Summary
Burada fare vivo biotin ile glomerular hücre yüzey proteinlerin etiketleme için bir iletişim kuralı mevcut. Bu protokolü nasıl fare böbrekler sıvı, glomeruli ayırma ve ilgi proteinin endojen immunoprecipitation gerçekleştirmek yönergeler içerir.
Abstract
Proteinüri Poşlu endotel, glomerular membran ve podocytes onların yarık zarlar ile oluşan glomerular filtre bozulma oluşur. Glomerular filtre, özellikle yarık diyafram, narin yapısı farklı hücre yüzey proteinleri etkileşimi üzerinde dayanır. Bu hücre yüzey proteinleri eğitim defa vitro çalışmalar veya histolojik analiz için sınırlı olmuştur. Burada, glomerular hücre yüzey proteinleri fizyolojik ve etyopatogenezi koşullar altında çalışma sağlayan yöntem, etiketleme bir fare içinde vivo biotinylation mevcut. Bu iletişim kuralı fare böbrekler sıvı, glomeruli ayırma ve ilgi bir proteinin endojen immunoprecipitation gerçekleştirme hakkında bilgi içerir. Yarı Nefelometri glomerular hücre yüzey bereket hazır bu roman yöntemi ve tüm proteinler biotin perfüzyon için erişilebilir olduğunu ve immunoprecipitation okudu. Buna ek olarak, izolasyon-in glomeruli ya da biotinylation olmadan daha fazla çözümleme glomerular RNA ve protein hem de birincil glomerular hücre kültürü (Yani, birincil podocyte hücre kültürü) sağlar.
Introduction
Proteinüri glomerular yaralanma özelliğidir ve genellikle glomerular filtre1bozulma eşlik eder. Glomerular filtre Poşlu endotel, glomerular membran ve podocytes oluşur. Glomerular filtre hassas moleküler yapısını son derece dinamik hücre yüzey protein hem sağlıklı ve hastalıklı böbrekler2,3,4,5' te,6 kaçakçılığı olup . Endositoz hücre yüzey proteinlerin podocytes7yaşam için temel olarak gösterilmiştir. Nephrin ve podocalyxin podocytes ifade edilen transmembran proteinler vardır. Podocalyxin bir sialoglycoprotein podocytes8,9,10ikincil ayak süreçlerinin kaplama ise Nephrin glomerular yarık diyafram belkemiğidir. Endositik kaçakçılığı daha önce nephrin podocalyxin3,11,12,13,ve14için gösterilmiştir.
Bizim bilgi en iyi şekilde, endositoz hücre yüzey proteinlerin henüz literatürde glomerular endotel hücrelerinde tarif edilmiştir değil. Ancak, endotel hücreleri genel olarak tüm gerekli proteinler endositoz (Yani, clathrin bağımlı, Sal-bağımlı endositoz)15,16farklı türleri için hızlı. Bu nedenle, endotel hücre yüzey kaçakçılığı, örneğin, vasküler endotel (VE) kullanarak bu yöntemle ele-cadherin ve hücre içi adezyon molekülü (ICAM-2) bir hücre olarak yüzey glomerular endotel hücreleri17 için işaretleyici protein .
Ne yazık ki, hiçbir doğru vitro modeli hangi hücre yüzey proteini kaçakçılığı okudu olabilir hassas üç katmanlı glomerular filtresi vardır. Böylece bu yöntemin hedeftir glomerular protein kaçakçılığı vivo içindeçalışmaya. Ayrıca, bu iletişim kuralını glomeruli, daha da glomerular RNA, proteinler veya hücre Analizi etkinleştirme izole konularında bilgi sağlar. Farklı tarafından açıklanan teknikleri benzer glomerular yalıtım18,19gruplandırır.
Daha önce biz ve diğerleri ex vivo glomerular hücre yüzey proteinlerin biotinylation2,3,4,20,21tarafından etiketleme kullandık. Ancak, bu ex vivo yöntemde, izole glomeruli endositik ticareti etkileyebilecek mekanik stres maruz bırakıldı. Alternatif olarak, glomerular hücre yüzey proteinlerin ayirt etiketleme kapsamlı edebiyat2,20,22yılında kullanılmıştır. Bu yöntemle ancak, az sayıda protein bir slayt içinde analiz edilebilir ve Nefelometri ayirt görüntülerin genellikle zordur.
Bu roman vivo Yöntem glomerular hücre yüzey proteini bolluk ve kaçakçılığı doğru içinde sağlıklı ve hastalıklı böbrekler çalışmaya güvenilir bir aracı sunuyor ve ek olarak ayirt testleri kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fareler bir in-house cins yerel hayvan bakım tesisi veya Javier Labs Fransa olarak elde edilmiştir. İncelemeler bakım ve Laboratuvar hayvanlarının kullanımı (ABD ulusal kurumları, Sağlık Yayın No 85-23, 1996 revize) için Kılavuzu'nda açıklanan yönergelere göre yapılmıştır. İlgili kurumsal onayları uygun olarak tüm hayvan deneyleri gerçekleştirilmiştir (eyalet hükümeti LANUV referans numarası AZ:84-02.04. 2016.A435).
1. hazırlanması çözümleri, donatım ve aygıtlar
- 1 L 1 mM magnezyum klorür (MgCl2) ve 0,1 mM kalsiyum klorür (CaCl2) ile desteklenmiş fosfat tamponlu tuz hazırlamak (PBSCM) ve steril bir filtreden filtre.
- 5 mL steril PBSCM fare başına de perfüzyon için hazırlamak ve buz üzerinde yerleştirin.
- Her fare için 5 mL steril PBSCM 0,5 mg/mL biotin ile desteklenmiş de hazırlayın.
- Her fare için 5 mL steril PBSCM de hazırlamak ve 0.8 x 108 manyetik boncuklar ekleme (Örn., 200 Önarıtma olmadan bir 4 x 108 boncuk/mL solüsyon µL) glomeruli embolizasyon için. Bu çözüm manyetik boncuklar özgün tüpte steril tutmak için hücre kültür tezgah altında hazırlayın. Bu çözüm buza koyun.
- PBSCM (fare başına 5 mL) 100 mM glisin eklenerek su verme bir çözüm hazırlamak ve buz üzerinde tutun.
- Bir collagenase çözüm (0,378 U/mL collagenase A steril PBSCM içinde) olun. Fare, başına 1 mL collagenase çözeltisi 2 mL tüp içine pipet ve buz üzerinde yerleştirin.
- Çamaşır için steril PBSCM hazırlamak (bkz. Adım 1.1) 50 ml tüp ve buz üzerinde yerleştirin.
- Perfüzyon için bir şırınga pompa akışı 2.0 mL/dk ile kullanın.
- Bir 10 mL şırınga 21 G iğne ile hazırlayın. İğne ucu bir 20-30 cm uzun kateter yerleştirin (iç çap, kimliği = 0,58 mm). Kateter bağlanmak (0,58 mm ID) 10 cm kısa kateter ile (0,28 mm ID) ve daha küçük kateter ucu eğik fare aort içine kolay bir ekleme için kesti.
- Ameliyat sırasında bağ yordamlar için üç 5-7 cm ipek (4-0 6-0) başına düşen iş parçacığı fare kesmek.
- 3 cerrahi kelepçeler, 2 cerrahi makas, 2 cımbız, 2 iyi cımbız, 1 ince makas ve temizleme bezi ameliyat için hazırlayın. Anestezi (Örneğin, mayi anestezi ketamin 100 mg/kg vücut ağırlığı ve xylazine 5 mg/kg vücut ağırlığı) hazırlayın.
- İki böbrek glomeruli yalıtımı için bir 100 µm hücre süzgeç, iki 50 ml tüp ve bir mıknatıs alıcı kullanma.
- ARKADAŞLAR lizis arabellek hazırlamak: 20 mM 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (çocuklar); 20 mM Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) pH 7.5; 50 mM sodiumchorlide (NaCl); 50 mM sodiumfluoride (KAF); 15 mM Na4P2, O7; 0,1 mM Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) pH 8.0; 2 mM sodiumorthovanadate; ve 2 mM adenosinetriphosphat (ATP).
- Serin santrifüjler ile 4 ° c
2. cerrahi mikroskop altında
- Fare anestezi (Örneğin, ketamin/xylazine ile intraperitoneally, bkz: adım 1.11). Uygun anestezi doğrulamak için ayak-çimdik testi gerçekleştirin.
- Fare ile % 70 isopropanol ventral tarafında dezenfekte.
- Cilt üzerinden ortalama bir kesim için sternum leğen kemiği gerçekleştirmek ve cımbız kullanarak karın fasya cilt kaldırın. Deriyi karın ortasında her iki tarafta cerrahi makasla kesme.
- Cerrahi Araçlar değiştirin. Medyan kesiği karın kas katmanı yoluyla mesane xiphoid uygulamak ve bunları cımbız ve cerrahi makas kullanarak dört çeyrek daire bölmek. İki cerrahi kelepçeler ile fare boyun doğru kelepçeler ile üst iki kenara iliştirin.
Not: Karın şimdi açıldı. - Viseral organlar bir steril bez ile bir kenara koymak ve hepatik frenik bağ iyi makasla kesme.
- Bir tüp ligasyonu (ile 6-0 ipek iplik 4-0) renal arter böbreküstü bezi yüksekliğini üzerinde proksimal aort çevresinde iki iyi cımbız ile hazırlayın. Kan akımı cımbız ile kaldırılması için proksimal aort ligasyonu sıkın.
- Fasya, yağ ve diğer dokularda distal aort ücretsiz ve çevresinde kafatası hepatik/mezenterik arter ligasyonu iyi cerrahi Cımbız kullanarak renal arter hazırlamak.
- Renal arter distal aort çevresinde (ile 6-0 ipek iplik 4-0) bir ligasyonu hazırlamak ve vena kava ve aort bifurkasyon yükseklikte kelepçe.
- Böylece aorta yarı çapını deliktir bir küçük aort distal renal arterler delik açın. Katater aort koymak ve ile hazırlanan bağ düzeltebilirim.
Dikkat: hava embolisi önlemek için perfüzyon sistemi kabarcıklar kaçının. - Perfüzyon buz gibi PBSCM 2 mL/dk akış hızında başlayın.
- İyi cerrahi makas ile renal arter düzeyinde renal ven içine bir delik açıp ve çevresinde hepatik ve mezenterik arter ligasyonu sıkın.
Not: Böbrekler perfüzyon başlattıktan sonra soluk açmalısınız.
3. in Vivo Biotinylation
- Değişim kabarcık içermeyen için buz gibi PBSCM şırınga ile 0,5 mg/mL biotin etiketleme yüzey için takıma ve böbrekler ile 2 mL/dk akış hızında 5 mL sıvı.
Not: PBSCM çözümleri (50 mL tüpler çevirerekmesela ) karışımı yavaşça çözüm içindeki kabarcıklar oluşturan önlemek için. Sonra şırıngayı çözümünüzde aspirasyon, şırıngadan herhangi bir kabarcıklar veya hava tahliye edin. İlave bir kanül (21 G) şırıngayı kateter sisteme bağlı kanül boşluğu doldurmak için kullanın. Son olarak, şırınga kanül kabarcıklar olmadan kateter ile içine sopa. - Şırınga kabarcık-Alerjik glomeruli gidermek ve 5 mL 2 mL/dak bir akış yönü ile sıvı buz gibi PBSCM 100 mM glisin ile desteklenmiş değiştirin.
- Değişim şırınga için buz gibi PBSCM bubble ücretsiz 200 μL manyetik boncuklar/mL ile desteklenmiş ve böbrekler 2 mL/dk sıvı.
Not: böbrek yüzeyinde, glomeruli kahverengi manyetik boncuklar ile embolizasyon görünür hale gelir.
4. Glomeruli iki böbrekler üzerinden yalıtım
- Kapsülün sökün ve Hilus, böbrekler. Böbrekler buz 15 ml PBSCM 10 cm hücre kültür tabağına yerleştirin. Böbrekler hasat sonra servikal çıkığı anestezi altında fareyle ötenazi. Cerrahi ve perfüzyon yordamlar yaklaşık olarak 20-22 dk son.
- Böbrekler en küçük olası yeni bir çift-kenar bıçakla parçalara. Doku ile collagenase A 1 mL 2 mL tüp içine taşıyın (bkz. Adım 1.6) ve sindirmek için 30 dk 37 ° C'de. Önce ve sonra sindirim 1000 μL pipet kesilmiş bir karışımı yavaşça.
- Sindirilir doku buz gibi PBSCM kullanarak bir 100 mikron hücre süzgeç aracılığıyla durulayın. Yavaşça kalan doku yalak hücre süzgeç kıyma ve daha sonra toplam hacmi 50 mL için buz gibi PBSCM ile durulayın için hücre kazıyıcı kullanın.
- 5 dk. süpernatant kaldırmak ve Pelet vortexing pelet ise buz gibi PBSCM biraz daha az 1,5 mL ile resuspend 4 ° C 500 x g de süspansiyon santrifüj kapasitesi. Daha sonra glomerular süspansiyon yeni 2 mL tüp içine koymak.
5. çamaşır
- Mıknatıs catcher glomeruli bir tarafa çekmek için kullanın. Glomeruli doğru mıknatıs taşındı önce 1 dakika bekleyin.
- 2 mL tüp mıknatıs catcher kalırken süpernatant 1000 μL pipet ile kaldırın. Birinci ve ikinci yıkama sırasında (bkz. Adım 5.3), glomeruli kaybı olmaması için tüp süpernatant kalıntıları 250 μL adımları. Hızlı bir şekilde yapılar tüp altına lavabo izin kaçının bu yordamı gerçekleştirin.
Not: Çamaşır yordamı Aksi takdirde uzun sürecek. - 2 mL tüp mıknatıs catcher kaldırmak ve PBSCM, pipet (çok önemli), o yukarı ve aşağı 1 mL ekleyin girdap.
- Tüp mıknatıs catcher koy ve adım 5.2 ile baştan.
- Glomeruli saflığı % 90 ulaşmıştır kadar çamaşır adımları yineleyin. Bunun için bir temsilci aliquot süpernatant mikroskop (40-100 X) altında inceleyin.
Not: Glomeruli kahverengi manyetik boncuklar içeren yuvarlak yapıları görünür. Uzun yapılar borulu parçaları, ve ücretsiz manyetik boncuklar kahverengi yuvarlak noktalar görünür. Hücre artıkları hantal yapıları görünebilir. - Saflık eriştiyseniz, glomeruli sayısı PBSCM 1 ml glomeruli çözülerek tahmin ediyoruz. Karıştırma sonra 10 μL bir aliquot al ve glomeruli mikroskop altında saymak. Glomeruli aşağıda ki formül ile sayısını hesaplayın: glomeruli son sayısı = 10 μL aliquot x 100 glomeruli sayısı.
- Glomeruli başarılı yalıtım 10.000-40,000 glomeruli bir dizi yol açar.
6. protein çıkarma ve Immunoprecipitation (IP)
- Santrifüjü 6800 x g 5 dakika süreyle de 4 ° C'de tarafından toplamak glomeruli süpernatant bir mıknatıs alıcı kullanırken kaldırmak ve Pelet buz gibi lizis arabellekte resuspend (Örn., 30.000 glomeruli 300 μL; Çocuklar, bakın adım 1.11). 30 için en yüksek hızda bir doku homogenizer ile örnekleri homojenize s ve onları buz 30 dk için koşullar.
- Santrifüjü 4 ° c için 30 dak için 15.000 x g de tarafından çözünmez malzeme çıkarmak Yeni 1,5 mL tüp içine lysate hücre içeren süpernatant pipette. Pelet atmak.
- Bir bicinchoninic (BCA) kullanarak protein konsantrasyonu süpernatant ölçmek-üreticinin yönergelerini takip yöntemi dayalı. 30.000 glomeruli başarılı bir lizis için 700-1000 µg/mL glomerular protein miktarını verir. Eşit protein miktarları ile lizis arabellek için ayarlayın.
- Bir aliquot için toplam hacminin % 10 glomerular almak lysate ve 95 ° C'de 2 x Laemmli + dithiothreithol (DTT) kuluçka 5 min için önce Ekle
- IP için kalanı lysate streptavidin özel boncuk gecede 4 ° C'de üzerinde genel gider bir shaker ile kuluçkaya.
- Özel boncuk vasıl 1000 x g 4 ° C'de 3 dk santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırın ve belirsiz protein bağlama için boncuk yıkamayı lizis arabelleği 800 μL ekleyin.
- Yıkama 3 kez tekrarlayın ve süpernatant tamamen kaldırın.
- 2 x Laemmli + DTT 30 μL ekleyin ve 5 min için 95 ° C'de kuluçkaya.
- Lysate yük ve IP sonda üzerinde % 10 SDS jel ve SDS jel çalıştırmak için 30 dk 70 V, daha sonra 20 mA 1,5 h. için jel başına daha sonra leke için 2 h 200 jel nitroselüloz membran anne.
- Gecede 4 ° C'de % 5 Sığır serum albumin (BSA) ile nitroselüloz membran arabellek yıkama engelleyin.
- Membran antikor gecede 4 ° C'de ilgi ile kuluçkaya Bir shaker üzerinde 5 min için 3 kez arabellek yıkama ile yıkama ve membran ile Oda sıcaklığında 1 h için HRP öğesini ikincil antikor kuluçkaya. Çamaşır adımı yineleyin.
- Lysate görselleştirmek ve immunoprecipitation membran üzerinde bir CCD fotoğraf makinesi ile süper çözünürlük chemiluminescent Aracısı kullanarak sondalar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Glomeruli doğru bir şekilde ayırmak için fare böbrekler PBSCM ile ilk sıvı gereklidir. PBSCM ile perfüzyon böbrekler soluk (Şekil 1A) döner. Glomeruli manyetik boncuklar ile embolizasyon (Şekil 1B) böbrek yüzeyinde kahverengi noktalar olarak görünür. Glomeruli yalıtım mıknatıs catcher ile kirlenme böbrek tubuli (Şekil 1C) ile gösterilebilir. Analizinde glomeruli önce glomeruli > %95 saflığı glomeruli daha iyice yıkayarak elde gerekir (resim 1D).
Vivo biotinylation hücre yüzey proteinleri ile biotin etiketlemek için yeteneğine dayalı. Bu çalışma için fare böbrekler PBSCM veya hücre membran geçirgen biotin periosteum. Şekil 2' de gösterildiği gibi biotin kapiller döngüler biotin periosteum ama kontrol fare böbrekler içinde Etiketler. Hücre yüzey proteinleri in vivo biotin perfüzyon tarafından etiketli glomerulus araştırmak için glomerular özleri biotin kısmını immunoprecipitation gerçekleştirilir. Şekil 3 A glomerular transmembran proteinler nephrin ve podocalyxin immunoprecipitated biotin kesir içinde olduğunu gösterir. Ancak, denetim farelerde herhangi bir nephrin veya podocalyxin biotinylated protein immunoprecipitated kısmını algılanır. Kinazlar p42 ve p44 hücre içi protein hücre dışı sinyal bir negatif kontrol düzenlenir (ERK) denetim ve biotin periosteum fare böbrekler biotinylated proteinlerin immunoprecipitated kısmını bulunamadı. Bu yöntemle hücre yüzey proteini nephrin aslında biotinylated olduğunu doğrulamak için nephrin denetim ve biotin periosteum fare böbrekler çöktürülmüş. Biotin görselleştirmek için immunoprecipitated kesir streptavidin ile lekeli. Şekil 3 B biotinylated nephrin biotin periosteum gösterir ama hayvan kontrol. Lysate denetimleri denetim ve biotin periosteum hayvan protein eşit miktarda gösterir. Endotel protein vasküler endotel (VE)-cadherin Şekil 3' teCgösterilen biotin kesir içinde immunoprecipitated olduğunu. VE-cadherin denetim ve biotin periosteum hayvanların lysates içinde mevcut iken kontrol farelerde yok VE-cadherin, çöktürülmüş. Hücre içi adezyon molekül 2 (ICAM-2) biotin periosteum hayvanlardan çöktürülmüş ve hiçbir ICAM-2 kontrol hayvanlarda bulunur. Lysates denetim ve biotin periosteum hayvanların ICAM-2 (Şekil 3C) eşit miktarda göster. Aktin yükleme denetimi olarak görev yaptı.
Bu yöntem glomerular hücre yüzey proteinleri modelleri nefropati (Örneğin, nefrotoksik nefrit, NTN) ve miktarda ölçmek için kullanılabilir. NTN [günün 1 (1 d) NTN serum enjeksiyonu ardından] erken aşamasında proteinüri hızla artar. NTN [gün 18 (18 d)] daha sonraki aşamada proteinüri önemli ölçüde azaltır. Şekil 4 nephrin hücre yüzey bereket erken NTN (1 d) gösterir. Vivo biotinylation tahlil (Şekil 4A) kontrollere göre NTN hayvanlarda hücre yüzey nephrin bir azalma gösterir. Densitometric analiz (Şekil 4C) kontrollere göre NTN hayvanlarda biotinylated nephrin (% 57) önemli bir azalma göstermektedir. Kantitatif analiz aktin için toplam nephrin, hiçbir denetimleri ve NTN fareler (Şekil 4B) arasında önemli farklılıklar ortaya koymaktadır. Bir p57 podocyte hücre belirli boyama kullanarak, podocyte sayılarını NTN ve denetim hayvanlarda (rakamlar 4 d ve 4E) eşit tutarı görüntüler. Şekil 5 nephrin hücre yüzey bereket sonuçlarını geç NTN (18 d) görüntüler. Şekil 5 A denetim ve hücre yüzey nephrin kurtarılması gösteren NTN fareler içinde vivo biotinylation tahlil gösterir. Densitometric analiz kontrol ve NTN fareler (Şekil 5B) hücre yüzey nephrin hiçbir önemli farklılıklar gösterir. Toplam nephrin (Şekil 5C) NTN farelerde % 25 düşürülmüştür. Podocyte sayıları yaklaşık % 19 tarafından (rakamlar 5 d ve 5E) kontrollere göre NTN farelerde azalma.
Resim 1 : Böbrek perfüzyon ve yalıtım glomeruli. (a) görünümüyle mikroskop ile perfüzyon sonra fare kalbin içine PBSCM. Katater aort içinde bir okla belirtilir. Perfüzyon PBSCM ile soluk açmak için böbrekler yol açar. (B) embolizasyon glomeruli manyetik boncuklar ile böbrek yüzeyinde kahverengi noktalar olarak görünür. (C) yine de gösterilen ben mikroskop görüntülemek) glomeruli (kahverengi); yapıları kirlenme II) ile tubuli (ışık uzun yapıları); ve III) hücre enkaz. Glomeruli saflığı yaklaşık % 50'dir. Ücretsiz manyetik boncuklar kahverengi noktalar (100 X büyütme) görünür. (D) glomeruli (100 X büyütme) % 95 saflığı gösterilen mikroskop ile görüntüleyin. Ölçek çubukları 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Biotin glomerular kapiller döngü algılandı. PBSCM (kontrol) ve biotin (biotin) ile periosteum temsilcisi ayirt görüntüsü fare glomeruli (C57BL/6). Biotin (yeşil) streptavidin biotin periosteum farelerde sadece glomerular kapiller döngüsünde tarafından görüntülenmiştir. Denetim fare glomerular biotin boyama gösterme. WT1 (kırmızı) her iki farelerde podocytes çekirdekleri algılanır. Bu rakam bir önceki yayın20değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: In vivo biotin glomerular hücre yüzey proteinlerin etiketleme. (A) Western blot Analizi immunoprecipitated (IP) biotinylated hücre yüzey proteinleri (IP: streptavidin özel boncuk) ve lysates (lysate) böbrekler PBSCM periosteum (kontrol) ve biotin periosteum (biotin) fareler. Transmembran proteinler nephrin ve podocalyxin sadece immunoprecipitated biotin periosteum fare böbrek örneklerinde tespit edilir. Kontrol fare, nephrin ve podocalyxin kontrol fare böbrekler immunoprecipitated sondalar içinde tespit edilmedi. İçinde Lysates denetim ve biotin periosteum hayvanların toplam nephrin ve podocalyxin eşit olarak her iki gruplar halinde ifade edilir. Kinazlar p42 ve p44 hücre içi protein hücre dışı sinyal düzenlenir (ERK) denetim ve biotin periosteum fare böbrekler immunoprecipitated probları tespit edilmedi. Her iki fare grup lysates içinde ERK eşit miktarlarda algılanır. Aktin yükleme denetimi olarak lekeli. (B) Western blot Analizi immunoprecipitated nephrin (IP: α-nephrin) PBSCM periosteum (kontrol) ve biotin periosteum (biotin) fareler. Nephrin için hiçbir algılama kontrol farelerde bulunur iken biotin periosteum böbrek, streptavidin boyama ile nephrin görüntülenir. Nephrin immunoprecipitated kısmını (IP: α-nephrin, WB: nephrin) yanı sıra lysate kesir (lysate, WB: nephrin) nephrin gösteri eşit miktarda nephrin için lekeli. Aktin yükleme denetimi olarak kullanılır. (C) Western blot Analizi immunoprecipitated biotinylated hücre yüzey protein (IP: streptavidin özel boncuk) ve derin PBSCM (kontrol) ve biotin periosteum (biotin) fareler böbrekler, (lysate) lysates. Transmembran marker protein vasküler endotel (VE)-cadherin ve hücre içi adezyon molekül 2 (ICAM-2) sadece biotin periosteum hayvanlar immunoprecipitated kısmını algılanır. Denetim fare yok VE-cadherin veya ICAM-2 algılanır. Aktin yükleme denetimi olarak hizmet vermektedir. Bu rakam bir önceki yayın20değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Glomerular protein nephrin bolluk içinde erken nefrotoksik nefrit nefropati (NTN). (A) Western blot Analizi yüzey nephrin (IP: α-nephrin, WB: streptavidin) ve toplam nephrin (IP: α-nephrin veya lysate, WB: nephrin) farelerde kontrol ve nefrotoksik serum tedavi (NTN 1 d). Aktin yükleme denetimi olarak hizmet vermektedir. Kontrollere, NTN göre tedavi fareler göstermek azaltılmış hücre yüzey nephrin (IP: α-nephrin, WB streptavidin) kontrollere göre. (B) kantitatif analiz toplam nephrin/aktin kontrolü ve NTN 1 d fare [kontrol n = 4, NTN n = 6, önemli olmayan farklılıklar (ns)]. Hücre yüzey nephrin (biotinylated nephrin/toplam nephrin) kontrolü ve NTN fareler (C) Densitometric Analizi (* p < 0,01, kontrol n = 4, NTN n = 6). (D) denetim ve NTN 1 d fareler podocytes gösterilen immünhistokimya, p57. (E) kantitatif analiz p57 pozitif hücre tutam alan (μm kalınlığında2) başına. (fare başına 40 glomeruli sayısal, ns). Western blot verileri göstermek anlamına gelir ± SD Podocyte sayıları göstermek anlamına gelir ± SEM Unpaired t-testi ile Welch düzeltme. Ölçek çubuğu 50 µm =. Bu rakam bir önceki yayın20değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Glomerular protein nephrin bolluk içinde geç nefrotoksik nefrit nefropati (NTN). (A) Western blot Analizi yüzey nephrin (IP: α-nephrin, WB: streptavidin) ve toplam nephrin (IP: α-nephrin veya lysate, WB: nephrin) denetim ve nefrotoksik serum tedavi fareler (NTN 18 d). Denetimleri ile karşılaştırıldığında, NTN 18 d fare eşit miktarda hücre yüzey nephrin göster (IP: α-nephrin, WB: streptavidin). NTN fareler gün 18 ekranda daha az toplam nephrin tedavi ve aktin yükleme denetimi olarak hizmet vermektedir. (B) densitometric analiz hücre yüzey nephrin denetimleri ve NTN 18 d fareler arasında hiçbir önemli farklılıklar gösterir (kontrol n = 4, NTN n = 3). Aktin için toplam nephrin (C) Densitometric analizi. Gün 18 NTN farelerde nephrin kontrollere göre daha az ifadesi yoktur (kontrol n = 4, NTN n = 3, ** p < 0.001). (D) denetim ve NTN 18 d fareler podocytes gösterilen immünhistokimya, p57. (Kırmızı) NTN 18 d farelerde kontrollere göre daha az p57 pozitif hücreler vardır. Manyetik boncuklar siyah noktalar görünür. (E) kantitatif analiz glomerular tutam alan (μm kalınlığında2) başına p57 pozitif hücrelerinin (*** p < 0,0001, kontrol n = 2, NTN n = 2, sayısal fare başına 40 glomeruli). Western blot verileri göstermek anlamına gelir ± SD Podocyte sayıları göstermek anlamına gelir ± SEM istatistiksel analiz: unpaired t-testi ile Welch düzeltme. Ölçek çubuğu 50 µm =. Bu rakam bir önceki yayın20değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sunulan Yöntem glomerular RNA veya protein araştırmak için glomeruli başarılı yalıtım sağlar. Buna ek olarak, birincil glomerular hücre kültürlerinde izole glomeruli gerçekleştirilir. Biotin glomerular yalıtım daha önce uyguladıysanız, glomerular hücre yüzey proteinlerin etiketleme gerçekleştirilebilir. Bu yöntemle vivo içinde glomerular hücre yüzey proteini kaçakçılığı okudu ve protein bereket yarı Nefelometri mümkündür. Başarıyla glomerular hücre yüzey proteini bereket testleri için en kritik 1 adımlardır) fare cerrahisinde özellikle aort cannulation el ile uzmanlık geliştirme, 2) kabarcık-bağlantı şırıngaların hava embolizasyon ile önlemek için ücretsiz glomeruli ve 3) perfüzyon PBSCM ile başladıktan sonra buz gibi koşullar altında çalışıyor.
Bu teknik için fare cerrahi el ile uzmanlık esastır. Gemi diseksiyon perfüzyon böbrekler engeller olarak aort cannulation özellikle önemlidir. Aortada ayında kesilmiş kadar büyük olmalıdır (damar çapı yaklaşık % 50) kateter tanıtmak için yeterli alanı oluşturmak için. Kateter çapraz kesersen, kateter giriş aorta içine daha kolay olacak. Diseksiyon ek olarak tanıtılan kateter renal arterler engel değil için aort içinde yüksek yer almalıdır. Renal arterler Aksi takdirde biotin ve manyetik boncuklar ile derin değil.
Biotin streptavidin proteinlerinin için yüksek afinite ile bağlanır küçük bir vitamindir. Onun küçük büyüklük (244 Da), biotin conjugated proteinlerin işlevi değiştirmez ve glomerulus filtre uygulanır. Streptavidin ile kuluçka tarafından biotinylated proteinler kolayca etiketsiz proteinler özel boncuk veya diğer yöntemleri tarafından ayrılabilir. N-hydroxysuccimide (NHS) esterleri biotin bağlamak için Amin (-NH2) gruplar proteinlerin, örneğin lizin artıkları, yan zincirlerinin bol miktarda bulunmaktadır. Sulfo-NHS-LC-biotin çözünür ve hücre-geçirmez, hücre zarlarında bozulmamış ise sudur. Sulfo-NHS-LC-biotin hücre yüzey proteinleri23etiketlemek için gösterilmiştir. PH (7-9) ve amin-Alerjik arabellekleri (yani PBSCM) kullanımı biotin NHS esterleri Amin grupları için bağlama bağlıdır. En iyi çözünürlük ve biotin fonksiyonu ile ideal fizyolojik özellikleri birleştirir gibi PBSCM pH 7.4 ile bu nedenle fare böbrekler ile biotin, sıvı için kullanıldı. Etiketleme sonra proteinler gidermek için PBSCM perfüzyon ile glisin, glisin Amin gruplarına bağlı olmak ücretsiz biotin izin gerçekleştirilir. Hayvan ölümünden sonra hücresel önlemek için perfüzyon buz gibi bir çözüm ile gerçekleştirmek ve buz üzerinde çalışmaya devam etmek önemlidir.
Benzer şekilde ex vivo biotinylation yöntemleri, glomeruli vivo biotinylation sırasında işleme mekanik stres Mayıs da etkisi endositoz, olaylar ve RNA bütünlük sinyal hızlı protokolleri. Bu nedenle tüm işleme adımlarını enzimatik hücresel hareketlilik riskini azaltmak için buz üzerinde gerçekleştirilen esastır.
Proteinuric hayvan modelleri nefrotoksik serum nefrit (NTN) hasar fare böbrekler ciddi bir şekilde seviyorum. Özellikle, NTN böbrek fibrozis hastalığı (42 gün)24ileri evrelerde lider mesangial genişleme, glomerular skleroz ve borulu lezyonlar ile sonuçlanır. Hayır glomeruli hastalık modelleri, Engelli perfüzyon protein bereket önyargılı sonuçlara neden olabilir. Hayır glomeruli büyük olasılıkla ile manyetik boncuklar periosteum değil ve bu nedenle bu yöntemde izole olmak değil. Şiddetli glomerular skleroz için önde gelen hastalık modellerinde glomeruli yolu farklı eleme merdiven yalıtmak için teknikleri kullanarak bu protokolü25içinde kullanılan manyetik boncuklar yöntemi için bir alternatif olabilir. Glomeruli ciddi bir şekilde Hayır ancak, biotin ile bile perfüzyon bozukluğu olabilir. Buna ek olarak, ex vivo biotinylation, ayıklanan glomeruli yıkanırlardı ex vivo biotin çözümleri21, olan bu modelleri avantajlı olmayacaktır muhtemelen. Alternatif olarak, ayirt glomeruli perfüzyon üzerinde dayanmaz derecede protein bolluk içinde ciddi bir şekilde hastalıklı glomeruli-ebilmek var olmak avantajlı, algılamak için kullanır.
Bu teknikle protein bereket yarı Nefelometri de Dansitometresi kullanımı ile çalışır. Ancak, protein bereket küçük farklılıklar Dansitometresi algılama sınırı sonucu olarak özledim.
Açıklanan tekniği koşuluyla ilgi yapılardır yalıtım teknikleri tarafından erişilebilir bir hücre türü veya organ yapısı için özel ilgi yüzey proteindir periosteum hayvan diğer organlara transfer edilebilir. Tüm yüzey proteinleri biotinylated bu tekniği ile olsa bile, spesifik bir antikor için immunoprecipitation kullanarak hücre yüzey proteini ifade belirli protein fraksiyonu ( Şekil 3Bnephrin için gösterildiği gibi) yol açacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Blanka Duvnjak onun olağanüstü teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu eser Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 M.W. ve QU280/3-1 için IQ tarafından desteklenmiştir Sermaye sağlayıcı çalışma tasarım, veri toplama, veri analizi, yayımlamaya karar ve el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | PZN:01320422 | anesthesia |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors, for cut into the aorta |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for abdominal cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery until the abdomen is opened |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | biotin |
| Dynabeads Untouched Mouse T-cells | Invitrogen | 11413D | to embolize glomeruli |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | to digest kidney tissue |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | Magnet catcher |
| 100µm cell stainer | Greiner-bio | 542000 | for glomerular isolation |
| Axiovert 40 CFL | Zeiss | non available | to confirm glomerular purity |
| TissueRuptor | Quiagen | 9002755 | Tissue homogenizer |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | for lysis buffer |
| Tris-HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | for lysis buffer |
| NaCl | VWR chemicals | 27810295 | for lysis buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | for lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | for lysis buffer |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | for lysis buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Follow the manufacturer's instructions |
| nephrin antibody | Progen | GP-N2 | for westernblot |
| Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody | R&D Systems | AF15556-SP | for westernblot |
| Streptavidin Agarose Resin | Thermo Scientific | 20347 | for immunoprecipitation |
| Protein A sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | for immunoprecipitation |
| polyclonal rabbit anti-p57 antibody | SCBT | sc-8298 | for Immunohistochemistry |
| mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | Western blot loading control |
| rabbit anti-p44/42 | cell signalling | 4695 | for westernblot |
| Pierce High sensitivity streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21130 | for westernblot |
| polyclonal mouse ICAM-2 antibody | R&D Systems | AF774 | for westernblot |
| polyclonal mouse anti-VE-cadherin | R&D Systems | AF1002 | for westernblot |
References
- Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Quack, I., et al. beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).
- Quack, I., et al. PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia. Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).
- Swiatecka-Urban, A. Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm. Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).
- Swiatecka-Urban, A. Membrane trafficking in podocyte health and disease. Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).
- Soda, K., et al. Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes. The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Martin, C. E., Jones, N. Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).
- Nielsen, J. S., McNagny, K. M. The role of podocalyxin in health and disease. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).
- Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).
- Tossidou, I., et al. Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis. Public Library of Science One. 5 (4), 10185 (2010).
- Qin, X. S., et al. Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).
- Waters, A. M., et al. Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).
- Zhang, X., Simons, M. Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).
- Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies. Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Haase, R., et al. A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease. Public Library of Science One. 12 (6), 0179217 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).
- Tomas, N. M., et al. Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy. New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface. Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).
- Ougaard, M. K. E., et al. Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease. International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).
- Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals. Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).
