Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Strukturelle undersøgelser af makromolekyler i løsning ved hjælp af små vinkel X-Ray spredning

doi: 10.3791/58538 Published: November 5, 2018

Summary

Vi præsenterer her, hvordan lille vinkel X-Ray spredning (SAXSA) kan udnyttes til at få oplysninger om lav opløsning konvolutter repræsenterer de makromolekylære strukturer. Når det bruges sammen med høj opløsning strukturelle teknikker såsom røntgenkrystallografi og Kernemagnetisk resonans, kan SAXSA levere nærmere indsigt i flere domæner proteiner og makromolekylære komplekser i-løsning.

Abstract

Protein-protein interaktioner, der vedrører proteiner med flere kugleformede domæner nuværende tekniske udfordringer til at bestemme hvordan sådan komplekser form og hvor domænerne er orienteret/placeret. Her, er en protokol med potentiale for belyse hvilke specifikke domæner mægle samspillet i stand system gennem ab initio modellering beskrevet. En metode til beregning af løsning strukturer af makromolekyler og deres forsamlinger er forudsat, der involverer integration af data fra lille vinkel X-ray spredning (SAXSA), kromatografi og atomic opløsning strukturer sammen i en hybrid tilgang. Et konkret eksempel er komplekset af fuld længde nidogen-1, som samler ekstracellulære matrix proteiner og danner en udvidet, buede nanostrukturer. En af dens kugleformede domæner tillægger laminin γ-1, som strukturer basalmembranen. Dette giver et grundlag for fastlæggelse af præcise strukturer af fleksible flere domæner proteinkomplekser og aktiveres af synkrotron kilder kombineret med automation robotteknologi og størrelse udstødelse kromatografi systemer. Denne kombination giver mulighed for hurtig analyse, hvor flere oligomere stater er adskilt lige før SAXSA dataindsamling. Analysen giver oplysninger om radius gyration, partikel dimension, Molekylær form og interdomain parring. Protokol for at skabe 3D-modeller af komplekser ved montering med høj opløsning strukturer af komponent proteiner er også givet.

Introduction

Celler indeholder indviklet netværk af proteiner, der fungerer som molekylære maskiner til at udføre cellulære funktioner såsom signalering kaskader og opretholde strukturel integritet. De måder, hvorpå disse forskellige komponenter flytte og interagere i tredimensionale rum giver anledning til de specifikke funktioner i makromolekyler. Betydningen af protein struktur, dynamik og interaktioner ved fastsættelsen af funktion har givet behovet for løbende udvikling, komplekse teknikker til at måle disse egenskaber. Af disse, Kernemagnetisk resonans (NMR), røntgenkrystallografi (XRC) og mere for nylig, Cryo-Elektron Mikroskopi (CEM) informere høj opløsning strukturelle. Men XRC og CEM udbytte af en af mange stater, biomolekylære strukturer og mangler oplysninger om dynamikken af protein struktur, mens 3D-struktur bestemmelse af NMR er typisk begrænset til mindre kugleformede proteiner. En måde at overvinde disse begrænsninger er at udnytte lille vinkel X-Ray spredning (SAXSA) for at generere molekylære konvolutter af store, flere domæner eller kompleksbundet systemer, og kombinere de med høj opløsning stive makromolekylære strukturer for at belyse den globale arkitektur og dynamiske funktioner.

SAXSA producerer lav opløsning konvolutter af makromolekylære komplekser med en opløsning på ca 10-20 Å 1, give indsigt ikke kun i struktur, men også de dynamiske egenskaber, at komplekset viser. Selvom SAXSA udnytter røntgenbilleder for at afdække molekylære struktur, er det i modsætning til XRC i den tilfældige isotropic orientering af partikler i opløsningen ikke fører til diffraktion, men snarere at spredning, som ikke kan give atomic opløsning. I stedet, en elektron "kuvert" af makromolekyle genereres som repræsenterer et gennemsnit på med konformationer som makromolekyle viser. Denne information kan bruges i direkte montering af tidligere løst atomic opløsning strukturer for at udlede regioner af fleksibilitet i en enkelt protein eller underenhed organisation eller dynamik i en større, multi protein kompleks. SAXSA data er indsamlet på synchrotrons ved hjælp af højenergi monokromatiske stråler eller fra interne kilder, som giver en svagere røntgenstråler kilde der kræver timer i stedet for sekunder af prøven eksponeringstid (figur 1). SAXSA data er ofte indsamlet fra flere prøver med en enkelt eksperimentel opsætning og buffer, der kræver længere tid til at indsamle en runde af nyttige data på et system. Prøver skal derfor være stabile og ikke-sammenlægning i mindst et par timer baseret på verificerbare kvalitetskontrol metoder såsom dynamisk lysspredning (DLS) og/eller analytisk ultracentrifuge (AUC) analyse at opnå høj kvalitet SAXSA data2 , 3. her vi give en praktisk beskrivelse af SAXSA, principperne bag dens skik, fordele, begrænsninger og forberedelse af prøver og fokusere stærkt på dataindsamling og analyse, langs med rørende kortvarigt på ab initio modellering ved hjælp af den ekstracellulær matrix proteiner nidogen-1 og laminin γ-1 som en eksperimentel eksempel.

