Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

अलगाव की Glomeruli और Vivo में Glomerular सेल सतह प्रोटीन की लेबलिंग

Published: January 18, 2019 doi: 10.3791/58542
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Nephrology, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University, 2Institute of Cellular and Integrative Physiology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

Summary

यहां हम vivo में murine के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान glomerular कोशिका की सतह प्रोटीन के साथ बायोटिन की लेबलिंग । इस प्रोटोकॉल कैसे माउस गुर्दे perfuse करने के लिए, glomeruli को अलग, और ब्याज की प्रोटीन के अंतर्जात immunoprecipitation प्रदर्शन के बारे में जानकारी शामिल है ।

Abstract

glomerular फिल्टर है कि fenestrated endothelium, glomerular तहखाने झिल्ली से बना है के विघटन से Proteinuria परिणाम, और उनके भट्ठा डायाफ्राम के साथ podocytes । glomerular फिल्टर की नाजुक संरचना, विशेष रूप से भट्ठा डायाफ्राम, विविध कोशिका सतह प्रोटीन के साथ खेलना पर निर्भर करता है । इन सेल की सतह प्रोटीन का अध्ययन अब तक इन विट्रो अध्ययन या histologic विश्लेषण करने के लिए सीमित किया गया है । यहां, हम vivo biotinylation लेबलिंग विधि में एक murine मौजूद है, जो शारीरिक और pathophysiologic शर्तों के तहत glomerular सेल सतह प्रोटीन के अध्ययन में सक्षम बनाता है । इस प्रोटोकॉल कैसे माउस गुर्दे perfuse करने के लिए, glomeruli को अलग, और ब्याज की एक प्रोटीन के अंतर्जात immunoprecipitation प्रदर्शन के बारे में जानकारी शामिल है । glomerular सेल सतह बहुतायत के अर्द्ध quantitation इस उपंयास विधि के साथ आसानी से उपलब्ध है, और सभी बायोटिन छिड़काव और immunoprecipitation के लिए सुलभ प्रोटीन का अध्ययन किया जा सकता है । इसके अलावा, glomeruli के साथ या बिना biotinylation के अलगाव glomerular आरएनए और प्रोटीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्राथमिक glomerular सेल संस्कृति (यानी, प्राथमिक podocyte सेल संस्कृति) के आगे विश्लेषण सक्षम बनाता है ।

Introduction

Proteinuria glomerular चोट की एक बानगी है और आम तौर पर glomerular फ़िल्टर1के साथ व्यवधान । glomerular फिल्टर fenestrated endothelium, glomerular तहखाने झिल्ली, और podocytes से बना है । glomerular फिल्टर की नाजुक आणविक संरचना अत्यधिक गतिशील और कोशिका की सतह के अधीन है दोनों स्वस्थ और रोगग्रस्त गुर्दे में प्रोटीन की तस्करी2,3,4,5,6 . सेल की सतह प्रोटीन के Endocytosis7podocytes के अस्तित्व के लिए आवश्यक हो दिखाया गया है । Nephrin और podocalyxin transmembrane प्रोटीन podocytes पर व्यक्त कर रहे हैं । Nephrin glomerular भट्ठा डायाफ्राम की रीढ़ है, जबकि podocalyxin एक sialoglycoprotein कोटिंग podocytes8,9,10के माध्यमिक पैर प्रक्रियाओं है । Endocytic ्े पहले nephrin और podocalyxin3,11,12,13,14के लिए दिखाया जा चुका है ।

हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, सेल सतह प्रोटीन के endocytosis अभी तक साहित्य में glomerular endothelial कोशिकाओं में वर्णित नहीं किया गया है । हालांकि, सामांय में endothelial कोशिकाओं endocytosis के विभिंन प्रकार के लिए सभी आवश्यक प्रोटीन व्यक्त (यानी, clathrin निर्भर, बेड़ा निर्भर endocytosis)15,16। इसलिए, endothelial सेल भूतल तस्करी का उपयोग कर इस विधि के साथ अध्ययन किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, संवहनी endothelial (VE)-cadherin और intracellular आसंजन अणु (िकैम-2) glomerular endothelial कोशिकाओं के लिए एक सेल सतह मार्कर प्रोटीन के रूप में17 .

दुर्भाग्य से, वहां कोई सटीक इन विट्रो मॉडल नाजुक तीन स्तरित glomerular फ़िल्टर जिसमें कोशिका सतह प्रोटीन तस्करी के लिए अध्ययन किया जा सकता है के लिए है । इस पद्धति का लक्ष्य वीवो मेंglomerular प्रोटीन के तस्करी का अध्ययन करने के लिए इस प्रकार है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल कैसे glomeruli को अलग करने के लिए, glomerular आरएनए, प्रोटीन, या कोशिकाओं के आगे विश्लेषण को सक्षम करने के बारे में जानकारी शामिल है । इसी प्रकार की glomerular आइसोलेशन तकनीक का वर्णन विभिन्न समूहों द्वारा18,19.

पहले, हम और दूसरों biotinylation2,3,4,20,21द्वारा glomerular सेल सतह प्रोटीन के पूर्व vivo लेबलिंग का इस्तेमाल किया है । हालांकि, इस पूर्व vivo विधि में, पृथक glomeruli यांत्रिक तनाव के संपर्क में थे, जो endocytic तस्करी को प्रभावित कर सकते हैं । वैकल्पिक रूप से, इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग glomerular कोशिका की सतह प्रोटीन बड़े पैमाने पर साहित्य में इस्तेमाल किया गया है2,20,22. इस विधि के साथ, तथापि, केवल प्रोटीन की एक छोटी संख्या एक स्लाइड के भीतर विश्लेषण किया जा सकता है, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों के quantitation अक्सर मुश्किल है ।

vivo विधि में यह उपंयास glomerular सेल सतह प्रोटीन बहुतायत और स्वस्थ और रोगग्रस्त गुर्दे में सही तस्करी का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण प्रदान करता है, और यह इम्यूनोफ्लोरेसेंस परीक्षण के लिए एक अतिरिक्त के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

चूहों को स्थानीय पशु देखभाल सुविधा से या फ्रांस में Janvier लैब्स से एक घर में नस्ल के रूप में प्राप्त किया गया । जांच की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड में उल्लिखित दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किए गए (अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य के संस्थान प्रकाशन No. 85-23, संशोधित १९९६) । सभी पशु प्रयोगों को प्रासंगिक संस्थागत अनुमोदनों (राज्य सरकार LANUV संदर्भ संख्या AZ: 84-02.04 के अनुसार किया गया था । 2016. A435).

1. उपकरणों, समाधान, और उपकरणों की तैयारी

  1. 1 एल फॉस्फेट के साथ तैयार 1 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड (MgCl2) और ०.१ मिमी कैल्शियम क्लोराइड (CaCl2) (PBSCM) के साथ पूरक और एक बाँझ फिल्टर के माध्यम से फिल्टर.
  2. छिड़काव के लिए प्रति माउस बाँझ PBSCM के 5 मिलीलीटर तैयार है और यह बर्फ पर जगह है ।
  3. प्रत्येक माउस के लिए, तैयार बाँझ PBSCM के 5 मिलीलीटर ०.५ मिलीग्राम/एमएल बायोटिन के साथ पूरक ।
  4. प्रत्येक माउस के लिए, बाँझ PBSCM के 5 मिलीलीटर तैयार करने और glomeruli के embolization के लिए ०.८ x 108 चुंबकीय मोती (जैसे, एक 4 x 108 मोतियों की २०० µ एल/एमएल समाधान,) जोड़ने के लिए । मूल ट्यूब में चुंबकीय मोती बाँझ रखने के लिए सेल संस्कृति पीठ के तहत इस समाधान तैयार करते हैं । इस घोल को बर्फ पर लगाएं ।
  5. १०० mM glycine को PBSCM (प्रति माउस 5 मिलीलीटर) जोड़कर एक शमन समाधान तैयार करें और इसे बर्फ पर रखें ।
  6. एक collagenase समाधान करें (०.३७८ U/mL collagenase a in बाँझ PBSCM). प्रति माउस, एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में collagenase समाधान के 1 मिलीलीटर पिपेट और यह बर्फ पर जगह है ।
  7. धोने के लिए, एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में बाँझ PBSCM (१.१ कदम देखें) तैयार है और यह बर्फ पर जगह है ।
  8. छिड़काव के लिए, २.० मिलीलीटर का एक प्रवाह के साथ एक सिरिंज पंप का उपयोग करें/
  9. एक 21G सुई के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज तैयार करें । एक 20-30 सेमी लंबे कैथेटर (इनर व्यास, आईडी = ०.५८ मिमी) में सुई की नोक प्लेस । एक 10 सेमी कम कैथेटर (आईडी ०.२८ मिमी) के साथ कैथेटर (आईडी ०.५८ मिमी) कनेक्ट और माउस महाधमनी में एक आसान प्रविष्टि के लिए छोटे कैथेटर की नोक काट ।
  10. सर्जरी के दौरान संयुक्ताक्षर प्रक्रियाओं के लिए, प्रति माउस तीन 5-7 सेमी रेशम धागे (4-0 6-0) में कटौती ।
  11. सर्जरी के लिए, 3 सर्जिकल clamps, 2 सर्जिकल कैंची, 2 चिमटी, 2 ठीक चिमटी, 1 ठीक कैंची, और झाड़ू तैयार करते हैं । संज्ञाहरण (जैसे, intraperitoneal संज्ञाहरण ketamine १०० मिलीग्राम/किग्रा bodyweight और xylazine 5 मिलीग्राम/bodyweight) तैयार करें ।
  12. दो गुर्दे के glomeruli के अलगाव के लिए, एक १०० µm सेल छलनी, २ ५० मिलीलीटर ट्यूबों, और एक चुंबक पकड़ने का उपयोग करें ।
  13. तैयार लोग lysis बफर: 20 मिमी 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (लोग); 20 mM Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) pH ७.५; ५० मिमी sodiumchorlide (NaCl); ५० मिमी sodiumfluoride (NaF); 15 मिमी ना4पी2ओ7; ०.१ मिमी Ethylenediaminetetraacetic अम्ल (EDTA) पीएच ८.०; 2 मिमी sodiumorthovanadate; और 2 मिमी adenosinetriphosphat (एटीपी) ।
  14. शांत 4 डिग्री सेल्सियस के लिए केंद्रापसारक ।

2. माइक्रोस्कोप के तहत सर्जरी

  1. Anesthetize (उदा., ketamine/xylazine intraperitoneally के साथ, चरण १.११) देखें । पैर की अंगुली चुटकी परीक्षण करने के लिए उचित संज्ञाहरण की पुष्टि करें ।
  2. ७०% isopropanol के साथ माउस के ventral पक्ष को संक्रमित ।
  3. उरोस्थि करने के लिए श्रोणि से त्वचा के माध्यम से एक औसत कटौती प्रदर्शन और चिमटी का उपयोग कर उदर प्रावरणी से त्वचा को हटा दें । सर्जिकल कैंची के साथ पेट के बीच में दोनों किनारों पर त्वचा को काट ।
  4. शल्य चिकित्सा उपकरण बदलें । पेट की मांसपेशी परत के माध्यम से मूत्राशय के लिए असिरूप से एक औसत कटौती लागू करते हैं और चिमटी और सर्जिकल कैंची का उपयोग कर चार चक्रों में विभाजित । दो सर्जिकल clamps के साथ माउस की गर्दन की ओर clamps के साथ ऊपरी दो अलग संलग्न ।
    नोट: अब पेट खुल गया है ।
  5. एक बाँझ झाड़ू के साथ आंत अंगों अलग रखो और ठीक कैंची के साथ यकृत phrenic बंधन में कटौती ।
  6. एक बंधाव (एक रेशम धागे के साथ 4-0 के लिए 6-0) दो ठीक चिमटी के साथ अधिवृक्क ग्रंथि की ऊंचाई पर गुर्दे की धमनियों के महाधमनी समीपस्थ के आसपास तैयार करें । चिमटी के साथ रक्त के प्रवाह को समाप्त करने के लिए समीपस्थ महाधमनी बंधाव कस ।
  7. प्रावरणी, वसा, और अंय ऊतकों से बाहर महाधमनी मुक्त और यकृत/ठीक शल्य चिमटी का उपयोग कर गुर्दे की धमनियों की mesenteric धमनी कपाल के आसपास एक बंधाव तैयार करते हैं ।
  8. एक बंधाव तैयार (एक रेशम धागा 4-0 के साथ 6-0) गुर्दे की धमनियों के बाहर महाधमनी के आसपास और महाधमनी की ऊंचाई पर वेना कावा और विभाजन दबाना ।
  9. इतना है कि छेद आधा महाधमनी के व्यास है गुर्दे की धमनियों के लिए बाहर महाधमनी में एक छोटा सा छेद में कटौती । महाधमनी में कैथेटर रखो और तैयार संयुक्ताक्षर के साथ इसे ठीक ।
    सावधानी: एयर आवेश को रोकने के लिए छिड़काव सिस्टम में बुलबुले से बचें ।
  10. 2 मिलीलीटर/मिनट की एक प्रवाह दर पर बर्फ ठंडा PBSCM के साथ छिड़काव शुरू करो ।
  11. ठीक शल्य कैंची के साथ गुर्दे की धमनियों के स्तर पर गुर्दे की नस में एक छेद में कटौती और यकृत और mesenteric धमनियों के आसपास बंधाव कस ।
    नोट: गुर्दे छिड़काव शुरू करने के बाद पीली बारी चाहिए ।

3. Vivo Biotinylation में

  1. सिरिंज बुलबुला-मुक्त करने के लिए बर्फ ठंडा PBSCM के साथ पूरक ०.५ मिलीग्राम/एमएल बायोटिन सतह लेबलिंग के लिए, और perfuse गुर्दे के साथ 5 मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर 2 मिलीलीटर/
    नोट: मिश्रण PBSCM समाधान (जैसे, ५० मिलीलीटर ट्यूबों बदल कर) धीरे समाधान के भीतर बुलबुले बनाने से बचने के लिए । सिरिंज के भीतर समाधान की आकांक्षा के बाद, सिरिंज से किसी भी बुलबुले या हवा खाली । प्रवेशनी है कि कैथेटर प्रणाली से जुड़ा है में अंतरिक्ष को भरने के लिए सिरिंज पर एक अतिरिक्त प्रवेशनी (21G) का उपयोग करें । अंत में, बुलबुले के बिना कैथेटर के साथ प्रवेशनी में सिरिंज छड़ी ।
  2. सिरिंज बुलबुला-मुक्त करने के लिए बर्फ ठंडा PBSCM १०० mM glycine के साथ पूरक glomeruli और perfuse के एक प्रवाह में 5 मिलीलीटर के साथ बुझाने के लिए 2 मिलीलीटर/
  3. सिरिंज बुलबुला-मुक्त करने के लिए बर्फ ठंडा PBSCM २०० μL चुंबकीय मोतियों के साथ पूरक/एमएल और perfuse गुर्दे 2 मिलीलीटर/
    नोट: गुर्दे की सतह पर, भूरे रंग के चुंबकीय मोतियों के साथ glomeruli की embolization दिखाई जाएगी ।

4. दो किडनी से Glomeruli का अलगाव

  1. hilum पर गुर्दे निकालें और कैप्सूल निकालें । एक 10 सेमी सेल कल्चरल डिश में PBSCM के 15 मिलीलीटर में बर्फ पर गुर्दे रखें । Euthanize गुर्दे की कटाई के बाद संज्ञाहरण के तहत गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के साथ माउस । सर्जरी और छिड़काव प्रक्रियाओं पिछले लगभग 20-22 मिनट ।
  2. एक नया डबल बढ़त ब्लेड के साथ संभव छोटे टुकड़ों में गुर्दे में कटौती । collagenase के 1 मिलीलीटर के साथ एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में ऊतक ले जाएं (१.६ कदम देखें) और 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर पचा । पहले और पाचन के बाद, एक १००० μL कट पिपेट के साथ धीरे से मिश्रण ।
  3. एक १०० माइक्रोन के माध्यम से पचा ऊतक कुल्ला बर्फ ठंडा PBSCM का उपयोग कर सेल छलनी । धीरे से सेल खुरचनी का उपयोग करने के लिए शेष ऊतक भरती गर्त सेल छलनी और यह बर्फ के साथ कुल्ला-ठंड PBSCM बाद में ५० मिलीलीटर की कुल मात्रा में ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर निलंबन 5 मिनट के लिए ५०० x g केंद्रापसारक । supernatant निकालें और गोली के साथ थोड़ा कम १.५ मिलीलीटर बर्फ ठंड PBSCM के साथ गोली फिर से स्थगित करते हैं । बाद में, एक नया 2 मिलीलीटर ट्यूब में glomerular निलंबन डाल दिया ।

5. धुलाई

  1. चुंबक पकड़ने का उपयोग करने के लिए एक तरफ glomeruli खींचो । 1 मिनट के लिए रुको इससे पहले कि glomeruli चुंबक की ओर स्थानांतरित कर दिया है ।
  2. एक १००० μL पिपेट के साथ supernatant निकालें, जबकि 2 मिलीलीटर ट्यूब चुंबक पकड़ने में रहता है । पहले और दूसरे वाशिंग स्टेप्स (५.३ स्टेप देखें) के दौरान, supernatant के २५० μL glomeruli के नुकसान से बचने के लिए ट्यूब में रहता है । इस प्रक्रिया को जल्दी से प्रदर्शन दे ट्यूबलर संरचनाओं ट्यूब के नीचे करने के लिए सिंक से बचने के लिए ।
    नोट: धुलाई प्रक्रिया अब अंयथा पिछले जाएगा ।
  3. चुंबक पकड़ने से 2 मिलीलीटर ट्यूब निकालें और PBSCM के 1 मिलीलीटर जोड़ें, ऊपर और नीचे पिपेट (बहुत महत्वपूर्ण), तो भंवर ।
  4. ट्यूब वापस चुंबक पकड़ने में डाल दिया और कदम ५.२ के साथ शुरू करते हैं ।
  5. glomeruli की शुद्धता ९०% तक पहुंच गया है जब तक धुलाई चरणों को दोहराएँ । इसके लिए एक माइक्रोस्कोप (40-100X) के तहत supernatant के एक प्रतिनिधि aliquot की जांच करें ।
    नोट: Glomeruli भूरे रंग के चुंबकीय मोतियों से युक्त गोल संरचनाओं के रूप में दिखाई देगा । लंबी संरचनाओं ट्यूबलर टुकड़े कर रहे हैं, और मुक्त चुंबकीय मोती भूरे रंग के दौर डॉट्स के रूप में दिखाई देते हैं । सेल मलबे भारी संरचनाओं के रूप में प्रकट हो सकता है ।
  6. यदि शुद्धता पहुंच जाती है तो PBSCM के 1 मिलीलीटर में glomeruli को भंग करके glomeruli की गिनती का अनुमान लगाएं । मिश्रण के बाद, 10 μL का एक aliquot ले लो और माइक्रोस्कोप के तहत glomeruli गिनती । निंनलिखित समीकरण के साथ glomeruli की संख्या की गणना: glomeruli की अंतिम संख्या = 10 μL aliquot x १०० में glomeruli की संख्या ।
  7. glomeruli का सफल अलगाव 10000-40000 glomeruli की सीमा तक जाता है ।

6. प्रोटीन निष्कर्षण और Immunoprecipitation (आईपी)

  1. 5 मिनट के लिए ६८०० x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक द्वारा glomeruli इकट्ठा । supernatant निकालें जबकि एक चुंबक पकड़ने का उपयोग कर और बर्फ में गोली स्थगित ठंड lysis बफर (जैसे, ३०,००० ३०० में glomeruli μL; लोग, १.११ चरण देखें) । 30 एस के लिए उच्चतम गति पर एक ऊतक homogenizer के साथ नमूनों Homogenize और 30 मिनट के लिए बर्फ पर उन्हें लाइसे.
  2. 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 30 मिनट के लिए १५,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा अघुलनशील सामग्री निकालें । पिपेट supernatant जो एक नया १.५ एमएल ट्यूब में सेल lysate शामिल है । गोली छोड़ें ।
  3. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एक bicinchoninic (बीसीए)-आधारित पद्धति का उपयोग करके supernatant के प्रोटीन एकाग्रता को मापने । ३०,००० glomeruli पैदावार का एक सफल lysis 700-1000 µ g/एमएल की एक glomerular प्रोटीन राशि के लिए । lysis बफर के साथ बराबर प्रोटीन मात्रा को समायोजित करें ।
  4. glomerular lysate के लिए कुल मात्रा का 10% की एक aliquot ले लो और ९५ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए मशीन से पहले 2x Laemmli + dithiothreithol (डीटीटी) जोड़ें ।
  5. आईपी के लिए, एक उपरि शेखर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर streptavidin agarose मोतियों के साथ lysate के बाकी की गर्मी ।
  6. 4 ° c में 3 मिनट के लिए १००० x g पर agarose मोती केंद्रापसारक, supernatant निकालें, और lysis बफर के ८०० μL जोड़ने के लिए विशिष्ट प्रोटीन बंधन के लिए मोती धोने ।
  7. धो 3 बार दोहराएं, और supernatant पूरी तरह से हटा दें ।
  8. 2x Laemmli + डीटीटी के 30 μL जोड़ें और 5 मिनट के लिए ९५ ° c पर मशीन ।
  9. एक 10% एसडीएस जेल पर lysate और आईपी जांच लोड और 30 मिनट के लिए ७० वी पर एसडीएस जेल चलाने के लिए, तो १.५ ज के लिए जेल प्रति 20 मा पर, एक nitrocellulose झिल्ली पर २०० ma में 2 ज के लिए जेल दाग ।
  10. धोने बफर में 5% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के साथ 4 ° c पर रातोंरात nitrocellulose झिल्ली ब्लॉक ।
  11. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ब्याज की एंटीबॉडी के साथ झिल्ली की मशीन । धोने बफर के साथ 3 बार एक शेखर पर 5 मिनट के लिए धोने और एचआरपी-टैग माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली गर्मी कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए । धुलाई कदम दोहराएं ।
  12. एक सीसीडी कैमरे के साथ एक सुपर संकल्प chemiluminescent एजेंट का उपयोग करके झिल्ली पर lysate और immunoprecipitation जांच कल्पना ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

glomeruli को अलग करने के लिए पहले PBSCM के साथ murine किडनी को perfuse करना जरूरी होता है । PBSCM के साथ छिड़काव गुर्दे पीला (चित्रा 1ए) बदल जाता है । चुंबकीय मोतियों के साथ glomeruli के Embolization गुर्दे की सतह पर भूरे रंग के डॉट्स के रूप में दिखाई देगा (चित्रा 1ख) । चुंबक पकड़ने के साथ glomeruli का अलगाव गुर्दे tubuli (चित्रा 1सी) के साथ संदूषण दिखा सकते हैं । glomeruli के आगे विश्लेषण से पहले, एक > ९५% glomeruli की शुद्धता की जरूरत है glomeruli अधिक अच्छी तरह से धुलाई द्वारा प्राप्त किया (चित्रा 1डी) ।

vivo biotinylation में बायोटिन के साथ सेल की सतह प्रोटीन लेबल करने की क्षमता पर निर्भर करता है । इस अध्ययन के लिए, murine गुर्दे PBSCM या गैर कोशिका-झिल्ली पारगंय बायोटिन के साथ perfused हैं । के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है, बायोटिन बायोटिन-perfused में नहीं बल्कि नियंत्रण माउस गुर्दे में केशिका छोरों लेबल । vivo बायोटिन छिड़काव में द्वारा लेबल glomerulus के सेल सतह प्रोटीन की जांच करने के लिए, glomerular अर्क के बायोटिन अंश का immunoprecipitation किया जाता है । चित्रा 3 एक दर्शाता है कि बायोटिन अंश के भीतर glomerular transmembrane प्रोटीन्स nephrin और podocalyxin immunoprecipitated हैं. हालांकि, नियंत्रण चूहों में, biotinylated प्रोटीन के immunoprecipitated अंश में कोई nephrin या podocalyxin का पता चला है । एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, intracellular प्रोटीन extracellular-संकेत विनियमित kinases p42 और p44 (ERK) नियंत्रण और बायोटिन-immunoprecipitated माउस गुर्दे दोनों के biotinylated प्रोटीन के perfused अंश में नहीं पाए जाते हैं । कोशिका सतह प्रोटीन nephrin वास्तव में इस विधि द्वारा biotinylated है कि पुष्टि करने के लिए, nephrin नियंत्रण और बायोटिन-perfused माउस गुर्दे से उपजी है । बायोटिन की कल्पना करने के लिए, immunoprecipitated अंश streptavidin के साथ दाग है । चित्रा 3 बी biotinylated nephrin में बायोटिन-perfused से पता चलता है लेकिन जानवरों पर नियंत्रण नहीं है । Lysate नियंत्रण और बायोटिन-perfused जानवरों में प्रोटीन की बराबर मात्रा का संकेत देते हैं । Endothelial प्रोटीन संवहनी Endothelial (VE)-cadherin 3सीचित्रा में दिखाया के रूप में बायोटिन अंश के भीतर immunoprecipitated है । नियंत्रण चूहों में, कोई ve-cadherin उपजी है, जबकि ve-cadherin नियंत्रण और बायोटिन-perfused जानवरों के lysates में मौजूद है । Intracellular आसंजन अणु 2 (िकैम-2) बायोटिन-perfused पशुओं से उपजी है, और कोई िकैम-2 नियंत्रण पशुओं में पाया जाता है । Lysates के नियंत्रण और बायोटिन-perfused जानवरों िकैम-2 (चित्रा 3सी) की बराबर मात्रा में दिखाते हैं । Actin लोडिंग नियंत्रण के रूप में कार्य किया ।

इस विधि नेफ्रोपैथी (जैसे, nephrotoxic नेफ्रैटिस, NTN) के मॉडलों में glomerular कोशिका की सतह प्रोटीन की मात्रा यों तो इस्तेमाल किया जा सकता है । NTN [day 1 (1 d) के प्रारंभिक चरण में NTN सीरम इंजेक्शन के बाद], proteinuria तेजी से बढ़ता है । NTN के बाद के चरण में [दिन 18 (18 घ)], proteinuria काफी कम हो जाती है । चित्रा 4 जल्दी NTN (1 डी) में nephrin सेल सतह बहुतायत से पता चलता है । vivo biotinylation परख (चित्रा 4ए) में नियंत्रण की तुलना में NTN पशुओं में सेल सतह nephrin की कमी से पता चलता है । densitometric विश्लेषण (चित्रा 4सी) नियंत्रण की तुलना में NTN जानवरों में biotinylated nephrin (५७%) की एक महत्वपूर्ण कमी से पता चलता है । actin करने के लिए कुल nephrin का मात्रात्मक विश्लेषण नियंत्रण और NTN चूहों (चित्रा 4बी) के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर पता चलता है. एक p57 podocyte सेल विशिष्ट धुंधला का उपयोग करना, podocyte संख्या NTN और नियंत्रण जानवरों में बराबर मात्रा में प्रदर्शन (आंकड़े 4d और 4E) । चित्रा 5 देर NTN (18 डी) में nephrin सेल सतह बहुतायत के परिणाम प्रदर्शित करता है । चित्रा 5 एक से पता चलता है vivo में नियंत्रण में biotinylation परख और NTN चूहों सेल सतह nephrin की वसूली का संकेत है । Densitometric विश्लेषण में नियंत्रण और NTN चूहों (चित्रा 5ख) में सेल सतह nephrin का कोई महत्वपूर्ण अंतर प्रदर्शित करता है । कुल nephrin NTN चूहों में 25% की कमी हुई (चित्रा 5सी). Podocyte संख्याओं को लगभग 19% (आंकड़े 5d और 5E) द्वारा नियंत्रणों की तुलना में NTN चूहों में कम किया गया ।

Figure 1
चित्रा 1 : किडनी छिड़काव और glomeruli का अलगाव । (क) PBSCM के साथ छिड़काव के बाद murine सीटू में माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखें. महाधमनी में कैथेटर एक तीर के साथ संकेत दिया है । PBSCM के साथ छिड़काव गुर्दे बारी करने के लिए पीला हो जाता है । (ख) चुंबकीय मोतियों के साथ glomeruli के Embolization गुर्दे की सतह पर भूरे रंग के डॉट्स के रूप में दिखाई देते हैं. (ग) दृश्य यद्यपि मैं दिखा माइक्रोस्कोप) glomeruli के संदूषण (ब्राउन दौर संरचनाओं); ii) tubuli (प्रकाश लम्बी संरचनाओं के साथ); और iii) सेल मलबे । glomeruli की शुद्धता लगभग ५०% है । नि: शुल्क चुंबकीय मोती भूरे रंग के डॉट्स (आवर्धन 100X) के रूप में दिखाई देते हैं । (घ) glomeruli (आवर्धन 100X) की ९५% शुद्धता दर्शाने वाले माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखें. स्केल बार्स = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: बायोटिन glomerular केशिका पाश में पाया गया । प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेज ऑफ़ माउस glomeruli (C57BL 6) perfused विथ PBSCM (कंट्रोल) एंड बायोटिन (बायोटिन). बायोटिन (green) केवल बायोटिन-perfused चूहों में glomerular केशिका पाश में streptavidin द्वारा कल्पना की है । नियंत्रण चूहों glomerular बायोटिन धुंधला दिखाई नहीं देते । दोनों चूहों में podocytes के नाभिक में WT1 (red) का पता लगाया जाता है । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन20से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: vivo बायोटिन में glomerular सेल सतह प्रोटीन की लेबलिंग । (क) immunoprecipitated के पश्चिमी दाग विश्लेषण (आई पी) biotinylated कोशिका की सतह प्रोटीन (आईपी: streptavidin agarose मोतियों) और lysates (lysate) से गुर्दे की PBSCM-perfused (नियंत्रण) और बायोटिन-perfused (बायोटिन) चूहों. transmembrane प्रोटीन्स nephrin और podocalyxin केवल बायोटिन-perfused माउस गुर्दे के immunoprecipitated नमूनों में पाए जाते हैं । नियंत्रण चूहों में, nephrin और podocalyxin नियंत्रण माउस गुर्दे की immunoprecipitated जांच में पता नहीं कर रहे हैं. नियंत्रण और बायोटिन-perfused पशुओं के lysates में, कुल nephrin और podocalyxin दोनों समूहों में समान रूप से व्यक्त होते हैं. intracellular प्रोटीन extracellular-सिग्नल विनियमित kinases p42 और p44 (ERK) नियंत्रण और बायोटिन-immunoprecipitated माउस गुर्दे की perfused जांच में पता नहीं कर रहे हैं । दोनों माउस समूहों के lysates में, ERK बराबर मात्रा में पाया जाता है । Actin एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में दाग है । (ख) PBSCM-perfused (नियंत्रण) और बायोटिन-perfused (बायोटिन) चूहों में immunoprecipitated nephrin (IP: α-nephrin) का पश्चिमी दाग विश्लेषण । बायोटिन-perfused गुर्दे में, nephrin streptavidin धुंधला के साथ visualized है, जबकि nephrin के लिए कोई पता लगाने चूहों नियंत्रण में पाया जाता है । nephrin के immunoprecipitated अंश (IP: α-nephrin, वाइड: nephrin) के साथ ही lysate अंश (lysate, पश्चिम बंगाल: nephrin) nephrin के बराबर मात्रा में nephrin दिखाने के लिए दाग है । Actin एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है । (ग) immunoprecipitated biotinylated कोशिका सतह के प्रोटीन का पश्चिमी दाग विश्लेषण (आईपी: streptavidin agarose मोती) और lysates (lysate) गुर्दे के PBSCM perfused (नियंत्रण) और बायोटिन-perfused (बायोटिन) चूहों से होता है. transmembrane मार्कर प्रोटीन संवहनी endothelial (VE)-cadherin और intracellular आसंजन अणु 2 (िकैम-2) केवल बायोटिन-immunoprecipitated जानवरों के perfused अंश में पाए जाते हैं । नियंत्रण चूहों में, कोई VE-cadherin या िकैम-2 का पता लगाया है । Actin एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में कार्य करता है । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन20से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : अर्ली nephrotoxic नेफ्रैटिस नेफ्रोपैथी (NTN) में Glomerular प्रोटीन nephrin बहुतायत । (A) सतह nephrin का पश्चिमी ब्लाट विश्लेषण (ip: α-nephrin, वाइड: streptavidin) और कुल nephrin (ip: α-nephrin या lysate, वाइड: nephrin) नियंत्रण में और nephrotoxic सीरम-स्वास्थ्यकर्मी चूहों (NTN 1 d) । Actin एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में कार्य करता है । नियंत्रणों की तुलना में, NTN चूहों को नियंत्रण की तुलना में कम सेल सतह nephrin (IP: α-nephrin, वाइड streptavidin) दिखाएँ । (ख) नियंत्रण में कुल nephrin/actin और NTN 1 d चूहों का मात्रात्मक विश्लेषण [नियंत्रण n = 4, NTN n = 6, गैर-महत्वपूर्ण अंतर (ns)] । (ग) नियंत्रण और nephrin चूहों में कोशिका सतह nephrin (biotinylated nephrin/कुल NTN) का Densitometric विश्लेषण (* p < ०.०१, control n = 4, NTN n = 6). (घ) नियंत्रण और NTN 1 D चूहों में podocytes दिखा p57 का Immunohistochemistry. (ङ) प्रति गुच्छा क्षेत्र p57 सकारात्मक कोशिकाओं का मात्रात्मक विश्लेषण (माइक्रोन2). (४० glomeruli प्रति माउस quantified, ns). पश्चिमी दाग डेटा शो ± एसडी Podocyte गिनती का मतलब है शो ± SEM. unpair के सुधार के साथ टीपरीक्षण ख़राब । स्केल बार = ५० µm । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन20से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : Glomerular प्रोटीन nephrin बहुतायत में देर nephrotoxic नेफ्रैटिस नेफ्रोपैथी (NTN) । (A) सतह nephrin का पश्चिमी दाग विश्लेषण (ip: α-nephrin, वाइड: streptavidin) और कुल nephrin (ip: α-nephrin या lysate, वाइड: nephrin) नियंत्रण में और nephrotoxic सीरम स्वास्थ्यकर्मी चूहों (NTN 18 डी) । नियंत्रणों की तुलना में, NTN 18 d चूहों में बराबर मात्रा में सेल सरफ़ेस nephrin (IP: α-nephrin, वाइड: streptavidin) दिखाई पड़ता है । NTN 18 दिन पर चूहों का इलाज कम कुल nephrin प्रदर्शन, और actin एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में कार्य करता है । (B) Densitometric विश्लेषण नियंत्रण और NTN 18 d चूहों के बीच कक्ष सतह nephrin में कोई महत्वपूर्ण अंतर प्रदर्शित करता है (नियंत्रण n = 4, NTN n = 3). (ग) कुल nephrin का Densitometric विश्लेषण actin. 18 दिन में NTN चूहों में, वहाँ नियंत्रण की तुलना में nephrin की कम अभिव्यक्ति है (नियंत्रण n = 4, NTN n = 3, * * p < ०.००१). (घ) नियंत्रण और NTN 18 डी चूहों में podocytes दिखा p57 का Immunohistochemistry. नियंत्रणों की तुलना में NTN 18 डी चूहों में कम p57 पॉजिटिव कोशिकाएं (लाल) होती हैं । चुंबकीय मोती काले डॉट्स के रूप में दिखाई देते हैं । (ङ) प्रति glomerular गुच्छा क्षेत्र p57 सकारात्मक कोशिकाओं का मात्रात्मक विश्लेषण (माइक्रोन2) (* * * p < ०.०००१, नियंत्रण n = 2, NTN n = 2, ४० glomeruli प्रति माउस quantified) । पश्चिमी दाग डेटा शो ± एसडी Podocyte गिनती का मतलब है शो ± SEM. सांख्यिकीय विश्लेषण: वेल्च के सुधार के साथ टीपरीक्षण ख़राब । स्केल बार = ५० µm । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन20से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

प्रस्तुत विधि glomeruli के सफल अलगाव glomerular आरएनए या प्रोटीन की जांच करने के लिए सक्षम बनाता है । इसके अलावा, प्राथमिक glomerular कोशिका संस्कृतियों अलग glomeruli से किया जा सकता है । अगर बायोटिन glomerular अलगाव से पहले लागू किया जाता है, glomerular सेल सतह प्रोटीन के लेबल प्रदर्शन किया जा सकता है । इस विधि के साथ, vivo glomerular सेल सतह प्रोटीन ्े में अध्ययन किया जा सकता है, और प्रोटीन बहुतायत के अर्द्ध quantitation संभव है । सफलतापूर्वक परीक्षण glomerular सेल सतह प्रोटीन बहुतायत के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं 1) माउस सर्जरी में मैनुअल विशेषज्ञता का विकास विशेष रूप से महाधमनी के cannulation, 2) बबल-सीरिंज के मुक्त कनेक्शन के एयर embolization से बचने के क्रम में glomeruli, और 3) बर्फ के तहत काम कर ठंड की स्थिति एक बार PBSCM के साथ छिड़काव शुरू कर दिया है ।

इस तकनीक के लिए, माउस सर्जरी में मैनुअल विशेषज्ञता आवश्यक है । महाधमनी के Cannulation विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, के रूप में पोत के विच्छेदन गुर्दे की छिड़काव को रोकने जाएगा । महाधमनी में कटौती काफी बड़ा होना चाहिए (लगभग ५०% पोत व्यास) कैथेटर परिचय करने के लिए पर्याप्त जगह बनाने के लिए । कैथेटर तिरछे काट रहा है, महाधमनी में कैथेटर का परिचय आसान हो जाएगा । विच्छेदन के अलावा, शुरू कैथेटर महाधमनी के भीतर उच्च रखा जाना चाहिए ताकि गुर्दे की धमनियों बाधा नहीं है । गुर्दे की धमनियों अंयथा बायोटिन और चुंबकीय मोतियों के साथ perfused नहीं होगा ।

बायोटिन एक छोटा सा विटामिन है जो streptavidin प्रोटीन को उच्च अपनत्व के साथ बांधता है । अपने छोटे आकार (२४४ दा) के कारण, बायोटिन संयुग्मित प्रोटीन के समारोह में परिवर्तन नहीं करता है और glomerulus के माध्यम से फ़िल्टर किया जाएगा । streptavidin के साथ मशीन द्वारा, biotinylated प्रोटीन आसानी से agarose मोतियों या अंय तरीकों से untaggeded प्रोटीन से अलग किया जा सकता है । N-hydroxysuccimide (एन एच सी) बायोटिन बाँध के एस्टर (-NH2) प्रोटीन के समूह, जो lysine अवशेषों की ओर जंजीरों पर प्रचुर मात्रा में हैं, उदाहरण के लिए. Sulfo-एन एच एस-नियंत्रण-बायोटिन पानी में घुलनशील और कोशिका-अभेद्य है, अगर कोशिका झिल्ली बरकरार है । Sulfo-एन एच एस-नियंत्रण-बायोटिन के लिए सेल सतह प्रोटीन23लेबल दिखाया गया है । बाल अमीन समूहों के लिए बायोटिन एन एस एस्टर के बंधन पीएच (7-9) और अमीन-मुक्त बफ़र्स (यानी, PBSCM) के उपयोग पर निर्भर है । ७.४ के एक पीएच के साथ PBSCM इसलिए बायोटिन के साथ माउस गुर्दे perfuse करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, क्योंकि यह इष्टतम घुलनशीलता और बायोटिन के समारोह के साथ आदर्श शारीरिक गुणों को जोड़ती है । लेबलिंग के बाद प्रोटीन बुझाने के लिए, glycine के साथ PBSCM के छिड़काव किया जाता है, मुक्त बायोटिन glycine के अमीन समूहों के लिए बाध्य बनने की अनुमति । पशु की मौत के बाद सेलुलर प्रक्रियाओं को रोकने के लिए, यह एक बर्फ ठंड समाधान के साथ छिड़काव प्रदर्शन और बर्फ पर काम जारी रखने के लिए महत्वपूर्ण है ।

पूर्व विवो biotinylation तरीकों के लिए इसी तरह, vivo biotinylation प्रोटोकॉल में दौरान प्रसंस्करण glomeruli के यांत्रिक तनाव भी endocytosis, तेजी से संकेत देने की घटनाओं, और आरएनए अखंडता प्रभाव हो सकता है. इसलिए यह आवश्यक है कि सभी प्रसंस्करण कदम बर्फ पर प्रदर्शन करने के लिए एंजाइमी सेलुलर गतिविधि के जोखिम को कम कर रहे हैं ।

nephrotoxic सीरम नेफ्रैटिस (NTN) की तरह Proteinuric पशु मॉडल नुकसान माउस गुर्दे गंभीर रूप से । विशेष रूप से, mesangial विस्तार में NTN परिणाम, glomerular स्केलेरोसिस, और ट्यूबलर घावों, रोग के उन्नत चरणों में गुर्दे की फाइब्रोसिस के लिए अग्रणी (४२ दिन)24. रोग मॉडल में sclerosed glomeruli के बिगड़ा छिड़काव प्रोटीन बहुतायत के पक्षपातपूर्ण परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । Sclerosed glomeruli संभावना चुंबकीय मोतियों के साथ perfused नहीं किया जाएगा और इस तरह इस पद्धति में अलग नहीं हो सकता है । गंभीर glomerular स्केलेरोसिस के लिए अग्रणी रोग मॉडल में, विभिन्न sieving चरणों के माध्यम से glomeruli को अलग करने के लिए तकनीक का उपयोग कर इस प्रोटोकॉल25में प्रयुक्त चुंबकीय मोतियों की विधि के लिए एक विकल्प हो सकता है. हालांकि, अगर glomeruli गंभीर रूप से sclerosed हैं, तो भी बायोटिन के साथ छिड़काव ख़राब हो सकता है । इसके अलावा, पूर्व vivo biotinylation, जिसमें निकाले glomeruli है नहाया पूर्व बायोटिन समाधान21में vivo , शायद इन मॉडलों में लाभप्रद नहीं होगा । वैकल्पिक रूप से, इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करने के लिए गंभीर रूप से रोगग्रस्त glomeruli में प्रोटीन बहुतायत का पता लगाने लाभप्रद हो सकता है, क्योंकि यह glomeruli के छिड़काव पर भरोसा नहीं करता है ।

अर्द्ध प्रोटीन बहुतायत के quantitation इस तकनीक का उपयोग densitometry का उपयोग करके अच्छी तरह से काम करता है । हालांकि, प्रोटीन बहुतायत में छोटे मतभेदों densitometry का पता लगाने की सीमा के परिणाम के रूप में याद किया जा सकता है ।

वर्णित तकनीक अंय पशु अंगों कि perfused रहे है के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है, बशर्ते कि ब्याज की संरचनाओं अलगाव तकनीकों या ब्याज की सतह प्रोटीन द्वारा पहुंच रहे है एक कोशिका प्रकार या अंग संरचना के लिए विशिष्ट है । हालांकि सभी सतह प्रोटीन इस तकनीक द्वारा biotinylated हैं, immunoprecipitation के लिए एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग विशिष्ट प्रोटीन के सेल सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति के अंश को बढ़ावा मिलेगा (जैसा कि चित्रा 3बीमें nephrin के लिए दिखाया गया है) ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक उसे असाधारण तकनीकी सहायता के लिए Blanka Duvnjak धंयवाद । यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 से M.W. और QU280/3-1 से I.Q. तक समर्थित था funder अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह, डेटा विश्लेषण, प्रकाशित करने के लिए निर्णय, और पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Motic SMZ168 BL Motic SMZ168BL microscope for mouse surgery
KL1500LCD Pulch and Lorenz microscopy 150500 light for mouse surgery
Rompun (Xylazin) 2% Bayer PZN:01320422 anesthesia
Microfederschere Braun, Aesculap FD100R fine scissors, for cut into the aorta
Durotip Feine Scheren Braun, Aesculap BC210R for abdominal cut
Anatomische Pinzette Braun, Aesculap BD215R for surgery until the abdomen is opened
Präparierklemme Aesculap BJ008R for surgery 
Seraflex Serag Wiessner IC108000 silk thread
Ketamine 10% Medistar anesthesia
Rompun (Xylazin) 2% Bayer anesthesia
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm Portex 800/100/100 Catheter
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm Portex 800/100/200 Catheter
Harvard apparatus 11 Plus Harvard Apparatus 70-2209 syringe pump
EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin Thermo Scientific 21335 biotin
Dynabeads Untouched Mouse T-cells Invitrogen 11413D to embolize glomeruli
Collagenase A Roche 10103578001 to digest kidney tissue
DynaMag-2 Invitrogen 123.21D Magnet catcher
100µm cell stainer Greiner-bio 542000 for glomerular isolation
Axiovert 40 CFL Zeiss non available to confirm glomerular purity
TissueRuptor Quiagen 9002755 Tissue homogenizer
CHAPS Sigma-Aldrich C3023 for lysis buffer
Tris-HCL Sigma-Aldrich T5941 for lysis buffer
NaCl VWR chemicals 27810295 for lysis buffer
NaF Sigma-Aldrich 201154 for lysis buffer
EDTA Sigma-Aldrich E5134 for lysis buffer
ATP Sigma-Aldrich 34369-07-8 for lysis buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 Follow the manufacturer's instructions
nephrin antibody Progen GP-N2 for westernblot
Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody R&D Systems AF15556-SP for westernblot
Streptavidin Agarose Resin Thermo Scientific 20347 for immunoprecipitation
Protein A sepharose CL-4B GE Healthcare 17096303 for immunoprecipitation
polyclonal rabbit anti-p57 antibody SCBT sc-8298 for Immunohistochemistry
mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 Sigma-Aldrich A2228 Western blot loading control
rabbit anti-p44/42 cell signalling 4695 for westernblot
Pierce High sensitivity streptavidin-HRP Thermo Scientific 21130 for westernblot
polyclonal mouse ICAM-2 antibody R&D Systems AF774 for westernblot
polyclonal mouse anti-VE-cadherin R&D Systems AF1002 for westernblot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
  2. Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
  3. Quack, I., et al. beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).
  4. Quack, I., et al. PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia. Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).
  5. Swiatecka-Urban, A. Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm. Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).
  6. Swiatecka-Urban, A. Membrane trafficking in podocyte health and disease. Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).
  7. Soda, K., et al. Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes. The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).
  8. Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
  9. Martin, C. E., Jones, N. Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).
  10. Nielsen, J. S., McNagny, K. M. The role of podocalyxin in health and disease. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).
  11. Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).
  12. Tossidou, I., et al. Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis. Public Library of Science One. 5 (4), 10185 (2010).
  13. Qin, X. S., et al. Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).
  14. Waters, A. M., et al. Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).
  15. Zhang, X., Simons, M. Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).
  16. Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies. Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).
  17. Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
  18. Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
  19. Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).
  20. Haase, R., et al. A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease. Public Library of Science One. 12 (6), 0179217 (2017).
  21. Satoh, D., et al. aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).
  22. Tomas, N. M., et al. Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy. New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).
  23. Daniels, G. M., Amara, S. G. Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface. Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).
  24. Ougaard, M. K. E., et al. Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease. International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).
  25. Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals. Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).

Tags

vivo biotinylation में जैव रसायन अंक १४३ सेल सरफेस प्रोटीन लेबलिंग glomeruli आइसोलेशन ऑफ glomeruli चुंबकीय मोतियों का endocytosis vivo प्रोटीन ्े
अलगाव की Glomeruli और <em>Vivo में</em> Glomerular सेल सतह प्रोटीन की लेबलिंग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Königshausen, E., Potthoff, S.… More

Königshausen, E., Potthoff, S. A., Haase, R., Meyer-Schwesinger, C., Kaufmann, E., Rump, L. C., Stegbauer, J., Sellin, L., Quack, I., Woznowski, M. Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58542, doi:10.3791/58542 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter