Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

בידוד של Glomeruli, In Vivo תיוג של חלבונים פני שטח התא Glomerular

Published: January 18, 2019 doi: 10.3791/58542
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Nephrology, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University, 2Institute of Cellular and Integrative Physiology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

Summary

כאן אנו מציגים עבור מאתר ויוו תיוג של חלבונים פני שטח התא glomerular עם ביוטין פרוטוקול. פרוטוקול זה מכיל מידע על אופן perfuse העכבר הכליות, לבודד glomeruli, ולבצע immunoprecipitation אנדוגני של החלבון עניין.

Abstract

פרוטאינוריה נובעת שיבוש המסנן glomerular המורכבת אנדותל fenestrated גלומרולרי במרתף, podocytes עם דיאפרגמות חריץ שלהם. המבנה העדין של המסנן glomerular, במיוחד הסרעפת שסע, מסתמכת על יחסי הגומלין של חלבונים פני שטח התא מגוונות. לומדים אלה חלבונים פני שטח התא כה הוגבלה במבחנה בלימודים או ניתוח היסטולוגית. כאן, אנו מציגים biotinylation מאתר ויוו תיוג שיטה, אשר מאפשר חקר חלבונים פני שטח התא glomerular בתנאים הפיזיולוגיות, pathophysiologic. פרוטוקול זה מכיל מידע על אופן perfuse העכבר הכליות, לבודד glomeruli, ולבצע immunoprecipitation אנדוגני של חלבון עניין. כימות למחצה של שפע פני שטח התא glomerular ונותרות עם שיטה חדשנית זו, נגיש זלוף ביוטין כל החלבונים, ניתן יהיה ללמוד immunoprecipitation. בנוסף, בידוד של glomeruli עם או בלי biotinylation מאפשר עוד ניתוח של glomerular RNA, חלבון, כמו גם תרבית תאים glomerular הראשית (קרי, תרבית תאים של podocyte הראשית).

Introduction

פרוטאינוריה מהווה סימן היכר של פציעה glomerular ומלווה בדרך כלל שיבוש מסנן glomerular1. המסנן glomerular מורכב של אנדותל fenestrated, גלומרולרי במרתף, podocytes. המבנה המולקולרי העדין של המסנן glomerular היא דינמית מאוד על תאי הדם בבני אדם בשתי הכליות בריאים וחולים2,3,4,5,6 . אנדוציטוזה של חלבונים פני שטח התא הוכח חיונית להישרדותו של podocytes7. Nephrin podocalyxin transmembrane חלבונים לידי ביטוי podocytes בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. Nephrin הוא עמוד השדרה של הסרעפת שסע glomerular, בעוד podocalyxin הוא sialoglycoprotein ציפוי תהליכי רגל משני podocytes8,9,10. סחר endocytic שהוצג בעבר עבור nephrin ו- podocalyxin3,11,12,13,14.

לפי מיטב ידיעתנו, אנדוציטוזה של חלבונים פני שטח התא לא עוד תואר בתאי האנדותל glomerular בספרות. עם זאת, תאי אנדותל לבטא באופן כללי כל החלבונים הדרושים עבור סוגים שונים של אנדוציטוזה (קרי, אנדוציטוזה clathrin תלוית, תלויי-רפסודה)15,16. לכן, תאי אנדותל משטח סחר עשויים להילמד בשיטה זו משתמשים, לדוגמה, אנדותל כלי הדם (VE)-קדהרין, מולקולה אדהזיה תאיים (ICAM-2) כמו תא משטח סמן חלבון תאי אנדותל glomerular17 .

למרבה הצער, יש אין מודל מדויק במבחנה למסנן עדין שלוש שכבות glomerular בתא שבו הדם סחר יכול להילמד. המטרה של שיטה זו היא ובכך ללמוד חלבון glomerular סחר ויוו. בנוסף, פרוטוקול זה מכיל מידע על כיצד לבודד glomeruli, המאפשר ניתוח של glomerular RNA, חלבונים, או תאים. דומה בידוד glomerular טכניקות תוארו על ידי שונים קבוצות18,19.

בעבר, אנחנו ואחרים השתמשו שמחוץ תיוג של חלבונים פני שטח התא glomerular מאת biotinylation2,3,4,20,21. עם זאת, בשיטה זו שמחוץ , מבודד glomeruli נחשפו ללחץ מכני, העלולים להשפיע על סחר endocytic. לחלופין, immunofluorescence תיוג של חלבונים פני שטח התא glomerular בהרחבה שימש בספרות2,20,22. בשיטה זו, עם זאת, ניתן לנתח כמות קטנה של חלבונים בתוך שקופית אחת, כימות של immunofluorescence תמונות קשה לעיתים קרובות.

השיטה הרומן ויוו מציעה כלי אמין ללמוד glomerular תא הדם שפע וסחר במדויק בתוך בריאים וחולים הכליות, זה יכול לשמש כתוספת בדיקות immunofluorescence.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

עכברים התקבלו כמו גזע ללא צורך במיקור חוץ מתקן טיפול בבעלי חיים מקומיים או מעבדות Janvier בצרפת. החקירות נערכו על פי ההנחיות המפורטות במדריך עבור טיפול, שימוש של חיות מעבדה (ארה ב נבחרת מוסדות של בריאות פרסום מס ' 85-23, תוקן 1996). כל הניסויים בוצעו על פי האישורים מוסדיים הרלוונטיים (ממשלת מדינת LANUV להפנות מספר AZ:84-02.04. 2016.A435).

1. הכנת כלי נגינה, פתרונות וציוד

  1. להכנת 1 ליטר של תמיסת מלח פוספט באגירה מלאה בתוספת 1 מ מ מגנזיום כלוריד (MgCl2) ו- 0.1 מ מ סידן כלורי (2CaCl) (PBSCM) ולסנן אותו דרך מסנן סטרילי.
  2. להתכונן 5 מ של PBSCM סטרילי לכל העכבר זלוף ומניחים אותו על קרח.
  3. עבור כל עכבר, להכין 5 מ של PBSCM סטרילית בתוספת 0.5 מ"ג/מ"ל ביוטין.
  4. עבור כל עכבר, להכין 5 מ של PBSCM סטרילי, להוסיף 0.8 x 108 beads מגנטי (למשל., 200 µL של8 4 x 10 חרוזים/mL פתרון, ללא רעלני) עבור אמבוליזציה של glomeruli. להכין פתרון זה תחת הספסל התרבות התא כדי לשמור את החרוזים מגנטי סטרילי הצינור המקורי. במקום פתרון זה על קרח.
  5. להכין פתרון quenching על-ידי הוספת 100 מ מ גליצין PBSCM (5 מ"ל לכל עכבר) ולשמור אותו בקרח.
  6. להפוך את פתרון collagenase (0.378 U/mL collagenase א ב PBSCM סטרילי). לכל עכבר, פיפטה 1 מ"ל של הפתרון collagenase לתוך צינור 2 מ"ל ומניחים אותו על קרח.
  7. עבור כביסה, להכין PBSCM סטרילי (ראה שלב 1.1) ב- 50 מל צינור ומניחים אותו על קרח.
  8. זלוף, להשתמש משאבת מזרק עם זרם של 2.0 mL/min.
  9. להכין מזרק 10 מ"ל עם מחט 21G. מניחים את קצה המחט צנתר ארוכה 20-30 ס מ (הקוטר הפנימי, ID = 0.58 מ מ). לחבר את הקטטר (מזהה 0.58 מ"מ) עם צנתר קצר 10 ס מ (מזהה 0.28 מ מ) חותכים את קצה הקטטר קטנים עקיפה עבור ההכנסה בקלות לתוך העורקים העכבר.
  10. להליכי קשירה במהלך הניתוח, חותכים שלושה 5-7 ס מ חוטי משי (4-0 ל- 6-0) לכל העכבר.
  11. . לניתוח, להכין 3 מלחציים כירורגי, מספריים כירורגיים 2, פינצטה 2, 2 פינצטה בסדר, מספריים בסדר 1, מטליות. הכינו את ההרדמה (למשל, בקרום הבטן הרדמה קטמין 100 מ"ג/ק"ג משקל גוף, חריגות השירותים הווטרינריים 5 מ"ג/ק"ג משקל גוף).
  12. עבור בידוד של glomeruli של שתי כליות, השתמש מסננת תא 100 מיקרומטר, שני צינורות 50 מ ל, תופס מגנט.
  13. תתכוננו בחורים פירוק מאגר: 20 מ מ 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate (בחורים); 20 מ מ טריס (hydroxymethyl)-aminomethan (טריס) pH 7.5; sodiumchorlide 50 מ מ (NaCl); sodiumfluoride 50 מ מ (NaF); 15 מ מ נה4P2O7; 0.1 מ מ Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) pH 8.0; sodiumorthovanadate 2 מ מ; adenosinetriphosphat 2 מ מ (ATP).
  14. צנטריפוגות מגניב עד 4 ° C.

2. ניתוח מתחת למיקרוסקופ

  1. עזים ומתנגד העכבר (למשל, עם חריגות קטמין/השירותים הווטרינריים intraperitoneally, ראה שלב 1.11). לבצע את הבדיקה הבוהן-קמצוץ לאשר הרדמה. ראויה.
  2. לחטא הצד הבטני של העכבר עם אלכוהול איזופרופיל 70%.
  3. לבצע חתך החציוני דרך העור מן האגן לעצם החזה ולהסיר את העור fascia בטן באמצעות פינצטה. לחתוך את העור משני הצדדים באמצע הבטן עם מספריים כירורגיים.
  4. שינוי כלי ניתוח. להחיל חתך החציוני של מצאתי שלפוחית השתן דרך השכבה שריר הבטן, לחלק את אותם ארבעת הרבעים באמצעות פינצטה ומספריים כירורגי. לצרף את העליונות בצד שני עם התפסים כלפי הצוואר של העכבר עם שני תופסנים כירורגי.
    הערה: הבטן עכשיו נפתח.
  5. לשים איברים הקרביים הצידה עם מקלון סטרילי, לחתוך רצועה ולשננו-הסרעפת עם מספריים משובחים.
  6. להכין מצדו (עם משי חוט 4-0 ל- 6-0) סביב העורקים צינתור עורקי כליות על הגובה של בלוטת יותרת הכליה עם פינצטה בסדר שני. להדק את מצדו של אבי העורקים proximal לבטל זרימת הדם עם פינצטה.
  7. חינם העורקים דיסטלי fascia, שומן, רקמות אחרות והכן של מצדו סביב עורק מצע המעי/העליון ולשננו הגולגולת של העורקים הכליות באמצעות פינצטה כירורגית משובחים.
  8. להכין מצדו (עם משי חוט 4-0 ל- 6-0) סביב העורקים דיסטלי של העורקים כליות, מלחציים הנבוב העליון של אבי העורקים בשיא ההסתעפות.
  9. לחתוך חור קטן לתוך העורקים דיסטלי העורקים כליות כך החור הוא מחצית מהקוטר של אבי העורקים. מכניסים את הצנתר העורקים ותקן אותה באמצעות הקשירה מוכנה.
    זהירות: יש להימנע בועות במערכת זלוף כדי למנוע. תסחיף אוויר.
  10. נתחיל זלוף PBSCM קר כקרח בספיקה של 2 mL/min.
  11. לחתוך חור לווריד כליות ברמה של העורקים כליות עם מספריים כירורגיים בסדר והדק את מצדו סביב העורקים הכבד, מצע המעי העליון.
    הערה: הכליות צריך לפנות חיוור לאחר הפעלת את זלוף.

3. Biotinylation in Vivo

  1. שינוי המזרק בועה-חופשית כדי PBSCM קר כקרח בתוספת 0.5 מ"ג/מ"ל ביוטין עבור משטח labelling, והוא perfuse כליות 5 מ ל קצב הזרימה של 2 mL/min.
    הערה: לערבב את הפתרונות PBSCM (למשל, על-ידי הפעלת הצינורות 50 מ ל) בעדינות כדי למנוע יצירת בועות בתוך הפתרון. לאחר השאיפה של הפתרון בתוך המזרק, לפנות את כל בועות או אוויר מן המזרק. להשתמש בצינורית תוספת של (21 גרם) על המזרק כדי למלא את החלל ב הצינורית המחוברת למערכת קטטר. לבסוף, לתחוב את המזרק לתוך הצינורית עם הצנתר ללא בועות.
  2. לשנות את המזרק ללא בועות PBSCM קר כקרח בתוספת 100 מ מ גליצין להרוות glomeruli, perfuse עם 5 מ ל- זרם של 2 mL/min.
  3. שינוי המזרק בועה-חופשית כדי PBSCM קר כקרח בתוספת 200 μL מגנטי חרוזים/mL, perfuse כליות ב 2 mL/min.
    הערה: על פני השטח כליות, אמבוליזציה של glomeruli עם חום beads מגנטי יהיה גלוי.

4. בידוד של Glomeruli מ שתי כליות

  1. להסיר כליות ב hilum ולהסיר את הקפסולה. מניחים את הכליות על הקרח ב-15 מיליליטר PBSCM בצלחת תרבות תא 10 ס מ. המתת חסד את העכבר עם נקע בצוואר הרחם תחת הרדמה לאחר לקצור את הכליות. ההליכים זלוף ובבית האחרון כ 20-22 דקות.
  2. לחתוך הכליות לחתיכות הקטן ביותר האפשרי עם להב כפול-קצה חדש. להזיז את הרקמה לתוך צינור 2 מ"ל עם 1 מ ל collagenase א (ראה שלב 1.6), תקציר ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לפני ואחרי תהליך העיכול, מערבבים בעדינות עם μL 1000 לחתוך פיפטה.
  3. יש לשטוף את הרקמה מתעכל דרך מסננת 100 μm התא באמצעות PBSCM קר כקרח. להשתמש בעדינות את התא-במגרדת מינצ את השוקת הרקמה הנותרת מסננת התא, לשטוף אותו עם PBSCM קר כקרח לאחר מכן את הנפח הכולל של 50 מ.
  4. Centrifuge את המתלים ב 4 ° C g 500 x 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר עם מעט פחות מ- 1.5 מ ל PBSCM קפואים בזמן vortexing בגדר. לאחר מכן, מכניסים את המתלים glomerular צינור 2 מ"ל.

5. כביסה

  1. השתמש הנדפק מגנט למשוך glomeruli לצד אחד. המתן 1 דקות לפני glomeruli עברו לכיוון המגנט.
  2. הסר את תגובת שיקוע עם פיפטה μL 1000 בעוד הצינור 2 מ"ל נשאר בהתפסן מגנט. במהלך השטיפה הראשונה והשניה צעדים (ראה שלב 5.3), 250 μL שרידי supernatant בצינור כדי להימנע מאובדן glomeruli. בצע הליך זה במהירות כדי להימנע לתת מבנים צינורי לשקוע לתחתית הצינור.
    הערה: ההליך כביסה מעמד אחרת.
  3. להסיר את הצינור 2 מ"ל מגנט התופס ולהוסיף 1 מ"ל של PBSCM, פיפטה למעלה ולמטה (חשוב מאוד), אז מערבולת.
  4. תחזיר את הצינור לתוך הנדפק מגנט ולהתחיל מחדש עם צעד 5.2.
  5. חזור על השלבים כביסה עד טוהר glomeruli הגיעה 90%. בשביל זה, לבחון aliquot הנציגה של תגובת שיקוע תחת מיקרוסקופ (40-100 X).
    הערה: Glomeruli יופיעו כמבני עגול המכיל beads מגנטי חום. מבנים מאורכים שברי צינורי הינם חינם beads מגנטי להופיע כנקודות סיבוב חום. שאריות תאים עשויים להופיע כמבני מגושם.
  6. אם טוהר הגיעה, הערכה הרוזן glomeruli על ידי המסת glomeruli ב 1 מ"ל של PBSCM. לאחר ערבוב, של aliquot של 10 μL ואין ספור glomeruli מתחת למיקרוסקופ. לחשב את מספר glomeruli עם המשוואה הבאה: המספר הסופי של glomeruli = מספר glomeruli ב 10 μL aliquot x 100.
  7. הבידוד מוצלח של glomeruli מוביל מגוון glomeruli 10,000-40,000.

6. חלבון חילוץ ו- Immunoprecipitation (IP)

  1. Glomeruli לאסוף על ידי צנטריפוגה ב 4 ° C-g x 6800 עבור 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע תוך שימוש תופס מגנט, resuspend בגדר במאגר פירוק כקרח (למשל., 30,000 glomeruli ב- 300 μL; חברים, ראה שלב 1.11). Homogenize את הדגימות עם רקמות מהמגן במהירות הגבוהה ביותר ב-30 s ואת lyse אותם על קרח למשך 30 דקות.
  2. מסירים חומרים לא מסיסים על ידי צנטריפוגה ב 15,000 g x במשך 30 דקות על 4 מעלות צלזיוס. Pipette את תגובת שיקוע הכולל את התא lysate לתוך צינור 1.5 mL החדש. להתעלם בגדר.
  3. למדוד את ריכוז חלבון תגובת שיקוע על-ידי שימוש של bicinchoninic (BCA)-המבוסס על שיטת ההוראות של היצרן. פירוק מוצלחת של 30,000 glomeruli התשואות על כמות חלבון glomerular של 700-1, 000 µg/mL. להתאים כמויות חלבון שווה עם פירוק מאגר.
  4. . קח את aliquot של 10% מהנפח הכולל עבור glomerular lysate ולהוסיף 2 x Laemmli + dithiothreithol (DTT) לפני הדגירה למשך 5 דקות ב 95 ° C.
  5. עבור ה-IP, דגירה שאר lysate עם חרוזים agarose streptavidin בין לילה-4 מעלות צלזיוס על שייקר תקורה.
  6. צנטריפוגה agarose חרוזים ב 1000 x g למשך 3 דקות ב 4 ° C, להסיר את תגובת שיקוע והוסף μL 800 פירוק מאגר לשטוף את החרוזים עבור איגוד חלבון לא ספציפי.
  7. חזור על לשטוף את 3 פעמים, להסיר את תגובת שיקוע לחלוטין.
  8. להוסיף 30 μL של 2 x Laemmli + DTT, דגירה ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
  9. טען את lysate ואת ה-IP הגששים-מרחביות 10% ג'ל ולהפעיל את הג'ל מרחביות 70 V למשך 30 דקות, ואז בגיל 20 אמא לכל ג'ל ה 1.5 לאחר מכן, למחוק את הג'ל על 2 h ב- 200 mA על קרום ניטרוצלולוזה.
  10. לחסום את הקרום ניטרוצלולוזה בן לילה ב 4 ° C עם 5% אלבומין שור (BSA) ב שטיפת מאגר.
  11. דגירה הקרום עם הנוגדן עניין בן לילה ב 4 º C. לשטוף עם שטיפה מאגר 3 פעמים במשך 5 דקות על מטרף, דגירה הקרום עם הנוגדן משני מתויג HRP לשעה בטמפרטורת החדר. חזור על השלב כביסה.
  12. דמיינו את lysate, immunoprecipitation רגשים על הקרום באמצעות סוכן chemiluminescent סופר רזולוציה עם מצלמת CCD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לבודד glomeruli באופן מדויק, יש צורך perfuse מאתר הכליות עם PBSCM קודם. זלוף עם PBSCM פונה הכליות חיוור (איור 1א'). אמבוליזציה של glomeruli עם חרוזים מגנטי יהיה גלוי כנקודות חום על פני כליות (איור 1B). בידוד של glomeruli עם התפסן מגנט עשוי להראות זיהום עם כליות tubuli (איור 1C). לפני ניתוח נוסף של glomeruli, > 95% טוהר של glomeruli צריך להיות מושגת על ידי שטיפה glomeruli באופן יסודי יותר (איור 1D).

In vivo biotinylation מסתמך על היכולת לתייג התא חלבונים פני שטח עם ביוטין. במחקר זה, מאתר הכליות הן perfused עם PBSCM או ביוטין חדיר הלא--קרום התא. כפי שמוצג באיור2, ביוטין מתייגת את לולאות נימי ביוטין-perfused אך לא שליטה בעכבר הכליות. לחקור חלבונים פני שטח התא של פקעית תווית באמצעות ויוו ביוטין זלוף, immunoprecipitation של השבר ביוטין של תמציות glomerular מתבצע. איור 3 A מדגים כי glomerular חלבונים transmembrane nephrin ו- podocalyxin הם immunoprecipitated בתוך השבר ביוטין. עם זאת, בעכברים שליטה, בלי nephrin או podocalyxin מזוהה בהשבר immunoprecipitated של חלבונים biotinylated. כפקד שלילי, חלבונים תאיים חוץ-תאית-האות מוסדר kinases p42 ו- p44 (טיפשה) לא נמצאים השבר immunoprecipitated של חלבונים biotinylated של שליטה ושל הכליות העכבר ביוטין-perfused. כדי לוודא כי nephrin חלבון פני השטח התא הוא למעשה biotinylated בשיטה זו, nephrin הוא זירז לבין שליטה בעכבר perfused-ביוטין הכליות. כדי להמחיש ביוטין, השבר immunoprecipitated הוא מוכתם streptavidin. איור 3 B מציג biotinylated nephrin perfused-ביוטין אבל לא לשלוט בבעלי חיים. פקדים lysate מצביעים על כמויות שוות של חלבון שליטה ובעלי perfused-ביוטין. חלבון אנדותל כלי הדם אנדותל (VE)-קדהרין הוא immunoprecipitated בתוך השבר ביוטין, כפי שמוצג באיור 3ג'. בעכברים שליטה, אין VE-קדהרין הוא זירז, אמנם VE-קדהרין נוכח lysates של שליטה ובעלי ביוטין-perfused. אדהזיה תאיים מולקולה 2 (ICAM-2) הוא זירז מחיות perfused-ביוטין, ICAM-2 נמצא שליטה בעלי חיים. Lysates של שליטה ובעלי perfused-ביוטין להראות כמויות שוות של ICAM-2 (איור 3ג'). אקטין שימש פקד הטעינה.

בשיטה זו ניתן לכמת את כמות חלבונים פני שטח התא glomerular במודלים של כלייתית (למשל, nephrotoxic דלקת כליות, NTN). בשלב מוקדם של NTN [יום 1 (1 ד) לאחר ההזרקה סרום NTN], פרוטאינוריה גדל במהירות. בשלב מאוחר יותר של NTN [יום 18 (18 יח)], פרוטאינוריה פוחתת באופן משמעותי. איור 4 מציג שפע פני השטח של התא nephrin NTN מוקדם (ד 1). אין ויוו biotinylation וזמינותו (איור 4א) מציגה ירידה של nephrin פני שטח התא בבעלי NTN לעומת שולט. הניתוח densitometric מראה ירידה משמעותית של biotinylated nephrin (57%) בבעלי NTN לעומת שולט (איור 4C). ניתוח כמותי של nephrin הכולל כדי אקטין מגלה אין הבדלים משמעותיים בין הפקדים NTN עכברים (איור 4B). שימוש של p57 podocyte תא מסוים מכתים, מספרים podocyte להציג כמויות שוות NTN ובעלי שליטה (דמויות 4D ו- 4E). איור 5 מציג את התוצאות של שפע פני השטח של התא nephrin NTN מאוחר (ד 18). איור 5 A מציג את הבדיקה biotinylation ויוו שליטה ועכברים NTN המציין החלמה של nephrin פני שטח התא. ניתוח densitometric מציג אין הבדלים משמעותיים של תא nephrin משטח שליטה ועכברים NTN (איור 5B). Nephrin סה כ צומצם ב- 25% בעכברים NTN (איור 5C). מספרים Podocyte ירדו בעכברים NTN לעומת שולט בכ 19% (דמויות 5D ו- 5E).

Figure 1
איור 1 : כליות זלוף ובידוד של glomeruli. (א) מבעד למיקרוסקופ לתוך סיטוס מאתר לאחר זלוף עם נוף PBSCM. הקטטר באבי העורקים מסומן בחץ. זלוף עם PBSCM מוביל את הכליות לפנות חיוור. (ב) אמבוליזציה של glomeruli עם חרוזים מגנטי מופיעים כנקודות חום על פני השטח את הכליה. (ג) הצג למרות המיקרוסקופ מראה אני) זיהום של glomeruli (חום סביב מבנים); ii) עם tubuli (מבני מוארך אור); ו- iii) תא פסולת. טוהר glomeruli הוא כ- 50%. חינם beads מגנטי מופיעים כנקודות חום (הגדלה 100 X). (ד) להציג דרך המיקרוסקופ מראה של 95% טוהר glomeruli (הגדלה 100 X). גודל ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ביוטין זוהה הלולאה נימי glomerular. תמונה immunofluorescence הנציגה של העכבר glomeruli (C57BL/6) perfused עם PBSCM (בקרה), ביוטין (ביוטין). ביוטין (ירוק) הוא מדמיין מאת streptavidin בתמונה נימי glomerular רק בעכברים perfused-ביוטין. בקרת עכברים אינם מראים ביוטין glomerular מכתים. WT1 (אדום) זוהה את הגרעינים של podocytes שני עכברים. דמות זו שונתה מן הפרסום הקודם20. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: In vivo ביוטין תיוג של חלבונים פני שטח התא glomerular. (א) המערבי כתם ניתוח של חלבונים פני שטח התא immunoprecipitated (IP) biotinylated (IP: חרוזים agarose streptavidin), lysates (lysate) של הכליות של PBSCM-perfused (בקרה) ועכברים perfused-ביוטין (ביוטין). החלבונים transmembrane nephrin ואת podocalyxin מזוהים רק בדגימות immunoprecipitated של perfused-ביוטין העכבר הכליות. בעכברים שליטה, nephrin ו- podocalyxin לא מזוהים ב immunoprecipitated הגששים שליטה בעכבר הכליות. ב- lysates של שליטה ובעלי perfused-ביוטין, הכולל nephrin, podocalyxin באים לידי ביטוי באופן שווה בשתי הקבוצות. חלבונים תאיים חוץ-תאית-האות מוסדר kinases p42 ו- p44 (טיפשה) לא מזוהים ב immunoprecipitated הגששים של שליטה והכליות העכבר ביוטין-perfused. ב lysates של שתי הקבוצות העכבר, טיפשה מזוהה בכמויות שוות. אקטין היא מוכתמת כפקד טעינה. (ב) המערבי כתם ניתוח של immunoprecipitated nephrin (IP: α-nephrin) PBSCM perfused (בקרה) ועכברים perfused-ביוטין (ביוטין). בכליות ביוטין-perfused, nephrin הוא מדמיין עם streptavidin מכתים, בעוד אין זיהוי של nephrin נמצא בעכברים שליטה. השבר immunoprecipitated של nephrin (IP: α-nephrin, WB: nephrin) כמו גם השבר lysate (lysate, WB: nephrin) צבעונית עבור כמויות שוות של הצג nephrin של nephrin. אקטין משמש פקד הטעינה. (ג) המערבי ניתוח כתם של biotinylated immunoprecipitated תא הדם (IP: חרוזים agarose streptavidin), lysates (lysate) של הכליות של PBSCM perfused (בקרה) ועכברים perfused-ביוטין (ביוטין). החלבון הסמן transmembrane אנדותל כלי הדם (VE)-קדהרין, אדהזיה תאיים מולקולה 2 (ICAM-2) מזוהים רק ב השבר immunoprecipitated בעלי חיים perfused-ביוטין. בעכברים שליטה, אין VE-קדהרין או ICAM-2 מזוהים. אקטין משמש פקד הטעינה. דמות זו שונתה מן הפרסום הקודם20. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : חלבון glomerular שפע nephrin, nephrotoxic מוקדמת דלקת כליות כלייתית (NTN). (א) המערבי כתם ניתוח של פני השטח nephrin (IP: α-nephrin, WB: streptavidin), הכולל nephrin (IP: α-nephrin או lysate, WB: nephrin) בעכברים nephrotoxic ובקרה שטופלו סרום (NTN ד 1). אקטין משמש פקד הטעינה. לעומת שולט, NTN עכברים התייחס להראות מופחת nephrin פני שטח התא (IP: α-nephrin, WB streptavidin) לעומת שולט. (ב) ניתוח כמותי של nephrin/אקטין הכולל בקרת ועכברים d NTN 1 [לשלוט n = 4, NTN n = 6, הבדלים שאינם משמעותיים (ns)]. (ג) Densitometric ניתוח של תא שטח nephrin (biotinylated nephrin nephrin/סה כ) שליטה ועכברים NTN (* p < 0.01, לשלוט n = 4, NTN n = 6). (ד) אימונוהיסטוכימיה של p57 מציג podocytes שליטה ועכברים NTN 1-d. (ה) ניתוח כמותי של תאים חיוביים p57 אניץ שטח (μm2). (glomeruli 40 לכל העכבר לכמת, ns). תספיג חלבון נתונים להראות אמצעי ± SD. Podocyte ספירות להראות ± באמצעים ב- SEM Unpaired t-מבחן עם התיקון של וולש. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. דמות זו שונתה מן הפרסום הקודם20. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : חלבון glomerular שפע nephrin ב nephrotoxic לאחר דלקת כליות כלייתית (NTN). (א) המערבי כתם ניתוח של פני השטח nephrin (IP: α-nephrin, WB: streptavidin), הכולל nephrin (IP: α-nephrin או lysate, WB: nephrin) בנסיוב ובקרה nephrotoxic מטופלים עכברים (NTN ד 18). בהשוואה פקדים, עכברים d NTN 18 להראות כמויות שוות של nephrin פני שטח התא (IP: α-nephrin, WB: streptavidin). NTN מטופלים עכברים בתצוגה יום 18 פחות nephrin הכולל, ומשמש אקטין פקד הטעינה. (ב) ניתוח densitometric הצגת אין הבדלים משמעותיים תא nephrin פני השטח בין הפקדים ועכברים d NTN 18 (לשלוט n = 4, NTN n = 3). (ג) Densitometric ניתוח nephrin הכולל כדי אקטין. בעכברים NTN ביום 18, יש פחות ביטוי של nephrin לעומת שולט (לשלוט n = 4, NTN n = 3, * * p < 0.001). (ד) אימונוהיסטוכימיה של p57 מציג podocytes שליטה ועכברים d NTN 18. ישנם תאים חיובית פחות p57 (אדום) בעכברים d NTN 18 לעומת שולט. Beads מגנטי מופיעות נקודות שחורות. (ה) ניתוח כמותי של תאים חיוביים p57 אניץ glomerular שטח (μm2) (* * * p < 0.0001, לשלוט n = 2, NTN n = 2, 40 glomeruli לכל העכבר לכמת). תספיג חלבון נתונים להראות אמצעי ± SD. Podocyte ספירות להראות ± באמצעים Statistical ב- SEM. ניתוח: אינטראקצית t-מבחן עם התיקון של וולש. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. דמות זו שונתה מן הפרסום הקודם20. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה הציג מאפשר בידוד מוצלחת של glomeruli לחקור glomerular RNA או החלבון. בנוסף, ניתן לבצע תרביות תאים glomerular הראשית glomeruli מבודד. אם ביוטין מוחל לפני glomerular בידוד, תיוג של חלבונים פני שטח התא glomerular יכולה להתבצע. בשיטה זו, אין ויוו glomerular תא הדם סחר יכול להילמד, כימות למחצה של חלבון שפע אפשרית. השלבים הקריטיים ביותר בהצלחה בדיקה שפע חלבונים פני שטח התא glomerular הם 1) פיתוח ידני מומחיות בניתוח העכבר במיוחד תעלות של אבי העורקים, 2) בועה ללא חיבור של מזרקים כדי למנוע אוויר אמבוליזציה של glomeruli, ו- 3) עובד בתנאים קר כקרח, ברגע זלוף עם PBSCM התחיל.

טכניקה זו, מומחיות ידנית בניתוח העכבר חיוני. תעלות של אבי העורקים הוא קריטי במיוחד, כמו ניתוח של כלי השיט תמנע זלוף של הכליות. החתך באבי העורקים וצריכה להיות מספיק גדולה (כ 50% מקוטר כלי) כדי ליצור מספיק מקום להציג את הקטטר. אם הצנתר הוא נחתך באלכסון, החדרת הקטטר לתוך העורקים יהיה קל יותר. בנוסף, את חיתוך הקטטר הציג יוצבו גבוה בתוך העורקים כדי לא לחסום את העורקים כליות. העורקים כליות אחרת לא ניתן perfused עם ביוטין וחרוזים מגנטי.

ביוטין הוא ויטמין קטנה המאגד עם זיקה גבוהה streptavidin חלבונים. בגלל גודלו הקטן (244 Da), ביוטין אינו משנה את תפקוד conjugated חלבונים, יעברו סינון דרך פקעית. על ידי דגירה עם streptavidin, biotinylated חלבונים יכולים בקלות ניתן להפריד חלבונים לא מתויגות מאת agarose חרוזים או בשיטות אחרות. N-hydroxysuccimide (NHS) אסטרים של ביוטין לאגד אמין (-NH2) קבוצות של חלבונים, המהווה בשפע על הצד שרשראות של שאריות ליזין, לדוגמה. Sulfo-NHS-LC-ביוטין הוא מים מסיסים ואטום תא-, אם קרום התא שלמים. Sulfo-NHS-LC-ביוטין הוכח תווית חלבונים פני שטח התא23. איגוד של ביוטין אסטרים NHS לקבוצות אמין הוא תלוי pH (7-9), השימוש במאגרים ללא אמין (קרי: PBSCM). PBSCM עם pH של 7.4 ולכן שימשה perfuse העכבר הכליות עם ביוטין, כפי שהיא משלבת מאפיינים פיזיולוגיים אידיאלי עם מסיסות אופטימלית, הפונקציה של ביוטין. כדי להרוות חלבונים אחרי תיוג, מבוצע זלוף של PBSCM עם גליצין, ומאפשר ביוטין חינם להיות מאוגדים לקבוצות אמין של גליצין. למניעת תהליכים תאיים לאחר מותו של בעל החיים, חשוב לבצע זלוף עם פתרון כקרח ולהמשיך לעבוד על קרח.

בדומה לשיטות biotinylation ' ex-vivo , הלחץ מכני של עיבוד glomeruli במהלך ויוו biotinylation פרוטוקולים מאי גם השפעה אנדוציטוזה, מהירה איתות האירועים ויושר RNA. לכן חיוני כי כל שלבי עיבוד מבוצעות על קרח כדי להפחית את הסיכון של פעילות תאית אנזימטיות.

מודלים בעלי חיים proteinuric כמו nephrotoxic סרום דלקת כליות (NTN) נזק העכבר הכליות באופן חמור. בפרט, NTN התוצאה mesangial הרחבה, טרשת נפוצה glomerular, נגעים צינורי, מוביל סיסטיק כליות בשלבים מתקדמים של המחלה (42 ימים)24. זלוף לקוי של sclerosed glomeruli במודלים של המחלה עלול להוביל מוטה תוצאות של חלבון שפע. Sclerosed glomeruli סביר לא ניתן perfused עם חרוזים מגנטי, ובכך עלול לא להיות מבודדים בשיטה זו. במודלים המחלה שמוביל טרשת glomerular חמורה, באמצעות טכניקות כדי לבודד glomeruli דרך השלבים ניפוי שונים עשויים להיות אלטרנטיבה לשיטת beads מגנטי זה פרוטוקול25. עם זאת, אם glomeruli קשות sclerosed, ייתכן זלוף אפילו עם ביוטין לקוי. בנוסף, שמחוץ biotinylation, שבה glomeruli המחולצים הם רחצו שמחוץ ביוטין פתרונות21, כנראה לא יהיה יתרון במודלים אלה. לחלופין, שימוש immunofluorescence כדי לזהות חלבונים שפע glomeruli חולה קשות עשוי להיות יתרון, כמו אין להסתמך על זלוף של glomeruli.

כימות למחצה של שפע חלבונים בעזרת טכניקה זו פועלת גם באמצעות densitometry. עם זאת, הבדלים קטנים בשפע חלבון יכול להישמט כתוצאה של מגבלת זיהוי של densitometry.

ניתן להעביר את הטכניקה המתוארת לאיברים אחרים בעלי חיים זה הם perfused, ובלבד המבנים עניין נגישים באמצעות טכניקות בידוד או החלבון משטח עניין היא ספציפית למבנה סוג או איברים תא אחד. למרות כל החלבונים משטח biotinylated באמצעות הטכניקה הזו, שימוש של נוגדנים ספציפיים עבור immunoprecipitation יוביל השבר של תא הדם ביטוי חלבון ספציפי (כפי שמוצג על nephrin ב איור 3ב).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים Duvnjak בלנקה על סיוע טכני יוצא דופן שלה. עבודה זו נתמכה על ידי פתוח (www.dfg.de) WO1811/2-1 כדי M.W. ו- QU280/3-1 על מנת משכל Funder היה לא תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח נתונים, ההחלטה לפרסם ולאחר ההכנה של כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Motic SMZ168 BL Motic SMZ168BL microscope for mouse surgery
KL1500LCD Pulch and Lorenz microscopy 150500 light for mouse surgery
Rompun (Xylazin) 2% Bayer PZN:01320422 anesthesia
Microfederschere Braun, Aesculap FD100R fine scissors, for cut into the aorta
Durotip Feine Scheren Braun, Aesculap BC210R for abdominal cut
Anatomische Pinzette Braun, Aesculap BD215R for surgery until the abdomen is opened
Präparierklemme Aesculap BJ008R for surgery 
Seraflex Serag Wiessner IC108000 silk thread
Ketamine 10% Medistar anesthesia
Rompun (Xylazin) 2% Bayer anesthesia
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm Portex 800/100/100 Catheter
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm Portex 800/100/200 Catheter
Harvard apparatus 11 Plus Harvard Apparatus 70-2209 syringe pump
EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin Thermo Scientific 21335 biotin
Dynabeads Untouched Mouse T-cells Invitrogen 11413D to embolize glomeruli
Collagenase A Roche 10103578001 to digest kidney tissue
DynaMag-2 Invitrogen 123.21D Magnet catcher
100µm cell stainer Greiner-bio 542000 for glomerular isolation
Axiovert 40 CFL Zeiss non available to confirm glomerular purity
TissueRuptor Quiagen 9002755 Tissue homogenizer
CHAPS Sigma-Aldrich C3023 for lysis buffer
Tris-HCL Sigma-Aldrich T5941 for lysis buffer
NaCl VWR chemicals 27810295 for lysis buffer
NaF Sigma-Aldrich 201154 for lysis buffer
EDTA Sigma-Aldrich E5134 for lysis buffer
ATP Sigma-Aldrich 34369-07-8 for lysis buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 Follow the manufacturer's instructions
nephrin antibody Progen GP-N2 for westernblot
Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody R&D Systems AF15556-SP for westernblot
Streptavidin Agarose Resin Thermo Scientific 20347 for immunoprecipitation
Protein A sepharose CL-4B GE Healthcare 17096303 for immunoprecipitation
polyclonal rabbit anti-p57 antibody SCBT sc-8298 for Immunohistochemistry
mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 Sigma-Aldrich A2228 Western blot loading control
rabbit anti-p44/42 cell signalling 4695 for westernblot
Pierce High sensitivity streptavidin-HRP Thermo Scientific 21130 for westernblot
polyclonal mouse ICAM-2 antibody R&D Systems AF774 for westernblot
polyclonal mouse anti-VE-cadherin R&D Systems AF1002 for westernblot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
  2. Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
  3. Quack, I., et al. beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).
  4. Quack, I., et al. PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia. Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).
  5. Swiatecka-Urban, A. Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm. Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).
  6. Swiatecka-Urban, A. Membrane trafficking in podocyte health and disease. Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).
  7. Soda, K., et al. Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes. The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).
  8. Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
  9. Martin, C. E., Jones, N. Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).
  10. Nielsen, J. S., McNagny, K. M. The role of podocalyxin in health and disease. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).
  11. Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).
  12. Tossidou, I., et al. Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis. Public Library of Science One. 5 (4), 10185 (2010).
  13. Qin, X. S., et al. Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).
  14. Waters, A. M., et al. Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).
  15. Zhang, X., Simons, M. Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).
  16. Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies. Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).
  17. Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
  18. Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
  19. Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).
  20. Haase, R., et al. A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease. Public Library of Science One. 12 (6), 0179217 (2017).
  21. Satoh, D., et al. aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).
  22. Tomas, N. M., et al. Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy. New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).
  23. Daniels, G. M., Amara, S. G. Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface. Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).
  24. Ougaard, M. K. E., et al. Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease. International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).
  25. Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals. Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).

Tags

ביוכימיה גיליון 143 biotinylation In vivo תיוג חלבון פני שטח התא glomeruli בידוד של glomeruli beads מגנטי אנדוציטוזה ויוו חלבון סחר
בידוד של Glomeruli, <em>In Vivo</em> תיוג של חלבונים פני שטח התא Glomerular
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Königshausen, E., Potthoff, S.… More

Königshausen, E., Potthoff, S. A., Haase, R., Meyer-Schwesinger, C., Kaufmann, E., Rump, L. C., Stegbauer, J., Sellin, L., Quack, I., Woznowski, M. Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58542, doi:10.3791/58542 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter