Summary
Aquí, nos proporcionan un flujo de trabajo que permite la identificación de células sanas y patológicas basado en su forma de 3 dimensiones. Describimos el proceso de utilizar esquemas de proyección 2D basados en las superficies 3D para entrenar un mapa de auto-organización que ofrecerá la agrupación objetiva de las poblaciones celulares investigados.
Abstract
El aspecto y los movimientos de las células inmunes son conducidos por su entorno. Como reacción a la invasión de un patógeno, las células inmunes son reclutadas en el sitio de la inflamación y se activan para evitar más lejos el separarse de la invasión. Esto también se refleja en cambios en el comportamiento y el aspecto morfológico de las células inmunes. En el tejido canceroso, morphokinetic los cambios similares se han observado en el comportamiento de las células microgliales: microglia intra tumoral tienen formas de 3 dimensiones menos complejos, con procesos celulares menos ramificado y mover más rápidamente que ésos en saludable tejido. El examen de tales propiedades morphokinetic requiere técnicas de la microscopia 3D complejos, que pueden ser extremadamente difíciles cuando ejecuta longitudinalmente. Por lo tanto, la grabación de una forma 3D estática de una célula es mucho más sencilla, porque esto no requiere de mediciones intravital y puede realizarse en tejido suprimido también. Sin embargo, es esencial poseer herramientas de análisis que permiten la rápida y precisa Descripción de las formas 3D y permite la clasificación diagnóstica de las muestras de tejido sano y patógenos basadas únicamente en información estática, relacionada con la forma. Aquí, presentamos una herramienta que analiza los componentes de Fourier discretos del contorno de un conjunto de proyecciones 2D de 3D celular superficies mediante mapas de auto-organización. La aplicación de métodos de inteligencia artificial permite que nuestro marco conocer distintas formas de la célula como se aplica a las muestras de tejido más y más, mientras que el flujo de trabajo permanece simple.
Introduction
Determinación oportuna, sencilla y precisa de la situación patológica de tejido biológico es del mayor interés en la investigación biomédica. Modelos de ratón proporcionan los medios para estudiar una variedad de condiciones patológicas, tales como reacciones inmunes o desarrollo del cáncer, en combinación con complejos 3D y técnicas de microscopía 4D (3 dimensiones espaciales y tiempo). Estudios de la microscopia pueden ser realizado vía intravital o tejido suprimido 2 fotones microscopía, microscopía de luz de hoja y - a una profundidad limitada de tejido de aproximadamente 100 μm-por microscopia confocal. Para obtener información relacionada con el tiempo sobre el comportamiento de las células bajo condiciones fisiológicas o patológicas, es necesario controlar el tejido por un período prolongado de tiempo, que generalmente requiere de1,imagen intravital2 . Naturalmente, la aplicabilidad de esta técnica está limitada a modelos animales debido a su invasividad. Técnicas no invasivas están también disponibles para los usos humanos, incluyendo una variedad de métodos de tomografía (MSOT, CT, etc.), pero estos métodos carecen de la necesaria espacial - y a menudo resolución temporal para estudiar el comportamiento a nivel celular.
Información estática sobre la aparición de las células puede ser más fácilmente accesible vía 3D diferentes técnicas de imagen ejecutado el suprimido las muestras de tejido. Aquí, el comportamiento cinético de las células no se mide, por lo tanto es necesario adoptar técnicas de nuevos análisis que son capaces de determinar el estado de patógeno de las células examinadas basados únicamente en su morfología3. Este enfoque fue utilizado para vincular celular formas y texturas de tejido patológico comportamiento4,5,6.
En la nueva técnica que se describe aquí, las células son reconstruidas como superficies 3D y sus formas son caracterizados a través de proyecciones de 3D a 2D y periferia-forma basada en la transformada de Fourier sucesivos análisis7,8. Al reducir las dimensiones de 3 a 2, se simplifica el problema. También es posible caracterizar las superficies celulares en 3D mediante la aplicación de análisis de armónicos esféricos, como se ha hecho para imágenes médicas9. Sin embargo, armónicos esféricos no manejan formas fuertes y robustas, que requiere una red de múltiples escalas para establecerse en el ámbito de la unidad. Además, el número de componentes armónicos esféricos necesarios puede ser grande (50-70), con los cálculos subyacentes muy exigente y los resultados difíciles de interpretar10,11,12.
Con nuestro método recién propuesto, la tarea se reduce a una serie de descripciones de la figura en 2D, donde el número de las proyecciones 2D depende del analista y se puede ajustar según la complejidad de la forma 3D. Las proyecciones se generan automáticamente a través de un script en Python que se ejecuta dentro de una herramienta de animación en 3D. Se describen las proyecciones 2D por el discreto Fourier transforma (DFT) los componentes de su periferia, calculados por un plugin de13 de Fiji que se proporciona aquí como parte de nuestro paquete de software. La DFT se aplica aquí para descomponer el complejo esquema de la célula en una serie de funciones de pecado y lechuga romana. De este modo, podemos describir el contorno con un número relativamente pequeño de componentes DFT, reduciendo así la complejidad del problema (para más detalles ver sección de ecuaciones). Los componentes de la DFT se ponen en entrenados mapa de auto-organización (SOM14), donde la existencia de forma racimos pueden ser objetivamente probado8. A veces proporcionan una herramienta de aprendizaje competitivo y sin supervisión del campo de la inteligencia artificial. Consisten en un conjunto vinculado de neuronas artificiales que se comunican a través de una función de la distancia ponderada de barrio. El sistema neuronal responde al primer elemento del conjunto de datos entrada y las neuronas cuya respuesta es el más fuerte se "agrupan" más cerca entre sí. El sistema neuronal recibe más de entrada, las neuronas de datos que respondan varias veces fuertemente comienzan a formar grupo bien definido dentro del sistema. Después de un entrenamiento adecuado en una gran base de datos que contiene información sobre la forma 2D en forma de un conjunto de componentes DFT, componentes DFT de cualquier célula individual se pueden poner en el SOM entrenado y revelan si la célula probablemente pertenece al sano o al grupo de células patógenas. Esperamos que esta herramienta para convertirse en una gran adición a los métodos de diagnóstico científico y clínico.
Protocol
1. el protocolo requisitos
- Obtener datos de deconvolución tridimensional (3D) microscopía de alta resolución deconvolución en conformidad con el criterio de Nyquist con un intervalo de muestreo por lo menos dos veces la frecuencia espacial más alta de la muestra para obtener una imagen de alta resolución.
- Utilizar software de Render 3D para la reconstrucción de la superficie y la exportación.
- Usar software de animación 3D capaz de ejecutar secuencias de comandos de Python (el script de Python puede descargarse desde el repositorio de github: https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis) para crear proyecciones 2D.
- Utilice Fiji13 para analizar las proyecciones 2D y extraer los componentes de la DFT.
- Utilice la distribución actual de Fiji. Si ya existe una versión instalada de Fiji, asegúrese de que la versión instalada es la última. Esto puede lograrse fácilmente mediante la ejecución de la ayuda | Opción de actualización .
- Uso de plugin de contorno activo15, que puede descargarse desde http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=plugin:segmentation:active_contour:start y deben copiarse en la carpeta plugins.
- Descargar el plugin de Fiji de sombra desde el repositorio de github y copia en la carpeta plugins.
- Utilizar software de matemáticas computacional capaz de calcular mapas de auto-organización.
2. reconstruir la imagen 3D.
Nota: Para propósitos de prueba, un conjunto de datos de ejemplo se proporciona en el repositorio de github (véase arriba).
- Inicie el software de reconstrucción 3D y abrir los datos de imagen en 3D.
- Crear una superficie 3D de objetos (todos).
- Seleccione la opción vista 3D y haga clic en superficies. Haga clic en el siguiente botón (círculo azul con un triángulo blanco) para continuar con el Asistente de creación de superficie.
- Seleccione el canal de imagen para la reconstrucción de la superficie.
- Aplicar una función de suavizado para evitar superficies porosas.
- Elija un valor de suavizado que no oculta los detalles de la superficie, pero evita las superficies porosas.
- Seleccione un método de umbralización para encontrar las superficies.
- Usar un umbral absoluto de intensidad cuando los objetos están bien separados del fondo y tienen una luminosidad aproximadamente uniforme.
- Aplicar un umbral de contraste local cuando los objetos varían en su intensidad pero todavía pueden ser separados del fondo local y de los otros objetos que los rodean. Defina el área de búsqueda de umbral local según el valor del diámetro esperado de los objetos reconstruidos.
- Filtro la superficie reconstruida según parámetros morfológicos de interés, por ejemplo, volumen, esfericidad, relación superficie a volumen, etc.y terminar la reconstrucción de la superficie.
- Guardar y exportar las superficies generadas en un formato que es compatible con el software de animación 3D que se utilizarán en el siguiente paso.
3. transformar el 3D reconstruido las superficies en las proyecciones 2D
- Inicie Blender y vaya a la ficha de salida en la ventana de la derecha. Selecciona el formato TIFF en el menú desplegable y establecer la profundidad de color a 8 bits RGBA.
- Cambiar al modo de secuencias de comandos y abra el archivo de secuencia de comandos proporcionada "GUI_AutoRotate.py" desde el repositorio proporcionado de este trabajo (https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis).
- Haga clic en Ejecutar secuencia de comandos. Elige la carpeta de los archivos wrl cuando se le solicite para la entrada.
- Si es necesario, crear más rotaciones cuando se trabaja con superficies más complejas: ir a la GUI y establecer el cuadro de rotaciones en un valor por encima de 6.
Nota: Una rotación de 6 diferentes ángulos puede ser suficiente para distinguir las diferentes poblaciones celulares. No se recomienda para crear menos de seis rotaciones por superficie, debido a la potencial pérdida de información. - Ejecute el script haciendo clic en el botón rotar en el GUI. Guardar las proyecciones de las superficies individuales en la misma carpeta que fue utilizada como la carpeta de entrada (paso 2.3). De forma predeterminada, las imágenes se guardan en un Tiff de 8 bits del formato (vea el paso 2.1), que es el formato requerido por el plugin de Fiji sombra.
4. encontrar la periferia y calcular los componentes de Fourier con Fiji.
- Abra Fiji y seleccione sombra del menú de Plugins. Comience con los valores por defecto y ajustar los parámetros más tarde. Haga clic en Aceptar cuando esté listo para ejecutar el programa.
- Elija un valor de Umbral de gradiente por el umbral de la imagen de entrada.
- Seleccione el número de iteraciones. Cuanto mayor sea el valor del Número de iteraciones , la más exacta reconstrucción de la periferia. Para las formas más simples, un número más bajo es generalmente suficiente.
- Utilice el parámetro Número de dilataciones para determinar cuánto más grande la máscara partida se compara con la celda real. Generalmente formas más complejas necesitan más pasos de dilatación para encontrar periferia apropiada.
- Marque la casilla de Fondo oscuro si las formas proyectadas son más brillantes que el fondo.
- Active la casilla de verificación Mostrar resultados intermedios solamente cuando se usa un conjunto de datos de prueba pequeña para determinar el funcionamiento de la cortina. Activar esta opción para grandes conjuntos de datos disminuye la eficiencia computacional y posiblemente podría detener un sistema con poca memoria de video.
- Marque la casilla Guardar resultado tablas para usar los resultados de la cortina como insumo para el paso 5. Si la casilla está activada, todos los resultados se guardan en archivos csv individuales. Un resumen de los datos de salida se genera siempre en un archivo llamado "Result_collection_of_all_DFT_calculations.csv".
- Seleccione la carpeta de datos de entrada que contiene los archivos TIFF creados en el paso 3.
- Proporcionar la carpeta de datos de salida.
- Haga clic en Aceptar para iniciar el plugin.
5. uno mismo-organización mapas
Nota: Las redes SOM sólo son capaces de clasificar los datos cuando están entrenados en una gran base de datos que contiene la entrada de todos los tipos de la célula prevista y condiciones. Para fines de demostración, un conjunto de datos es proporcionado y que podrá encontrar en nuestro repositorio ("AllCells_summary_normalised.csv" de https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis
- Siga estas pautas si no SOM entrenado disponible todavía para los datos de entrada; de lo contrario continúe con el paso 5.2.
- Iniciar un programa matemático computacional capaz de realizar clasificaciones de redes neuronales.
- Seleccione un archivo de datos que se utilizará para la formación de la red SOM. Este conjunto de datos debe contener todas las condiciones experimentales a fin de formar el SOM en los tipos celulares particulares y condiciones experimentales.
Nota: También es posible utilizar el AllCells_summary_normalised.csv proporcionado para probar el sistema. - Iniciar el entrenamiento y esperar a que la formación se completa antes de proceder. De forma predeterminada, el script se encuentra ejecutar 2000 iteraciones ("épocas").
Nota: El número de iteraciones depende de la tasa de aprendizaje del SOM. Según los datos de entrada es recomendable probar mayor y menor número de épocas y observar la estabilidad del patrón del SOM. Cuando se utiliza el guión previsto, el número de iteraciones se puede cambiar bajo línea 32. El tamaño de la red puede cambiar en la línea 34 (por defecto que se encuentra a 12 de 12). - Una vez terminado el entrenamiento, examinar la topología de la red (distancias de vecino, entradas planos, muestra hits, etc.). La red ahora está entrenada y puede guardarse para uso futuro.
- Carga en el SOM, al usar un mapa ya entrenado (esto puede venir de paso 5.1 o de otras fuentes) con el fin de agrupar un conjunto de datos.
- Importar el archivo csv que debe analizarse con el SOM entrenados precargados. Seleccione la salida csv del Plugin sombra del paso 4 al usar datos elaborados por el plugin de sombra.
Nota: También es posible utilizar los archivos de la datos de ejemplo "InteractingCells_summary_normalised.csv", "MobileCells_summary_normalised.csv" o "PhagocytosingCells_summary_normalised.csv" que se proporcionan a través de github. - Al terminar la clasificación, evaluar los resultados de la SOM como en el paso 5.1.5.
- Examinar la hitmap generado desde el archivo csv. Cada celda del mapa muestra cómo muchas veces el conjunto de datos "hits" a esa celda particular del SOM entrenados. Cuando un grupo de células se agrupan en una pequeña zona de este mapa, esto indica que el conjunto de datos es bastante homogénea. Varios clústeres indica que probablemente los subgrupos existen en el conjunto de datos.
- Examinar las distancias de peso de barrio. Las áreas de este mapa bien separados corresponden a grupos de objetos que se comportan muy diferente desde la perspectiva de la SOM. Con los componentes de la DFT como datos de entrada, esto significa que estos grupos de células tienen formas muy diferentes de las correspondientes superficies 3D.
- Examinar los planos de peso para obtener información acerca de la contribución por cada elemento del vector característica. En caso de utilizar los 20 componentes de la DFT como se describió anteriormente, 19 mapas aparecerán aquí. Cuando se utiliza el conjunto de datos de ejemplo proporcionados, los primeros 5 o 6 aviones de peso será diferentes, pero el resto aparecerán bastante similar. En este caso se puede concluir que sería suficiente para aproximadamente 7 componentes de la DFT.
- Importar el archivo csv que debe analizarse con el SOM entrenados precargados. Seleccione la salida csv del Plugin sombra del paso 4 al usar datos elaborados por el plugin de sombra.
Representative Results
Aplicamos un DFT para calcular los componentes principales de la forma correspondiente a las proyecciones de la célula. Los descriptores de Fourier se obtuvieron aplicando el algoritmo DFT a los pares de coordenadas xy de la periferia equipada de las proyecciones de la célula, como la salida de la AbSnake parte de nuestro flujo de trabajo. Estos pares de xycoordinate pueden ser tratados como un valor complejo vector 2D "g":
Desde el vector "g", utilizamos DFT para calcular el espectro de Fourier de valor complejo:
Basados en conocidas fórmulas del espectro de Fourier discreto y utilizando el etiquetado de número complejo de la "g" como:
Obtenemos:
(1)
Podemos calcular el verdadero ("A") y el imaginario componentes ("B") de 
:
(2)
(3)
Aquí, la primera DFT componente G0 corresponde a m = 0, lo que da:
(4)
(5)
Por lo tanto, este componente describe el centro geométrico del objeto original.
El segundo elemento del espectro adelante DFT, G1, corresponde a m = 1:
(6)
Desde Eq.6 podemos concluir que estos puntos forman un círculo con un radio de 
y el ángulo de partida 
, donde el círculo describe una revolución completa mientras que la forma se remonta una vez. El centro del círculo se encuentra en el origen (0, 0), el radio es | G1| y el punto de partida es:
(7)
En general, para un único coeficiente de Fourier 
, las coordenadas se describen como:
(8)
De manera similar a Eq.6, Eq.8 también describe un círculo, pero con un radio de Rm= | Gm|, un ángulo de partida 
y un punto de partida en 
, donde el contorno se remonta una vez mientras el círculo gira a través de la "m" órbitas completo16,17.
Parámetros de la forma como entrada SOM
El flujo de trabajo, como se describe en la figura 1, se aplicó a un deconvolved (usando una función de extensión de punto medido) conjunto de datos de microscopia intravital de fotones múltiples de las células microgliales para caracterizar los cambios morfológicos en sana o cancerosa corticales tejido18. Veinte componentes DFT se calcularon para cada proyección 2D de las superficies 3D reconstruidas y los resultados se utilizaron como insumo para la formación de SOM. En condiciones fisiológicas, la microglia presenta una forma bastante compleja con múltiples, muy ramificado (Figura 2a) los procesos. Cuando se coloca en un entorno canceroso (modelo de tumor cortical), la microglia cambiada a una forma más simple, más del huso-como (figura 2b).
El SOM entrenado fue probada con el fin de evaluar su capacidad para distinguir entre células sanas y cancerosas. La población de la célula sana se proyectó en una sola área de SOM (figura 2C). El SOM respondió a dataset microglia canceroso con una región activa en forma de pesa (Figura 2d). Un conjunto de datos entrado oculto mixto que consistió en DFT forma componentes de los sanos y el grupo canceroso fue proyectado por el SOM en dos grupos distintos, manteniendo la forma de sus contornos individuales similares a los de los grupos separados ( Figura 2e; Comparar con 2C y 2d). Se puede concluir que el conjunto de datos mixto con éxito fue agrupado por el SOM.
Probamos el rendimiento de la SOM al comparar sus proyecciones con el análisis manual de los mismos datos por un médico experto, que el conjunto de datos basado en su comportamiento espacio-temporal. El experto identificó cuatro grupos distintos de la célula (las células de reclinación, phagocytosing células, células interactuantes y células móviles18), que fueron reconstruidos y solía entrenar un 12 x 12 SOM. La red entrenada (figura 3a) muestra grupos de neuronas artificiales de alto valor de golpe, sobre todo en la parte inferior izquierda y central del SOM. También se probó la respuesta de la red entrenada con cuatro subconjuntos seleccionados al azar (que no eran parte del conjunto de datos de entrenamiento) de imágenes de los cuatro grupos diferentes identificados por los expertos18. Estos subconjuntos de imagen dio lugar a cuatro respuestas bien definidas por el SOM, como se muestra en la figura 3b. Las células de reclinación exhiben la forma más compleja y demostró el más alto nivel de separación dentro de la red neuronal (figura 3b el panel de "descanso"). Los otros tres tipos de células identificadas comparten un espacio común de la SOM en la esquina inferior izquierda, pero de lo contrario se separaron por el SOM. La esquina inferior izquierda área SOM así corresponde a los valores de la DFT de menor índice.
La solidez del enfoque SOM fue probada usando el SOM formado con tres subconjuntos al azar del mismo - descanso - tipo (no forma parte del conjunto de datos de entrenamiento) de la célula. La respuesta de SOM a esta entrada muestra una respuesta muy similar (figura 3 c, subconjuntos de 1-3), demostrando la robustez de nuestro enfoque.
Cambios en la forma de la célula dependiente del tiempo se caracterizan precisamente por DFT
Para examinar el efecto de los cambios dependientes del tiempo de la forma de la célula en los componentes de la DFT, una a tres células por subgrupo (ver figura 3b) fueron seguidas de 13 a 28 puntos del tiempo. La figura 4 muestra la primera DFT de diez componentes de un celular móvil (figura 4a) y una interacción de la célula (Figura 4b), que se trazaron en función del tiempo. Móvil celular exhibe una forma permanentemente alterar (Ver Video complementario 4 de 8), que es reflejada por una superficie más áspera de la DFT. Las ráfagas de la amplitud DFT en el primer tercio del curso del tiempo para la interacción célula coinciden con los cambios de forma rápida y extensa de la célula como se muestra en el vídeo complementario 5 en 8.
El curso del tiempo de todos los componentes DFT 19 también fue caracterizado para estas dos células en tres momentos distintos durante el rastreo de un celular móvil (figura 5a) y de una interacción de la célula (figura 5b). Los ejes perpendiculares representan los ángulos de seis rotación e indican que todas las proyecciones son igualmente importantes para la caracterización de la forma para ambos tipos de células.
Figura 1. Paso a paso el flujo de trabajo de la informática para identificar la célula agrupamiento basado en la forma de células. Superficies reconstruidas en 3D fueron utilizadas como entrada para licuadora para proyecciones 3D a 2D automatizadas. La periferia de cada proyección se encontraba y se calcularon los componentes de la DFT. Los componentes se sirven como entrada a un SOM entrenado en Matlab, o formar una nueva SOM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Aspecto típico de las células de microglía corticales de ratón bajo condiciones de control (a) y en el tejido canceroso (b) imágenes de superficies reconstruidas de la microglia. Proyecciones de SOM fueron creadas de los tres grupos de muestras de la microglía de la corteza del ratón: controlar (no tumoral) células (c), las células del tumor (d) y una población mixta de células (e). Esta figura se ha modificado con permiso8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. (a, a la izquierda) Mapa de auto-organización de un dataset de la microglía de ratón consistente en vectores de entrada característica 768. El conjunto de datos se utilizó para entrenar una red neuronal artificial 12 x 12, con geometría hexagonal barrio, inicialización random y épocas de 2000. (una, derecha) El SOM correspondiente entrada planos de los primeros 10 componentes de la DFT (b) las respuestas de la SOM representado en (a), a un al azar VRML archivo subconjunto cada uno de los tipos de cuatro celulares "móviles", "interactuando", "descanso" y "fagocitarias" como se describe en primera figura 5 de Bayerl et al. 18. respuesta (c) la del mismo SOM como en (a, izquierda) a tres subconjuntos al azar de todo conjunto de datos (que no eran así parte del conjunto de datos de entrenamiento) de las "células de reclinación"-tipo de superficies 3D. Es notable la semejanza entre las tres respuestas. Esta figura se ha modificado con permiso8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. (a) dependencia de el tiempo de los primeros 10 componentes DFT durante un experimento imagen intravital de la microglía de ratón. Este panel muestra datos de una celda del tipo "Células móviles". El eje x corresponde a puntos del tiempo del experimento en 60 s tiempo de resolución, el eje y muestra la amplitud de los componentes de la DFT en unidades arbitrarias (a.u.), mientras que el eje z corresponde al componente de la DFT de 1 a 10. (b) como en (a) pero para una célula de la "interacción de las células de" tipo. Esta figura se ha modificado con permiso8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. (a) el comportamiento de todos los componentes DFT 19 de una célula del tipo "Células móviles" al principio, en medio y al final del experimento. Los números en el eje x corresponden a lo ID de componente DFT del 1 al 19. El eje y muestra la amplitud de la componente DFT en unidades arbitrarias (a.u.), mientras que el z-eje marca los seis ángulos de rotación al azar. (b) igual a (a) pero para una célula de la "interacción de las células de" tipo. Esta figura se ha modificado con permiso8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
La identificación de condiciones potencialmente patológicas usando muestras pequeñas de tejido intacto es de gran importancia. Estas técnicas le asegurará una respuesta oportuna a las enfermedades infecciosas y agresivos tipos de cáncer. Las respuestas morfológicas y cinéticas de varias células inmunes, por ejemplo, microglia y macrófagos, son característicos de la respuesta inmune del cuerpo. Aunque en la mayoría de los casos no es práctico ni posible controlar el comportamiento cinético de estas células, es bastante sencillo adquirir imágenes 3-dimensionales para recuperar su forma. Normalmente, las células inmunes asumen una forma compleja en tejido sano y de una forma mucho más simple bajo condiciones de inflamación o cancerosos18. Mientras que añadir las características dependientes del tiempo de estos cambios de forma a nuestra comprensión del desarrollo de la respuesta inmune, utilizando solamente la forma 3D de un grupo representativo de células también puede ser suficiente para determinar el carácter saludable o patológico de los tejidos.
Caracterización de la superficie 3-dimensional de una célula no es una tarea sencilla. La aplicación de armónicos esféricos es una manera de representar una superficie 3D con un número relativamente grande (50-70) de los componentes11,12. Además, la determinación de los armónicos esféricos es computacionalmente costoso; proyección de formas muy complejas en el ámbito de la unidad es imposible o muy difícil debido a la necesidad de aplicar varias rejillas de finura varia en la esfera de la unidad; Finalmente, la interpretación significativa de los espectros de los componentes de armónicos esféricos es lejos de ser trivial.
En nuestro trabajo presentada, reemplazamos la difícil tarea de análisis de superficies 3D directa con el enfoque mucho más simple de utilizar proyecciones 2D de la superficie original para obtener suficiente información morfológica para identificar las condiciones patológicas. Demostramos cada paso de este flujo de trabajo mediante el uso de datos de microscopia 3D de las células mieloides, mientras que claramente señalando que todos los pasos eran fáciles de completar, y los mapas 2 dimensiones resultantes fueron fáciles de interpretar.
Naturalmente, una proyección de 3D a 2D conducirá a pérdida de información sobre la estructura de la superficie. Nuestro conjunto de datos de ejemplo de microglia en un modelo murino de tumor cortical, era suficiente con seis ángulos al crear las proyecciones 2D. Sin embargo, formas más complejas o menos prominentes cambios morfológicos pueden requerir que un mayor número de proyecciones es creado con el fin de poder identificar confiablemente subgrupos de células con el SOM. Por este motivo, nuestro enfoque está diseñado para ser capaz de generar y analizar cualquier número de proyecciones. Simplemente eligiendo un número más alto de las proyecciones de formas más complejas, es posible aumentar la pérdida de información a un mínimo tolerable. Por ejemplo, el tipo de la célula interactúan en la figura 4a y 4b requeriría un mayor número de proyecciones para representar adecuadamente la superficie compleja.
Como cualquier método aproximado, el flujo de trabajo por la presente propuesta tuvo que probarse contra los resultados de un proceso de clasificación manual de microglia18. Los resultados presentados anteriormente confirman la confiabilidad del flujo de trabajo automatizado. Además, el flujo de trabajo es eficiente más tiempo en comparación con los análisis convencionales. El experto médico que las células de microglía manualmente necesita aproximadamente 4 semanas para su análisis del conjunto de datos, considerando que nuestro flujo de trabajo necesario sólo 1 día. La robustez de nuestro enfoque fue probada también claramente por la reproducibilidad de la SOM entrenado a un subconjunto de datos que pertenecían al mismo tipo de celular pero no fue utilizados para entrenar el SOM, como se muestra en la figura 3 c.
A pesar de que nuestro enfoque no considera información cinética, examinamos el efecto de la sincronización en el análisis de la forma basada en la DFT. El ejemplo más típico para el comportamiento dependiente del tiempo se encontró entre la población de células móviles, donde la contribución de los componentes más altos de la DFT indexadas claramente observable, como en la figura 4a. Esto llama la atención sobre la importancia de utilizar un número suficiente de componentes DFT tratándose de tipos celulares que suelen comportarse de una manera muy dependiente del tiempo. Debido a la naturaleza automatizada y velocidad de ejecución alta de nuestras herramientas de software, el aumento del número de componentes DFT y proyecciones aumentará la precisión y la fiabilidad de los resultados, mientras que no obstaculizará considerablemente el rendimiento computacional.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Benjamin Krause para la discusión fructífera y su apoyo. Los autores más gracias a Robert Günther por su ayuda con la microscopía de células vivas.
El trabajo contó con el apoyo financiero de la DFG NI1167/3-1 (JIMI) a R.N. y Z.C., DFG financiera apoyo CRC 1278 PolyTarget proyecto Z01 Z.C., C01 en TRR130 R.N. y SFB633, TRR130, Exc257 y J.B.S. A.E.H. La BfR apoyo intramural SFP1322-642 F.L.K y A.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaris 9.1.2, software | Bitplane, Zürich, Switzerland | v.9.1.2 | 3D image reconstruction and surface generation; this was used by us! |
| Blender 2.75a, software | https://www.blender.org/ | v.2.75a | 3D and 4D open source animation software; 2.75a is the required version for this Python |
| Fiji /ImageJ, software | https://fiji.sc/ | ImageJ v.1.52b | Open source multi-D image analysis toolkit |
| MATLAB | MathWorks, www.mathworks.com | R2017b | General computational mathematical software |
| MATLAB Machine Learning kit | MathWorks, www.mathworks.com | R2017b | Can only be used together with MATLAB |
| Fiji plugins: SHADE | https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis | v.1.0 | |
| Fiji plugins: ActiveContour | http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php? id=plugin:segmentation:active_contour:start |
absnake2 | |
| Computer | Any | NA | See Imaris instructions for minimum computer requirements |
References
- Masedunskas, A., et al. Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).
- Niesner, R. A., Hauser, A. E. Recent advances in dynamic intravital multi-photon microscopy. Cytometry A. 79 (10), 789-798 (2011).
- Ho, S. Y., et al. NeurphologyJ: an automatic neuronal morphology quantification method and its application in pharmacological discovery. BMC Bioinformatics. 12, 230 (2011).
- Yin, Z., et al. A screen for morphological complexity identifies regulators of switch-like transitions between discrete cell shapes. Nature Cell Biology. 15 (7), 860 (2013).
- Yu, H. Y., Lim, K. P., Xiong, S. J., Tan, L. P., Shim, W. Functional Morphometric Analysis in Cellular Behaviors: Shape and Size Matter. Advanced Healthcare Materials. 2 (9), (2013).
- Johnson, G. R., Buck, T. E., Sullivan, D. P., Rohde, G. K., Murphy, R. F. Joint modeling of cell and nuclear shape variation. Molecular Biology of the Cell. 26 (22), 4046-4056 (2015).
- Wang, S. -H., Cheng, H., Phillips, P., Zhang, Y. -D. Multiple Sclerosis Identification Based on Fractional Fourier Entropy and a Modified Jaya Algorithm. Entropy. 20 (4), 254 (2018).
- Kriegel, F. L., et al. Cell shape characterization and classification with discrete Fourier transforms and self-organizing maps. Cytometry Part A. 93 (3), 323-333 (2017).
- Styner, M., et al. Framework for the Statistical Shape Analysis of Brain Structures using SPHARM-PDM. Insight Journal. (1071), 242-250 (2006).
- El-Baz, A., et al. 3D shape analysis for early diagnosis of malignant lung nodules. Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention. 14 (Pt 3), 175-182 (2011).
- Williams, E. L., El-Baz, A., Nitzken, M., Switala, A. E., Casanova, M. F. Spherical harmonic analysis of cortical complexity in autism and dyslexia. Translational Neuroscience. 3 (1), 36-40 (2012).
- Kruggel, F. Robust parametrization of brain surface meshes. Medical Image Analysis. 12 (3), 291-299 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Kohonen, T. Essentials of the self-organizing map. Neural Networks. 37, 52-65 (2013).
- Andrey, P., Boudier, T. Adaptive Active Contours. ImageJ user and developer conference. , Luxembourg. (2006).
- Burger, W., Burge, M. J. Principles of Digital Image Processing. , Springer-Verlag. (2013).
- Lestrel, P. E. Fourier Descriptors and their Applications in Biology. , Cambridge University Press. (2008).
- Bayerl, S. H., et al. Time lapse in vivo microscopy reveals distinct dynamics of microglia-tumor environment interactions-a new role for the tumor perivascular space as highway for trafficking microglia. Glia. 64 (7), 1210-1226 (2016).
