie, J. R., Fink, A. L. Why are “natively unfolded” proteins unstructured under physiologic conditions? Proteins. 41 (3), 415-427 (2000).
  5. Uversky, V. N., Gillespie, J. R., Millett, I. S., Khodyakova, A. V., Vasiliev, A. M., Chernovskaya, T. V., Abramov, V. M. Natively Unfolded Human Prothymosin α Adopts Partially Folded Collapsed Conformation at Acidic pH. Biochemistry. 38 (45), 15009-15016 (1999).
  6. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
  7. Schneidman-Duhovny, D., Hammel, M., Tainer, J. A., Sali, A. FoXS, FoXSDock and MultiFoXS: Single-state and multi-state structural modeling of proteins and their complexes based on SAXS profiles. Nucleic Acids Research. 44, 424-429 (2016).
  8. Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL - a Program to Evaluate X-ray Solution Scattering of Biological Macromolecules from Atomic Coordinates. Journal of Applied Crystallography. 28 (6), 768-773 (1995).
  9. Pérez, J., Vachette, P. A Successful Combination: Coupling SE-HPLC with SAXS. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1009, 183-199 (2017).
  10. Patel, T. R., Bernards, C., Meier, M., McEleney, K., Winzor, D. J., Koch, M., Stetefeld, J. Structural elucidation of full-length nidogen and the laminin-nidogen complex in solution. Matrix Biology. 33, 60-67 (2014).
  11. Meier, M., Moya-Torres, A., Krahn, N. J., McDougall, M. D., Orriss, G. L., McRae, E. K. S. Structure and hydrodynamics of a DNA G-quadruplex with a cytosine bulge. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. Franke, D., Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Panjkovich, A., Tuukkanen, A., Mertens, H. D. T. ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50, 1212-1225 (2017).
  13. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1277-1282 (2003).
  14. Tuukkanen, A. T., Svergun, D. I. Weak protein-ligand interactions studied by small-angle X-ray scattering. The FEBS Journal. 281 (8), 1974-1987 (2014).
  15. Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).
  16. Koch, M. H., Vachette, P., Svergun, D. I. Small-angle scattering: a view on the properties, structures and structural changes of biological macromolecules in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 36 (2), 147-227 (2003).
  17. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40 (3), 191-285 (2007).
  18. Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Applications of small-angle X-ray scattering to biomacromolecular solutions. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (2), 429-437 (2013).
  19. Svergun, D. I. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25 (4), 495-503 (1992).
  20. Patel, T. R., Morris, G. A., Zwolanek, D., Keene, D. R., Li, J., Harding, S. E. Nano-structure of the laminin γ-1 short arm reveals an extended and curved multidomain assembly. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 29 (7), 565-572 (2010).
  21. Patel, T. R., Reuten, R., Xiong, S., Meier, M., Winzor, D. J., Koch, M., Stetefeld, J. Determination of a molecular shape for netrin-4 from hydrodynamic and small angle X-ray scattering measurements. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 31 (2), 135-140 (2012).
  22. Dzananovic, E., Patel, T. R., Deo, S., McEleney, K., Stetefeld, J., McKenna, S. A. Recognition of viral RNA stem-loops by the tandem double-stranded RNA binding domains of PKR. RNA. 19 (3), New York, N.Y. 333-344 (2013).
  23. Meier, M., Patel, T. R., Booy, E. P., Marushchak, O., Okun, N., Deo, S. Binding of G-quadruplexes to the N-terminal recognition domain of the RNA helicase associated with AU-rich element (RHAU). The Journal of Biological Chemistry. 288 (49), 35014-35027 (2013).
  24. Dzananovic, E., Patel, T. R., Chojnowski, G., Boniecki, M. J., Deo, S., McEleney, K. Solution conformation of adenovirus virus associated RNA-I and its interaction with PKR. Journal of Structural Biology. 185 (1), 48-57 (2014).
  25. Bacik, J. -P., Tavassoli, M., Patel, T. R., McKenna, S. A., Vocadlo, D. J., Khajehpour, M., Mark, B. L. Conformational itinerary of Pseudomonas aeruginosa 1,6-anhydro-N-acetylmuramic acid kinase during its catalytic cycle. The Journal of Biological Chemistry. 289 (7), 4504-4514 (2014).
  26. Deo, S., Patel, T. R., Dzananovic, E., Booy, E. P., Zeid, K., McEleney, K. Activation of 2’ 5’-oligoadenylate synthetase by stem loops at the 5’-end of the West Nile virus genome. PloS One. 9 (3), e92545 (2014).
  27. Vadlamani, G., Thomas, M. D., Patel, T. R., Donald, L. J., Reeve, T. M., Stetefeld, J., Mark, B. L. The β-lactamase gene regulator AmpR is a tetramer that recognizes and binds the D-Ala-D-Ala motif of its repressor UDP-N-acetylmuramic acid (MurNAc)-pentapeptide. The Journal of Biological Chemistry. 290 (5), 2630-2643 (2015).
  28. Deo, S., Patel, T. R., Chojnowski, G., Koul, A., Dzananovic, E., McEleney, K., McKenna, S. A. Characterization of the termini of the West Nile virus genome and their interactions with the small isoform of the 2’ 5’-oligoadenylate synthetase family. Journal of Structural Biology. 190 (2), 236-249 (2015).
  29. Ariyo, E. O., Booy, E. P., Patel, T. R., Dzananovic, E., McRae, E. K., Meier, M., McKenna, S. A. Biophysical Characterization of G-Quadruplex Recognition in the PITX1 mRNA by the Specificity Domain of the Helicase RHAU. PloS One. 10 (12), (2015).
  30. Hyde, E. I., Callow, P., Rajasekar, K. V., Timmins, P., Patel, T. R., Siligardi, G., Scott, D. J. Intrinsic disorder in the partitioning protein KorB persists after co-operative complex formation with operator DNA and KorA. The Biochemical Journal. 474 (18), 3121-3135 (2017).
  31. Dzananovic, E., Astha, null, Chojnowski, G., Deo, S., Booy, E. P., Padilla-Meier, P., McKenna, S. A. Impact of the structural integrity of the three-way junction of adenovirus VAI RNA on PKR inhibition. PloS One. 12 (10), (2017).
  32. Krahn, N., Meier, M., To, V., Booy, E. P., McEleney, K., O’Neil, J. D., Stetefeld, J. Nanoscale Assembly of High-Mobility Group AT-Hook 2 Protein with DNA Replication Fork. Biophysical Journal. 113 (12), 2609-2620 (2017).
  33. Patel, T. R., Besong, T. M. D., Meier, M., McEleney, K., Harding, S. E., Winzor, D. J., Stetefeld, J. Interaction studies of a protein and carbohydrate system using an integrated approach: a case study of the miniagrin-heparin system. European Biophysics Journal: EBJ. , (2018).
  34. Svergun, D. I. Restoring low resolution structure of biological macromolecules from solution scattering using simulated annealing. Biophysical Journal. 76 (6), 2879-2886 (1999).
  35. Blanchet, C. E., Svergun, D. I. Small-Angle X-Ray Scattering on Biological Macromolecules and Nanocomposites in Solution. Annual Review of Physical Chemistry. 64 (1), 37-54 (2013).
  36. Volkov, V. V., Svergun, D. I. Uniqueness of ab initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 36, 860-864 (2003).
  37. Kozin, M. B., Svergun, D. I. Automated matching of high- and low-resolution structural models. Journal of Applied Crystallography. 34 (1), 33-41 (2001).
  38. Franke, D., Svergun, D. I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (Pt 2), 342-346 (2009).
  39. Svergun, D. I., Petoukhov, M. V., Koch, M. H. J. Determination of Domain Structure of Proteins from X-Ray Solution Scattering. Biophysical Journal. 80 (6), 2946-2953 (2001).
  40. Baumgartner, R., Czisch, M., Mayer, U., Pöschl, E., Huber, R., Timpl, R., Holak, T. A. Structure of the nidogen binding LE module of the laminin gamma1 chain in solution. Journal of Molecular Biology. 257 (3), 658-668 (1996).
  41. Stetefeld, J., Mayer, U., Timpl, R., Huber, R. Crystal structure of three consecutive laminin-type epidermal growth factor-like (LE) modules of laminin gamma1 chain harboring the nidogen binding site. Journal of Molecular Biology. 257 (3), 644-657 (1996).
  42. Takagi, J., Yang, Y., Liu, J. -H., Wang, J. -H., Springer, T. A. Complex between nidogen and laminin fragments reveals a paradigmatic beta-propeller interface. Nature. 424 (6951), 969-974 (2003).
  43. Förster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J. Appl. Cryst. 43, 639-646 (2010).
  44. Hopkins, J. B., Gillilan, R. E., Skou, S. BioXTAS RAW: improvements to a free open-source program for small-angle X-ray scattering data reduction and analysis. J. Appl. Cryst. 50, 1545-1553 (2017).
  45. Bernadó, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. (17), 5656-5664 (2007).
  46. Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).
  47. Mertens, H. D. T., Svergun, D. I. Combining NMR and small angle X-ray scattering for the study of biomolecular structure and dynamics. Arch Biochem Biophys. 628, 33-41 (2017).

Tags

Biokjemi problemet 141 ekstracellulær matrix proteiner hybrid løsning struktur laminin trafikk protein nidogen protein samhandling proteinstruktur strukturell domene liten vinkel X-ray spredning tredimensjonal modell
Strukturelle studier av makromolekyler i løsning med liten vinkel X-Ray spredning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mrozowich, T., McLennan, S.,… More

Mrozowich, T., McLennan, S., Overduin, M., Patel, T. R. Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering. J. Vis. Exp. (141), e58538, doi:10.3791/58538 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter