Summary
Здесь мы представляем протокол для мышиных в естественных условиях маркировки клубочковых клеток поверхности белков с биотин. Этот протокол содержит информацию о том, как perfuse мыши почек, изолировать клубочков и выполнять эндогенного иммунопреципитации протеина интереса.
Abstract
Протеинурия результаты от нарушения клубочковых фильтр, который состоит из перфорированную эндотелия, клубочковых базальной мембраны и podocytes с их щели диафрагмы. Деликатный структура клубочковых фильтра, особенно щели диафрагмы, опирается на взаимодействие различных клеток поверхности белков. Изучая эти клетки поверхности белки до настоящего времени была ограничена в vitro исследования или гистологический анализ. Здесь мы представляем мышиных в vivo biotinylation маркировки метод, который позволяет исследование белков клубочковых клеток поверхности физиологического и патофизиологические условиях. Этот протокол содержит информацию о том, как perfuse мыши почек, изолировать клубочков и выполнять эндогенного иммунопреципитации протеина интереса. Полуфинал количественный поверхностного залегания клубочковых клеток легко доступны с этот новый метод и все белки доступным для перфузии биотина и иммунопреципитации могут быть изучены. Кроме того изоляция клубочков, с или без biotinylation позволяет далее анализ клубочковых РНК и белка, а также первичных клубочковых клеток культуры (т.е. первичной Подоцит клеток).
Introduction
Протеинурия является отличительной чертой клубочковых травмы и обычно сопровождает нарушение клубочковых фильтра1. Клубочковой фильтрации состоит из перфорированную эндотелия, клубочковых базальной мембраны и podocytes. Деликатный молекулярной структуры клубочковой фильтрации очень динамичный и подвергать белка клеточной поверхности оборота как здоровые и больные почки2,3,4,5,6 . Эндоцитоза поверхностных белков клеток было показано, быть необходимым для выживания podocytes7. Трансмембранные белки, выраженные на podocytes Nephrin и podocalyxin. Nephrin является основой клубочковых щели диафрагмы, в то время как podocalyxin является sialoglycoprotein, покрытие процессов вторичного ноги podocytes8,9,10. Endocytic оборот ранее было показано, для nephrin и podocalyxin3,11,12,,1314.
В меру наших знаний эндоцитоза белков клеток поверхности не еще был описан в клубочковых клеток эндотелия в литературе. Однако эндотелиальные клетки в целом выразить все необходимые белки для различных типов эндоцитоза (то есть, зависящих от Клатрин, плот зависимая эндоцитоза)15,16. Таким образом, эндотелиальных клеток поверхности людьми может быть изучена с помощью этого метода, используя, например, сосудистого эндотелия (VE)-Кадгерины и внутриклеточных Межмицеллярная молекула (ICAM-2) как клетка поверхности белка маркера для клубочковых клеток эндотелия17 .
К сожалению не существует точного в vitro модели для деликатной трехслойное клубочковых фильтра, в котором ячейки могут быть изучены людьми поверхности белка. Цель этого метода является таким образом изучить клубочковых белка торговли людьми, в естественных условиях. Кроме того этот протокол содержит информацию о том, как изолировать клубочков, позволяя дальнейшего анализа клубочковых РНК, белки или клетки. Подобные клубочковых изоляции, что методы были описаны различные группы18,19.
Ранее мы и другие использовали ex vivo маркировки клубочковых клеток поверхности белков biotinylation2,3,4,,2021. Однако в этом методе ex vivo , изолированные клубочков были подвержены механическому воздействию, которое может повлиять на endocytic людьми. Кроме того Этикетировочный иммунофлуоресценции клубочковых клеток поверхности белков широко использовалась в литературе2,20,22. С помощью этого метода однако, только небольшое количество белков могут быть проанализированы в течение одного слайда, и количественный иммунофлюоресценции изображений часто бывает трудно.
Этот роман в vivo метод предлагает надежный инструмент для изучения клубочковых клеток поверхности белка изобилия и людьми точно в здоровые и больные почки, и он может использоваться как дополнение к иммунофлюоресценции тесты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Мышей были получены как внутренний породы от местных животных ухода объекта или Жанвье лабораторий во Франции. Согласно руководящим принципам, изложенным в руководстве для ухода и использования лабораторных животных (США национальных институтов из здравоохранения публикация № 85-23, редакция 1996) были проведены расследования. Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с соответствующих институциональных утверждений (правительство штата LANUV ссылка номер AZ:84-02.04. 2016.A435).
1. Подготовка документов, решений и оборудования
- Подготовка 1 Л-фосфатный буфер дополнена хлорид магния 1 мм (2MgCl) и хлорид кальция 0,1 мм (2CaCl) (PBSCM) и процеживают через стерильную фильтр.
- Подготовить 5 мл стерильной PBSCM на мышь для перфузии и поместите его на льду.
- Для каждой мыши Подготовьте 5 мл стерильной PBSCM дополнена биотина 0.5 мг/мл.
- Для каждой мыши, подготовить 5 мл стерильной PBSCM и добавить 0,8 x 108 магнитные бусы (например., 200 мкл раствора 4 x 108 шариков/мл, без предварительной обработки) для эмболизации клубочков. Готовить это решение под скамейкой культуры клеток держать магнитные шарики в оригинальной трубки стерильные. Место это решение на льду.
- Приготовляют раствор закалки, добавив 100 мм глицин PBSCM (5 мл на мыши) и держать его на льду.
- Сделайте раствор коллагеназы (0,378 ед/мл коллагеназы A в стерильные PBSCM). На мышь Пипетка 1 мл раствора коллагеназы в 2-мл пробирку и поместите его на льду.
- Для стирки, подготовить стерильные PBSCM (см. шаг 1.1) в 50 мл трубки и поместите его на льду.
- Для перфузии используйте шприцевый насос с потоком 2.0 мл/мин.
- Подготовки шприц 10 мл с иглой 21G. Место кончике иглы в 20-30 см длиной катетер (внутренний диаметр, ID = 0,58 мм). Подключите катетера (ID 0,58 мм) с катетером короткие 10 см (ID 0,28 мм) и отрезать кончик катетера меньше косой для легко вставки в аорту мыши.
- Лигатура процедур во время операции сократить три 5-7 см шелковой нити (4-0 6-0) на мышь.
- Для хирургии Подготовьте 3 хирургические зажимы, 2 хирургические ножницы, 2 пинцета, 2 штрафа пинцет, 1 штраф ножниц и тампоны. Подготовьте анестезии (например, внутрибрюшинного анестезии кетамином 100 мг/кг веса тела и ксилазина 5 мг/кг веса тела).
- Для изоляции клубочков почек используйте стрейнер ячейки 100 мкм, две трубы 50 мл и магнит зрелище.
- Подготовить главы литического буфера: 20 мм 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (главы); 20 мм (гидроксиметил) трис-aminomethan (Tris) рН 7,5; 50 мм sodiumchorlide (NaCl); 50 мм sodiumfluoride (NaF); 15 мм Na2O4P7; 0,1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) рН 8,0; sodiumorthovanadate 2 мм; и 2 мм adenosinetriphosphat (АТФ).
- Прохладный центрифуги до 4 ° C.
2. хирургии под микроскопом
- Анестезировать мыши (например, с кетамином/Ксилазина внутрибрюшинно, см. шаг 1.11). Выполните тест мыс пинча для подтверждения надлежащего анестезии.
- Продезинфицируйте вентральной стороне мыши с 70% изопропиловый спирт.
- Выполните срединного разреза через кожу от таза до грудины и удалить кожу от брюшной фасции с помощью пинцета. Вырежьте кожу с обеих сторон в середине живота с Ножницы хирургические.
- Изменить хирургические инструменты. Применять средний отрезок от мечевидного в мочевой пузырь через слой мышц живота и разделить их на четыре квадранта, используя хирургические ножницы и щипчики. Прикрепите верхнюю сторону два с зажимами к шее мыши с двух хирургических зажимов.
Примечание: Живот теперь открыт. - Положите висцеральных органов сторону с помощью стерильного тампона и сократить печеночно диафрагмального связки с тонкой ножницами.
- Подготовьте перевязки (с шелковой нитью 4-0 6-0) вокруг аорты проксимальных почечных артерий на высоту надпочечников с двумя хорошо пинцетом. Затяните проксимального отдела аорты лигирование отменить поток крови с помощью пинцета.
- Бесплатный дистальной части аорты из фасции, жир и другие ткани и подготовить лигирование вокруг печени/верхней брыжеечной артерии черепной почечных артерий, с помощью тонкой хирургического пинцета.
- Подготовить перевязки (с шелковой нитью 4-0 6-0) вокруг аорты дистальных почечных артерий и зажим верхней полой вены и аорты на высоте бифуркации.
- Вырежьте небольшое отверстие в аорту дистальных почечных артерий так, чтобы отверстие половину диаметра аорты. Поместить катетер в аорту и исправить ее с подготовленной лигатур.
Предупреждение: Во избежание пузырей в системе перфузии во избежание эмболии. - Начните с ледяной PBSCM при скорости потока 2 мл/мин перфузии.
- Вырезать отверстие в почечной Вены на уровне почечных артерий с тонкой Ножницы хирургические и затяните лигирование вокруг печени и верхней брыжеечной артерии.
Примечание: Почки должны повернуть бледно после запуска перфузии.
3. в Vivo Biotinylation
- Изменение шприц, пузырь бесплатно ледяной PBSCM дополнена 0.5 мг/мл биотина для маркировки поверхности и perfuse почками с 5 мл со скоростью потока 2 мл/мин.
Примечание: Mix PBSCM решения (например, повернув 50 мл трубки) осторожно, чтобы избежать образования пузырьков в рамках решения. После аспирации раствор в шприц эвакуировать или пузырьков воздуха из шприца. Использование дополнительных канюля (21G) на шприц для заполнения пространства в канюли, которая подключена к системе катетера. Наконец вставьте шприц в канюлю с катетер без пузырьков. - Измените шприц пузырей на ледяной PBSCM дополнена 100 мм глицин утолить клубочков и perfuse с 5 мл на поток 2 мл/мин.
- Изменение шприц, пузырь бесплатно ледяной PBSCM дополнена 200 мкл магнитных шариков/мл и perfuse почками в 2 мл/мин.
Примечание: На поверхности почек, эмболизация клубочков с коричневой магнитные бусы будет видимым.
4. изоляция клубочков из двух почек
- Почки в рубчик и удалите капсулы. Место на льду в 15 мл PBSCM в 10 см блюдо культуры клеток почек. Усыпить мыши с шейки матки дислокации после сбора урожая почки под наркозом. Процедур хирургии и перфузии длится примерно 20-22 мин.
- Нарежьте почки наименьшее возможно с новой двойной край лезвия. Переместите ткани в 2-мл пробирку с 1 мл раствора коллагеназы A (см. шаг 1.6) и дайджест при 37 ° C за 30 мин. До и после переваривания осторожно перемешать с 1000 мкл, вырезать пипеткой.
- Промойте переваривается ткани через стрейнер ячейки 100 мкм, с помощью ледяной PBSCM. Аккуратно используйте клетки скребок для фарш оставшиеся корыта ткани клеток сетчатый фильтр и промойте его с ледяной PBSCM потом к общим объемом 50 мл.
- Центрифуга подвеска на 4 ° C 500 x g 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте лепешка с чуть менее 1,5 мл ледяной PBSCM во время vortexing гранул. Впоследствии Положите клубочковых подвеска в новом 2-мл пробирку.
5. мытье
- Использование магнита зрелище тянуть клубочков в одну сторону. Подождите 1 мин до клубочков перешли к магниту.
- Удалите супернатант с 1000 мкл пипетки 2-мл пробирку остается в магнит зрелище. Во время первой и второй стирки шаги (см. шаг 5.3), 250 мкл супернатанта остается в трубе, во избежание потери клубочков. Выполните эту процедуру быстро, чтобы избежать давая трубчатых структур опускаться на дно трубки.
Примечание: Процедура стирки будет длиться дольше, в противном случае. - Снять 2-мл пробирку с магнит зрелище и добавить 1 мл PBSCM, Пипетка вверх и вниз (очень важно), затем вихря.
- Положить трубку обратно в магнит зрелище и начать с шага 5.2.
- Повторите шаги Стиральная чистоту клубочков достигла 90%. Для этого проверьте представитель Алиготе супернатант под микроскопом (40-100 X).
Примечание: Клубочков будет отображаться как круглые структуры, содержащие коричневый магнитные бусы. Удлиненные структуры трубчатых фрагменты, и свободный магнитные шарики появляются как коричневый круглыми точками. Ячейки мусор может появиться как громоздкие структуры. - Если достигается чистота, оцените количество клубочков, растворяя клубочков в 1 мл PBSCM. После смешивания, возьмите Алиготе 10 мкл и рассчитывать клубочков под микроскопом. Рассчитать количество клубочков с помощью следующего уравнения: окончательное количество клубочков = количество клубочков в 10 мкл аликвота x 100.
- Успешной изоляции клубочков приводит к ряду 10000-40000 клубочков.
6. белка добычу и иммунопреципитации (IP)
- Собирать клубочков центрифугированием при 4 ° C на 6800 х g для 5 минут удалить супернатант при использовании магнит зрелище и Ресуспензируйте гранулы ледяной литического буфера (например., 30000 клубочков в 300 мкл; РЕБЯТА, смотрите шаг 1.11). Однородный образцы с ткани гомогенизатор на максимальной скорости для 30 s и лизируют их на льду за 30 мин.
- Удаление нерастворимый материал центрифугированием на 15000 x г за 30 мин на 4 ° C. Пипетка супернатанта, которая включает в себя клетки lysate в новой 1,5 мл трубку. Выбросите гранулы.
- Измерить концентрацию белка супернатант с помощью bicinchoninic (BCA)-на основе метода следуя инструкциям производителя. Успешное лизис 30000 клубочков уступает клубочковых белка, количество 700-1000 мкг/мл. Приспособиться к суммы равной белка с буфера lysis.
- Возьмите Алиготе 10% от общего объема для клубочковых lysate и добавить 2 x Лэмли + dithiothreithol (DTT) до инкубации в течение 5 мин при 95 ° C.
- Для IP-адреса Инкубируйте остальной части lysate стрептавидина агарозы бисером на ночь при 4 ° C на накладных шейкер.
- Центрифуга агарозы бусы на 1000 x g 3 мин при температуре 4 ° C, удалить супернатант и добавить 800 мкл буфера lysis мыть Бусины для связывания неспецифических белков.
- Повторить 3 раза мыть и полностью удалить супернатант.
- Добавьте 30 мкл 2 x Лэмли + DTT и Инкубируйте на 95 ° C за 5 мин.
- Загрузить lysate и IP зонды на 10% SDS гель и Побегите гель SDS 70 V 30 мин, затем 20 мА на гель для 1,5 ч. После этого, пятно гель для 2 h 200 мА на нитроцеллюлозную мембрану.
- Блокировать нитроцеллюлозную мембрану на ночь при 4 ° C с 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в отмывающего буфера.
- Проинкубируйте мембрану с антителом интерес на ночь при 4 ° C. Промойте отмывающим буфером 3 раза за 5 мин в шейкере и Проинкубируйте мембрану с ПХ тегами вторичное антитело за 1 ч при комнатной температуре. Повторите шаг стирки.
- Визуализировать lysate и иммунопреципитации зонды на мембрану с помощью супер-резолюции хемилюминесцентный агента с ПЗС-камеры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы изолировать клубочков точно, надо сначала perfuse мышиных почки с PBSCM. Перфузия с PBSCM поворачивает почки бледно (рис. 1А). Эмболизация клубочков с магнитной бусины будет виден как коричневые точки на поверхности почек (рис. 1Б). Изоляция клубочков с магнитом зрелище может показать загрязнения с почечной tubuli (рис. 1C). До дальнейшего анализа клубочков, > 95% чистоты клубочков необходимо достичь путем более тщательного промывания клубочков (рис. 1D).
В естественных условиях biotinylation опирается на способность ярлык клеток поверхности белки с биотин. Чтобы изучить это, мышиных почек увлажненную с PBSCM или биотин проницаемость клеточной мембраны. Как показано на рисунке 2, биотин этикетки капиллярных петель биотин увлажненную но не управления мыши почек. Расследовать клеток поверхности белки glomerulus, обозначены в vivo биотина перфузии, выполняется иммунопреципитации биотина фракции клубочковых экстрактов. Рисунок 3 A показывает, что клубочковых трансмембранные белки nephrin и podocalyxin immunoprecipitated в пределах биотина дроби. Однако управления мышей, не nephrin или podocalyxin обнаруживается в immunoprecipitated фракции биотинилированного белков. Как отрицательный контроль, внутриклеточных белков внеклеточного сигнала регулируется p42 киназы и p44 (Эрк) не найден в immunoprecipitated фракции биотинилированным белков как управления, так и биотин увлажненную мыши почек. Чтобы подтвердить, что клетки поверхности белка nephrin на самом деле биотинилированным этим методом, nephrin осаждается из управления и биотин увлажненную мыши почек. Чтобы визуализировать биотин, immunoprecipitated фракция запачкается с стрептавидина. Рисунок 3 B показывает биотинилированным nephrin в увлажненную биотин, но не контролировать животных. Lysate управления указывают одинаковое количество белка в управления и биотин увлажненную животных. Эндотелиальные белка сосудистого эндотелия (VE)-Кадгерины является immunoprecipitated в пределах биотина фракция, как показано на рис. 3C. В мышах управления не ве Кадгерины осаждается, хотя VE-Кадгерины присутствует в лизатов управления и биотин увлажненную животных. Внутриклеточные Межмицеллярная молекула 2 (ICAM-2) осаждается из биотин увлажненную животных, и не КУПР-2 находится в контрольных животных. Лизатов управления и биотин увлажненную животных показывают одинаковое количество КУПР-2 (рис. 3C). Актин служил загрузки элемента управления.
Этот метод может использоваться для количественного определения количества белков клубочковых клеток поверхности в модели нефропатии (например, нефротоксичные нефрит, НТН). В ранней фазе НТН [день 1 (1 d) после инъекции сыворотки НТН] протеинурия, быстро возрастает. В поздней фазе НТН [день 18 (18 d)] протеинурия значительно уменьшается. Рисунок 4 показывает nephrin клеток поверхности изобилия в начале НТН (1 d). В естественных условиях biotinylation пробу (рис. 4A) показывает сокращение клеток поверхности nephrin НТН животных, по сравнению с элементами управления. Денситометрических анализ показывает значительное сокращение биотинилированным nephrin (57%), НТН животных, по сравнению с элементами управления (рис. 4C). Количественный анализ общего nephrin актина показывает без существенных различий между элементами управления и НТН мышей (Рисунок 4B). С помощью p57 Подоцит клеток специфического окрашивания, Подоцит числа отображаются равные суммы в НТН и контроля животных (цифры 4 d и 4E). Рисунок 5 отображает результаты nephrin клеток поверхности изобилия в конце НТН (18 d). Рисунок 5 A показывает biotinylation в vivo пробирного контроля и НТН мышей, указывающий на восстановление клеток поверхности nephrin. Денситометрических анализ показывает никаких значимых отличий поверхности nephrin клеток в управления и НТН мышей (рис. 5B). Общая nephrin был сокращен на 25% в НТН мышей (рис. 5C). Подоцит номера были снижены в НТН мышей, по сравнению с элементов управления приблизительно 19% (цифры 5 d и 5E).
Рисунок 1 : Почечная перфузия и изоляции клубочков. () Вид через микроскоп в мышиных situs после перфузии с PBSCM. Катетер в аорте, обозначается стрелкой. Перфузия с PBSCM приводит почки превратить бледно. (B) эмболизации клубочков с магнитные шарики появляются как коричневые точки на поверхности почек. (C) Посмотреть хотя Микроскоп, я показываю) загрязнение клубочков (коричневые круглые структуры); II) с tubuli (легкие удлиненной структуры); и iii) ячейки мусор. Чистота клубочков составляет примерно 50%. Бесплатные магнитные шарики появляются как коричневые точки (масштаб 100 X). (D) Посмотреть через микроскоп, показаны 95% чистоты клубочков (масштаб 100 X). Масштаб баров = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: биотина, обнаруженных в контуре клубочковых капилляров. Представитель иммунофлюоресценции изображение мыши клубочков (C57BL/6) увлажненную с PBSCM (контроль) и биотин (биотин). Биотин (зеленый) визуализированное стрептавидина в контуре клубочковых капилляров только в биотин увлажненную мышей. Мышь управления не показывать клубочковых биотина пятнать. РК1 (красный) обнаруживается в ядрах podocytes в обеих мышей. Этот рисунок был изменен с предыдущей публикации20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: В vivo биотина маркировки клубочковых клеток поверхности белков. (A) западной помарке анализ immunoprecipitated (IP) биотинилированным клеток поверхности белков (IP: стрептавидина агарозы бусины) и лизатов (lysate) почек от PBSCM-увлажненную (контроля) и увлажненную биотин (биотин) мышах. Трансмембранные белки nephrin и podocalyxin обнаруживаются лишь в immunoprecipitated образцах биотин увлажненную мыши почек. В мышах управления nephrin и podocalyxin не обнаруживаются в immunoprecipitated зонды управления мыши почек. В лизатов управления и биотин увлажненную животных общая nephrin и podocalyxin одинаково выражаются в обеих группах. Внутриклеточных белков внеклеточного сигнала регулируется p42 киназы и p44 (Эрк) не обнаруживаются в immunoprecipitated датчики контроля и биотин увлажненную мыши почек. В лизатов обеих групп мыши Эрк обнаружен в равных количествах. Актин витражи как элемент управления загрузки. (B) западной помарке анализ immunoprecipitated nephrin (IP: α-nephrin) в PBSCM-увлажненную (управления) и увлажненную биотин (биотин) мышах. В биотин увлажненную почек nephrin визуализируется с стрептавидина окрашивание, хотя нет обнаружения для nephrin в мышах управления. Immunoprecipitated фракция nephrin (IP: α-nephrin, ВБ: nephrin) а также lysate дроби (lysate, ВБ: nephrin) витражи для nephrin шоу равное количество nephrin. Актин используется как элемент управления загрузки. (C) Западная помарка анализ immunoprecipitated биотинилированным белка клеточной поверхности (IP: стрептавидина агарозы бусины) и лизатов (lysate) почек от PBSCM увлажненную (управления) и увлажненную биотин (биотин) мышах. Белка трансмембранного маркер сосудистого эндотелия (VE)-Кадгерины и внутриклеточных Межмицеллярная молекула 2 (ICAM-2) обнаруживаются лишь в immunoprecipitated фракции биотин увлажненную животных. В мышах управления обнаруживаются не ве Кадгерины или КУПР-2. Актин служит элемент управления загрузки. Этот рисунок был изменен с предыдущей публикации20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Клубочковых белка nephrin изобилия в начале нефротоксичные нефрит нефропатия (НТН). (A) западной помарке анализ поверхности nephrin (IP: α-nephrin, ВБ: стрептавидина) и общая nephrin (IP: α-nephrin или lysate, ВБ: nephrin) для управления и нефротоксичные сыворотки лечение мышей (НТН 1 d). Актин служит элемент управления загрузки. По сравнению с элементами управления, НТН обработанных мышей показывают сокращение клеток поверхности nephrin (IP: α-nephrin, стрептавидина ВБ) по сравнению с элементами управления. (B) количественный анализ всего nephrin/актина управления и НТН 1 d мышей [управления n = 4, НТН n = 6, не существенные различия (ns)]. (C) Densitometric анализ клеток поверхности nephrin (nephrin nephrin/всего биотинилированным) управления и НТН мышей (* p < 0.01, контролировать n = 4, НТН n = 6). (D) иммуногистохимия p57 показаны podocytes управления и НТН 1 d мышей. (E) количественный анализ позитивных клеток p57 за пучок области (2мкм). (40 клубочков на мышь количественно, ns). Западная помарка данные показывают средства ± SD. Подоцит подсчеты показывают средства ± SEM. Unpaired t-тест с коррекцией Уэлча. Шкалы бар = 50 мкм. Этот рисунок был изменен с предыдущей публикации20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Клубочковых белка nephrin изобилия в конце нефротоксичные нефрит нефропатия (НТН). (A) западной помарке анализ поверхности nephrin (IP: α-nephrin, ВБ: стрептавидина) и общая nephrin (IP: α-nephrin или лизатных, ВБ: nephrin) в сыворотке крови управления и нефротоксичные лечение мышей (НТН 18 d). По сравнению с контроль, d мышей НТН 18 Показать равное количество клеток поверхности nephrin (IP: α-nephrin, ВБ: стрептавидина). НТН трактуется мышей на 18 день дисплей меньше всего nephrin и актина служит элемент управления загрузки. (B) денситометрических анализа отображает не существенные различия в ячейке поверхности nephrin между элементами управления и НТН 18 d мышей (Управление n = 4, НТН n = 3). (C) Densitometric анализ общего nephrin актина. НТН мышей на 18 день, есть меньше выражение nephrin, по сравнению с элементами управления (управления n = 4, НТН n = 3, ** p < 0,001). (D) иммуногистохимия p57 показаны podocytes управления и НТН 18 d мышей. Есть меньше p57 позитивные клетки (красный) в НТН 18 d мышей, по сравнению с элементами управления. Магнитные шарики появляются как черные точки. (E) количественный анализ позитивных клеток p57 клубочковых клок площади (2мкм) (*** p < 0,0001, контролировать n = 2, НТН n = 2, 40 клубочков на мышь количественно). Западная помарка данные показывают средства ± SD. Подоцит подсчеты показывают средства ± SEM. Статистический анализ: непарные t-тест с коррекцией Уэлча. Шкалы бар = 50 мкм. Этот рисунок был изменен с предыдущей публикации20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленный метод позволяет успешно изоляции клубочков расследовать клубочковых RNA или протеина. Кроме того культуры первичной клубочковых клеток может выполняться из изолированных клубочков. Если биотина применяется перед клубочковых изоляции, маркировки клубочковых клеток поверхности белков может выполняться. С помощью этого метода в естественных условиях клубочковых клеток поверхности белка людьми могут быть изучены, и возможен полу количественный белка изобилия. Наиболее важных шагов для успешного тестирования клубочковых клеток поверхности белка изобилие являются 1) разработка ручной опыт в мыши хирургии особенно катетеризации аорты, 2) пузырь бесплатное подключение шприцев для того, чтобы избежать воздуха эмболизация клубочков и 3) работает в ледяной условиях после начала перфузии с PBSCM.
Для этой техники ручной опыт в хирургии мышь имеет важное значение. Катетеризации аорты имеет особенно важное значение, как рассечение судна будет помешать перфузии почек. Разрез в аорту должно быть достаточно большим (примерно 50% от диаметра сосуда) для создания достаточно места, чтобы ввести катетер. Если катетер нарезать по диагонали, введение катетера в аорту будет легче. Помимо рассечение введен катетер должен располагаться высокой в аорте с тем, чтобы не препятствовать почечных артерий. Почечных артерий в противном случае не быть увлажненную биотина и магнитные бусы.
Биотин является небольшой витамин, который связывает с высоким сродством к стрептавидина белков. Из-за ее небольшой размер (244 Da) биотин не изменяют функции сложные белки и будет фильтроваться через glomerulus. При инкубации с стрептавидина биотинилированным белков легко может отделяться от непомеченным белки агарозы бусы или другими методами. N-hydroxysuccimide (NHS) эфиры биотина привязку к Амин (-NH2) группы белков, которые имеются в изобилии на боковых цепей остатков лизина, например. Сульфогруппу-ГСЗ-LC-биотин является вода растворимых и клеток непроницаемый, если мембраны клеток остаются неизменными. Было показано, что сульфогруппу-ГСЗ-LC-биотин ярлык клеток поверхности белки23. Связывание биотина NHS эфиры Амин групп зависит от pH (7-9) и использование Амин свободных буферов (т.е. PBSCM). PBSCM с рН 7,4 таким образом использовалась для perfuse мыши почки с биотин, как он сочетает в себе идеальные физиологические свойства с оптимальной растворимости и функция биотин. Чтобы утолить белков после маркировки, выполняется перфузии PBSCM с глицином, позволяя свободный биотина стать связанным группам Амин глицина. Чтобы предотвратить клеточных процессов после смерти животного, важно выполнять перфузии с ледяной решения и продолжать работу на льду.
Подобно методам ex vivo biotinylation, механическому обработки клубочков во время biotinylation в vivo протоколы мая также влияние эндоцитоза, быстрое сигнализации событий и РНК целостность. Поэтому важно, что все шаги обработки выполняются на лед, чтобы снизить риск ферментативные клеточной активности.
Протеинурией Животные модели как нефротоксичные сыворотки нефрит (НТН) ущерб мыши почки сильно. В частности НТН приводит к Мезангиальный расширения, клубочковых склероз и трубчатых поражений, ведущих к фиброза почек на продвинутых стадиях заболевания (42 дня)24. Нарушением перфузии склерозирования клубочков в моделях заболеваний может привести к предвзятым результаты белка изобилия. Склерозирования клубочков скорее всего не будет быть увлажненную с магнитной бусины и таким образом не может стать изолированы в этом методе. В модели заболеванием, приводит к серьезным клубочковых склероз с использованием методов изолировать клубочков через различные шаги просеивание может быть альтернативой методу магнитной бусины, используемый в этот протокол25. Однако если сильно склерозирования клубочков, даже перфузии с биотина могут быть ослабленным. Кроме того ex vivo biotinylation, в котором извлеченные клубочков, купались ex vivo в биотина решения21, вероятно, не будет выгодно в этих моделях. Кроме того используйте иммунофлюоресценции для обнаружения белка изобилия в серьезно больными клубочков может быть выгодным, как это не полагаться на перфузии клубочков.
Полуфинал количественный белка изобилия, используя этот метод работает хорошо с помощью денситометрия. Однако небольшие различия в изобилии белка могут быть потеряны в результате предел обнаружения денситометрия.
Описан метод могут быть переданы в другие органы животных, которые являются увлажненную, при том условии, что структуры интереса являются доступными методами изоляции или поверхности протеина интереса для одной ячейки типа или орган структуры. Даже несмотря на то, что все поверхности белки являются биотинилированным на этот метод, с помощью специфического антитела для иммунопреципитации приведет к доля клеток поверхности белка выражения определенного белка (как показано на nephrin в рисунке 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Blanka Duvnjak за ее исключительной технической помощи. Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1-М.В и QU280/3-1-I.Q. Спонсора имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных, анализ данных, решение опубликовать и подготовка рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | PZN:01320422 | anesthesia |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors, for cut into the aorta |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for abdominal cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery until the abdomen is opened |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | biotin |
| Dynabeads Untouched Mouse T-cells | Invitrogen | 11413D | to embolize glomeruli |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | to digest kidney tissue |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | Magnet catcher |
| 100µm cell stainer | Greiner-bio | 542000 | for glomerular isolation |
| Axiovert 40 CFL | Zeiss | non available | to confirm glomerular purity |
| TissueRuptor | Quiagen | 9002755 | Tissue homogenizer |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | for lysis buffer |
| Tris-HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | for lysis buffer |
| NaCl | VWR chemicals | 27810295 | for lysis buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | for lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | for lysis buffer |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | for lysis buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Follow the manufacturer's instructions |
| nephrin antibody | Progen | GP-N2 | for westernblot |
| Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody | R&D Systems | AF15556-SP | for westernblot |
| Streptavidin Agarose Resin | Thermo Scientific | 20347 | for immunoprecipitation |
| Protein A sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | for immunoprecipitation |
| polyclonal rabbit anti-p57 antibody | SCBT | sc-8298 | for Immunohistochemistry |
| mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | Western blot loading control |
| rabbit anti-p44/42 | cell signalling | 4695 | for westernblot |
| Pierce High sensitivity streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21130 | for westernblot |
| polyclonal mouse ICAM-2 antibody | R&D Systems | AF774 | for westernblot |
| polyclonal mouse anti-VE-cadherin | R&D Systems | AF1002 | for westernblot |
References
- Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Quack, I., et al. beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).
- Quack, I., et al. PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia. Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).
- Swiatecka-Urban, A. Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm. Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).
- Swiatecka-Urban, A. Membrane trafficking in podocyte health and disease. Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).
- Soda, K., et al. Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes. The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Martin, C. E., Jones, N. Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).
- Nielsen, J. S., McNagny, K. M. The role of podocalyxin in health and disease. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).
- Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).
- Tossidou, I., et al. Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis. Public Library of Science One. 5 (4), 10185 (2010).
- Qin, X. S., et al. Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).
- Waters, A. M., et al. Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).
- Zhang, X., Simons, M. Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).
- Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies. Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Haase, R., et al. A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease. Public Library of Science One. 12 (6), 0179217 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).
- Tomas, N. M., et al. Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy. New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface. Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).
- Ougaard, M. K. E., et al. Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease. International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).
- Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals. Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).
