Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Kennzeichnung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine mit Biotin murinen in Vivo . Dieses Protokoll enthält Informationen zur Maus Nieren durchspülen, Glomeruli zu isolieren und endogenen Immunopräzipitation des Proteins des Interesses durchführen.
Abstract
Proteinurie ergibt sich aus der Störung des glomerulären Filters, der die gefensterten Endothels, glomeruläre Basalmembran und Podocytes mit ihren Schlitz Membranen zusammensetzt. Die zarte Struktur des glomerulären Filters, vor allem die Schlitz-Membran, stützt sich auf das Zusammenspiel der verschiedenen Zelle Oberflächenproteine. Studieren diese Zelle Oberflächenproteine wurde bisher zur in-vitro- Studien oder histologische Analyse beschränkt. Hier präsentieren wir Ihnen einen murinen in Vivo Biotinylierungen Kennzeichnung Methode, die die Untersuchung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine physiologische und pathophysiologische Bedingungen ermöglicht. Dieses Protokoll enthält Informationen zur Maus Nieren durchspülen, Glomeruli zu isolieren und endogenen Immunopräzipitation eines Proteins des Interesses durchführen. Semi-Quantifizierung der glomerulären Zelle Oberfläche Fülle ist leicht zugänglich mit dieser neuartigen Methode und alle Proteine für Biotin Perfusion zugänglich und Immunopräzipitation kann untersucht werden. Isolierung der Glomeruli mit oder ohne Biotinylierungen ermöglicht darüber hinaus weitere Analyse der glomerulären RNA und Protein sowie primäre glomeruläre Zellkultur (z. B. primäre hemolytic Zellkultur).
Introduction
Proteinurie ist ein Markenzeichen der glomerulären Verletzungen und Störungen der glomerulären Filter1in der Regel begleitet. Der glomeruläre Filter besteht aus den gefensterten Endothels glomerulären Basalmembran und Podocytes. Die zarte molekulare Struktur des glomerulären Filters ist sehr dynamisch und je nach Zelle Oberfläche Protein Menschenhandel sowohl gesunden und kranken Nieren2,3,4,5,6 . Endozytose Zelle Oberflächenproteine nachweislich essentiell für das Überleben der Podocytes7. Nephrin und Podocalyxin sind transmembrane Proteine auf Podocytes. Nephrin ist das Rückgrat der glomerulären Schlitz Membran, während Podocalyxin eine Beschichtung die sekundäre Fuß Prozesse der Podocytes8,9,10Sialoglycoprotein. Endocytic Handel wurde zuvor für Nephrin und Podocalyxin3,11,12,13,14gezeigt.
Nach bestem Wissen und gewissen wurde Endozytose Zelle Oberflächenproteine nicht noch in glomerulären Endothelzellen in der Literatur beschrieben. Allerdings äußern Endothelzellen im Allgemeinen alle notwendigen Proteine für die verschiedenen Arten von Endozytose (d. h. Clathrin-abhängige, Floß-abhängige Endozytose)15,16. Daher kann Endothelzellen Oberfläche Handel mit dieser Methode verwenden, z. B. vaskulären endothelialen (VE) untersucht werden-Cadherin und intrazellulären Adhäsionsmolekül (ICAM-2) als Zelle Oberfläche Marker Protein für glomeruläre Endothelzellen17 .
Leider gibt es keine genaue in Vitro -Modell für zarte dreischichtigen glomerulären Filters in welche Zelle Oberfläche Protein Menschenhandel studiert werden kann. Das Ziel dieser Methode ist somit glomerulären Protein des Drogenhandels in Vivozu studieren. Dieses Protokoll enthält darüber hinaus Informationen zum Glomeruli, wodurch weitere Analyse der glomerulären RNA, Proteinen und Zellen zu isolieren. Ähnliche glomerulären Isolation beschrieb Techniken von verschiedenen Gruppen18,19.
Wir und andere haben früher, ex Vivo Kennzeichnung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine von Biotinylierungen2,3,4,20,21. Jedoch wurden in diese ex-Vivo -Methode isoliert Glomeruli mechanischen Belastung ausgesetzt, die endocytic Handel beeinflussen können. Alternativ ist die Immunfluoreszenz Kennzeichnung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine beträchtlich in der Literatur2,20,22benutzt worden. Mit dieser Methode jedoch nur eine kleine Anzahl von Proteinen innerhalb einer Folie analysiert werden kann, und Quantifizierung von Immunfluoreszenz Bildern ist oft schwierig.
Diese neuartige in-Vivo -Methode bietet ein zuverlässiges Werkzeug um glomerulären Zelle Oberfläche Protein Fülle und Menschenhandel genau in gesunden und kranken Nieren zu untersuchen, und es kann als Ergänzung zum Immunofluoreszenz Tests verwendet werden.
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Protocol
Mäuse wurden als eigene Rasse von der lokalen Tierpflege-Anlage oder von Janvier Labs in Frankreich erhalten. Die Untersuchungen wurden nach den Richtlinien beschrieben in der Anleitung zur Pflege und Verwendung von Labortieren (US nationale Institute der Gesundheit-Veröffentlichung Nr. 85-23, revidiert 1996) durchgeführt. Alle Tierversuche wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den relevanten institutionellen Zulassungen (Landesregierung LANUV Referenz Nummer AZ:84-02.04. 2016.A435).
1. Vorbereitung der Ausrüstung, Instrumente und Lösungen
- Bereiten Sie 1 L Phosphat gepufferte Kochsalzlösung mit 1 mM Magnesiumchlorid (MgCl2) und 0,1 mM-Kalzium-Chlorid (CaCl2) ergänzt (PBSCM) und durch einen Sterilfilter zu filtern.
- Perfusion 5 mL sterile PBSCM per Mausklick vorzubereiten und auf Eis legen.
- Bereiten Sie für jede Maus 5 mL sterile PBSCM mit 0,5 mg/mL Biotin ergänzt.
- Für jede Maus zubereiten 5 mL steriles PBSCM und 0,8 x 108 magnetische Beads (zB., 200 µL einer 4 x 108 Perlen/mL Lösung ohne Vorbehandlung) für Embolisation der Glomeruli. Bereiten Sie diese Lösung unter der Zelle Kultur Bank magnetische Beads in den original Schlauch steril zu halten. Legen Sie diese Lösung auf Eis.
- Bereiten Sie eine abschrecken Lösung durch Zugabe von 100 mM Glycin, PBSCM (5 mL pro Maus) und halten sie auf dem Eis.
- Machen Sie eine Kollagenase-Lösung (0.378 U/mL Kollagenase A in sterilen PBSCM). Per Mausklick pipette 1 mL der Kollagenase-Lösung in eine 2 mL-Tube und legen Sie es auf dem Eis.
- Zum Waschen, bereiten Sie sterile PBSCM (siehe Punkt 1.1) in 50 mL tube und legen Sie es auf dem Eis.
- Durchblutung verwenden Sie eine Spritzenpumpe mit einem Fluss von 2,0 mL/min.
- Bereiten Sie eine 10 mL Spritze mit einer Nadel 21G. Setzen Sie die Spitze der Nadel in einen 20-30 cm lange Katheter (Innendurchmesser ID = 0,58 mm). Verbinden Sie den Katheter (ID 0,58 mm) mit einem 10 cm kurzen Katheter (0,28 mm ID) und schneiden Sie die Spitze des kleineren Katheters schräg für ein leichtes Einführen in die Maus Aorta.
- Ligatur Verfahren während der Operation schneiden Sie drei 5-7 cm Seidenfäden (4: 0, 6-0) per Mausklick.
- Bereiten Sie für die Operation 3 chirurgische Klemmen, 2 Chirurgische Scheren, 2 Pinzette, 2 feine Pinzette, 1 feine Schere und Tupfer vor. Bereiten Sie die Narkose (z. B. intraperitoneale Betäubung Ketamin 100 mg/kg Körpergewicht und Xylazin 5 mg/kg Körpergewicht).
- Verwenden Sie zur Isolation von der Glomeruli der beiden Nieren ein 100 µm Zelle Sieb, zwei 50 ml Röhrchen und ein Magnet-Catcher.
- Bereiten Sie CHAPS Lyse Puffer: 20 mM-3-[(3-cholamidopropyl)-Dimethylammonio] -1-Propanesulfonate (CHAPS); 20 mM Tris (Hydroxymethyl)-Aminomethan (Tris) pH 7,5; 50 mM Sodiumchorlide (NaCl); 50 mM Sodiumfluoride (NaF); 15 mM Na4P2O7; 0,1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) pH 8.0; 2 mM Sodiumorthovanadate; und 2 mM Adenosinetriphosphat (ATP).
- Cool Zentrifugen auf 4 ° C.
2. Operation unter dem Mikroskop
- Die Maus zu betäuben (z. B. mit Ketamin/Xylazin intraperitoneal, siehe Schritt 1.11). Führen Sie den Zeh-Prise Test um ordnungsgemäße Betäubung zu bestätigen.
- Desinfizieren Sie die Unterseite der Maus mit 70 % Isopropanol.
- Führen Sie einen Median Schnitt durch die Haut aus dem Becken, das Brustbein und entfernen Sie die Haut von der Bauch-Faszie mit einer Pinzette. Schneiden Sie die Haut auf beiden Seiten in der Mitte des Bauches mit Chirurgische Scheren.
- Chirurgische Werkzeuge zu ändern. Zuweisen der Blase durch die Bauchmuskel-Schicht einen Median Schnitt von Xiphoid und teilen sie in vier Quadranten mit Pinzette und chirurgische Scheren. Befestigen Sie die oberen zwei beiseite mit Schellen auf den Hals der Maus mit zwei chirurgische Klemmen.
Hinweis: Der Bauch ist nun geöffnet. - Viszeralen Organe mit einem sterilen Tupfer beiseite legen und das Leber-Phrenicus Ligament mit feinen Schere geschnitten.
- Bereiten Sie eine Verbindung (mit einem Seidenfaden 4: 0, 6-0) um die Aorta proximal der Nierenarterien auf der Höhe der Nebenniere mit zwei feinen Pinzette. Anziehen der proximalen Aorta Ligatur zur Abschaffung der Durchblutung mit einer Pinzette.
- Frei von der distalen Aorta aus Faszie, Fett und anderen Geweben und bereiten eine Ligatur um die Leber/mesenterialen Arterie cranial der der Nierenarterien feine chirurgische Pinzette.
- Bereiten Sie eine Verbindung (mit einem Seidenfaden 4: 0, 6-0) um die Aorta distal von der Nierenarterien und Klemmen Sie die Vena Cava und Aorta in der Höhe von der Bifurkation.
- Schneiden Sie ein kleines Loch in die Aorta distal an den Nierenarterien damit das Loch der halbe Durchmesser der Aorta ist. Setzen Sie den Katheter in die Aorta und fixieren Sie es mit der vorbereiteten Ligatur.
Achtung: Vermeiden Sie Luftblasen in der Perfusion System, Luft-Embolie zu verhindern. - Beginnen Sie Perfusion mit eiskalten PBSCM bei einer Durchflussmenge von 2 mL/min.
- Schneiden Sie ein Loch in die renale Vene auf der Ebene der Nierenarterien mit feinen Chirurgische Scheren und festziehen Sie der Ligatur um die Leber- und mesenterialen Arterien.
Hinweis: Nieren sollte blass biegen Sie nach dem Start der Perfusion.
3. in Vivo Biotinylierungen
- Änderung der Spritze blasenfreie, eiskalte PBSCM durchspülen der Nieren mit 5 mL bei einer Durchflussmenge von 2 mL/min und mit 0,5 mg/mL Biotin für Oberfläche Kennzeichnung ergänzt.
Hinweis: Mischen Sie die PBSCM-Lösungen (z. B. durch drehen die 50 mL-Röhrchen) sanft zu vermeiden Luftblasen innerhalb der Lösung. Nach dem Absaugen der Lösung in die Spritze keine Luftblasen oder Luft aus der Spritze zu evakuieren. Verwenden Sie eine zusätzliche Kanüle (21G) auf der Spritze, um den Raum in die Kanüle zu füllen, die mit dem Kathetersystem verbunden ist. Schließlich halten Sie die Spritze in die Kanüle mit dem Katheter blasenfrei. - Ändern Sie die Spritze blasenfrei in eiskalten PBSCM ergänzt mit 100 mM Glycin zu stillen die Glomeruli und durchspülen mit 5 mL bei einem Flow von 2 mL/min.
- Änderung der Spritze blasenfreie, eiskalte PBSCM mit 200 μL magnetischen Perlen/mL ergänzt und durchspülen der Nieren mit 2 mL/min.
Hinweis: Auf der Oberfläche der Niere, Embolisation der Glomeruli mit braunen magnetische Beads werden angezeigt.
4. Isolierung der Glomeruli aus zwei Nieren
- Nieren auf das Hilum und Entfernen der Kapsel. Legen Sie die Nieren auf Eis in 15 mL PBSCM in der Kulturschale 10 cm Zelle. Einschläfern Sie die Maus mit zervikale Dislokation in Narkose nach der Ernte der Nieren. Die Operation und Perfusion Verfahren dauern ca. 20-22 min.
- Schneiden Sie Nieren in die kleinsten Stücke möglich mit einer neuen zweischneidiges Klinge. Bewegen Sie das Gewebe in ein 2 mL Röhrchen mit 1 mL der Kollagenbildung A (siehe Schritt 1.6) und Digest bei 37 ° C für 30 Minuten. Mischen Sie vor und nach der Verdauung mit einem 1000 μl Pipette geschnitten.
- Spülen Sie das verdaute Gewebe durch ein 100 μm Zelle Sieb mit eiskalten PBSCM. Verwenden Sie sanft die Zelle-Schaber, um hacken des übrigen Gewebe Troges der Zelle Sieb und spülen Sie ihn mit eiskalten PBSCM danach auf ein Gesamtvolumen von 50 mL.
- Zentrifugieren Sie die Federung bei 4 ° C 500 X g, für 5 min. Überstand zu entfernen und erneut das Pellet mit etwas weniger als 1,5 mL eiskaltes PBSCM beim Aufschütteln der Pellet. Danach setzen Sie die glomeruläre Suspension in eine neue 2-mL-Tube.
5. Waschen
- Verwenden der Magnet-Catcher, um die Glomeruli auf der einen Seite zu ziehen. 1 min. warten Sie, bevor die Glomeruli in Richtung der Magnet bewegt haben.
- Den Überstand mit einer 1000 μl Pipette zu entfernen, während der 2 mL Tube in der Magnet-Fänger bleibt. Während des ersten und zweiten Waschens Schritte (siehe Punkt 5.3), 250 μl überstand bleibt in der Röhre, um den Verlust der Glomeruli zu vermeiden. Führen Sie dieses Verfahren schnell, um zu vermeiden, röhrenförmige Strukturen auf den Boden des Röhrchens sinken zu lassen.
Hinweis: Der Waschvorgang wird sonst länger dauern. - Entfernen der 2 mL Tube von Magnet-Catcher und 1 mL PBSCM, Pipette rauf und runter (sehr wichtig), dann Wirbel.
- Setzen Sie den Schlauch wieder in der Magnet-Fänger und starte mit Schritt 5.2.
- Wiederholen Sie die Waschschritte, bis die Reinheit der Glomeruli 90 % erreicht hat. Dazu untersuchen Sie eine repräsentative Teilprobe des Überstands unter dem Mikroskop (40-100 X).
Hinweis: Glomeruli erscheinen als Runde Strukturen, die braune magnetische Kügelchen enthalten. Längliche Strukturen sind röhrenförmige Fragmente und kostenlose magnetische Beads als braune Runde Punkte angezeigt. Zellenrückstand kann als sperrige Strukturen angezeigt werden. - Wenn Reinheit erreicht ist, schätzen Sie die Anzahl der Glomeruli durch Auflösen der Glomeruli in 1 mL PBSCM. Nach dem Mischen eine aliquote 10 μL und dabei die Glomeruli unter die Lupe genommen. Die Anzahl der Glomeruli mit folgender Gleichung berechnen: endgültige Zahl der Glomeruli = Anzahl der Glomeruli in 10 μL aliquoten X 100.
- Erfolgreiche Isolierung der Glomeruli führt zu einer Reihe von 10.000-40.000 Glomeruli.
6. Proteingewinnung und Immunopräzipitation (IP)
- Sammeln Glomeruli durch Zentrifugation bei 4 ° C bei 6800 X g für 5 min. Überstand zu entfernen, wobei eine Magnet-Catcher und Aufschwemmen das Pellet in eiskalten Lyse Puffer (zB., 30.000 Glomeruli in 300 μl; CHAPS, siehe Schritt 1.11). Homogenisieren von Proben mit einem Gewebe-Homogenisator bei höchster Geschwindigkeit für 30 s und lösen Sie diese für 30 min auf Eis.
- Entfernen von unlöslichen Material durch Zentrifugation bei 15.000 x g für 30 min bei 4 ° C. Den Überstand enthält die Zelle lysate zu einem neuen Schlauch 1,5 mL Pipette. Entsorgen Sie das Pellet.
- Messen die Konzentration des Proteins des Überstands mithilfe eines Bicinchoninic (BCA)-basierte Methode nach den Anweisungen des Herstellers. Eine erfolgreiche lyse von 30.000 Glomeruli führt zu einer glomerulären Protein-Menge von 700-1.000 µg/mL. Anpassung an gleiche Protein-Mengen mit Lyse Puffer.
- Nehmen Sie eine Aliquote von 10 % des Gesamtvolumens für glomeruläre lysate und fügen Sie 2 x Laemmli + Dithiothreithol (DTT) vor der Inkubation für 5 min bei 95 ° C.
- Inkubieren Sie für IP-Adresse den Rest der lysate mit Streptavidin Agarose Perlen über Nacht bei 4 ° C auf eine obenliegende Shaker.
- Agarose Korne 1000 X g für 3 min bei 4 ° C zentrifugiert, den Überstand entfernen und hinzufügen 800 μl der Lyse Puffer, die Perlen für unspezifischen Proteinbindung zu waschen.
- Die Wäsche 3 Mal wiederholen, und den Überstand vollständig entfernen.
- Fügen Sie 30 μl 2 x Laemmli + DVB-t und bei 95 ° C für 5 min inkubieren.
- Laden der lysate und IP-Sonden auf ein 10 % SDS gel und laufen das SDS-Gel auf 70 V für 30 min, dann auf 20 mA pro Gel für 1,5 h blot anschließend das Gel für 2 h bei 200 mA auf eine Nitrocellulose-Membran.
- Blockieren Sie die Nitrozellulose-Membran über Nacht bei 4 ° C mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA) in Waschpuffer.
- Inkubieren Sie die Membran mit dem Antikörper von Interesse über Nacht bei 4 ° c Waschen mit Waschpuffer 3 Mal für 5 min auf einem Boston-Shaker und die Membran mit dem HRP-markierten Sekundärantikörper für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Wiederholen Sie die Waschschritt.
- Die lysate zu visualisieren und Immunopräzipitation Sonden auf der Membran mit einer Höchstauflösung Chemilumineszenz-Agent mit einer CCD-Kamera.
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Representative Results
Um die Glomeruli präzise zu isolieren, ist es notwendig, murine Nieren mit PBSCM ersten durchspülen. Perfusion mit PBSCM dreht Nieren blass (Abb. 1A). Embolisation der Glomeruli mit magnetischen Beads wird als braune Punkte auf der Oberfläche der Niere (Abbildung 1B) angezeigt. Isolierung der Glomeruli mit Magnet-Catcher kann Verunreinigungen mit renalen Tubuli (Abbildung 1C) zeigen. Vor der weiteren Analyse der Glomeruli, eine Reinheit von > 95 % der Glomeruli muss erreicht werden, durch die Glomeruli mehr gründlich waschen (Abbildung 1D).
In Vivo Biotinylierungen beruht auf der Fähigkeit zu Zelle Oberflächenproteine mit Biotin kennzeichnen. Um dies zu untersuchen, sind mit PBSCM oder -Zellmembran durchlässig Biotin murine Nieren durchblutet. Wie in Abbildung 2dargestellt, Etiketten Biotin die Kapillaren Schlingen in Biotin-durchblutet aber nicht in Kontrolle Maus Nieren. Um Zelle Oberflächenproteine von den Glomerulus mit der Bezeichnung von in Vivo Biotin Perfusion zu untersuchen, wird Immunopräzipitation der Biotin-Fraktion der glomerulären Extrakte durchgeführt. Abbildung 3 A zeigt, dass glomerulären transmembranen Proteine Nephrin und Podocalyxin Immunoprecipitated innerhalb der Biotin-Bruch sind. Allerdings wird im Kontroll-Mäusen, kein Nephrin oder Podocalyxin in der Immunoprecipitated-Fraktion der biotinylierte Proteine erkannt. Als Negativkontrolle, reguliert das intrazelluläre Protein extrazelluläre Signal Kinasen p42 und p44 (ERK) sind nicht in der Immunoprecipitated Anteil der biotinylierte Proteine der Kontrolle und Biotin durchblutet Maus Nieren gefunden. Bestätigen Sie, dass die Zelle Oberfläche Protein Nephrin tatsächlich biotinylierte ist von dieser Methode, wird Nephrin von Kontrolle und Biotin durchblutet Maus Nieren ausgefällt. Um Biotin zu visualisieren, ist die Immunoprecipitated-Fraktion mit Streptavidin befleckt. Abbildung 3 B zeigt biotinylierte Nephrin in Biotin-durchblutet aber keine Kontrolle über Tiere. Lysate Steuerelemente zeigen gleiche Mengen von Protein in Kontrolle und Biotin durchblutet Tiere. Endotheliale Protein vaskulären endothelialen (VE)-Cadherin ist Immunoprecipitated innerhalb der Biotin-Bruch, wie in Abbildung 3Cdargestellt. Im Kontroll-Mäusen ist kein VE-Cadherin ausgefällt, während VE-Cadherin in Lysates Kontroll-und Biotin durchblutet Tiere vorhanden ist. Intrazelluläre Adhäsionsmolekül 2 (ICAM-2) wird von Biotin durchblutet Tieren ausgefällt und ICAM-2 findet sich in Kontrolltieren. Lysates Kontroll-und Biotin durchblutet Tiere zeigen gleiche Mengen von ICAM-2 (Abb. 3C). Aktin diente als das Steuerelement laden.
Diese Methode lässt sich die Beträge der glomerulären Zelle Oberflächenproteine in Modellen der Nephropathie (z. B. nephrotoxischen Nephritis, NTN) zu quantifizieren. In der frühen Phase der NTN [Tag 1 (1D) nach NTN Serum Injektion] steigt Proteinurie. In der späteren Phase der NTN [Tag 18 (18 d)] verringert Proteinurie deutlich. Abbildung 4 zeigt Nephrin Zelle Oberfläche Fülle in frühen NTN (1D). Die in Vivo Biotinylierungen Assay (Abb. 4A) zeigt eine Reduzierung der Zelle Oberfläche Nephrin NTN Tiere im Vergleich zu Kontrollen. Die densitometrische Analyse zeigt eine deutliche Reduzierung der biotinylierte Nephrin (57 %) in NTN Tiere im Vergleich zu Kontrollen (Abb. 4C). Quantitative Analyse der gesamten Nephrin, Aktin zeigt keine signifikanten Unterschiede zwischen Steuerelementen und NTN Mäuse (Abbildung 4B). Mit einem p57 hemolytic Zelle spezifische Färbung, anzeigen hemolytic Zahlen gleiche Mengen NTN und Kontrolle Tiere (Abbildungen 4 und 4E). Abbildung 5 zeigt die Ergebnisse der Nephrin Zelle Oberfläche Fülle in späten NTN (18 d). Abbildung 5 A zeigt die in Vivo Biotinylierungen Assay bei Kontrolle und NTN Mäusen eine Erholung der Zelle Oberfläche Nephrin angibt. Densitometrische Analyse zeigt keine signifikanten Unterschiede der Zelle Oberfläche Nephrin in Kontrolle und NTN Mäuse (Abb. 5B). Insgesamt Nephrin verringerte sich um 25 % bei NTN Mäusen (Abbildung 5C). Hemolytic Zahlen wurden bei NTN Mäusen im Vergleich zu Kontrollen um ca. 19 % (zahlen 5 und 5E) gesenkt.
Abbildung 1 : Niere Perfusion und Isolierung von Glomeruli. (A) Blick durch das Mikroskop in der murinen Situs nach Perfusion mit PBSCM. Der Katheter in der Aorta wird mit einem Pfeil angezeigt. Perfusion mit PBSCM führt die Nieren, blass zu machen. (B) Embolisation der Glomeruli mit magnetischen Beads erscheinen als braune Punkte auf der Oberfläche der Niere. (C) anzeigen aber das Mikroskop zeigt ich) Kontamination der Glomeruli (braune Runde Strukturen); (II) mit Tubuli (leichte längliche Strukturen); und Iii) Zelle Rückstand. Reinheit der Glomeruli beträgt ca. 50 %. Kostenlose magnetische Beads erscheinen als braune Punkte (100 X Vergrößerung). (D) Blick durch das Mikroskop mit einer Reinheit von 95 % der Glomeruli (100 X Vergrößerung). Skalieren von Balken = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Biotin in der glomerulären Kapillaren Schleife erkannt. Repräsentative Immunfluoreszenz Bild der Maus Glomeruli (C57BL/6) mit PBSCM (Kontrolle) und Biotin (Biotin) durchströmt. Biotin (grün) wird durch Streptavidin in der glomerulären Kapillaren Schleife nur an Biotin durchblutet Mäusen visualisiert. Kontroll-Mäusen zeigen nicht glomeruläre Biotin Färbung. WT1 (rot) wird in den Kernen der Podocytes in den beiden Mäusen erkannt. Diese Zahl wurde von einer früheren Veröffentlichung20geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: In Vivo Biotin Kennzeichnung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine. (A) Western-blot Analyse von Immunoprecipitated (IP) biotinylierte Zelle Oberflächenproteine (IP: Streptavidin Agarose Korne) und Lysaten (lysate) Nieren von PBSCM durchblutet (Kontrolle) und Biotin durchblutet (Biotin) Mäuse. Die transmembranen Proteine Nephrin und Podocalyxin sind nur in Immunoprecipitated Proben von Biotin durchblutet Maus Nieren nachgewiesen. Im Kontroll-Mäusen sind Nephrin und Podocalyxin nicht in Immunoprecipitated Sonden Steuerung Maus Nieren festgestellt. In Lysates Kontroll-und Biotin durchblutet Tiere werden insgesamt Nephrin und Podocalyxin in beiden Gruppen gleich ausgedrückt. Die intrazelluläre Protein extrazelluläre Signal Kinasen p42 und p44 geregelt (ERK) sind im Immunoprecipitated Sonden Kontroll-und Biotin durchblutet Maus Nieren nicht erkannt. In der Lysates beider Gruppen Maus detektiert ERK in gleicher Höhe. Aktin ist als Steuerelement laden befleckt. (B) Western-blot Analyse der Immunoprecipitated Nephrin (IP: α-Nephrin) in PBSCM durchblutet (Kontrolle) und Biotin durchblutet (Biotin) Mäuse. In Biotin-durchblutet Nieren wird Nephrin mit Streptavidin beflecken, visualisiert, während keine Erkennung für Nephrin in Kontroll-Mäusen gefunden wird. Der Immunoprecipitated Anteil der Nephrin (IP: α-Nephrin, WB: Nephrin) sowie der lysate Bruch (lysate, WB: Nephrin) für Nephrin zeigen gleiche Mengen von Nephrin gebeizt. Aktin dient als ein Steuerelement laden. (C) Western-Blot Analyse der Immunoprecipitated biotinylierte Zelle Oberfläche Protein (IP: Streptavidin Agarose Korne) und der Nieren (lysate) Lysaten aus PBSCM durchblutet (Kontrolle) und Biotin durchblutet (Biotin) Mäuse. Die transmembranen Marker Protein vaskulären endothelialen (VE)-Cadherin und intrazellulären Adhäsionsmolekül 2 (ICAM-2) nur in der Immunoprecipitated-Fraktion der Biotin-durchblutet Tiere erkannt werden. Im Kontroll-Mäusen werden keine VE-Cadherin oder ICAM-2 erkannt. Aktin dient als ein Steuerelement laden. Diese Zahl wurde von einer früheren Veröffentlichung20geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Glomerulären Protein Nephrin Fülle in frühen nephrotoxischen Nephritis Nephropathie (NTN). (A) Western-blot Analyse der Oberfläche Nephrin (IP: α-Nephrin, WB: Streptavidin) und total Nephrin (IP: α-Nephrin oder lysate, WB: Nephrin) in Steuerung und nephrotoxischen Serum-behandelten Mäusen (NTN 1D). Aktin dient als ein Steuerelement laden. Im Vergleich zu Kontrollen, NTN behandelten Mäuse zeigen reduziert Zelle Oberfläche Nephrin (IP: α-Nephrin, WB Streptavidin) im Vergleich zu Kontrollen. (B) Quantitative Analyse der gesamten Nephrin/Aktin in Kontrolle und NTN 1 d Mäuse [Kontrolle n = 4, NTN n = 6, nicht signifikante Unterschiede (ns)]. (C) Densitometric Analyse der Zelle Oberfläche Nephrin (biotinylierte Nephrin/Gesamt Nephrin) bei Kontrolle und NTN Mäusen (* p < 0,01, Steuern, n = 4, NTN n = 6). (D) Immunohistochemistry des p57 Podocytes in Kontrolle und NTN 1 d Mäuse zeigen. (E) Quantitative Analyse der p57 positive Zellen pro Büschel Bereich (μm2). (40 Glomeruli per Mausklick quantifiziert, ns). Western-Blot-Daten zeigen Mittel ± SD hemolytic zählt Mittel ± SEM Unpaired t-test mit Welch es Korrektur. Maßstabsleiste = 50 µm. Diese Zahl wurde von einer früheren Veröffentlichung20geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Glomerulären Protein Nephrin Fülle im späten nephrotoxischen Nephritis Nephropathie (NTN). (A) Western-blot Analyse der Oberfläche Nephrin (IP: α-Nephrin, WB: Streptavidin) und total Nephrin (IP: α-Nephrin oder lysate, WB: Nephrin) im Kontroll- und nephrotoxischen Serum behandelten Mäuse (NTN 18d). Im Vergleich zu Kontrollen, NTN 18 d Mäusen zeigen gleiche Mengen von Zelle Oberfläche Nephrin (IP: α-Nephrin, WB: Streptavidin). NTN behandelten Mäuse am Tag 18 Display weniger total Nephrin, und Actin dient als ein Steuerelement laden. (B) densitometrische Analyse zeigt keine signifikanten Unterschiede in der Zelle Oberfläche Nephrin zwischen Steuerelementen und NTN 18 d Mäuse (Steuern, n = 4, NTN n = 3). (C) Densitometric Analyse der gesamten Nephrin, Aktin. NTN-Mäuse am Tag 18, ist weniger Ausdruck von Nephrin im Vergleich zu Kontrollen (Kontrolle n = 4, NTN n = 3, ** p < 0,001). (D) Immunohistochemistry des p57 Podocytes in Kontrolle und NTN 18 d Mäuse zeigen. Es gibt weniger p57 positive Zellen (rot) bei NTN 18 d Mäusen im Vergleich zu Kontrollen. Magnetische Beads erscheinen als schwarze Punkte. (E) Quantitative Analyse von p57 positive Zellen pro glomerulären Büschel Bereich (μm2) (*** p < 0,0001, Steuern, n = 2, NTN n = 2, 40 Glomeruli per Mausklick quantifiziert). Western-Blot-Daten zeigen Mittel ± SD hemolytic zählt Mittel ± SEM statistische Analyse: ungepaarten t-test mit Welch es Korrektur. Maßstabsleiste = 50 µm. Diese Zahl wurde von einer früheren Veröffentlichung20geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die vorgestellte Methode ermöglicht erfolgreiche Isolierung der Glomeruli glomerulären RNS oder Protein zu untersuchen. Darüber hinaus können primäre glomeruläre Zellkulturen aus isolierten Glomeruli durchgeführt werden. Biotin vor glomerulären Isolierung angewendet wird, kann der glomerulären Zelle Oberflächenproteine Kennzeichnung durchgeführt werden. Mit dieser Methode in Vivo glomerulären Zelle Oberfläche Protein des Menschenhandels kann untersucht werden, und semi-Quantifizierung der Protein Fülle ist möglich. Die wichtigsten Schritte zum Testen erfolgreich glomerulären Zelle Oberfläche Protein Fülle sind 1) Entwicklung manuelle Expertise in der Maus Chirurgie vor allem Kanülierung der Aorta, (2) blasenfreie Verbindung von Spritzen zur Vermeidung von Luft Embolisation von der Glomeruli, und 3) unter eiskalten Bedingungen arbeiten, sobald Perfusion mit PBSCM begonnen hat.
Für diese Technik unbedingt manuelle Know-how in der Maus Chirurgie. Kanülierung der Aorta ist besonders kritisch, da Dissektion des Schiffes Durchblutung der Nieren verhindert werden. Der Schnitt in der Aorta sollte groß genug sein (etwa 50 % des Schiffs Durchmesser) erstelle ich genügend Platz, um den Katheter einzuführen. Wenn der Katheter diagonal geschnitten wird, wird die Einführung des Katheters in die Aorta einfacher sein. Zusätzlich Dissektion sollte der eingeführte Katheter hoch in die Aorta platziert werden um die Nierenarterien nicht zu behindern. Die Nierenarterien werden sonst nicht mit Biotin und die magnetische Beads durchblutet werden.
Biotin ist ein kleines Vitamin, die mit hoher Affinität an Streptavidin Proteine bindet. Wegen seiner geringen Größe (244 Da) Biotin ändert nichts an die Funktion des Conjugated Proteine und wird durch den Glomerulus gefiltert werden. Durch Inkubation mit Streptavidin können biotinylierte Proteine leicht von unmarkierten Proteine durch Agarose Korne oder andere Methoden getrennt werden. N-Hydroxysuccimide (NHS) Ester von Biotin binden an Amin (-NH2) Gruppen von Proteinen, die zum Beispiel auf Seitenketten von Lysin Rückständen, reichlich vorhanden sind. Sulfo-NHS-LC-Biotin ist wasserlöslich und Zelle-undurchlässig, wenn Zellmembranen intakt sind. Sulfo-NHS-LC-Biotin hat sich gezeigt, um Zelle Oberflächenproteine23zu beschriften. Bindung von Biotin NHS Ester Amin Gruppen ist abhängig von pH (7-9) und die Verwendung der Amin-freie Puffer (z.B. PBSCM). PBSCM mit einem pH-Wert von 7,4 wurde daher zur Maus Nieren mit Biotin, Technologieprodukte wie es ideale physiologische Eigenschaften mit optimalen Löslichkeit und die Funktion von Biotin kombiniert. Um Proteine nach Kennzeichnung zu stillen, erfolgt Perfusion des PBSCM mit Glycin ermöglicht kostenlose Biotin Amin Gruppen von Glycin gebunden werden. Um zelluläre Prozesse nach dem Tod des Tieres zu verhindern, ist es wichtig, Perfusion eine eiskalte Lösung ausführen und weiterarbeiten auf dem Eis.
Ähnlich wie bei ex-Vivo Biotinylierungen Methoden, Protokolle die mechanische Beanspruchung der Verarbeitung Glomeruli während in Vivo Biotinylierungen Mai auch Auswirkungen Endozytose, schnelle Signalisierung Veranstaltungen und Integrität der RNA. Es ist daher wichtig, dass alle Verarbeitungsschritte auf Eis zur Verringerung des Risikos von enzymatischen Zellaktivität durchgeführt werden.
Proteinuric Tiermodellen wie nephrotoxischen Serum Nephritis (NTN) Schaden Maus Nieren schwer. Insbesondere führt NTN mesangialen Expansion, glomeruläre Sklerose und tubuläre Läsionen in fortgeschrittenen Stadien der Erkrankung (42 Tage)24Niere Fibrose führt. Beeinträchtigte Durchblutung der verödete Glomeruli in Krankheitsmodellen kann zu verzerrten Ergebnissen Protein Fülle führen. Verödete Glomeruli werden wahrscheinlich nicht mit magnetischen Beads durchblutet werden und somit nicht in dieser Methode isoliert werden können. In Krankheitsmodellen führt zu schweren glomeruläre Sklerose möglicherweise mit Techniken zur Glomeruli über verschiedene Stufen der siebenden isolieren eine Alternative, die in diesem Protokoll25magnetischen Beads Methode. Jedoch wenn Glomeruli stark verödete sind, möglicherweise sogar Perfusion mit Biotin beeinträchtigt werden. Darüber hinaus wird ex-Vivo Biotinylierungen, in dem extrahierten Glomeruli gebadet ex Vivo Biotin Lösungen21, sind wahrscheinlich nicht in diese Modelle vorteilhaft. Alternativ der Immunfluoreszenz verwenden Sie, um zu erkennen, dass Protein Fülle in schwer erkrankten Glomeruli von Vorteil sein kann, da es nicht auf Perfusion der Glomeruli angewiesen ist.
Semi-Quantifizierung der Protein-Fülle mit dieser Technik arbeitet gut mit Densitometrie. Allerdings können kleine Unterschiede in Hülle und Fülle Protein als Ergebnis der Nachweisgrenze der Densitometrie übersehen werden.
Die beschriebene Technik kann auf andere tierische Organe übertragen werden, die durchblutet werden, vorausgesetzt, dass die Strukturen von Interesse Isolierungstechniken erreichbar sind oder die Oberfläche Protein des Interesses spezifisch für eine Zellstruktur Typ oder Orgel ist. Obwohl alle Oberflächenproteine biotinylierte durch diese Technik sind, führt mit einem spezifischen Antikörper für Immunopräzipitation der Bruchteil der Zelle Oberfläche Protein-Expression des spezifischen Proteins zu (siehe für Nephrin in Abbildung 3B).
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Blanka Duvnjak für ihre außergewöhnliche technische Hilfe. Diese Arbeit wurde gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1, M.W. und QU280/3-1, IQ Die Geldgeber hatten keine Rolle im Studiendesign, Datenerhebung, Datenanalyse, Entscheidung, zu veröffentlichen und der Manuskripterstellung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | PZN:01320422 | anesthesia |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors, for cut into the aorta |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for abdominal cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery until the abdomen is opened |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | biotin |
| Dynabeads Untouched Mouse T-cells | Invitrogen | 11413D | to embolize glomeruli |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | to digest kidney tissue |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | Magnet catcher |
| 100µm cell stainer | Greiner-bio | 542000 | for glomerular isolation |
| Axiovert 40 CFL | Zeiss | non available | to confirm glomerular purity |
| TissueRuptor | Quiagen | 9002755 | Tissue homogenizer |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | for lysis buffer |
| Tris-HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | for lysis buffer |
| NaCl | VWR chemicals | 27810295 | for lysis buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | for lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | for lysis buffer |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | for lysis buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Follow the manufacturer's instructions |
| nephrin antibody | Progen | GP-N2 | for westernblot |
| Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody | R&D Systems | AF15556-SP | for westernblot |
| Streptavidin Agarose Resin | Thermo Scientific | 20347 | for immunoprecipitation |
| Protein A sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | for immunoprecipitation |
| polyclonal rabbit anti-p57 antibody | SCBT | sc-8298 | for Immunohistochemistry |
| mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | Western blot loading control |
| rabbit anti-p44/42 | cell signalling | 4695 | for westernblot |
| Pierce High sensitivity streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21130 | for westernblot |
| polyclonal mouse ICAM-2 antibody | R&D Systems | AF774 | for westernblot |
| polyclonal mouse anti-VE-cadherin | R&D Systems | AF1002 | for westernblot |
References
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