Principper, fordele og begrænsninger af SAXSA:

Den vejledende principle(s) bag SAXSA er relativt enkel: en løsning af monodispersed forberedelse af macromolecule(s) af interesse er placeret inden for en kapillær og er udsat for en høj energi monokromatiske X-ray stråle. Fotonerne medføre elektroner i den atomare shell til at begynde, oscillerende, resulterer i en sfærisk bølge bliver udledt af den samme energi og bølgelængde. Da hver elektron vil svinge, en konstant baggrund vil blive nået, og den resulterende elektron tæthed af makromolekyle er kontrast til baggrunden. Den deraf følgende spredning intensitet er indsamlet som en funktion af scattering vinkel, 2Θ (figur 1).

Mens andre teknikker såsom XRC, NMR og CEM giver strukturelle oplysninger på det atomare niveau, er der flere fordele til SAXSA, at andre teknikker ikke kan give. SAXSA kan udføres i næsten enhver buffer og kræver ikke nogen speciel prøveforberedelse. Dette er især vigtigt at studere adfærd og struktur af makromolekyler under varierende forhold såsom tilstedeværelsen eller fraværet af mono - eller divalent kationer eller ændringer i pH4,5. SAXSA har evnen til at give oplysninger om fleksible regioner et makromolekyle6, noget de andre børsnoterede teknikker kan kæmper med. Derfor kan SAXSA bruges som en stærk gratis teknik med de stabile dele af et makromolekyle, der studerede med XRC, NRM eller CEM, og den hele makromolekyle eller komplekse analyseres i lav opløsning med SAXSA og kombineret med forskellige analyseværktøjer sådanne som FoXSDock7 eller CRYSOL8. Da SAXSA er en løsningsteknik, er det ofte bruges til at bekræfte, hvis statisk strukturer som dem, der opnås fra XRC er konsekvent i løsning6. SAXSA har også fordelen at være en teknik, der kræver en forholdsvis lille mængde af prøven investeringer (typisk 50-100 µL) og en relativt lille eksperiment tid (30 min - 1 h).

Den største begrænsning af SAXSA er sårbarhed for prøven sammenlægning og/eller forringelse, som kan føre til forkerte strukturelle forudsigelser. En sammenlægning, selv så lavt som 5%, kan sprede lys i meget store mængder, hvilket fører til en overvurdering af maksimal partikel dimension (Dmax) og radius af gyration (Rg). På den anden side kan prøve nedbrydning føre til en undervurderes af molekylære egenskaber. Denne sårbarhed skyldes SAXSA er en gennemsnitsberegning teknik, hvilket betyder at prøve ensartethed er afgørende for at opnå pålidelige og reproducerbare resultater. Enhver proeve, der skal analyseres ved SAXSA underkastes derfor flere metoder til rensning og kontrol, homogenitet, denaturering og indfødte gelelektroforese, størrelse udstødelse kromatografi, dynamiske lys spredning, og analytiske ultracentrifugering. Ofte, vil SAXSA beamlines køre prøver gennem high-performance væskekromatografi som en sidste kvalitetskontrol trin før SAXSA (S-SAXSA)3,9. SAXSA data bør indsamles på flere koncentrationer og Rg af hvert datasæt skal sammenlignes, at sikre en tæt lighed for at undgå interparticle interaktioner og sammenlægning, hvilket resulterer i en overvurdering af partikel dimensioner, fører til unøjagtige dataanalyse og modellering. Da spredning afhænger af både koncentration og størrelse, kan mindre makromolekyler kræver en mere specifik optimering af koncentrationsområde. Dette er på grund af den Gensidighed teorem, hvor store størrelser scatter mod små vinkler og små størrelser mod store vinkler. Dette manifesterer sig i dataindsamling, hvor jegO er proportional med R6, hvor R er partikel radius. En endelig begrænsning af SAXSA er potentialet for strålingsskader på prøven under eksponering, hvilket kan føre til fordrejning af dataene. Det er god praksis at sammenligne prøve kvalitet, før og efter SAXSA prøve eksponering for det ikke sker.

Protocol

1. SAXSA prøve forberedelse og dataopsamling

  1. Prøveforberedelse:
    1. SAXSA eksperimenter kræver homogen, stabil og ikke-sammenlægning af protein prøver; observere stabilitet og oligomere stat med størrelse udstødelse kromatografi (S), DLS og/eller AUC forud for dataindsamling.
    2. Emne prøver (nidogen-1 og laminin γ-1 i dette tilfælde) til DLS analyse og tricine SDS-PAGE til at visualisere prøve renhed10.
      Bemærk: Prøver kan dække en række koncentrationer (1-4 mg/mL) afhængigt af deres størrelse, deres løsning adfærd som selvstændig forening og sammenlægning sammen med stabilitet; her, fem koncentrationer af nidogen-1, (139 kDa), tre af laminin γ-1 (109 kDa) og fire af S-renset equimolar komplekset blev udarbejdet som tidligere beskrevet10.
  2. Dataindsamling:
    1. Indsamle SAXSA data ved hjælp af en in-house-system eller synchrotron, ifølge producentens eller facilitet retningslinjer.
      NOTE: Data, der anvendes i dette arbejde blev indsamlet ved hjælp af et internt system (Se Tabel af materialer), der indeholder en 3-pinhole kamera udstyret med + 002 microfocus forseglet rør (Cu Kα stråling på 1,54 Å) og konfokal Max-Flux (CMF) optik opererer på 40 W. Systemet er også udstyret med en 200 nm multi wire 2D detektor for dataindsamling. Dog med tilgængeligheden af moderne synchrotrons i Frankrig, Tyskland, Storbritannien, USA og andre lande, som giver adgang til en S-SAXSA set-up, der letter adskillelse af en monodispersed forberedelse fra mulige sammenlægning/nedbrydning, vi nu rutinemæssigt indsamle data på synkrotron faciliteter. En nyligt offentliggjort artikel om en DNA G-quadruplex11 er et eksempel på en S-SAXSA data indsamling strategi. I dette tilfælde SAXSA data blev indsamlet i rækken af 0,08 ≤ q ≤ 0,26 Å i 3 timer for nidogen-1 (2.0, 2,5, 3,0, 3,5 og 4,0 mg/mL); laminin γ-1 (1,5, 2,0 og 2,5 mg/mL) og deres komplekse (0,8, 1,0, 1,25 og 1,5 mg/mL).
    2. Reducere data for buffer og prøver ved hjælp af forarbejdning software specifikke for-systemet. Subtrahere buffer bidrag fra protein data ved hjælp af et program som PRIMUS/qt12 (figur 2A).

2. dataanalyse

Bemærk: I øjeblikket, er der et par software-pakker, der er nyttige for SAXSA dataanalyse: ScÅtter43 (download til rådighed på www.bioisis.net), bioXtas rå44og ATSAS suite13. Dette afsnit indeholder en oversigt over generelle trin skal tages ved analysere rå SAXSA data ved hjælp af ATSAS program suite og konkrete skridt fra ATSAS 2.8.1 download. Andre programmer kan bruges og diskuteres kort senere.

  1. Buffer subtraktion
    Bemærk: Disse trin er relevante for statisk SAXSA prøver kun.
    1. Vælg indstillingen "Åben" menuen i PRIMUS/qt og vælg datafiler af interesse. Vær opmærksom på at datafiler skal være i ASCII-format, hvor den første kolonne er s-vektor aksen og den anden kolonne er intensiteten. Gentag dette trin for data indsamlet på bufferen, selv ved at indsætte disse data i den samme menu.
    2. Vælg "SUBTRAHER" i vinduet databehandling, som vil generere en fratrukkede spredning kurve der repræsenterer kun spredning fra makromolekyle af interesse. Gentag dette trin for hver koncentration.
  2. Guinier analyse
    1. For at udføre Guinier analyse, skal du indlæse en buffer trækkes scatter kurve i PRIMUS/qt som tidligere beskrevet taktfast 2.1.1.
    2. Klik på "Radius af Gyration", som vil fortsætte med at åbne guiden Primus Guinier; et plot af ln(I) vs q2 vises.
    3. For at opnå bruge en foreløbig Rg funktionen "AUTORG", som er et eksternt modul indbygget i PRIMUS/qt. finde knappen "Autorg" og klik på den.
    4. Indtaste flere filer på én gang ved at markere dem alle og indsætte dem i menuen i højre side, meget lig 2.1.1.
    5. Bruge handlingen Guinier oprettet tidligere at vurdere datakvaliteten; den grønne linje under Guinier plot viser residualerne plottet repræsenterer en linearitet fit. Vær opmærksom på at ikke-linearitet i Guinier analyse kunne være et tegn på prøve sammenlægning og yderligere analyse bør ikke udføres i denne sag.
      Bemærk: En lineær Guinier fit giver en Rg med en lille fejl (< 5%) og tyder på en høj kvalitet prøve.
  3. Kratky analyse
    1. Indlæse data til visualiseres i en lignende måde som beskrevet ovenfor.
    2. Klik på "Vælg afkrydsningsfeltet" ved siden af navnet på filen. Dette vil afbilde data i et separat vindue.
    3. Klik på knappen "PLOT" efterfulgt af "Kartky Plot" valg i dropdown-menuen.
    4. Dette vil afbilde data som "q2 x L(q) vs q". Vær opmærksom på at kugleformede proteiner vise en Gaussisk peak, mens udfoldet proteiner vil vise et plateau i stedet for et højdepunkt og ligne en hyperbolsk plot17.
  4. Data fusionerende
    1. Belastning buffer trækkes data for hver koncentration i PRIMUS/qt igen, som i trin 2.1.1.
    2. Hvis du vil flette dataene, blot klikke på knappen "Flet" i vinduet behandling.
    3. Inspicere hver kurve og jeg skala nummer, som korrelerer til koncentrationer foretaget fra den oprindelige prøve.
      Bemærk: Prøver i højere koncentration viser mindre støj i regionen hale af kurver.
  5. P(r) Distribution
    1. For at generere P(r) plot, skal du indlæse de flettede data kurver i PRIMUS/qt som tidligere beskrevet.
    2. Klik på knappen "Afstand Distribution" til at åbne et nyt vindue præsenterer de flettede data af intensiteten af spredt lys vs q og par-afstand distribution funktion plot på højre side.
      Bemærk: Oplysningerne på højre side præsenterer den overordnede kvalitet af par-afstand distribution funktion beregninger.
    3. Justere dataområde af de flettede data til at undgå enhver væsentlig støj på enden af de rå data.
    4. Udelad datapunkter tæt på beam stop i regionen lav-q.
    5. For at bestemme Dmax, starten med en vifte af ~ 5 gange den Rg af Guinier analysen. Gradvis at reducere denne værdi indtil P(r) plottet ikke brat falde til nul på y-aksen og ikke har en lang hale før nærmer sig nul.
    6. Kontroller, at den eksperimentelle Rg/jeg0 (afledt fra Guinier tilnærmelse) og P(r) Rg/jeg0numre er ens.
      Bemærk: I nogle tilfælde yderligere manipulation på vifte af data, datapunkter og ALPHA (en legalisering parameter, der fortæller programmet forholdet mellem hvor meget opmærksomhed glathed af fordelingen i forhold til montering eksperimentelle data) er også kræves21 at opnå en god kvalitet P(r) plot.

3. enb initio perle modellering og gennemsnit

  1. Når data indsamlet ved flere koncentrationer er flettet, eller de data, der indsamles ved hjælp af S-SAXSA er minimeret, og Kratky plot, P(r) plot og Guinier analyse er blevet bekræftet, beregne lav opløsning strukturer af makromolekyler og deres komplekser. Denne rørledning kan bruges til at studere løsning strukturer og interaktioner af nukleinsyrer, proteiner og nukleinsyrer-protein eller protein-protein komplekser10,11,21,22,23 ,24,25,26,27,28,29,30,31,32 ,33,34. En af de mest populære programmer er DAMMIN, udviklet af Svergun35 og en del af den ATSAS pakke13, som beskæftiger simulerede udgloedning protokoller med foreløbige input oplysninger på Rg og Dmax . Ab initio modellering tilgange og principper er beskrevet i detaljer andetsteds18,36.

Representative Results

Den data analyse metode beskrevet ovenfor blev udnyttet til at beregne Rg og Dmax for nidogen-1, laminin γ-1, og deres komplekse, ved hjælp af funktionen P(r). Vi opnåede Rg værdier 7,20 (±0.10) nm, 8.10 (±0.20) nm og 10,9 (±0.4) nm for nidogen-1, laminin γ-1 og deres komplekse henholdsvis (figur 2A-B). Desuden er Dmax værdier af 24 nm, 26 nm, og 35 nm for nidogen-1, laminin γ-1, og deres komplekse henholdsvis (figur 2)10 blev indhentet. DAMMIF blev brugt til at få lav opløsning strukturer af nidogen-1 og laminin γ-1, som foreslog at begge proteiner vedtage en udvidet form i løsning. Værdierne for X og NSD for nidogen-1 (~ 1 og 0,8) og laminin γ-1 (~0.9 og 0,8 henholdsvis) var også i det acceptable område. Tilpasning af strukturer, høj opløsning, to domæner af nidogen-1 og to af laminin γ-1, på deres lav opløsning strukturer fremstillet ved hjælp af SAXSA tilladt identifikation af deres N - og C-terminale regioner10.

Nidogen-1 blev identificeret som en interagerende partner laminin γ-139,40 og webstedet interaktion blev tilknyttet ved hjælp af røntgenkrystallografi til C-terminale domæner41. Høj opløsning strukturer involveret dog kun interagerende domæner og ikke den fuld-længde nidogen-1 eller hele laminin γ-1 arm. Derfor, vi renset en kompleks indeholdende nidogen-1 (fuld længde) og laminin γ-1 arm til at identificere de interagerende regioner samt for at studere den relative orientering af de N-terminale domæner af både proteiner. SAXSA data for komplekset givet en Rg 10,9 (±0.4) nm og en Dmax 35 nm. Vi udnyttede MONSA for at få det hele kompleks, som foreslog at faktisk kun den C-terminale region af både proteiner deltage i mægle interaktioner, mens resten af domænerne er langt fra hinanden ( med lav opløsning struktur Figur 3, Video 1).

Figure 1
Figur 1. Skemaer af SAXSA set-up. En monodispersed præparat af biomolekyler eller deres komplekser er parat, efterfulgt af eksponering med høj energi røntgenstråler. Afhængigt af kilden (fx, in-house vs synkrotron), kan energi x-stråler og prøve at kilde afstand variere. Røntgenstråler spredning mønster (det afhænger af størrelsen og formen af biomolekyler) er registreret og radialt i gennemsnit for at opnå et 1-dimensionelt plot (1D), der indeholder oplysninger om intensiteten af spredt lys med hensyn til scattering vinkel. Som buffer molekyler scatter også lys, fratrækkes bidrag fra disse molekyler for at opnå en spredning mønster af biomolekyler af interesse. På synchrotron, før dataindsamling SAXSA en yderligere rensning trin ved hjælp af i-line størrelse udstødelse og højtydende væskekromatografi udføres også typisk (oppefra). Dette trin er afgørende for at fjerne eventuelle aggregerede og/eller forringet produkt samt for at fjerne enhver ubundne biomolekyler fra komplekset. 1D spredning plot er konverteret til elektron par-afstand fordelingen plot (P(r) plot), som giver radiussen af gyration og maksimale partikel dimension af biomolekyler. Dette plot bruges som input-filen for den ab initio modellering pakker (dvs. DAMMIN/DAMMIF) til at få lav opløsning strukturer af biomolekyler eller andre pakker (dvs. SASREF/CORAL) Hvis kodebaseret struktur af dele af biomolekyler eller individuelle biomolekyler af komplekset er kendt.  Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. (A) et plot af en intensitet af spredt lys vs scattering vinkel (q = 4πsinθ/λ, nm-1) tyder på kvaliteten af biomolekyler (lav region) og form (høj region) af biomolekyler. (B) elektron par-afstand distributionen P(r) bestemmes ud fra spredning data tyder på en aflang form af biomolekyler under undersøgelsen (laminin γ-1, nidogen-1 og deres komplekse). (C) Kratky plot tyder på, at nidogen-1 og laminin γ-1 proteiner er ikke udfoldet. (D) Guinier plot for nidogen-1, laminin γ-1 og deres komplekse, der angiver den lineære region for bestemmelse af radius af gyration ved hjælp af data i lav-spredning vinkel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Lav opløsning struktur af komplekset af nidogen-1 og laminin γ-1 fremstillet ved analyse af flettede datasæt ved hjælp af programmet MONSA. Farveskemaet er det samme som figur 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Movie 1
Video 1. Nidogen-1 og laminin lav opløsning struktur γ-1 kompleks. Denne film blev udarbejdet ved brug af PYMOL for at visualisere forskellige strukturelle elementer i komplekset. Krystalstruktur af laminin-nidogen complex (FBF-ID: 1NPE) er vist som båndet tegnefilm, fremhæve den interagere websteder til dette kompleks. Farveskemaet er det samme som figur 2. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Discussion

Kritiske trin i SAXSA dataanalyse skitseret i afsnittet protokol i dette papir Medtag buffer subtraktion, Guinier analyse, Kratky analyse, data fusionerende og P(r) distribution. Ab initio perle modellering er alt for omfattende til at blive dækket her i detaljer og omtales derfor kun kortvarigt.

På synchrotrons (f.eks. DESY i Tyskland, diamant i Det Forenede Kongerige og ESRF i Frankrig), er det muligt at indsamle SAXSA data til en meget lille brøkdel (~ par µL) af hver prøve som fraktioner er at være elueres fra kolonnen s er tilsluttet i-line (Se figur 1 ). Elastisk spredte SAXSA data er radialt i gennemsnit bruger de pakker, der leveres af instrumentets fabrikant eller af synkrotron før buffer subtraktion kan finde sted. Den resulterende 1D data repræsenterer mængden af spredt lys (i, jeg(q)) på Y-aksen og scattering vinkel (q= 4πsinθ/λ, hvor λ er bølgelængden af hændelsen X-stråler) og er skitseret i figur 1. Programmet PRIMUS/qt12 bruges til at trække direkte fra enhver form for baggrundsviden på grund af buffer og er beskrevet i afsnit 1.1. Andre programmer såsom; ScÅtter43 (download til rådighed på www.bioisis.net) med en tilgængelig på https://www.youtube.com/channel/UCvFatdC5HcZOLv6OSjblfeA, og bioXtas rå44 (tilgængelig på https:// tutorial bioxtas-raw.readthedocs.io/en/Latest/index.html) kan udnyttes som et alternativ til pakken ATSAS.

Guinier analysen giver oplysninger om prøven sammenlægning og homogenitet samt give Radius Gyration (Rg) for makromolekyle af interesse baseret på SAXSA data fra lav s regionen14. Et plot er konstrueret med PRIMUS/qt for SAXSA data indhentet fra hver koncentration, efterfulgt af kurven fitting med den maksimal rækkevidde på op til 1,30 for q x Rg. En monodispersed prøveforberedelse bør give en lineær Guinier plot i denne region (figur 2D), der henviser til, at sammenlægningen resultater i en ikke-lineær Guinier plot15,16. Hvis Guinier analysen er lineær, kan graden af "unfoldedness" af et makromolekyle interesse observeres med Kratky plot, hvilket er nyttigt, når der træffes beslutning om at udføre stive organ modellering eller konstruere ensembler af lav opløsning modeller. En kugleformede protein vises i et Kratky plot om at have en klokkeformet kurve, forlaenget molekyler eller udfoldet peptider vises at plateau eller endda øge i rækken større q og mangler bell-formen (figur 2 c).

At opnå Rg fra Guinier analyse kun mener datapunkter fra regionen lav q 1 D scatter plot (figur 2D), men det er muligt at bruge næsten hele datasættet til at udføre en indirekte Fourier transformation at konvertere de gensidige-plads oplysninger af ln (I (q)) vs (q) i en reel plads afstand distribution funktion (P(r)) som giver information om Dmax og Rg (Figur 2B) Form af handlingen P(r) repræsenterer brutto løsning kropsbygning af makromolekyle interesse18,19. konvertering af gensidige-space data til real-space data er et kritisk skridt men en detaljeret beskrivelse er ikke omfattet af dette papir. Derfor henvise til en artikel af Svergun20 at forstå hver parameter.

Når bufferen trækkes data i individuelle koncentrationer behandles via Guinier analyse med en konsekvent værdi for Rg, efterfulgt af undersøge deres folde mønster ved hjælp af Kratky analyse, disse data kan flettes. De flettede data er for nidogen-1, laminin γ-1, og deres komplekse blev behandlet som beskrevet ovenfor og den resulterende P(r) grunde præsenteret i figur 2B. Ideelt set bør man også beregne par-afstand fordelingsfunktion P(r) for hver koncentration at afgøre, om SAXSA data indsamles for hver koncentration giver lignende Rg og Dmax værdier. Hvis Rg og Dmax forbliver lignende over en bred vifte af koncentrationer, skal så brugeren fortsætte. Det skal bemærkes, at afhængigt af signalet, kan afkortes data før data sammenlægning. Dette er ofte tilfældet hvis koncentrationer og/eller molekylvægt af makromolekyler under undersøgelsen er lav.

Lav opløsning figur analyse ved hjælp af DAMMIN kan udføres i forskellige tilstande (f.eks. hurtig, langsom, ekspert tilstande, osv.). Den hurtige tilstand er en ideelle første skridt til at evaluerer hvis P(r) plottet giver god kvalitet modeller. Typisk bør mindst 10 modeller opnås for hver P(r) plot til at kontrollere, hvis der opnås reproducerbare resultater, strukturelt med lav opløsning med en lav godhed af fit parameter kaldet χ (en værdi på 0,5-1,0 anses for god baseret på vores omfattende arbejde ), en værdi, der beskriver en aftale mellem eksperimentelt indsamlede SAXSA data og model-afledte data. Publikation formål, vi typisk bruger langsom eller ekspert mode og beregne mindst 15 modeller. Ud over DAMMIN, en hurtigere version af det, DAMMIF37, samt GASBOR38 er også alternativer. Derudover for at studere protein-protein eller protein-nucleic acid komplekser, er det muligt at bruge den MONSA program35, som letter samtidige montering af den enkelte SAXSA data for både makromolekyler samt deres kompleks. For flere detaljer med høj opløsning modelberegninger samt for RNA-protein interaktion undersøgelser, henvise til en nylig artikel af Patel et al3.

SAXSA er teoretisk enkle, men uden tvivl en meget komplementære metode til andre strukturbiologi værktøjer og resultater i lav opløsning strukturelle data, der kan bruges alene eller sammen med høj opløsning teknikker til at belyse oplysninger om makromolekylære struktur og dynamik. Så længe en monodispersed forberedelse af makromolekyler og deres komplekser kan fås, kan SAXSA udnyttes til at studere i løsning struktur og interaktioner af enhver form for biologiske makromolekyle. For komplekset diskuteret her, det er bemærkelsesværdigt, at mindre end 10% af den samlede tilgængelige areal af kvælstof-1 og laminin γ-1 er begravet i dette kompleks, der henviser til, at resten af domæner af begge proteiner er frit tilgængeligt til at interagere med andre proteiner på den ekstracellulære matrix til at opretholde sin strukturelle stivhed (figur 3). At opnå sådanne oplysninger for et kompleks med ~ 240kDa ville være meget udfordrende, ved hjælp af andre strukturbiologi teknikker såsom røntgenkrystallografi, NMR og Cryo-EM mikroskopi.

Afdække protein struktur via røntgenkrystallografi eller NMR er en iboende tidskrævende proces. Denne flaskehals i struktur bestemmelse er et område hvor SAXSA viser sin styrke som en strukturel teknik; dataopsamling for en enkelt SAXSA eksperiment kan tage mindre end en time og med hjælp af strømlinede analyse software analyse kan ske hurtigt og effektivt. SAXSA har potentiale til høj grad øge gennemløb af strukturelle undersøgelser som en stand-alone teknik, fordi det giver en lav opløsning model af den makromolekylære struktur, før data med høj opløsning er tilgængelige. En barriere for andre strukturelle teknikker er kravet om en meget ren, koncentreret prøve for dataopsamling, hvilket nødvendiggør en høj grad af protein udtryk og stabilitet over en lang periode. Mens SAXSA prøver også behovet for at være ren og koncentreret, prøve diskenheder er omtrent 100 µL gør SAXSA en relativt billig analysemetode i forhold til andre strukturelle teknikker. Derudover bliver SAXSA kombineret med størrelse udstødelse kromatografi mere og mere almindelige som giver en ekstra kvalitetskontrol trin. For nylig har der været stærk fremskridt i kombination af NMR og SAXSA data ved hjælp af Ensemble optimering metode (EOM)45,46 for at belyse fleksible systemer. I et nyligt papir af Mertens og Svergun47beskriver forfatterne flere nylige eksempler på EOM SAXSA i kombination med NMR, sammen med mange andre eksempler på SAXSA data bliver brugt i forbindelse med NMR. Forskud foretages løbende inden for SAXSA, og nye teknikker er ved at blive udviklet til SAXSA at bruges sammen med, ikke bare gratis til andre strukturelle teknikker. Vi mener derfor, at efterspørgslen efter SAXSA kun vil stige over tid, især i forbindelse med NMR at karakterisere dynamiske systemer hvor funktioner er defineret af fleksibilitet.

Disclosures

Forfatterne har ingen oplysninger til at erklære.

Acknowledgments

Dette projekt har været støttet af NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta Innovation Program (RCP-12-002 C) og Alberta Prion Research Institute / Alberta innoverer Bio Solutions (201600018) tilskud til M.O. TRP er en Canada forskning stol i RNA & Protein Biofysik (201704) og anerkender NSERC opdagelse grant (RGPIN-2017-04003). TM er finansieret af NSERC opdagelse tilskud til TRP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK 293 EBNA Cell Line In-Lab availability - Cell line used to overexpress protein(s)
Ni Sepharose High Performance histidine-tagged protein purification resin GE Healthcare 17524801 Affinity protein purification resin
Superdex 200 Increase 10/300 GE Healthcare 28990944 SEC Column
ÄKTA Pure FPLC GE Healthcare - FPLC System
Nanodrop Nanodrop - Spectrophotometer
Basic Reagents (NaCl, Tris-HCl etc.)
S-MAX3000 Rigaku - SAXS Pinhole Camera System
Zetasizer Nano-S Malvern Instruments Ltd - Dynamic Light Scattering instrument
0.1µm Filter Millipore JVWP04700 Used to Concentrate Sample Prior to DLS
Thrombin cleavage kit abcam ab207000 Thrombin cleavage to remove His tag
Strep-Tactin Sepharose Column IBA 2-1201-010 Strep-Tag Affinity Purification
D-desthiobiotin Sigma-Aldrich 533-48-2 Elution of Strep Tag Protein
Software
SAXGUI Rigaku - Data Collection for SAXS and data reduction
ATSAS Suit Franke et al., 2017 - SAXS Data Analysis Software program suite
PRIMUS Konarev et al., 2003 - Buffer Subtraction
GNOM Svergun, 1992 - Rg, Dmax and p(r) Calculation
DAMMIF Franke and Svergun, 2009 - Ab initio model calculation
DAMAVER Volkov and Svergun, 2003 - Averaged Solution Conformation calculations
MONSA Svergun, 1999 - Simultaneous model fitting for the complex
GASBOR Svergun et al., 2001 - Alternative Ab initio model calculations
DTS Software V6.20 Malvern Instruments Ltd - DLS supplied instrument software
PyMOL Schrodinger, LLC. - The PyMOL Molecular Graphics System V2.0
The Protein Data Bank Berman et al., 2000 - PDB ID: 1NPE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Advances in structure analysis using small-angle scattering in solution. Current Opinion in Structural Biology. 12, (5), 654-660 (2002).
  2. Patel, T. R., Chojnowski, G., Koul, A., McKenna, S. A., Bujnicki, J. M. Structural studies of RNA-protein complexes: A hybrid approach involving hydrodynamics, scattering, and computational methods. Methods. 118, 146-162 (2017).
  3. Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8, (4), 409-427 (2016).
  4. Uversky, V. N., Gillespie, J. R., Fink, A. L. Why are “natively unfolded” proteins unstructured under physiologic conditions? Proteins. 41, (3), 415-427 (2000).
  5. Uversky, V. N., Gillespie, J. R., Millett, I. S., Khodyakova, A. V., Vasiliev, A. M., Chernovskaya, T. V., Abramov, V. M. Natively Unfolded Human Prothymosin α Adopts Partially Folded Collapsed Conformation at Acidic pH. Biochemistry. 38, (45), 15009-15016 (1999).
  6. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Letters. 589, (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
  7. Schneidman-Duhovny, D., Hammel, M., Tainer, J. A., Sali, A. FoXS, FoXSDock and MultiFoXS: Single-state and multi-state structural modeling of proteins and their complexes based on SAXS profiles. Nucleic Acids Research. 44, 424-429 (2016).
  8. Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL - a Program to Evaluate X-ray Solution Scattering of Biological Macromolecules from Atomic Coordinates. Journal of Applied Crystallography. 28, (6), 768-773 (1995).
  9. Pérez, J., Vachette, P. A Successful Combination: Coupling SE-HPLC with SAXS. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1009, 183-199 (2017).
  10. Patel, T. R., Bernards, C., Meier, M., McEleney, K., Winzor, D. J., Koch, M., Stetefeld, J. Structural elucidation of full-length nidogen and the laminin-nidogen complex in solution. Matrix Biology. 33, 60-67 (2014).
  11. Meier, M., Moya-Torres, A., Krahn, N. J., McDougall, M. D., Orriss, G. L., McRae, E. K. S. Structure and hydrodynamics of a DNA G-quadruplex with a cytosine bulge. Nucleic Acids Research. (2018).
  12. Franke, D., Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Panjkovich, A., Tuukkanen, A., Mertens, H. D. T. ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50, 1212-1225 (2017).
  13. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36, (5), 1277-1282 (2003).
  14. Tuukkanen, A. T., Svergun, D. I. Weak protein-ligand interactions studied by small-angle X-ray scattering. The FEBS Journal. 281, (8), 1974-1987 (2014).
  15. Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496, (7446), 477-481 (2013).
  16. Koch, M. H., Vachette, P., Svergun, D. I. Small-angle scattering: a view on the properties, structures and structural changes of biological macromolecules in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 36, (2), 147-227 (2003).
  17. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40, (3), 191-285 (2007).
  18. Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Applications of small-angle X-ray scattering to biomacromolecular solutions. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45, (2), 429-437 (2013).
  19. Svergun, D. I. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25, (4), 495-503 (1992).
  20. Patel, T. R., Morris, G. A., Zwolanek, D., Keene, D. R., Li, J., Harding, S. E. Nano-structure of the laminin γ-1 short arm reveals an extended and curved multidomain assembly. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 29, (7), 565-572 (2010).
  21. Patel, T. R., Reuten, R., Xiong, S., Meier, M., Winzor, D. J., Koch, M., Stetefeld, J. Determination of a molecular shape for netrin-4 from hydrodynamic and small angle X-ray scattering measurements. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 31, (2), 135-140 (2012).
  22. Dzananovic, E., Patel, T. R., Deo, S., McEleney, K., Stetefeld, J., McKenna, S. A. Recognition of viral RNA stem-loops by the tandem double-stranded RNA binding domains of PKR. RNA. 19, (3), New York, N.Y. 333-344 (2013).
  23. Meier, M., Patel, T. R., Booy, E. P., Marushchak, O., Okun, N., Deo, S. Binding of G-quadruplexes to the N-terminal recognition domain of the RNA helicase associated with AU-rich element (RHAU). The Journal of Biological Chemistry. 288, (49), 35014-35027 (2013).
  24. Dzananovic, E., Patel, T. R., Chojnowski, G., Boniecki, M. J., Deo, S., McEleney, K. Solution conformation of adenovirus virus associated RNA-I and its interaction with PKR. Journal of Structural Biology. 185, (1), 48-57 (2014).
  25. Bacik, J. -P., Tavassoli, M., Patel, T. R., McKenna, S. A., Vocadlo, D. J., Khajehpour, M., Mark, B. L. Conformational itinerary of Pseudomonas aeruginosa 1,6-anhydro-N-acetylmuramic acid kinase during its catalytic cycle. The Journal of Biological Chemistry. 289, (7), 4504-4514 (2014).
  26. Deo, S., Patel, T. R., Dzananovic, E., Booy, E. P., Zeid, K., McEleney, K. Activation of 2’ 5’-oligoadenylate synthetase by stem loops at the 5’-end of the West Nile virus genome. PloS One. 9, (3), e92545 (2014).
  27. Vadlamani, G., Thomas, M. D., Patel, T. R., Donald, L. J., Reeve, T. M., Stetefeld, J., Mark, B. L. The β-lactamase gene regulator AmpR is a tetramer that recognizes and binds the D-Ala-D-Ala motif of its repressor UDP-N-acetylmuramic acid (MurNAc)-pentapeptide. The Journal of Biological Chemistry. 290, (5), 2630-2643 (2015).
  28. Deo, S., Patel, T. R., Chojnowski, G., Koul, A., Dzananovic, E., McEleney, K., McKenna, S. A. Characterization of the termini of the West Nile virus genome and their interactions with the small isoform of the 2’ 5’-oligoadenylate synthetase family. Journal of Structural Biology. 190, (2), 236-249 (2015).
  29. Ariyo, E. O., Booy, E. P., Patel, T. R., Dzananovic, E., McRae, E. K., Meier, M., McKenna, S. A. Biophysical Characterization of G-Quadruplex Recognition in the PITX1 mRNA by the Specificity Domain of the Helicase RHAU. PloS One. 10, (12), (2015).
  30. Hyde, E. I., Callow, P., Rajasekar, K. V., Timmins, P., Patel, T. R., Siligardi, G., Scott, D. J. Intrinsic disorder in the partitioning protein KorB persists after co-operative complex formation with operator DNA and KorA. The Biochemical Journal. 474, (18), 3121-3135 (2017).
  31. Dzananovic, E., Astha, null, Chojnowski, G., Deo, S., Booy, E. P., Padilla-Meier, P., McKenna, S. A. Impact of the structural integrity of the three-way junction of adenovirus VAI RNA on PKR inhibition. PloS One. 12, (10), (2017).
  32. Krahn, N., Meier, M., To, V., Booy, E. P., McEleney, K., O’Neil, J. D., Stetefeld, J. Nanoscale Assembly of High-Mobility Group AT-Hook 2 Protein with DNA Replication Fork. Biophysical Journal. 113, (12), 2609-2620 (2017).
  33. Patel, T. R., Besong, T. M. D., Meier, M., McEleney, K., Harding, S. E., Winzor, D. J., Stetefeld, J. Interaction studies of a protein and carbohydrate system using an integrated approach: a case study of the miniagrin-heparin system. European Biophysics Journal: EBJ. (2018).
  34. Svergun, D. I. Restoring low resolution structure of biological macromolecules from solution scattering using simulated annealing. Biophysical Journal. 76, (6), 2879-2886 (1999).
  35. Blanchet, C. E., Svergun, D. I. Small-Angle X-Ray Scattering on Biological Macromolecules and Nanocomposites in Solution. Annual Review of Physical Chemistry. 64, (1), 37-54 (2013).
  36. Volkov, V. V., Svergun, D. I. Uniqueness of ab initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 36, 860-864 (2003).
  37. Kozin, M. B., Svergun, D. I. Automated matching of high- and low-resolution structural models. Journal of Applied Crystallography. 34, (1), 33-41 (2001).
  38. Franke, D., Svergun, D. I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42, (Pt 2), 342-346 (2009).
  39. Svergun, D. I., Petoukhov, M. V., Koch, M. H. J. Determination of Domain Structure of Proteins from X-Ray Solution Scattering. Biophysical Journal. 80, (6), 2946-2953 (2001).
  40. Baumgartner, R., Czisch, M., Mayer, U., Pöschl, E., Huber, R., Timpl, R., Holak, T. A. Structure of the nidogen binding LE module of the laminin gamma1 chain in solution. Journal of Molecular Biology. 257, (3), 658-668 (1996).
  41. Stetefeld, J., Mayer, U., Timpl, R., Huber, R. Crystal structure of three consecutive laminin-type epidermal growth factor-like (LE) modules of laminin gamma1 chain harboring the nidogen binding site. Journal of Molecular Biology. 257, (3), 644-657 (1996).
  42. Takagi, J., Yang, Y., Liu, J. -H., Wang, J. -H., Springer, T. A. Complex between nidogen and laminin fragments reveals a paradigmatic beta-propeller interface. Nature. 424, (6951), 969-974 (2003).
  43. Förster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J. Appl. Cryst. 43, 639-646 (2010).
  44. Hopkins, J. B., Gillilan, R. E., Skou, S. BioXTAS RAW: improvements to a free open-source program for small-angle X-ray scattering data reduction and analysis. J. Appl. Cryst. 50, 1545-1553 (2017).
  45. Bernadó, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. (17), 5656-5664 (2007).
  46. Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2, (Pt 2), 207-217 (2015).
  47. Mertens, H. D. T., Svergun, D. I. Combining NMR and small angle X-ray scattering for the study of biomolecular structure and dynamics. Arch Biochem Biophys. 628, 33-41 (2017).
Strukturelle undersøgelser af makromolekyler i løsning ved hjælp af små vinkel X-Ray spredning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mrozowich, T., McLennan, S., Overduin, M., Patel, T. R. Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering. J. Vis. Exp. (141), e58538, doi:10.3791/58538 (2018).More

Mrozowich, T., McLennan, S., Overduin, M., Patel, T. R. Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering. J. Vis. Exp. (141), e58538, doi:10.3791/58538 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter