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Biochemistry

절연 Glomeruli와 비보에 사 세포 표면 단백질의 라벨

doi: 10.3791/58542 Published: January 18, 2019

Summary

여기 선물이 murine 비보에 biotin과 사 세포 표면 단백질의 라벨에 대 한 프로토콜. 이 프로토콜은 마우스 신장 perfuse glomeruli, 격리 하 고, 관심사의 단백질의 생 immunoprecipitation를 수행 하는 방법에 대 한 정보를 포함 합니다.

Abstract

Proteinuria fenestrated endothelium, 사 지하실 막 그리고 podocytes 그들의 슬릿 격 막으로 구성 된 사 필터의 붕괴에서 유래한 다. 사 필터, 특히 슬릿 격 막의 섬세 한 구조는 다양 한 세포 표면 단백질의 상호 작용에 의존합니다. 공부 하는이 세포 표면 단백질은 생체 외에서 연구 또는 조직학 분석을 제한 되었습니다 지금까지. 여기, 우리 murine vivo에서 biotinylation 라벨 생리 및 pathophysiologic 조건 사 세포 표면 단백질의 연구를 수 있는 방법 제시. 이 프로토콜은 마우스 신장 perfuse glomeruli, 격리 하 고, 관심사의 단백질의 생 immunoprecipitation를 수행 하는 방법에 대 한 정보를 포함 합니다. 사 셀 표면 풍부의 반 정량이 새로운 방법, 그리고 모든 단백질 biotin 관류에 액세스할 수와 함께 쉽게 사용할 수 이며 immunoprecipitation 공부 될 수 있다. 또한, 격리 또는 biotinylation 없이 glomeruli의 기본 사 세포 배양 (즉, 기본 podocyte 세포 배양) 뿐만 아니라 사 RNA와 단백질의 분석을 추가 있습니다.

Introduction

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Proteinuria 사 상해의 상징 이며 일반적으로 사 필터1의 장애를 동반 한다. 사 필터 fenestrated endothelium, 사 지하실 막, 및 podocytes 구성 됩니다. 사 필터의 섬세 한 분자 구조는 매우 역동적이 고 모두 건강 하 고 병에 걸린 신장2,3,,45,6에에서 거래 하는 세포 표면 단백질에 . 세포 표면 단백질 endocytosis podocytes7의 생존을 위해 필수적인 것으로 표시 되었습니다. Nephrin와 podocalyxin는 막 횡단 단백질 podocytes에 표현. Podocalyxin은 sialoglycoprotein podocytes8,,910의 보조 발 프로세스 코팅 Nephrin은 사 슬릿 격 막의 중추 이다. Endocytic 매매 이전 표시 되었습니다 nephrin와 podocalyxin3,11,12,,1314에 대 한.

우리의 지식의 베스트에 세포 표면 단백질 endocytosis 하지 아직 설명 하고있다 문학에서 사 내 피 세포에. 그러나, 내 피 세포는 일반적 endocytosis (즉, clathrin 종속, 뗏목 종속 endocytosis)15,16의 다른 종류에 대 한 모든 필요한 단백질을 표현 한다. 따라서, 내 피 세포 표면 매매 수로 공부 될이 메서드를 사용 하 여, 예를 들어 혈관 내 피 (VE)-cadherin 및 세포내 접착 분자 (ICAM-2) 셀으로 표면 사 내 피 세포17 마커 단백질 .

불행히도, 아니 정확 하 게 체 외에서 모델 필터에 대 한 섬세 한 3 계층화 사 어느 셀에 표면 단백질 매매 공부 될 수 있다 이다. 이 방법의 목표는 이렇게 사 단백질 밀매 vivo에서공부 하. 또한,이 프로토콜 glomeruli, 추가 분석 사 RNA, 단백질, 세포의 활성화를 격리 하는 방법에 대 한 정보를 포함 합니다. 유사한 사 격리 기법으로 다른 설명 되었습니다18,19그룹화 합니다.

이전에 우리와 다른 비보 전 사 세포 표면 단백질의 biotinylation2,,34,,2021에 의해 라벨 사용 했습니다. 그러나,이 비보 전 방법, 격리 glomeruli endocytic 인신 매매에 영향을 미칠 수 있습니다 기계적 스트레스에 노출 되었다. 또는, 사 세포 표면 단백질의 면역 형광 라벨은 광범위 하 게 사용 되었습니다 문학2,20,22에. 그러나이 방법으로 단백질 수가 적은 하나의 슬라이드 내에서 분석 될 수 있다, 그리고 면역 형광 이미지의 정량은 종종 어려운.

사 세포 표면 단백질 풍부 하 고 매매 정확 하 게에 건강 하 고 병에 걸린 신장, 공부를 신뢰할 수 있는 도구를 제공 하는이 소설은 vivo에서 방법 그리고 면역 형광 시험에 추가로 사용할 수 있습니다.

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Protocol

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마우스는 프랑스에서 1 월 실험실 또는 현지 동물 보호 시설에서 자체 품종으로 획득 했다. 조사 관리 및 실험 동물 사용 (미국 국립 연구소의 건강 게시 번호 85-23, 개정 1996)에 대 한 가이드에 설명 된 지침에 따라 실시 했다. 모든 동물 실험 관련 기관 승인에 따라 수행 했다 (주 정부 LANUV 참조 번호 AZ:84-02.04. 2016.A435)입니다.

1. 악기, 솔루션, 및 장비 준비

  1. 1mm 염화 마그네슘 (MgCl2)과 0.1 m m 칼슘 염화 물 (CaCl2) 보충 버퍼링 인산 염 분의 1 L를 준비 (PBSCM) 하 고 살 균 필터를 통해 필터링.
  2. 관류에 대 한 마우스 당 살 균 PBSCM의 5 mL을 준비 하 고 얼음에 그것을 배치.
  3. 각 마우스에 대 한 살 균 PBSCM 0.5 mg/mL 비오 틴 보충의 5 mL을 준비 합니다.
  4. 각 마우스에 대 한 살 균 PBSCM의 5 mL을 준비 하 고 108 자석 구슬 x 0.8을 추가 (. 200, 전처리 없이 4 × 108 구슬/mL 해결책의 µ L)는 glomeruli의 색전술에 대 한. 원래 관 살 균 자석 구슬을 유지 하기 위해 셀 문화 벤치에서이 솔루션을 준비 합니다. 얼음에이 솔루션을 배치 합니다.
  5. PBSCM (5 mL 당 마우스)를 100 mM 글리신을 추가 하 여 냉각 솔루션을 준비 하 고 얼음에 그것을 유지.
  6. 콜라 솔루션 (0.378 U/mL 콜라 A 메 마른 PBSCM에) 확인 합니다. 마우스, 당 2 mL 튜브에 콜라 솔루션의 1 mL를 플라스틱 하 고 얼음에 그것을 놓습니다.
  7. 세척, 살 균 PBSCM 준비 (단계 1.1 참조) 50 ml에서 튜브를 얼음에.
  8. 관류, 2.0 mL/min의 흐름으로는 주사기 펌프를 사용 합니다.
  9. 21g 바늘으로 10 mL 주사기를 준비 합니다. 20-30 센티미터 긴 카 테 테 르 바늘의 팁 장소 (내경, ID = 0.58 m m). 카 테 터 연결 (0.58 m m ID) 10cm 짧은 카 테 테 르와 (0.28 m m ID) 마우스 대동맥에 쉽게 삽입에 대 한 간접 작은 카 테 터의 끝을 잘라.
  10. 수술 동안에 합자 절차, 잘라 마우스 당 3 5-7 cm 실크 스레드 (6-0 4-0).
  11. 수술, 3 수술 클램프, 2 수술가 위, 핀셋 2, 2 고급 핀셋, 1 좋은 위, 및 면봉을 준비 합니다. 마 취 (예: 복 마 취 마 취 제 100 mg/kg bodyweight 및 xylazine 5 mg/kg 체중)을 준비 합니다.
  12. 두 개의 신장 glomeruli의 격리, 100 µ m 셀 스 트레이너, 2 개의 50 ml 튜브, 그리고 자석 포 수를 사용 하 여.
  13. 세포의 용 해 버퍼 챕 준비: 20 m m 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate (챕); 20 mM Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) pH 7.5; 50 m m sodiumchorlide (NaCl); 50 m m sodiumfluoride (NaF); 15 m m 나4P2O7; 0.1 m m Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) pH 8.0; 2 mM sodiumorthovanadate; 그리고 2 m m adenosinetriphosphat (ATP)입니다.
  14. 4 ° c.에 멋진 원심 분리기

2입니다. 수술 현미경

  1. Anesthetize는 마우스 (예를 들어, 케 타 민/xylazine와 intraperitoneally, 단계 참조 1.11). 발가락-핀치 테스트 확인 하는 적절 한 마 취를 수행.
  2. 70% 소 프로 파 놀과 마우스의 복 부 측을 치료.
  3. 흉 골을 골반에서 피부를 통해 중간 컷을 수행 하 고 핀셋을 사용 하 여 복 부 근 막에서 피부를 제거 합니다. 수술가 위로 복 부 중간 양쪽에는 피부를 잘라.
  4. 수술 도구를 변경 합니다. 복 부 근육 층을 통해 방광에 칼에서 중간 컷을 적용 하 고 핀셋과 수술가 위를 사용 하 여 4 개의 사분면으로 나눕니다. 마우스의 목 쪽으로 2 개의 외과 클램프와 클램프 상단 두 옆으로 첨부 합니다.
    참고: 복 지금 열립니다.
  5. 따로 멸 균 면봉으로 내장 기관 넣고 잘가 위 키 모 인할지 인 대를 잘라.
  6. 2 개의 정밀한 핀셋으로 부 신 샘의 높이에 신장 동맥의 근 위 대동맥 주위 (실크 스레드 4-0 6-0)와 함께 결 찰을 준비 합니다. 핀셋으로 혈액 흐름을 폐지 하 고 인접 대동맥 결 찰을 조입니다.
  7. 근 막, 지방, 그리고 다른 조직에서 원심 대동맥 및 미세 수술 핀셋을 사용 하 여 신장 동맥의 두개골 키 모/mesenteric 동맥 주위 결 찰을 준비 합니다.
  8. 결 찰 (실크 스레드 4-0 6-0)와 원심 대동맥 주위 신장 동맥의를 준비 하 고 분기의 높이에서 베 나 정 맥과 대동맥을 클램프.
  9. 작은 구멍으로 잘라 대동맥 원심 신장 동맥에 구멍은 대동맥의 절반 직경. 대동맥으로 카 테 터를 넣고 준비 된 합자와 그것을 해결.
    주의: 공기 색 전 증을 방지 하기 위해 관류 시스템에서 거품을 피하십시오.
  10. 2 mL/min의 유량에 얼음 처럼 차가운 PBSCM로 재 관류를 시작 합니다.
  11. 미세 수술가 위 신장 동맥의 수준에서 신장 혈관에 구멍을 삭감 하 고 간장 및 mesenteric 동맥 주위 결 찰 조입니다.
    참고: 신장 한다 돌 창백한는 관류를 시작 후.

3. Vivo에서 Biotinylation

  1. 변경 차가운 PBSCM를 거품 없는 주사기 0.5 mg/mL biotin 라벨, 표면에 대 한 보충 하 고 신장 2 mL/min의 유량에 5 mL와 함께 perfuse.
    참고: 혼합 PBSCM 솔루션 (예를 들어, 50 mL 튜브 여) 솔루션 내에 거품 형성 방지를 부드럽게. 주사기 내 솔루션의 포부, 후 주사기에서 어떤 거품 또는 공기를 철수. 주사기에 여분의 정 (21 G)를 사용 하 여 정 맥 카 테 터 시스템에 연결 된에서 공간을 채우기 위해. 마지막으로, 거품 없이 카 테 터와 정 맥에 주사기를 스틱.
  2. 거품 없는 주사기는 glomeruli 담금질 2 mL/min의 흐름에 5 mL와 함께 perfuse를 100 mM 글리신 보충 차가운 PBSCM 변경 합니다.
  3. 변경 차가운 PBSCM를 거품 없는 주사기 200 μ 자석 구슬/mL으로 보충 하 고 신장 2 mL/min에서 perfuse.
    참고: 신장 표면에 갈색 자석 구슬 glomeruli의 색전술 표시 됩니다.

4입니다. 두 개의 신장에서 Glomeruli의 격리

  1. 신장은 hilum에서 제거 하 고 캡슐을 제거. 10 cm 세포 배양 접시에 PBSCM의 15 mL에 얼음에 신장을 놓습니다. 신장 수확 후 마 취에서 자 궁 경부 전위와 마우스 안락사 수술 및 관류 절차 마지막 약 20 ~ 22 분.
  2. 신장으로 잘라 작은 조각 가능한 새로운 더블 가장자리 칼 날. 콜라 A의 1 mL 2 mL 튜브에 조직 이동 (단계 1.6 참조) 및 30 분 동안 37 ° C에서 다이제스트. 전후 소화, 피 펫 컷 1000 μ와 부드럽게 섞는다.
  3. 얼음 처럼 차가운 PBSCM를 사용 하 여 100 μ 셀 스 트레이너를 통해 소화 조직 린스. 부드럽게 셀-스 크레이 퍼를 사용 하 여 나머지 조직 구 유 셀 스 트레이너를 말하다 고 차가운 PBSCM 50 mL의 총 볼륨에 나중에 그것을 씻어.
  4. 5 분 제거는 상쾌한 고 resuspend vortexing 펠 릿 하면서 차가운 PBSCM의 약간 미만의 1.5 mL와 펠 릿 4 ° C 500 x g에서 현 탁 액을 원심. 나중에, 새로운 2 mL 튜브에 사 현 탁 액을 넣어.

5입니다. 세척

  1. 자석 포 수를 사용 하 여 한쪽에는 glomeruli를 당겨. glomeruli 자석 쪽으로 이동 하기 전에 1 분을 기다립니다.
  2. 2 mL 튜브 자석 포 수에 남아 있는 동안 1000 μ 피 펫과 상쾌한을 제거 합니다. 첫 번째 및 두 번째 세척 중 단계 (단계 5.3 참조), 250 μ glomeruli의 손실을 방지 하기 위해 튜브 표면에 뜨는 남아의. 관 구조는 튜브의 바닥에 침 몰 시키는 피하기 위해 신속 하 게이 프로시저를 수행 합니다.
    참고: 세척 절차 오래 지속 됩니다 그렇지 않으면.
  3. 자석 포 수에서 2 mL 튜브를 제거 하 고 PBSCM, (매우 중요), 그 아래로 피 펫의 1 mL을 추가 소용돌이.
  4. 자석 포 수 튜브를 다시 넣어 고 5.2 단계부터 다시 시작.
  5. 세척 단계를 반복 하 여 glomeruli 순도 90%에 도달 했습니다. 이 위해, 현미경 (40-100 X) 상쾌한의 대표적인 약 수를 검사 합니다.
    참고: Glomeruli 갈색 자석 구슬을 포함 하는 둥근 구조로 표시 됩니다. 길쭉한 구조는 관 조각, 그리고 무료 자석 구슬 갈색 둥근 점으로 표시. 셀 파편은 부피가 큰 구조로 나타날 수 있습니다.
  6. 순수성에 도달 하면 glomeruli PBSCM의 1 mL에 용 해 하 여 glomeruli의 수를 견적 한다. 혼합 후, 10 μ의 약 수 고 현미경 glomeruli 계산. 다음 방정식으로 glomeruli의 수를 계산: glomeruli의 최종 번호 = 10 μ aliquot x 100에에서 glomeruli의 수.
  7. Glomeruli의 성공적인 절연 리드 10000-40000 glomeruli의 범위.

6. 단백질 추출 및 Immunoprecipitation (IP)

  1. 6800 x g 5 분에서 4 ° C에서 원심 분리 하 여 수집 glomeruli 자석 포 수를 사용 하는 동안은 상쾌한을 제거 하 고 얼음 세포의 용 해 버퍼에 펠 릿을 resuspend (., 300 μ; 30000 glomeruli 챕, 단계 1.11 참조). 30에 대 한 최고 속도로 조직 균질 화기와 샘플을 균질 s와 30 분 동안 얼음에 그들을 lyse.
  2. 15000 x g 30 분 4 ° c에서 원심 분리 하 여 불용 성 물질을 제거 새로운 1.5 mL 튜브에 lysate 셀을 포함 하는 상쾌한 플라스틱 펠 릿을 삭제 합니다.
  3. Bicinchoninic (BCA)를 사용 하 여는 상쾌한의 단백질 농도 측정-제조업체의 지침에 따라 방법을 기반으로. 30000 glomeruli의 성공적인 세포 사 단백질 양의 700-1000 µ g/mL를 생성합니다. 세포의 용 해 버퍼와 동일한 단백질 양을 조정 합니다.
  4. 10%에 대 한 전체 볼륨의 약 수를 사가지고 lysate Laemmli + 5 분 동안 부 화 하기 전에 dithiothreithol (DTT) x 2 95 ° c.에 추가
  5. IP, 오버 헤드 통에 4 ° C에서 하룻밤 streptavidin agarose 구슬 lysate의 나머지를 품 어.
  6. Agarose 구슬 4 ° C에서 3 분 1000 x g에서 원심, 상쾌한, 제거 하 고 씻어 난다 단백질 바인딩 위한 구슬 세포의 용 해 버퍼의 800 μ를 추가.
  7. 반복 세척 3 번 하 고는 상쾌한을 완전히 제거.
  8. 2x Laemmli + DTT의 30 μ를 추가 하 고 5 분 동안 95 ° C에 품 어.
  9. Lysate를 로드 하 고 10 %SDS IP 프로브 젤 70 V 30 분, 다음 20에 SDS 젤을 실행 1.5 헤 대 한 젤 당 mA 나중에, 오 점 200에서 2 h 젤 니트로 멤브레인에 mA.
  10. 버퍼를 세척에 니트로 막 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 4 ° C에서 하룻밤을 차단 합니다.
  11. 4 ° c.에서 하룻밤의 항 체를 막 품 어 세척 통에 5 분 동안 3 번 버퍼와 세척 하 고 실 온에서 1 h HRP 태그 이차 항 체를 막 품 어. 세척 단계를 반복 합니다.
  12. lysate 시각화 및 CCD 카메라와 슈퍼 해상도 chemiluminescent 에이전트를 사용 하 여 막에 조사 하는 immunoprecipitation 있습니다.

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Representative Results

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격리 glomeruli 정확 하 게, 먼저 murine 신장 PBSCM와 perfuse 필요가 있다. PBSCM와 관류 신장 창백 (그림 1A) 나타났다. 마그네틱 구슬 glomeruli의 색전술 신장 표면 (그림 1B)에 갈색 점 들으로 표시 됩니다. 자석 포 수와 glomeruli의 절연 오염 신장 tubuli (그림 1C)으로 표시할 수 있습니다. 추가 분석 glomeruli, 전에 glomeruli의 > 95% 순도 glomeruli를 더 철저 하 게 세척 하 여 달성 될 필요가 (그림 1D).

Vivo에서 biotinylation 셀 biotin과 표면 단백질을 능력에 의존 합니다. 이 공부, murine 신장은 PBSCM 또는 비 세포 막 투과성 biotin 끼얹는다. 그림 2에서처럼 biotin 라벨 모 세관 루프 제어 마우스 신장에만 biotin 끼얹는다. 세포 표면 단백질 glomerulus biotin 관류 비보에 의해 표시 된의 조사, immunoprecipitation 사 추출의 biotin 분수의 수행 됩니다. 그림 3 A 사 막 횡단 단백질 nephrin 및 podocalyxin immunoprecipitated biotin 분수 내는 방법을 보여 줍니다. 그러나, 통제 쥐에 있는 아무 nephrin 또는 podocalyxin biotinylated 단백질의 immunoprecipitated 분수에서 감지 됩니다. 네거티브 컨트롤로 세포내 단백질 extracellular 신호 통제 kinases p42, p44 (ERK) 제어 및 biotin 끼얹는다 마우스 신장 biotinylated 단백질의 immunoprecipitated 분수에서 찾을 수 없습니다. 이 방법으로 세포 표면 단백질 nephrin 실제로 biotinylated 인지를 확인 하려면 nephrin 제어 및 biotin 끼얹는다 마우스 신장에서 시 켰 던. Biotin를 시각화 하려면 immunoprecipitated 분수는 streptavidin과 얼룩이 진다. 그림 3 B biotin 끼얹는다 biotinylated nephrin 보여줍니다 하지만 동물을 제어 하지. Lysate 컨트롤 제어 및 biotin 끼얹는다 동물에서 단백질의 동일한 금액을 나타냅니다. 내 피 단백질 혈관 내 피 (VE)-cadherin biotin 분수 내 immunoprecipitated은 그림 3C. 컨트롤 마우스, 아니 VE cadherin 침전 VE cadherin lysates의 제어 및 biotin 끼얹는다 동물에 존재 하는 동안. 세포내 접착 분자 (ICAM-2) 2 biotin 끼얹는다 동물에서 침전 하 고 아무 ICAM-2 제어 동물에서 발견 된다. 제어 및 biotin 끼얹는다 동물 Lysates 동일한 양의 ICAM-2 (그림 3C) 표시합니다. 말라 로드 컨트롤로 제공 됩니다.

신 장병 (예를 들어, nephrotoxic 신장 염, NTN)의 모델에 사 세포 표면 단백질의 양을 계량 하이 메서드를 사용할 수 있습니다. NTN [NTN 혈 청 주사 후 하루 1 (1 d)]의 초기 단계, proteinuria 급속 하 게 증가합니다. NTN [하루 18 (18 d)]의 나중 단계에서 proteinuria 크게 감소합니다. 그림 4 는 초기 NTN (1 d)에 nephrin 셀 표면 풍부를 보여준다. 비보에 biotinylation 분석 결과(그림 4)컨트롤에 비해 NTN 동물 세포 표면 nephrin의 감소를 보여줍니다. Densitometric 분석 NTN 동물 컨트롤 (그림 4C)에 비해 biotinylated nephrin (57%)의 뜻깊은 감소를 보여줍니다. 걸을 총 nephrin의 정량 분석 보여준다 컨트롤과 NTN 마우스 (그림 4B) 사이 상당한 차이가. p57 podocyte 셀 특정 얼룩을 사용 하 여, podocyte 번호 NTN 및 제어 동물 (그림 4D 4E)에 동일한 금액을 표시 합니다. 그림 5 늦은 NTN (18 d) nephrin 셀 표면 풍요로 움의 결과 표시합니다. 그림 5 A 제어 및 NTN 쥐 세포 표면 nephrin의 복구를 나타내는 비보에 biotinylation 분석 결과 보여줍니다. Densitometric 분석 제어 및 NTN 마우스 (그림 5B)의 세포 표면 nephrin의 상당한 차이가 표시 됩니다. 총 nephrin NTN 마우스 (그림 5C)에서 25%로 감소 되었다. Podocyte 숫자는 약 19% (그림 5D 5E)에 의해 컨트롤에 비해 NTN 생쥐에서 감소 했다.

Figure 1
그림 1 : 신장 관류의 및 절연 glomeruli. PBSCM와 관류 후 murine 사이트에 현미경을 통해 (A) 보기. 카 테 터 대동맥에 화살표와 함께 표시 됩니다. PBSCM와 관류 신장 창백한 차례에 리드. (B) 자석 구슬 glomeruli 색전술 신장 표면에 갈색 점 들으로 표시 됩니다. (C) 볼 비록 내가 보여주는 현미경) glomeruli 구조 라운드 (갈색);의 오염 ii)와 tubuli (가벼운 길쭉한 구조); 그리고 iii) 파편 세포. 순도 glomeruli의 대략 50% 이다입니다. 무료 자기 비즈 갈색 점 (100 X 배율)으로 표시 됩니다. (D) glomeruli (100 X 배율)의 95% 순도 보여주는 현미경을 통해 볼. 바 규모 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 사 모 세관 루프에서 감지 Biotin. 대표적인 면역 형광 영상 glomeruli 마우스 (C57BL/6) PBSCM (제어)와 비오 틴 (biotin) 끼얹는다. (녹색) biotin streptavidin biotin 끼얹는다 마우스에만 사 모 세관 루프에 의해 시각 이다. 컨트롤 마우스 사 biotin 얼룩이 표시 되지 않습니다. (빨간색) WT1 podocytes 두 쥐에서의 핵에서 감지 됩니다. 이 그림은 이전 게시20에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: vivo에서 biotin 사 세포 표면 단백질의 라벨. (A) 서쪽 오 점 immunoprecipitated (IP) biotinylated 세포 표면 단백질의 분석 (IP: streptavidin agarose 구슬)와 PBSCM 끼얹는다 (제어) 및 biotin 끼얹는다 (biotin) 쥐에서 신장의 lysates (lysate). 막 횡단 단백질 nephrin 및 podocalyxin immunoprecipitated 샘플 biotin 끼얹는다 마우스 신장에에서만 검색 됩니다. 컨트롤 마우스에서 nephrin 및 podocalyxin 검색 되지 않습니다 제어 마우스 신장의 immunoprecipitated 프로브에. 제어 및 biotin 끼얹는다 동물 lysates, 총 nephrin 및 podocalyxin 표현 됩니다 동등 하 게 두 그룹에서. 세포내 단백질 extracellular 신호 통제 kinases p42, p44 (ERK) immunoprecipitated 프로브 제어 및 biotin 끼얹는다 마우스 신장에서에서 검색 되지 않습니다. 두 마우스 그룹의 lysates ERK 동일 금액의 감지 됩니다. 말라는 로드 제어로 물 들 다. (B) 서쪽 오 점 분석 immunoprecipitated nephrin (IP: α-nephrin) 끼얹는다 비오 틴 (biotin) 쥐와 PBSCM 끼얹는다 (제어). Biotin 끼얹는다 신장에 nephrin nephrin에 대 한 감지 되지 않습니다 통제 쥐에 있는 발견은 동안 streptavidin 얼룩과 시각 이다. Immunoprecipitated 분수 nephrin (IP: α-nephrin, WB: nephrin) lysate 분수 뿐만 아니라 (lysate, WB: nephrin) nephrin 쇼 동등한 양의 nephrin 스테인드. 말라 로드 컨트롤로 사용 됩니다. Immunoprecipitated biotinylated 세포 표면 단백질의 (C) 서쪽 오 점 분석 (IP: streptavidin agarose 구슬)와 PBSCM 끼얹는다 (제어)를 끼얹는다 비오 틴 (biotin) 마우스 (lysate) 신장의 lysates. 막 횡단 마커 단백질 혈관 내 피 (VE)-cadherin 및 세포내 접착 분자 (ICAM-2) 2만 biotin 끼얹는다 동물의 immunoprecipitated 부분에 검색. 컨트롤 마우스에서 VE cadherin 또는 ICAM-2 검색 됩니다. 말라 로드 컨트롤 역할을 합니다. 이 그림은 이전 게시20에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 초기 nephrotoxic 신장 염 신 장병 (NTN)에 사 단백질 nephrin 풍부. (A) 서쪽 오 점 분석의 표면 nephrin (IP: α-nephrin, WB: streptavidin) 및 총 nephrin (IP: α-nephrin 또는 lysate, WB: nephrin) 제어 및 nephrotoxic 혈 청 치료 쥐 (NTN 1 d). 말라 로드 컨트롤 역할을 합니다. 컨트롤, NTN에 비해 치료 쥐 세포 표면 nephrin 감소 표시 (IP: α-nephrin, WB streptavidin) 컨트롤에 비해. (정량 분석 B)와 NTN 1 d 마우스 제어 총 nephrin/말라 [제어 n = 4, NTN n = 6, 비-중요 한 차이 (ns)]. NTN 마우스와 제어 셀 표면 nephrin (biotinylated nephrin/총 nephrin)의 (C) Densitometric 분석 (* p < 0.01, 제어 n = 4, NTN n = 6). (D) Immunohistochemistry p57의 제어 및 NTN 1 d 마우스에 podocytes 보여주는. (E) 술 지역 (μ m2) 당 p57 긍정적인 세포의 정량 분석. (마우스 당 40 glomeruli 정량, ns). 서쪽 오 점 데이터 표시 수단 ± sd. Podocyte 카운트 표시 수단 ± SEM. Unpaired t-웰 치의 교정 테스트. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림은 이전 게시20에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : 늦은 nephrotoxic 신장 염 신 장병 (NTN)에 사 단백질 nephrin 풍부. (A) 서쪽 오 점 분석의 표면 nephrin (IP: α-nephrin, WB: streptavidin) 및 총 nephrin (IP: α-nephrin 또는 lysate, WB: nephrin) 제어 및 nephrotoxic 혈 청 치료 쥐 (NTN 18 d). 컨트롤에 비해 NTN 18 d 마우스 동등한 양의 세포 표면 nephrin 표시 (IP: α-nephrin, WB: streptavidin). NTN 치료 하루 18 디스플레이에 쥐 덜 총 nephrin 및 말라 로드 컨트롤 역할. (B) densitometric 분석 컨트롤과 NTN 18 d 마우스 사이 셀 표면 nephrin에 큰 차이가 표시 (제어 n = 4, NTN n = 3). (C) Densitometric 걸을 총 nephrin의 분석. 하루 18 NTN 마우스에서는 nephrin 컨트롤에 비해 덜 표현 (제어 n = 4, NTN n = 3, * * p < 0.001). (D) Immunohistochemistry p57의 제어 및 NTN 18 d 마우스에 podocytes 보여주는. (빨간색) NTN 18 d 마우스 컨트롤에 비해 덜 p57 긍정적인 세포 있다. 마그네틱 구슬 검은 점으로 표시 됩니다. (E) 사 술 지역 (μ m2) 당 p57 긍정적인 세포의 정량 분석 (* * * p < 0.0001, 제어 n = 2, NTN n = 2, 계량 마우스 당 40 glomeruli). 서쪽 오 점 데이터 표시 수단 ± sd. Podocyte 카운트 표시 수단 ± SEM. 통계 분석: t홀-웰 치의 교정 테스트. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림은 이전 게시20에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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제시 방법 glomeruli 조사 사 RNA 또는 단백질의 성공적인 격리 수 있습니다. 또한, 기본 사 셀 문화 격리 glomeruli에서 수행할 수 있습니다. Biotin 사 격리 하기 전에 적용 되는 경우 사 세포 표면 단백질의 라벨을 수행할 수 있습니다. 이 방법으로, vivo에서 사 세포 표면 단백질 매매 공부 될 수 있다, 그리고 단백질 풍부의 반 정량 가능 합니다. 사 세포 표면 단백질 풍부를 성공적으로 테스트를 위한 가장 중요 한 단계 1는) 마우스 수술 대동맥의 특히 cannulation 수동 전문성 개발, 2) 거품 없는 주사기의 연결의 공기 색전술을 피하기 위하여는 glomeruli, 및 3) 차가운 조건에서 일 하는 관류 PBSCM 함께 시작 했다.

이 기술에 대 한 수동 전문 마우스 수술에 필수적 이다. 대동맥의 cannulation은 특히 중요 한 혈관의 해 부는 신장 관류를 방지할 것 이다. 대동맥에서 컷 충분히 커야 한다 (혈관 직경의 약 50%) 테 소개에 충분 한 공간을 만들. 카 테 터를 대각선으로 잘라 경우 대동맥으로 카 테 터의 소개는 쉬울 것 이다. 해 부, 뿐만 아니라 소개 테 두어야 한다 대동맥 내에서 높은 신장 동맥을 저지 하지 위해. 신장 동맥 것 이다 그렇지 않으면 안 될 끼얹는다 biotin과 자석 구슬.

비타민 b 복합체는 streptavidin 단백질에 높은 선호도 작은 비타민. 그것의 작은 크기 (244 다), 때문에 biotin conjugated 단백질의 기능을 변경 하지 않습니다 그리고는 glomerulus 통해 필터링 됩니다. Streptavidin 가진 외피에 의해 biotinylated 단백질 쉽게 분리 수 있습니다 태그 단백질에서 agarose 구슬 또는 기타의 방법으로. 아민 바인딩할 biotin의 N-hydroxysuccimide (NHS) 에스테 르 (-NH2)는 리 진 잔류물의 측면 사슬에 풍부한 예를 들면 단백질의 그룹. Sulfo NHS LC-비오 틴 물 가용성과 세포-불 침투성, 세포 막 손상 경우입니다. Sulfo NHS LC-비오 틴은 세포 표면 단백질23을 보였다. Biotin NHS 에스테 르 아민 그룹의 바인딩 pH (7-9) 및 아민 프리 버퍼 (즉, PBSCM)의 사용에 따라 달라 집니다. 이상적인 생리 적 속성으로 최적의 가용성 및 결합 비오 틴의 기능으로는 ph 7.4의 PBSCM 따라서 biotin와 마우스 신장 perfuse에 사용 되었다. 라벨링 후 단백질을 끄다, 글리신과 PBSCM의 관류 무료 biotin 글리신의 아민 그룹에 바인딩 될 수 있도록 수행 됩니다. 세포질 과정을 방지 하기 위해 동물의 죽음 후에, 그것은 관류 얼음 솔루션을 수행 하 고 얼음에 작업을 계속 하는 것이 중요.

Biotinylation 방법을 ex vivo와 마찬가지로, vivo에서 biotinylation 동안 glomeruli 처리의 기계적 스트레스 프로토콜 5 월 또한 영향 endocytosis, 빠른 신호 이벤트, RNA 무결성. 그러므로 모든 처리 단계 효소 세포 활동의 위험을 줄이기 위해 얼음에 수행 됩니다 필수적 이다.

Proteinuric 동물 모델 nephrotoxic 혈 청 신장 염 (NTN) 손상 마우스 신장 심각 처럼. 특히, NTN 결과 mesangial 확장, 사 경화 증, 관 병 변, 질병 (42 일)24의 고급 단계에서 신장 섬유 증에 지도. 질병 모델에서 sclerosed glomeruli의 장애인된 관류 단백질 풍부의 한쪽으로 치우친된 결과 발생할 수 있습니다. Sclerosed glomeruli 하지 자석 구슬 끼얹는다 될 가능성이 것입니다 하 고 따라서 수 있습니다 하지 될 고립 된이 방법. 심각한 사 경화 증으로 이어지는 질병 모델에서 다른 체질 하 단계를 통해 glomeruli 분리 기술을 사용 하 여이 프로토콜25에 사용 된 자석 구슬 방법 대신 있을 수 있습니다. 그러나, glomeruli 심각 sclerosed 경우, biotin과 심지어 관류 장애가 있을 수 있습니다. 또한, 비보 전 biotinylation, 추출된 glomeruli 목욕 비보 전 biotin 솔루션21일에 아마이 모델에 유리한 것입니다. 또는, 심각 하 게 병 glomeruli 단백질 풍부 수 유리, glomeruli의 관류에 의존 하지 않는 감지 면역 형광의 사용.

이 기술을 사용 하 여 단백질 풍부의 반 정량 densitometry를 사용 하 여 잘 작동 합니다. 그러나, 단백질 풍부 하 게에서 작은 차이 densitometry의 검출 한계의 결과적으로 놓칠 수 있습니다.

설명된 기법, 관심의 구조 격리 기술에 의해 액세스할 수 있습니다 이나 관심의 표면 단백질은 특정 한 세포 유형 또는 기관 구조에 끼얹는다는 다른 동물 장기로 옮겨질 수 있다. 비록 모든 표면 단백질이이 기술에 의해 biotinylated, immunoprecipitation에 대 한 특정 항 체를 사용 하 여 이어질 것입니다 특정 단백질의 세포 표면 단백질 식의 일부분 ( 그림 3Bnephrin 대와 같이).

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

저자는 그녀의 뛰어난 기술 지원 시 Duvnjak를 감사합니다. 이 작품 가운데 도이치 (www.dfg.de) WO1811/2-1 M.W. 및 QU280/3-1 지능에 의해 지원 되었다 Funder 연구 설계, 데이터 수집, 데이터 분석, 게시, 결정 및 원고 준비에 전혀 역할을 했다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Motic SMZ168 BL Motic SMZ168BL microscope for mouse surgery
KL1500LCD Pulch and Lorenz microscopy 150500 light for mouse surgery
Rompun (Xylazin) 2% Bayer PZN:01320422 anesthesia
Microfederschere Braun, Aesculap FD100R fine scissors, for cut into the aorta
Durotip Feine Scheren Braun, Aesculap BC210R for abdominal cut
Anatomische Pinzette Braun, Aesculap BD215R for surgery until the abdomen is opened
Präparierklemme Aesculap BJ008R for surgery 
Seraflex Serag Wiessner IC108000 silk thread
Ketamine 10% Medistar anesthesia
Rompun (Xylazin) 2% Bayer anesthesia
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm Portex 800/100/100 Catheter
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm Portex 800/100/200 Catheter
Harvard apparatus 11 Plus Harvard Apparatus 70-2209 syringe pump
EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin Thermo Scientific 21335 biotin
Dynabeads Untouched Mouse T-cells Invitrogen 11413D to embolize glomeruli
Collagenase A Roche 10103578001 to digest kidney tissue
DynaMag-2 Invitrogen 123.21D Magnet catcher
100µm cell stainer Greiner-bio 542000 for glomerular isolation
Axiovert 40 CFL Zeiss non available to confirm glomerular purity
TissueRuptor Quiagen 9002755 Tissue homogenizer
CHAPS Sigma-Aldrich C3023 for lysis buffer
Tris-HCL Sigma-Aldrich T5941 for lysis buffer
NaCl VWR chemicals 27810295 for lysis buffer
NaF Sigma-Aldrich 201154 for lysis buffer
EDTA Sigma-Aldrich E5134 for lysis buffer
ATP Sigma-Aldrich 34369-07-8 for lysis buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 Follow the manufacturer's instructions
nephrin antibody Progen GP-N2 for westernblot
Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody R&D Systems AF15556-SP for westernblot
Streptavidin Agarose Resin Thermo Scientific 20347 for immunoprecipitation
Protein A sepharose CL-4B GE Healthcare 17096303 for immunoprecipitation
polyclonal rabbit anti-p57 antibody SCBT sc-8298 for Immunohistochemistry
mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 Sigma-Aldrich A2228 Western blot loading control
rabbit anti-p44/42 cell signalling 4695 for westernblot
Pierce High sensitivity streptavidin-HRP Thermo Scientific 21130 for westernblot
polyclonal mouse ICAM-2 antibody R&D Systems AF774 for westernblot
polyclonal mouse anti-VE-cadherin R&D Systems AF1002 for westernblot

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References

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절연 Glomeruli와 <em>비보에</em> 사 세포 표면 단백질의 라벨
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Königshausen, E., Potthoff, S. A., Haase, R., Meyer-Schwesinger, C., Kaufmann, E., Rump, L. C., Stegbauer, J., Sellin, L., Quack, I., Woznowski, M. Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58542, doi:10.3791/58542 (2019).More

Königshausen, E., Potthoff, S. A., Haase, R., Meyer-Schwesinger, C., Kaufmann, E., Rump, L. C., Stegbauer, J., Sellin, L., Quack, I., Woznowski, M. Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58542, doi:10.3791/58542 (2019).

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