Summary
Hier presenteren we een protocol voor het lymfkliertest in vivo labelen van glomerulaire cel oppervlakte eiwitten met biotine. Dit protocol bevat informatie over hoe perfuse muis nieren, het isoleren van de glomeruli, en het uitvoeren van endogene immunoprecipitation van de proteïne van belang.
Abstract
Proteïnurie vloeit voort uit de verstoring van het glomerulaire filter dat is samengesteld uit de fenêtré endotheel, glomerulaire kelder-membraan en podocytes met hun gleuf pessarium. De fijne structuur van de glomerulaire filter, met name de gleuf membraan, dat is afhankelijk van het samenspel van verschillende cel oppervlakte-eiwitten. Het bestuderen van deze cel-oppervlakte-eiwitten tot nu toe beperkt gebleven voor in vitro studies of histologische analyse. Hier presenteren we een lymfkliertest in vivo biotinylation labeling methode, waarmee de studie van de oppervlakte eiwitten glomerulaire cel onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. Dit protocol bevat informatie over hoe perfuse muis nieren, het isoleren van de glomeruli, en het uitvoeren van endogene immunoprecipitation van een proteïne van belang. Halve kwantificatie van glomerulaire cel oppervlakte overvloed is beschikbaar met deze nieuwe methode, en alle eiwitten toegankelijk voor Biotine perfusie en immunoprecipitation kan worden bestudeerd. Bovendien, kan isolatie van de glomeruli met of zonder biotinylation verdere analyse van de glomerulaire RNA en eiwitten, evenals primair glomerulaire celkweek (dat wil zeggen, primaire podocyte celcultuur).
Introduction
Proteïnurie is een kenmerk van de glomerulaire letsel en meestal begeleidt verstoring van de glomerulaire filter1. Het glomerulaire filter is samengesteld uit de fenêtré endotheel, glomerulaire kelder-membraan en podocytes. De delicate moleculaire structuur van de glomerulaire filter is zeer dynamisch en onderhevig is aan cel oppervlakte-proteïne handel in beide gezonde en zieke nieren2,3,4,5,6 . Endocytose van cel oppervlakte-eiwitten is gebleken te zijn essentieel voor de overleving van de podocytes7. Nephrin en podocalyxin zijn transmembraan eiwitten uitgedrukt op podocytes. Nephrin is de ruggengraat van het middenrif glomerulaire gleuf, terwijl podocalyxin een coating van de voet van de secundaire processen van podocytes8,9,10sialoglycoprotein. Endocytotische handel eerder gebleken voor nephrin en podocalyxin3,11,12,13,14.
Tot de beste van onze kennis, is endocytose van cel oppervlakte-eiwitten niet nog is beschreven in glomerulaire endotheliale cellen van de literatuur. Echter uiting endotheliale cellen in het algemeen alle nodige eiwitten voor de verschillende soorten endocytose (dat wil zeggen, afhankelijk van de clathrin, vlot-afhankelijke endocytose)15,16. Daarom endothelial cel oppervlakte mensenhandel kan worden bestudeerd bij deze methode gebruikt, bijvoorbeeld, vasculaire endothelial (VE)-cadherine en intracellulaire adhesie molecuul (ICAM-2) als een cel oppervlak marker eiwitten voor glomerulaire endotheliale cellen17 .
Er bestaat helaas geen nauwkeurige in vitro model voor de delicate drie lagen glomerulaire filter in welke cel de oppervlakte-proteïne mensenhandel kan worden bestudeerd. Het doel van deze methode is dus om te studeren glomerulaire eiwit mensenhandel in vivo. Dit protocol bevat bovendien informatie over het isoleren van de glomeruli, waardoor verdere analyse van de glomerulaire RNA, eiwitten of cellen. Soortgelijke glomerulaire isolatie technieken zijn beschreven door verschillende groepen18,19.
Wij en anderen hebben vroeger ex vivo labeling van glomerulaire cel oppervlakte eiwitten door biotinylation2,3,4,20,21. Echter, in deze methode ex vivo geïsoleerde glomeruli werden blootgesteld aan mechanische stress, die invloed op endocytotische mensenhandel hebben kan. Als alternatief, immunofluorescentie labeling van glomerulaire cel oppervlakte-eiwitten is uitgebreid gebruikt in de literatuur2,20,22. Met deze methode echter slechts een klein aantal eiwitten binnen één dia kan worden geanalyseerd, en kwantificatie van immunofluorescentie beelden is vaak moeilijk.
Deze roman in vivo -methode biedt een betrouwbaar hulpmiddel om te studeren glomerulaire cel oppervlakte-proteïne overvloed en mensenhandel nauwkeurig in gezonde en zieke nieren, en het kan worden gebruikt als aanvulling op immunofluorescentie proeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Muizen zijn verkregen als een in-house ras uit de lokale dierenverzorgers faciliteit of Janvier Labs in Frankrijk. De onderzoeken werden uitgevoerd volgens de richtsnoeren in de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (Amerikaanse nationale instituten van gezondheid publicatie nr. 85-23, herziene versie van 1996). Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de relevante institutionele goedkeuringen (deelstaatregering LANUV verwijst naar nummer AZ:84-02.04. 2016.A435).
1. bereiding van de apparatuur, instrumenten en oplossingen
- Bereiden 1 L fosfaatgebufferde zoutoplossing aangevuld met 1 mM magnesiumchloride (MgCl2) en 0.1 mM calciumchloride (CaCl2) (PBSCM) en het filteren door middel van een steriel filter.
- 5 mL steriele PBSCM per muis voorbereiden perfusie en plaats deze op het ijs.
- Voorbereiden voor elke muis, 5 mL steriele PBSCM aangevuld met 0,5 mg/mL biotine.
- Voor elke muis, 5 mL steriele PBSCM bereiden en 0.8 x 108 magnetische kralen toe te voegen (bv., 200 µL van een 4 x 108 kralen/mL oplossing, zonder voorbehandeling) voor embolisatie kan leiden van de glomeruli. Bereid deze oplossing onder de cel cultuur Bank te houden van de magnetische kralen in de originele buis steriel. Plaats deze oplossing op het ijs.
- Bereid een blussen oplossing door 100 mM glycine toe te voegen aan PBSCM (5 mL per muis) en bewaar deze op ijs.
- Maak een oplossing van collagenase (0.378 U/mL collagenase A in steriele PBSCM). Per muis, 1 mL van de oplossing van collagenase Pipetteer in een tube 2 mL en plaats deze op het ijs.
- Voor het wassen, het bereiden van steriele PBSCM (zie stap 1.1) in een 50 mL tube en plaats deze op het ijs.
- Voor perfusie, gebruikt u een spuitpomp met een stroom van 2,0 mL/min.
- Een 10 mL injectiespuit met een naald 21G te bereiden. Plaats de punt van de naald in een 20-30 cm lange katheter (binnendiameter, ID = 0.58 mm). Verbinding maken met de katheter (ID 0.58 mm) met een 10 cm korte katheter (0,28 mm ID) en snijd het puntje van de kleinere katheter schuin voor een eenvoudige plaatsing in de aorta muis.
- Voor ligatuur procedures tijdens de operatie, knip drie 5-7 cm zijde draden (4-0 naar 6-0) per muis.
- Voorbereiding voor de operatie, 3 chirurgische klemmen, 2 chirurgische scharen, 2 pincet, 2 fijne pincet, 1 fijn schaar en wissers. Bereiden de narcose (bijvoorbeeld intraperitoneaal verdoving ketamine 100 mg/kg lichaamsgewicht en xylazine 5 mg/kg lichaamsgewicht).
- Voor isolatie van de glomeruli van twee nieren, door een 100 µm cel zeef, twee buizen van 50 ml en een magneet-catcher te gebruiken.
- CHAPS lysis-buffermengsel bereiden: 20 mM 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS); 20 mM Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) pH 7.5; 50 mM sodiumchorlide (NaCl); 50 mM sodiumfluoride (NaF); 15 mM nb4P2O7; 0.1 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) pH 8.0; 2 mM sodiumorthovanadate; en 2 mM adenosinetriphosphat (ATP).
- Cool centrifuges tot 4 ° C.
2. operatie onder de Microscoop
- Anesthetize van de muis (bijvoorbeeld met ketamine/xylazine intraperitoneally, zie stap 1.11). Het uitvoeren van de teen-snuifje test om te bevestigen goede verdoving.
- Desinfecteer de ventrale zijde van de muis met 70% isopropanol.
- Uitvoeren van een mediane snede via de huid van het bekken naar het borstbeen en verwijder de huid van de buik fascia met pincet. Snijd de huid aan beide zijden in het midden van de buik met een chirurgische schaar.
- Wijzigen van chirurgische gereedschappen. Een mediane snede van de xiphoid toepassen op de blaas door de buikspier laag en verdeel ze in vier kwadranten met pincet en chirurgische scharen. Bevestig het bovenste twee opzij met klemmen richting de hals van de muis met twee chirurgische klemmen.
Opmerking: De buik wordt nu geopend. - Zet viscerale organen opzij met een steriel doekje en snijd het hepatische-phrenic ligament met een fijne schaar.
- Bereiden een afbinding (met een zijden draad 4-0 naar 6-0) rond de aorta proximale van de renale bloedvaten op de hoogte van de bijnier met twee fijne pincet. Draai de proximale aorta afbinding af te schaffen doorbloeding met een pincet.
- De distale aorta van andere weefsels, fascia en vet vrij en bereiden een afbinding rond de craniale hepatische/mesenterische slagader van de renale bloedvaten met fijne chirurgische pincetten.
- Bereiden van een afbinding (met een zijden draad 4-0 naar 6-0) rond de aorta distale van de renale bloedvaten en klem de vena cava en de aorta op het hoogtepunt van de bifurcatie.
- Snij een klein gaatje in de aorta distale aan de renale bloedvaten zodat het gat de helft van de diameter van de aorta is. Zet de katheter in de aorta en repareren met de bereid ligatuur.
Let op: Vermijd bubbels in de perfusie-systeem om te voorkomen dat de lucht longembolie. - Start perfusie met de ijskoude PBSCM op een debiet van 2 mL/min.
- Snijd een gat in de renale ader op het niveau van de renale bloedvaten met een fijne chirurgische schaar en draai de afbinding rond de lever en de lymfklieren slagaders.
Opmerking: Nieren bleke moeten wenden na het starten van de perfusie.
3. in Vivo Biotinylation
- Veranderingen de spuit bubble-vrij om ijskoude PBSCM aangevuld met 0,5 mg/mL Biotine voor oppervlak etikettering en perfuse van de nieren met 5 mL op een debiet van 2 mL/min.
Opmerking: Vermeng de PBSCM oplossingen (bijvoorbeeld door te draaien aan de buizen 50 mL) voorzichtig om te voorkomen dat bellen binnen de oplossing vormen. Na aspiratie van de oplossing binnen de spuit, blaasjes of lucht van de spuit te evacueren. Gebruik een extra canule (21G) op de injectiespuit te vullen de ruimte in de canule die is aangesloten op het systeem van de katheter. Ten slotte, stok de spuit in de canule met de katheter zonder bubbels. - Wijzig de bubble-free spuit ijskoude PBSCM aangevuld met 100 mM glycine aan de glomeruli doven en perfuse met 5 mL op een stroom van 2 mL/min.
- Wijziging de spuit bubble-vrij om ijskoude PBSCM aangevuld met 200 μl magnetische kralen/mL en perfuse nieren op 2 mL/min.
Opmerking: Op het oppervlak van de nier, embolisatie kan leiden van de glomeruli met bruin magnetische kralen worden zichtbaar.
4. isolatie van de Glomeruli van twee nieren
- Nieren op de Hilus verwijderen en verwijder de capsule. Plaats de nieren op ijs in 15 mL PBSCM in een 10 cm schotel voor de cultuur van de cel. De muis met cervicale dislocatie onder verdoving na de oogst van de nieren euthanaseren. De chirurgie en perfusie procedures duren ongeveer 20-22 min.
- Nieren in de kleinste stukjes gesneden mogelijk met een nieuwe dubbel-edge mes. Verplaatsen van het weefsel in een 2 mL-buis met 1 mL collagenase A (zie stap 1.6) en verteren bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Voor en na vertering, meng zachtjes met een 1000 μL pipet knippen.
- Spoel het verteerd weefsel door een 100 μm cel zeef met ijskoude PBSCM. Voorzichtig gebruik de cel-schraper mince de resterende weefsel via de cel zeef en spoel het na met ijskoude PBSCM daarna tot een totaal volume van 50 mL.
- De schorsing bij 4 ° C 500 x g centrifugeren voor 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met iets minder dan 1,5 mL ijskoud PBSCM terwijl vortexing de pellet. Daarna zet de glomerulaire schorsing in een nieuwe 2 mL-buis.
5. wassen
- Gebruik de magneet-catcher te trekken van de glomeruli aan de ene kant. Wacht 1 minuut voordat de glomeruli hebben verplaatst naar de magneet.
- Verwijder de bovendrijvende vloeistof met een 1000 μL pipet terwijl de tube 2 mL in de magneet-catcher blijft. Tijdens het eerste en tweede wassen stappen (zie stap 5.3), 250 μL van supernatant blijft in de buis om te voorkomen dat het verlies van de glomeruli. Deze procedure snel en voorkom buisvormige structuren zinken naar de bodem van de buis te laten uitvoeren.
Opmerking: De procedure wassen zal langer duren anders. - Neem de tube 2 mL van magneet catcher en voeg 1 mL van PBSCM, pipet op en neer (zeer belangrijk), dan vortex.
- De buis terug te zetten in de magneet catcher en opnieuw te beginnen met stap 5.2.
- Herhaal de stappen wassen totdat de zuiverheid van de glomeruli 90% heeft bereikt. Onderzoeken hiervoor een representatieve hoeveelheid van het supernatans dat onder een microscoop (40-100 X).
Opmerking: De Glomeruli wordt weergegeven als ronde structuren met bruin magnetische kralen. Langgerekte structuren zijn buisvormige fragmenten en gratis magnetische kralen als bruin ronde stippen. Puin van de cel kan worden weergegeven als omvangrijk structuren. - Als zuiverheid is bereikt, de telling van de glomeruli te schatten door ontbinding van de glomeruli in 1 mL PBSCM. Na het mengen, neem een aliquoot deel van 10 μL en tellen van de glomeruli onder de Microscoop. Het aantal glomeruli met de volgende vergelijking berekenen: definitieve aantal glomeruli = aantal glomeruli in 10 μL aliquoot x 100.
- Succesvolle Isolatievan glomeruli leidt tot een bereik van 10.000-40.000 glomeruli.
6. eiwit extractie en Immunoprecipitation (IP)
- Verzamelen glomeruli door centrifugeren bij 4 ° C bij 6800 x g gedurende 5 min. de bovendrijvende vloeistof verwijderen tijdens het gebruik van een magneet catcher en resuspendeer de pellet in ijskoude lysis-buffermengsel (bv., 30.000 glomeruli in 300 μL; CHAPS, zie stap 1.11). Meng de monsters met de homogenizer van een weefsel op de hoogste snelheid voor 30 s en lyse hen op het ijs gedurende 30 minuten.
- Onoplosbaar materiaal verwijderen door centrifugeren bij 15.000 x g gedurende 30 min. voor 4 ° C. Pipetteer het supernatant waarin de cel lysate in een nieuwe 1,5 mL-buis. Gooi de pellet.
- De eiwitconcentratie van het supernatans dat meten met behulp van een bicinchoninic (BCA)-op basis van de methode volgens de instructies van de fabrikant. Een succesvolle lysis van 30.000 glomeruli levert aan een glomerulaire eiwit bedrag van 700-1000 µg/mL. Aanpassen aan gelijke eiwit bedragen met lysis-buffermengsel.
- Neem een aliquoot deel van 10% van het totale volume voor glomerulaire lysate en voeg 2 x Laemmli + dithiothreithol (DTT) voordat de incubatie gedurende 5 min bij 95 ° C.
- Incubeer voor IP, de rest van de lysate met daar agarose kralen 's nachts bij 4 ° C op een overhead shaker.
- Centrifugeer agarose kralen bij 1000 x g gedurende 3 min bij 4 ° C, de bovendrijvende vloeistof verwijderen en toevoegen van 800 μL van lysis buffer te wassen de kralen voor binding aan aspecifieke eiwitten.
- Herhaal de wash 3 keer en het supernatant volledig verwijderen.
- Voeg 30 μL van 2 x Laemmli + DTT en Incubeer bij 95 ° C gedurende 5 min.
- De lysate laden en IP-sondes op een 10% SDS gel en voert u de gel SDS V 70 voor 30 min en vervolgens bij 20 mA per gel voor 1,5 h. vlek daarna de gel voor 2 h bij 200 mA op een membraan van het nitrocellulose.
- Het blokkeren van het membraan van het nitrocellulose's nachts bij 4 ° C met 5% bovien serumalbumine (BSA) in het wassen van de buffer.
- Incubeer het membraan met de antistoffen van belang 's nachts bij 4 ° C. Wassen met buffer 3 keer gedurende 5 minuten op een shaker wassen en het membraan met de HRP-gelabeld secundair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur incuberen. Herhaal de stap wassen.
- Visualiseer de lysate en immunoprecipitation sondes op het membraan met behulp van een super resolutie chemiluminescentie agent met een CCD-camera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te isoleren glomeruli nauwkeurig, moet er eerst lymfkliertest nieren met PBSCM perfuse. Perfusie met PBSCM draait nieren bleke(Figuur 1). Embolisatie kan leiden van de glomeruli met magnetische kralen zijn zichtbaar als bruine puntjes op het oppervlak van de nier (Figuur 1B). Isolatie van de glomeruli met de magneet catcher kan besmetting met renale tubuli (Figuur 1C) worden weergegeven. Voor verdere analyse van de glomeruli, een > 95% zuiverheid van de glomeruli moet worden bereikt door de glomeruli meer grondig wassen (Figuur 1D).
In vivo biotinylation is afhankelijk van de mogelijkheid om het label cel oppervlakte eiwitten met biotine. Studeren dit, zijn lymfkliertest nieren geperfundeerd met PBSCM of niet-cel-membraan doorlaatbaar biotine. Zoals blijkt uit Figuur 2, etiketten Biotine de capillaire lussen in Biotine-geperfundeerd maar niet in controle muis nieren. Om te onderzoeken de oppervlakte proteïnen van de cel van de glomerulus gelabeld door in vivo Biotine perfusie, wordt immunoprecipitation van de Biotine breuk van de glomerulaire fragmenten uitgevoerd. Figuur 3 A toont aan dat de glomerulaire transmembraan eiwitten nephrin en podocalyxin immunoprecipitated binnen de Fractie biotine. Echter controle muizen, geen nephrin of podocalyxin is gevonden in de immunoprecipitated-Fractie van biotinyleerd eiwitten. Als een negatieve controle, het intracellulaire eiwitten extracellulaire-signaal kinases p42 en p44 geregeld (ERK) zijn niet gevonden in de immunoprecipitated-Fractie van biotinyleerd proteïnen van zowel de controle en de muis Biotine-geperfundeerd nieren. Om te bevestigen dat de cel-oppervlakte-proteïne nephrin eigenlijk biotinyleerd is door deze methode, wordt de nephrin van controle en biotine-geperfundeerd muis nieren neergeslagen. Om te visualiseren biotine, is de immunoprecipitated-fractie gekleurd met streptavidine. Figuur 3 B biotinyleerd nephrin toont in Biotine-geperfundeerd maar niet de controledieren. De besturingselementen van de lysate geven gelijke hoeveelheden eiwit in controle en biotine-geperfundeerd dieren. Endotheel eiwit vasculaire endothelial (VE)-cadherine immunoprecipitated binnen de Fractie Biotine is zoals aangegeven in Figuur 3C. Bij controle muizen, wordt geen VE-cadherine neergeslagen, terwijl VE-cadherine in lysates controle-en biotine-geperfundeerd dieren aanwezig is. Intracellulaire adhesie molecuul 2 (ICAM-2) is neergeslagen uit Biotine-geperfundeerd dieren, en geen ICAM-2 is gevonden in de controledieren. Lysates controle-en biotine-geperfundeerd dieren Toon gelijke hoeveelheden van ICAM-2 (Figuur 3C). Actin diende als het besturingselement laden.
Deze methode kan worden gebruikt om te kwantificeren van de bedragen van de oppervlakte eiwitten glomerulaire cel in modellen van nefropathie (bijvoorbeeld nefrotoxische nefritis, NTN). In de vroege fase van NTN [dag 1 (1 d) na NTN serum injectie] stijgt Proteïnurie snel. In de latere fase van NTN [dag 18 (18 d)] daalt Proteïnurie aanzienlijk. Figuur 4 toont nephrin cel oppervlakte overvloed in vroege NTN (1 d). De in vivo biotinylation assay (Figuur 4A) toont een vermindering van de oppervlakte nephrin cel in NTN dieren vergeleken met besturingselementen. De densitometric analyse toont een aanzienlijke vermindering van de biotinyleerd nephrin (57%) in NTN dieren vergeleken met besturingselementen (Figuur 4C). Kwantitatieve analyse van de totale nephrin naar actine blijkt geen significante verschillen tussen besturingselementen en NTN muizen (Figuur 4B). Met behulp van een p57 podocyte cel specifieke kleuring, podocyte nummers gelijke bedragen weergegeven NTN en controle dieren (figuren 4 d en 4E). Figuur 5 geeft de resultatenvan nephrin cel oppervlakte overvloed in late NTN (18 d). Figuur 5 A toont de biotinylation in vivo bepaling in controle en NTN muizen die aangeeft van een herstel van de cel-oppervlakte nephrin. Densitometric analyse geeft geen significante verschillen van cel oppervlakte nephrin in controle en NTN muizen (Figuur 5B). Totale nephrin van het programmawerdteruggebracht met 25% in NTN muizen (Figuur 5C). Podocyte nummers waren gedaald in NTN muizen in vergelijking met besturingselementen met ongeveer 19% (cijfers 5D en 5E).
Figuur 1 : Nier perfusie en isolatie van de glomeruli. (A) zicht door de Microscoop in de lymfkliertest situs na perfusie met PBSCM. De katheter in de aorta wordt aangegeven met een pijl. Perfusie met PBSCM leidt de nieren te zetten bleek. (B) embolisatie kan leiden van de glomeruli met magnetische kralen weergegeven als bruine puntjes op het oppervlak van de nier. (C) bekijken Hoewel de Microscoop tonen ik) besmetting van de glomeruli (bruin ronde structuren); II) met tubuli (lichte langgerekte structuren); en iii) cel puin. Zuiverheid van de glomeruli is ongeveer 50%. Gratis magnetische kralen weergegeven als bruine puntjes (vergroting 100 X). (D) bekijken door de Microscoop tonen een 95% zuiverheid van de glomeruli (vergroting 100 X). Schaal bars = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Biotine gedetecteerd in de glomerulaire capillaire lus. Afbeelding van de representatieve immunofluorescentie van de muis glomeruli (C57BL/6) geperfundeerd met PBSCM (control) en Biotine (Biotine). Biotine (groen) wordt gevisualiseerd door daar in het glomerulaire capillaire lus alleen in Biotine-geperfundeerd muizen. Controle muizen vertonen geen glomerulaire Biotine kleuring. WT1 (rood) wordt gedetecteerd in de kernen van podocytes in beide muizen. Dit cijfer is gewijzigd van een eerdere publicatie20. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: In vivo Biotine labeling van glomerulaire cel oppervlakte eiwitten. (A) de Western blot analyse van immunoprecipitated (IP) biotinyleerd cel oppervlakte-eiwitten (IP: daar agarose kralen) en lysates (lysate) van nieren van PBSCM-geperfundeerd (controle) en biotine-geperfundeerd (Biotine) muizen. De transmembrane eiwitten nephrin en podocalyxin worden alleen gedetecteerd in immunoprecipitated monsters van biotine-geperfundeerd muis nieren. Bij controle muizen, worden nephrin en podocalyxin niet gedetecteerd in immunoprecipitated sondes van controle muis nieren. Lysates controle-en biotine-geperfundeerd dieren, worden totaal nephrin en podocalyxin uitgedrukt even in beide groepen. Het intracellulaire eiwitten extracellulaire-signaal kinases p42 en p44 geregeld (ERK) worden niet gedetecteerd in immunoprecipitated sondes van controle en biotine-geperfundeerd muis nieren. In de lysates van beide groepen muis, wordt ERK in gelijke hoeveelheden ontdekt. Actin is gekleurd als een besturingselement laden. (B) de Western blot analyse van immunoprecipitated nephrin (IP: α-nephrin) in PBSCM-geperfundeerd (controle) en biotine-geperfundeerd (Biotine) muizen. Nephrin is Biotine-geperfundeerd nieren gevisualiseerd met daar kleuring, zolang geen detectie voor nephrin wordt aangetroffen in controle muizen. De Fractie van de immunoprecipitated van nephrin (IP: α-nephrin, WB: nephrin) alsmede de lysate breuk (lysate, WB: nephrin) gekleurd voor nephrin Toon gelijke hoeveelheden van de nephrin. Actin wordt gebruikt als een besturingselement laden. (C) westelijke vlekkenanalyse van immunoprecipitated biotinyleerd cel oppervlakte-proteïne (IP: daar agarose kralen) en lysates (lysate) van nieren van PBSCM geperfundeerd (control) en biotine-geperfundeerd (Biotine) muizen. Het eiwit transmembraan marker vasculaire endothelial (VE)-cadherine en intracellulaire adhesie molecuul 2 (ICAM-2) worden alleen gedetecteerd in de Fractie van de immunoprecipitated van biotine-geperfundeerd dieren. Controle muizen, geen VE-cadherine of ICAM-2 zijn gevonden. Actin fungeert als een besturingselement laden. Dit cijfer is gewijzigd van een eerdere publicatie20. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Glomerulaire eiwit nephrin overvloed in vroege nefrotoxische nefritis nefropathie (NTN). (A) de Western blot analyse van oppervlakte nephrin (IP: α-nephrin, WB: daar) en totale nephrin (IP: α-nephrin of lysate, WB: nephrin) in controle- en nefrotoxische serum-behandelde muizen (NTN 1 d). Actin fungeert als een besturingselement laden. In vergelijking met de besturingselementen, NTN behandelde muizen tonen verminderd cel oppervlakte nephrin (IP: α-nephrin, WB streptavidine) in vergelijking met besturingselementen. (B) kwantitatieve analyse van de totale nephrin/actine in controle en NTN 1 d muizen [controle n = 4, NTN n = 6, niet-significante verschillen (ns)]. (C) Densitometric analyse van cel oppervlakte nephrin (biotinyleerd nephrin/totaal nephrin) controle en NTN muizen (* p < 0,01, controle n = 4, NTN n = 6). (D) Immunohistochemistry van p57 podocytes in controle en NTN 1 d muizen tonen. (E) kwantitatieve analyse van p57 positieve cellen per oppervlakte-tuft (μm2). (40 glomeruli per muis gekwantificeerd, ns). Westelijke vlek gegevens tonen betekent ± SD. Podocyte graven middelen ± SEM. Unpaired t-test met Welch's correctie. Schaal bar = 50 µm. Dit cijfer is gewijzigd van een eerdere publicatie20. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Glomerulaire eiwit nephrin overvloed in late nefrotoxische nefritis nefropathie (NTN). (A) de Western blot analyse van oppervlakte nephrin (IP: α-nephrin, WB: daar) en totale nephrin (IP: α-nephrin of lysate, WB: nephrin) in serum van controle- en nefrotoxische behandeld muizen (NTN 18 d). In vergelijking met de besturingselementen, NTN 18 d muizen Toon gelijke hoeveelheden van de cel-oppervlakte nephrin (IP: α-nephrin, WB: daar). NTN behandeld muizen op dag 18 display minder totale nephrin en actine fungeert als een besturingselement laden. (B) densitometric analyse wordt weergegeven geen significante verschillen in cel oppervlakte nephrin tussen besturingselementen en NTN 18 d muizen (controle van n = 4, NTN n = 3). (C) Densitometric analyse van de totale nephrin naar actine. In NTN muizen op dag 18, is er minder uitdrukking van nephrin ten opzichte van controles (controle van n = 4, NTN n = 3, ** p < 0,001). (D) Immunohistochemistry van p57 podocytes in controle en NTN 18 d muizen tonen. Er zijn minder p57 positieve cellen (rood) in NTN 18 d muizen in vergelijking met besturingselementen. Magnetische kralen verschijnen als zwarte stippen. (E) kwantitatieve analyse van p57 positieve cellen per oppervlakte-glomerulaire tuft (μm2) (*** p < 0,0001, controle n = 2, NTN n = 2, 40 glomeruli per muis gekwantificeerd). Westelijke vlek gegevens tonen betekent ± SD. Podocyte graven middelen ± SEM. statistische analyse: ongepaarde t-test met Welch's correctie. Schaal bar = 50 µm. Dit cijfer is gewijzigd van een eerdere publicatie20. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De onderhavige methode kan succesvolle Isolatievan glomeruli te onderzoeken glomerulaire RNA of eiwit. Daarnaast kunnen glomerulaire primaire celculturen worden uitgevoerd vanaf de geïsoleerde glomeruli. Als biotine wordt vereffend voor glomerulaire isolatie, kan etikettering van glomerulaire cel oppervlakte eiwitten worden uitgevoerd. Met deze methode in vivo glomerulaire cel oppervlakte-proteïne mensenhandel kan worden bestudeerd, en semi-kwantificatie van eiwit overvloed is mogelijk. De belangrijkste stappen voor het succesvol testen glomerulaire cel oppervlakte-proteïne overvloed zijn 1) uitbouw van handmatige expertise in muis operatie vooral cannulation van de aorta, 2) bubble-vrije verbinding van spuiten om te voorkomen dat de lucht embolisatie kan leiden van de glomeruli, en 3) werken in ijskoude omstandigheden zodra perfusie met PBSCM is begonnen.
Voor deze techniek is handmatige expertise in muis operatie essentieel. Cannulation van de aorta is vooral kritisch, zoals dissectie van het vaartuig perfusie van de nieren voorkomen zal. De snede in de aorta moet groot genoeg zijn (ongeveer 50% van de diameter van het vaartuig) genoeg ruimte om in te voeren van de katheter te creëren. Als de katheter diagonaal gesneden wordt, zal binnenbrengen van de katheter de aorta gemakkelijker worden. Naast dissectie, moet de geïntroduceerde katheter worden geplaatst binnen de aorta hoge om niet verhindert de renale bloedvaten. De renale bloedvaten zal anders niet worden geperfundeerd met biotine en de magnetische kralen.
Biotine is een kleine vitamine die met hoge affiniteit aan daar eiwitten bindt. Vanwege haar kleine formaat (244 Da), Biotine verandert niets aan de functie van conjugated eiwitten en zal worden gefiltreerd door de glomerulus. Door incubatie met streptavidine, kunnen biotinyleerd proteïnen gemakkelijk worden gescheiden van niet-gelabelde proteïnen door agarose kralen of andere methoden. N-hydroxysuccimide (NHS) esters van biotine binden aan amine (-NH2) groepen van eiwitten, die overvloedige op zijketens van lysine residuen, bijvoorbeeld. Sulfo-NHS-LC-Biotine is water oplosbaar en cel-ondoordringbare, als celmembranen intact zijn. Sulfo-NHS-LC-Biotine heeft aangetoond dat het label cel oppervlakte eiwitten23. Binding van biotine NHS esters amine groepen is afhankelijk van de pH (7-9) en het gebruik van amine-vrije buffers (bijvoorbeeld PBSCM). PBSCM met een pH van 7,4 werd daarom gebruikt om de perfuse van muis nieren met biotine, zoals het ideale fysiologische eigenschappen met optimale oplosbaarheid en de functie van biotine combineert. Om quench eiwitten na labeling, wordt perfusie van PBSCM met glycine uitgevoerd, waardoor vrije Biotine aan amine groepen van glycine worden gebonden. Om te voorkomen dat cellulaire processen na de dood van het dier, is het belangrijk om perfusie met een ijskoude oplossing uitvoeren en vervolgens doorwerken op ijs.
Gelijkaardig aan ex vivo biotinylation methoden, de mechanische belasting van de verwerking van de glomeruli tijdens in vivo biotinylation protocollen mei ook gevolgen endocytose, snelle signalering gebeurtenissen en RNA integriteit. Het is daarom essentieel dat alle verwerking stappen zijn uitgevoerd op het ijs om het risico van enzymatische cellulaire activiteit.
Proteinuric dierlijke modellen zoals nefrotoxische serum nefritis (NTN) schade muis nieren ernstig. In het bijzonder resulteert NTN in mesangial expansie, glomerulaire sclerose en tubulaire laesies, leidt tot nier fibrose in gevorderde stadia van de ziekte (42 dagen)24. Verminderde perfusie van sclerosed glomeruli in modellen van de ziekte kan leiden tot vooringenomen resultaten van eiwit overvloed. Sclerosed glomeruli zal waarschijnlijk niet worden geperfundeerd met magnetische kralen en kunnen dus niet worden geïsoleerd in deze methode. In ziekte modellen leidt tot ernstige glomerulaire sclerose, wellicht met behulp van technieken om te isoleren van de glomeruli via verschillende zeven stappen een alternatief voor het magnetische kralen-methode die wordt gebruikt in dit protocol25. Echter als de glomeruli zijn ernstig sclerosed, kan zelfs perfusie met biotine worden aangetast. Bovendien, zullen ex vivo biotinylation, waarin uitgepakte glomeruli baadde ex vivo in Biotine oplossingen21 zijn, waarschijnlijk niet gunstig in deze modellen. U kunt ook gebruik van immunofluorescentie detecteren eiwit overvloed in ernstig zieke glomeruli kan nuttig zijn, aangezien het niet afhankelijk is van de perfusie van de glomeruli.
Halve kwantificatie van eiwit overvloed met behulp van deze techniek werkt goed met behulp van densitometrie. Echter kunnen kleine verschillen in eiwitten overvloed worden gemist als gevolg van de detectiegrens van densitometrie.
De beschreven techniek kan worden overgedragen aan andere dierlijke organen die zijn geperfundeerd, mits de structuren van belang toegankelijk door isolatie technieken zijn of de oppervlakte-proteïne van belang specifiek voor een type of orgel celstructuur is. Hoewel alle oppervlakte-eiwitten biotinyleerd door deze techniek zijn, zal met behulp van een specifiek antilichaam voor immunoprecipitation leiden tot de Fractie van de cel-oppervlakte-proteïne expressie van de specifieke proteïne (zoals voor nephrin in Figuur 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Blanka Duvnjak voor haar uitzonderlijke technische bijstand. Dit werk werd gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 aan de M.W. en IQ QU280/3-1 De funder had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling, gegevensanalyse, besloten tot bekendmaking en voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | PZN:01320422 | anesthesia |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors, for cut into the aorta |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for abdominal cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery until the abdomen is opened |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | biotin |
| Dynabeads Untouched Mouse T-cells | Invitrogen | 11413D | to embolize glomeruli |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | to digest kidney tissue |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | Magnet catcher |
| 100µm cell stainer | Greiner-bio | 542000 | for glomerular isolation |
| Axiovert 40 CFL | Zeiss | non available | to confirm glomerular purity |
| TissueRuptor | Quiagen | 9002755 | Tissue homogenizer |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | for lysis buffer |
| Tris-HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | for lysis buffer |
| NaCl | VWR chemicals | 27810295 | for lysis buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | for lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | for lysis buffer |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | for lysis buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Follow the manufacturer's instructions |
| nephrin antibody | Progen | GP-N2 | for westernblot |
| Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody | R&D Systems | AF15556-SP | for westernblot |
| Streptavidin Agarose Resin | Thermo Scientific | 20347 | for immunoprecipitation |
| Protein A sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | for immunoprecipitation |
| polyclonal rabbit anti-p57 antibody | SCBT | sc-8298 | for Immunohistochemistry |
| mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | Western blot loading control |
| rabbit anti-p44/42 | cell signalling | 4695 | for westernblot |
| Pierce High sensitivity streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21130 | for westernblot |
| polyclonal mouse ICAM-2 antibody | R&D Systems | AF774 | for westernblot |
| polyclonal mouse anti-VE-cadherin | R&D Systems | AF1002 | for westernblot |
References
- Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Quack, I., et al. beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).
- Quack, I., et al. PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia. Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).
- Swiatecka-Urban, A. Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm. Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).
- Swiatecka-Urban, A. Membrane trafficking in podocyte health and disease. Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).
- Soda, K., et al. Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes. The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Martin, C. E., Jones, N. Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).
- Nielsen, J. S., McNagny, K. M. The role of podocalyxin in health and disease. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).
- Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).
- Tossidou, I., et al. Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis. Public Library of Science One. 5 (4), 10185 (2010).
- Qin, X. S., et al. Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).
- Waters, A. M., et al. Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).
- Zhang, X., Simons, M. Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).
- Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies. Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Haase, R., et al. A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease. Public Library of Science One. 12 (6), 0179217 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).
- Tomas, N. M., et al. Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy. New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface. Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).
- Ougaard, M. K. E., et al. Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease. International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).
- Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals. Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).
