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Cancer Research

विज्ञान आधारित-स्वस्थ और रोग की कोशिकाओं के बीच अंतर का उपयोग रूपान्तर रूपांतरण और आत्म आयोजन नक्शे

Published: October 28, 2018 doi: 10.3791/58543
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 3, 2,3, 2, *1, *4
1Department of Chemical and Product Safety, German Federal Institute for Risk Assessment (BfR), 2Deutsches Rheuma-Forschungszentrum (DRFZ) Berlin, a Leibniz Institute, 3Charité Universitätsmedizin Berlin, 4Applied Systems Biology, Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology Hans Knöll Institute
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एक कार्यप्रवाह है कि उनके 3 आयामी आकार के आधार पर स्वस्थ और रोग कोशिकाओं की पहचान की अनुमति देता है प्रदान करते हैं । हम 3d प्रक्षेपण पर आधारित रूपरेखा का उपयोग करने की प्रक्रिया का वर्णन 3 डी के लिए एक आत्म-नक्शा है कि जांच सेल आबादी का उद्देश्य clustering प्रदान करेगा आयोजन को प्रशिक्षित सतहों ।

Abstract

उपस्थिति और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के आंदोलनों उनके पर्यावरण से प्रेरित हैं । एक रोगज़नक़ आक्रमण करने के लिए एक प्रतिक्रिया के रूप में, प्रतिरक्षा कोशिकाओं सूजन की साइट पर भर्ती कर रहे हैं और आक्रमण के आगे प्रसार को रोकने के लिए सक्रिय कर रहे हैं । यह भी व्यवहार में परिवर्तन और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूपात्मक उपस्थिति के द्वारा परिलक्षित होता है । कैंसर ऊतक में, समान morphokinetic परिवर्तन microglial कोशिकाओं के व्यवहार में देखा गया है: इंट्रा ट्यूमर microglia कम जटिल 3 आयामी आकार है, कम शाखाओं वाले सेलुलर प्रक्रियाओं, और स्वस्थ में उन से अधिक तेजी से कदम ऊतक. ऐसे morphokinetic गुणों की परीक्षा में जटिल 3डी माइक्रोस्कोपी तकनीक की आवश्यकता होती है, जो longitudinally को निष्पादित करते समय अत्यंत चुनौतीपूर्ण हो सकती है । इसलिए, एक सेल के एक स्थिर 3d आकार की रिकॉर्डिंग बहुत आसान है, क्योंकि यह intravital माप की आवश्यकता नहीं है और के रूप में अच्छी तरह से उत्पाद के ऊतकों पर किया जा सकता है । हालांकि, यह विश्लेषण उपकरण है कि 3 डी आकार की तेजी से और सटीक वर्णन की अनुमति देने और स्वस्थ और रोगजनक ऊतक नमूनों के नैदानिक वर्गीकरण केवल स्थिर, आकार से संबंधित जानकारी पर आधारित की अनुमति देता है के लिए आवश्यक है । यहां, हम एक toolkit कि आत्म-आयोजन नक्शे के माध्यम से 3d कोशिका के 2 डी अनुमानों का एक सेट की रूपरेखा के असतत रूपान्तर घटकों का विश्लेषण करती है वर्तमान । कृत्रिम खुफिया तरीकों के आवेदन हमारे ढांचे के रूप में यह अधिक से अधिक ऊतक नमूनों के लिए लागू किया जाता है के रूप में विभिन्न कोशिका आकृतियों के बारे में जानने के लिए अनुमति देता है, whilst कार्यप्रवाह सरल रहता है.

Introduction

जैविक ऊतक के रोग की स्थिति का समय पर, सरल और सटीक निर्धारण जैव चिकित्सा अनुसंधान में सबसे अधिक ब्याज की है । माउस मॉडल जटिल 3 डी और 4d (3 स्थानिक आयामों और समय) सूक्ष्म तकनीक के साथ संयोजन में रोग की स्थिति, जैसे प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं या कैंसर के विकास, की एक सीमा का अध्ययन करने के लिए साधन प्रदान करते हैं । सूक्ष्म अध्ययन intravital या उत्पाद-ऊतक 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी, हल्की चादर माइक्रोस्कोपी के माध्यम से किया जा सकता है, और-फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा-लगभग १०० µm की एक सीमित ऊतक गहराई करने के लिए. आदेश में शारीरिक या रोग की स्थिति के तहत कोशिकाओं के व्यवहार के बारे में समय से संबंधित जानकारी के लिए, यह समय की एक विस्तारित अवधि के लिए ऊतक पर नजर रखने के लिए आवश्यक है, जो आम तौर पर intravital इमेजिंग1,2 की आवश्यकता है . स्वाभाविक रूप से, इस तकनीक की प्रयोज्यता अपनी इनवेसिव के कारण पशु मॉडलों तक ही सीमित है । गैर इनवेसिव तकनीक टोमोग्राफी तरीकों की एक किस्म (MSOT, सीटी, आदि) सहित मानव अनुप्रयोगों, के लिए भी उपलब्ध हैं, लेकिन इन तरीकों सभी आवश्यक स्थानिक कमी-और अक्सर लौकिक संकल्प सेलुलर स्तर पर व्यवहार का अध्ययन करने के लिए ।

स्थैतिक कोशिकाओं के प्रकटन के बारे में जानकारी और अधिक आसानी से विभिंन 3 डी इमेजिंग उत्पादीय ऊतक नमूनों पर मार डाला तकनीकों के माध्यम से सुलभ हो सकता है । यहां, कोशिकाओं के काइनेटिक व्यवहार मापा नहीं है, इस प्रकार यह उपंयास विश्लेषण तकनीक है कि केवल उनकी आकृति विज्ञान3पर आधारित जांच की कोशिकाओं की रोगजनक स्थिति निर्धारित करने में सक्षम है अपनाने के लिए आवश्यक है । इस तरह के एक दृष्टिकोण के लिए कक्ष आकार और ऊतक textures रोग व्यवहार4,5,6से लिंक किया गया था ।

यहां वर्णित नई तकनीक में, कोशिकाओं को 3d सतहों के रूप में खंगाला जाता है और उनकी आकृतियों को 3d-2d अनुमानों और परवर्ती रूपान्तर आधारित परिधि-आकृति विश्लेषण7,8के माध्यम से पहचाना जाता है । आयामों को 3 से 2 तक कम करके, समस्या को सरलीकृत किया गया है । यह भी यह चिकित्सा9छवियों के लिए किया गया है के रूप में गोलाकार harmonics विश्लेषण लागू करने के द्वारा 3 डी में सतहों सेल की विशेषता के लिए संभव है. हालांकि, गोलाकार harmonics अच्छी तरह से तेज और बीहड़ आकार को संभाल नहीं, इकाई क्षेत्र पर स्थापित किया जा करने के लिए एक बहु-स्केल ग्रिड की आवश्यकता होती है. इसके अलावा, आवश्यक गोलाकार harmonics घटकों की संख्या बड़ी (50-70), अंतर्निहित गणना बहुत मांग और परिणाम10,11,12व्याख्या करने के लिए मुश्किल के साथ हो सकता है ।

हमारे नए प्रस्तावित विधि के साथ, कार्य 2d आकार वर्णन है, जहां 2 डी अनुमानों की संख्या विश्लेषक पर निर्भर है की एक श्रृंखला के लिए कम है और 3 डी आकार की जटिलता के अनुसार समायोजित किया जा सकता है । अनुमानों एक अजगर स्क्रिप्ट है कि एक 3 डी एनीमेशन उपकरण के अंदर चलाता है के माध्यम से स्वचालित रूप से उत्पंन कर रहे हैं । 2 डी अनुमानों असतत रूपान्तर के द्वारा वर्णित है रूपांतर (DFT) उनकी परिधि के घटकों, एक फिजी13 प्लगइन है कि हमारे सॉफ्टवेयर पैकेज के भाग के रूप में यहां प्रदान की जाती है द्वारा गणना की । DFT यहां लागू किया जाता है ताकि पाप और क्योंकि कार्यों की एक श्रृंखला में सेल के जटिल रूपरेखा विघटित करने के लिए । इस तरह, हम DFT घटकों की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या के साथ रूपरेखा का वर्णन कर सकते हैं, इस प्रकार समस्या की जटिलता को कम करने (अधिक जानकारी के लिए देखें समीकरण अनुभाग) । DFT अवयव एक प्रशिक्षित स्वयं में डाल रहे है नक्शे का आयोजन (सोम14), जहां आकार क्लस्टर के अस्तित्व को निष्पक्ष8परीक्षण किया जा सकता है । SOMs कृत्रिम बुद्धि के क्षेत्र से एक प्रतिस्पर्धी और पर्यवेक्षणीय शिक्षण उपकरण प्रदान करते हैं । वे एक भारित पड़ोस दूरी समारोह के माध्यम से एक दूसरे के साथ संवाद जो कृत्रिम ंयूरॉंस की एक लिंक सरणी से मिलकर बनता है । न्यूरॉन सिस्टम इनपुट डेटासेट के पहले तत्व के लिए प्रतिक्रिया करता है और न्यूरॉन्स जिसका जवाब सबसे मजबूत है "समूहीकृत" एक दूसरे के पास. के रूप में तंत्रिका तंत्र और अधिक से अधिक इनपुट प्राप्त करता है, डेटा न्यूरॉन्स कि लगातार प्रतिक्रिया जोरदार रूप से प्रणाली के भीतर क्लस्टर परिभाषित करने के लिए शुरू । एक बड़े डेटासेट कि DFT घटकों का एक सेट के रूप में 2d आकार जानकारी शामिल है पर उचित प्रशिक्षण के बाद, किसी भी व्यक्ति सेल के DFT घटकों प्रशिक्षित सोम में रखा जा सकता है और पता चलता है कि क्या सेल की संभावना स्वस्थ या रोगजनक सेल समूह के अंतर्गत आता है । हम इस तरह के उपकरण वैज्ञानिक और नैदानिक निदान के तरीकों के लिए एक महान इसके अलावा बनने की उम्मीद है ।

Protocol

1. प्रोटोकॉल आवश्यकताएँ

  1. उच्च संकल्प प्राप्त deconvolved तीन आयामी (3 डी) एक नमूना अंतराल के साथ Nyquist कसौटी के साथ अनुपालन में माइक्रोस्कोपिक डेटा deconvolved के लिए एक उच्च रिज़ॉल्यूशन छवि प्राप्त करने के लिए नमूना के उच्चतम स्थानिक आवृत्ति में कम से दो बार.
  2. सतह पुनर्निर्माण और निर्यात के लिए 3 डी प्रतिपादन सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें ।
  3. अजगर स्क्रिप्ट चलाने में सक्षम 3 डी एनिमेशन सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें (अजगर स्क्रिप्ट github भंडार से डाउनलोड किया जा सकता है: https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis) 2 डी अनुमानों बनाने के लिए ।
  4. 2 डी अनुमानों का विश्लेषण और DFT घटकों को निकालने के लिए फिजी13 का उपयोग करें ।
    1. वर्तमान फिजी वितरण का उपयोग करें । यदि फिजी का कोई स्थापित संस्करण पहले से मौजूद है, तो सुनिश्चित करें कि स्थापित संस्करण नवीनतम है । इस सहायता को चलाकर आसानी से प्राप्त किया जा सकता है | अद्यतन विकल्प ।
    2. सक्रिय समोच्च प्लगइन15का प्रयोग करें, जो http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=plugin:segmentation:active_contour:start से डाउनलोड किया जा सकता है और plugins फ़ोल्डर में नकल की जानी चाहिए ।
    3. डाउनलोड github भंडार से छाया फिजी प्लगइन और plugins फ़ोल्डर में कॉपी ।
  5. गणना गणित सॉफ्टवेयर स्व का आयोजन नक्शे की गणना करने में सक्षम का प्रयोग करें ।

2.3 डी छवि को खंगाला ।

नोट: परीक्षण प्रयोजनों के लिए, एक उदाहरण डेटासेट github भंडार में प्रदान की गई है (ऊपर देखें) ।

  1. 3 डी पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर शुरू और 3 डी छवि डेटा खोलें ।
  2. (सभी) ऑब्जेक्ट (ऑब्जेक्ट्स) का 3d सरफ़ेस बनाएं ।
    1. 3d दृश्य विकल्प का चयन करें और सतहोंपर क्लिक करें । सतह निर्माण विज़ार्ड के साथ आगे बढ़ने के लिए अगला बटन (सफ़ेद त्रिभुज के साथ नीला वृत्त) पर क्लिक करें ।
    2. सतह पुनर्निर्माण के लिए छवि चैनल का चयन करें ।
    3. छिद्रित सतहों से बचने के लिए एक स्मूथिंग फंक्शन लागू करें ।
      1. एक चिकनी मूल्य है कि सतह के विवरण को छिपाने नहीं है, लेकिन असुरक्षित सतहों से बचा जाता है चुनें ।
    4. सतहों को ढूँढने के लिए एक थ्रेशोल्ड विधि का चयन करें ।
      1. एक निरपेक्ष तीव्रता सीमा का उपयोग करें जब वस्तुओं अच्छी तरह से पृष्ठभूमि से अलग कर रहे है और एक लगभग समान चमक स्तर है ।
      2. एक स्थानीय विपरीत सीमा लागू करें जब वस्तुओं उनकी तीव्रता में भिंनता है, लेकिन अभी भी स्थानीय पृष्ठभूमि से और उंहें आसपास के अंय वस्तुओं से अलग किया जा सकता है । स्थानीय थ्रेशोल्ड खोज क्षेत्र को खंगाला गया ऑब्जेक्ट के अपेक्षित व्यास के मान के अनुसार सेट करें ।
    5. रूपात्मक ब्याज के मापदंडों, जैसे, मात्रा, sphericity, सतह से मात्रा अनुपात, आदिके अनुसार खंगाला सतहों फ़िल्टर, और सतह पुनर्निर्माण समाप्त...
  3. सहेजें और एक प्रारूप है कि अगले चरण में इस्तेमाल किया जाएगा कि 3 डी एनिमेशन सॉफ्टवेयर के साथ संगत है में उत्पंन सतहों निर्यात ।

3.3d पुनर्निर्माण सतहों 2 डी अनुमानों में बदलना

  1. ब्लेंडर प्रारंभ करें और दाईं ओर विंडो में आउटपुट टैब पर जाएँ । ड्रॉपडाउन मेनू से TIFF स्वरूप का चयन करें और रंग गहराई 8 बिट आरजीबीए के लिए सेट है ।
  2. स्क्रिप्टिंग मोड में स्विच करें और इस कार्य (https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis) के साथ प्रदान किए गए रिपॉसिटरी से प्रदान की गई स्क्रिप्ट फ़ाइल "GUI_AutoRotate. py" खोलें ।
  3. भागो स्क्रिप्टपर क्लिक करें । इनपुट के लिए संकेत दिए जाने पर wrl फ़ाइलों के फ़ोल्डर का चयन करें ।
  4. यदि आवश्यक हो, और अधिक घुमाव बनाने के लिए जब अधिक जटिल सतहों के साथ काम: जीयूआई में जाओ और 6 से ऊपर एक मूल्य के लिए बॉक्स घुमाव सेट ।
    नोट: 6 अलग कोणों के रोटेशन के लिए विभिंन कोशिका आबादी भेद पर्याप्त हो सकता है । यह सतह प्रति से कम छह घुमाव, संभावित जानकारी हानि के कारण बनाने के लिए अनुशंसित नहीं है ।
  5. जीयूआई में घुमाएँ बटन पर क्लिक करके स्क्रिप्ट भागो । इनपुट फ़ोल्डर (चरण २.३) के रूप में उपयोग किया गया था एक ही फ़ोल्डर में व्यक्तिगत सतहों के अनुमानों को सहेजें । डिफ़ॉल्ट रूप से, छवियों एक 8 bit Tiff प्रारूप में बच रहे है (२.१ कदम देखें), जो फिजी प्लगइन छाया द्वारा आवश्यक प्रारूप है ।

4. परिधि का पता लगाएं और फिजी का उपयोग करके रूपान्तर घटकों की गणना करें ।

  1. फिजी खोलें और Plugins मेनू में छाया का चयन करें । डिफ़ॉल्ट मानों के साथ प्रारंभ करें और पैरामीटर्स को बाद में फ़ाइन-ट्यून करते हैं. प्रोग्राम चलाने के लिए तैयार होने पर ठीक क्लिक करें ।
    1. इनपुट छवि के थ्रेशोल्ड के लिए ग्रेडिएंट थ्रेशोल्ड मान चुनें.
    2. पुनरावृत्तियों की संख्याचुनें. पुनरावृत्ति मान की अधिक संख्या , परिधि के पुनर्निर्माण की अधिक सटीक । सरल आकृतियों के लिए, निंन संख्या सामांयत: पर्याप्त होती है ।
    3. कितना बड़ा प्रारंभ मास्क वास्तविक कक्ष की तुलना है, यह निर्धारित करने के लिए फैलाव पैरामीटर की संख्या का उपयोग करें । आमतौर पर अधिक जटिल आकार उचित परिधि खोजने के लिए और अधिक फैलाव कदम की जरूरत है ।
    4. यदि अनुमानित आकृतियाँ पृष्ठभूमि से अधिक चमकीले हैं, तो डार्क पृष्ठभूमि चेकबॉक्स जाँचें.
    5. केवल एक छोटे परीक्षण dataset छाया की कार्यक्षमता निर्धारित करने के लिए का उपयोग करते समय मध्यवर्ती परिणाम दिखाएँ चेकबॉक्स को सक्रिय करें । बड़े डेटासेट के लिए इस विकल्प को सक्रिय करने से गणनात्मक दक्षता कम हो जाती है और संभवत: कम वीडियो मेमोरी वाली प्रणाली रुक सकती है ।
    6. चरण 5 के लिए कोई इनपुट के रूप में छाया के परिणाम का उपयोग करने के लिए परिणाम तालिका सहेजें चेकबॉक्स को चेक करें । यदि बॉक्स चेक किया गया है, तो सभी परिणाम व्यक्तिगत csv फ़ाइलों में सहेजे जाते हैं. आउटपुट डेटा का सारांश हमेशा "Result_collection_of_all_DFT_calculations. csv" नामक फ़ाइल में जेनरेट होता है.
  2. जिसमें चरण 3 में बनाए गए TIFF फ़ाइलें इनपुट डेटा फ़ोल्डर का चयन करें ।
  3. आउटपुट डेटा फ़ोल्डर प्रदान करें ।
  4. प्लगइन प्रारंभ करने के लिए ठीक क्लिक करें ।

5. स्व-आयोजन नक्शे

नोट: सोम नेटवर्क केवल डेटा वर्गीकृत करने में सक्षम है जब वे एक बड़े डेटासेट जो सभी अपेक्षित सेल प्रकार और शर्तों से इनपुट शामिल है पर प्रशिक्षित किया जाता है । प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए, इस तरह के एक डेटासेट प्रदान की जाती है और हमारे भंडार में पाया जा सकता है ("AllCells_summary_normalised. csv" https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis से

  1. इन दिशानिर्देशों का पालन करें यदि इनपुट डेटा के लिए अभी तक कोई प्रशिक्षित सोम उपलब्ध नहीं है; अंयथा ५.२ कदम के लिए आगे बढ़ना ।
    1. एक गणना गणितीय सॉफ्टवेयर तंत्रिका नेटवर्क वर्गीकरण प्रदर्शन करने में सक्षम शुरू करते हैं ।
    2. एक डेटा फ़ाइल का चयन करें सोम नेटवर्क प्रशिक्षण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । इस डेटासेट में सभी प्रायोगिक परिस्थितियां होनी चाहिए ताकि सोम को विशेष प्रकार के सेल प्रकारों और प्रायोगिक स्थितियों पर प्रशिक्षित कर सकें ।
      नोट: यह भी प्रणाली के परीक्षण के लिए प्रदान की AllCells_summary_normalised. csv का उपयोग करने के लिए संभव है ।
    3. प्रशिक्षण शुरू करें और आगे बढ़ने से पहले प्रशिक्षण पूरा होने तक प्रतीक्षा करें । डिफ़ॉल्ट रूप से, स्क्रिप्ट २००० पुनरावृत्तियां ("कछु") चलाने के लिए सेट किया गया है ।
      नोट: पुनरावृत्तियों की संख्या सोम की सीखने की दर पर निर्भर करता है । इनपुट डेटा के आधार पर यह कछु के दोनों उच्च और कम संख्या का परीक्षण और सोम के पैटर्न की स्थिरता का पालन करने के लिए सलाह दी जाती है. प्रदान स्क्रिप्ट का उपयोग करते हैं, पुनरावृत्तियों की संख्या पंक्ति ३२ के अंतर्गत बदला जा सकता है । नेटवर्क आकार ३४ लाइन में बदला जा सकता है (डिफ़ॉल्ट रूप से 12 से 12 के लिए सेट है) ।
    4. प्रशिक्षण समाप्त होने के बाद, नेटवर्क की टोपोलॉजी (पड़ोसी दूरी, इनपुट विमानों, नमूना हिट, आदि) की जांच करें । नेटवर्क अब प्रशिक्षित है और भविष्य के उपयोग के लिए बचाया जा सकता है ।
  2. सोम में लोड, जब एक पहले से ही प्रशिक्षित नक्शे का उपयोग कर (यह या तो ५.१ कदम से या अंय स्रोतों से आ सकते हैं) के क्रम में एक dataset क्लस्टर के लिए ।
    1. आयात किया जा करने के लिए है कि csv फ़ाइल को लोड प्रशिक्षित सोम के साथ. जब छाया प्लगइन द्वारा तैयार डेटा का उपयोग कर चरण 4 से छाया प्लगइन के सीएसवी उत्पादन का चयन करें.
      नोट: यह भी संभव है उदाहरण डेटा फ़ाइलों का उपयोग करें "InteractingCells_summary_normalised. csv", "MobileCells_summary_normalised. csv" या "PhagocytosingCells_summary_normalised. csv" कि github के माध्यम से प्रदान की जाती हैं ।
    2. वर्गीकरण के समाप्त होने के बाद, चरण 5.1.5 के रूप में सोम के परिणामों का मूल्यांकन करें ।
      1. csv फ़ाइल से उत्पंन hitmap की जांच करें । नक्शे के प्रत्येक सेल से पता चलता है कि कितने बार डेटासेट "हिट" कि प्रशिक्षित सोम के विशेष सेल । जब कक्षों का एक समूह इस मैप के किसी छोटे क्षेत्र में संकुलित होता है, तो यह इंगित करता है कि डेटासेट काफी समरूप है. एकाधिक क्लस्टर की संभावना है कि उपसमूह dataset में मौजूद इंगित करेगा ।
      2. पड़ोस वजन दूरी की जांच करें । इस नक्शे के क्षेत्रों है कि अच्छी तरह से अलग कर रहे है वस्तुओं के समूहों के अनुरूप है कि देखने के सोम बिंदु से बहुत अलग बर्ताव करते हैं । इनपुट डेटा के रूप में DFT घटकों के साथ, इसका अर्थ है कि इन कक्ष समूहों के पास संगत 3d सतहों की बहुत भिंन आकृतियां हैं ।
      3. सुविधा वेक्टर के प्रत्येक तत्व के योगदान के बारे में जानकारी के लिए वजन विमानों की जांच करें । पहले वर्णित के रूप में 20 DFT घटकों का उपयोग करने के मामले में, 19 नक्शे यहां दिखाई देगा । प्रदान किए गए उदाहरण डेटासेट का उपयोग करते समय, पहले 5 या 6 वजन वाले विमान अलग होंगे, लेकिन उनमें से बाकी काफी समान दिखाई देंगे । इस मामले में यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि यह लगभग 7 DFT घटकों का उपयोग करने के लिए पर्याप्त होगा ।

Representative Results

हमने कक्ष अनुमानों के संगत आकृति के मुख्य घटकों की गणना करने के लिए एक DFT लागू किया है । का रूपान्तर वर्णनकर्ता DFT एल्गोरिथ्म लागू करने के द्वारा प्राप्त किए गए थे xy-समंवय जोड़े के सज्जित परिधि कक्ष अनुमानों, हमारे कार्यप्रवाह के AbSnake भाग के आउटपुट के रूप में प्राप्त की । इन xycoordinate जोड़े एक जटिल मूल्य 2 डी वेक्टर "जी" के रूप में नियंत्रित किया जा सकता है:
Equation 1

वेक्टर "जी" से, हम DFT का उपयोग करने के लिए जटिल मूल्य रूपान्तर स्पेक्ट्रम की गणना:
Equation 2
असतत रूपान्तर स्पेक्ट्रम के प्रसिद्ध फार्मूले के आधार पर, और जटिल संख्या के लेबल का उपयोग कर के रूप में "जी":
Equation 3
हम मिल:
Equation 41
हम असली की गणना कर सकते है ("एक") और काल्पनिक ("बी") के Equation 5 घटक:
Equation 62
Equation 73
यहां, पहली DFT घटक जी0 से मेल खाती है = 0, जो देता है:
Equation 84
Equation 95
फलस्वरूप, यह घटक मूल ऑब्जेक्ट के ज्यामितीय केंद्र का वर्णन करता है ।
DFT फॉरवर्ड स्पेक्ट्रम, जी1के दूसरे तत्व, एम = 1 से मेल खाती है:
Equation 10
Equation 116

Eq .6 से हम निष्कर्ष है कि इन बिंदुओं के एक त्रिज्या के साथ एक चक्र फार्म और Equation 12 कोण Equation 13 शुरू, जहां चक्र एक पूर्ण क्रांति का वर्णन करता है, जबकि आकार एक बार पता लगाया है । सर्कल के केंद्र मूल (0, 0) पर स्थित है, त्रिज्या है । छ1| और प्रारंभिक बिंदु है:

Equation 14Equation 157

सामान्य रूप में, एक एकल रूपान्तर गुणांक Equation 16 के लिए, निर्देशांकों के रूप में वर्णित हैं:

Equation 17
Equation 188

इसी तरह eq .6, eq .8 भी एक चक्र का वर्णन करता है, लेकिन आरएम= के एक त्रिज्या के साथ । जीएम।, एक प्रारंभिक कोण Equation 19 और एक प्रारंभिक बिंदु पर Equation 20 , जहां समोच्च एक बार पता लगाया है के माध्यम से सर्कल "एम" पूरी कक्षाओं16,17चलाता है ।

सोम इनपुट के रूप में आकार पैरामीटर्स
चित्रा 1में वर्णित के रूप में, कार्यप्रवाह, एक deconvolved (एक मापा बिंदु प्रसार समारोह का उपयोग कर) के लिए लागू किया गया था intravital microglial कोशिकाओं के बहु-फोटॉन माइक्रोस्कोपी डेटासेट स्वस्थ या कैंसर रूपात्मक में उनके cortical परिवर्तन की विशेषता के लिए 18ऊतक । बीस DFT घटकों को खंगाला 3d सतहों के प्रत्येक 2d प्रक्षेपण के लिए गणना की गई और परिणाम सोम प्रशिक्षण के लिए एक इनपुट के रूप में इस्तेमाल किया गया । शारीरिक स्थितियों के तहत, microglia के साथ एक जटिल आकार प्रस्तुत एकाधिक, उच्च शाखाओं में संसाधित (चित्रा 2a) । जब एक कैंसर वातावरण में रखा (cortical ट्यूमर मॉडल), microglia एक सरल, अधिक धुरी की तरह आकार (चित्रा बी) को बदल दिया ।

प्रशिक्षित सोम को स्वस्थ और कैंसर कोशिकाओं के बीच अंतर करने की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए परीक्षण किया गया था । स्वस्थ सेल जनसंख्या सोम (चित्रा 2c) के एक एकल क्षेत्र पर पेश किया गया था । सोम एक dumbbell के आकार का सक्रिय क्षेत्र (चित्रा 2d) के साथ कैंसर microglia डेटासेट के लिए जवाब दिया । एक अंधा मिश्रित इनपुट डेटा सेट है कि दोनों स्वस्थ और कैंसर समूह से DFT आकार घटकों के शामिल दो अलग समूहों में सोम द्वारा पेश किया गया था, अपने व्यक्तिगत रूप से अलग समूहों के उन लोगों के समान आकार रखने whilst ( चित्रा 2e; 2c और 2d) के साथ तुलना करें । यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि मिश्रित dataset सफलतापूर्वक सोम द्वारा clustered किया गया था ।

हम एक चिकित्सा विशेषज्ञ, जो उनके spatio-लौकिक व्यवहार के आधार पर डेटासेट वर्गीकृत द्वारा एक ही डेटा के मैनुअल विश्लेषण के साथ अपने अनुमानों की तुलना द्वारा सोम के प्रदर्शन का परीक्षण किया । विशेषज्ञ चार विशिष्ट सेल समूहों की पहचान (कोशिकाओं को आराम, phagocytosing कोशिकाओं, बातचीत कोशिकाओं, और मोबाइल कोशिकाओं18), जो खंगाला और एक 12x12 सोम ट्रेन इस्तेमाल किया गया । प्रशिक्षित नेटवर्क (चित्रा 3ए) उच्च हिट मूल्य कृत्रिम ंयूरॉंस के समूहों, विशेष रूप से नीचे छोड़ दिया और सोम के मध्य क्षेत्रों में दिखाता है । प्रशिक्षित नेटवर्क की प्रतिक्रिया भी चार बेतरतीब ढंग से चयनित उपसमुच्चय के साथ परीक्षण किया गया था (जो प्रशिक्षण डेटासेट का हिस्सा नहीं थे) छवियों के चार विशेषज्ञ18द्वारा पहचान के समूहों से । ये छवि उपसमुच्चय सोम द्वारा चार अच्छी तरह से परिभाषित प्रतिक्रियाओं के परिणामस्वरूप, के रूप में चित्र बीमें दिखाया गया है । आराम करने की कोशिकाओं को सबसे जटिल आकार प्रदर्शन और तंत्रिका नेटवर्क के भीतर उच्चतम जुदाई स्तर दिखाया (बी "पैनल" आराम ") । अंय तीन की पहचान की सेल प्रकार के नीचे बाएं कोने में सोम का एक आम क्षेत्र साझा, लेकिन अंयथा सोम से अलग थे । नीचे बाएं कोने सोम क्षेत्र इस प्रकार कम सूचकांक DFT मूल्यों से मेल खाती है ।

सोम दृष्टिकोण की मजबूती एक ही-आराम-सेल प्रकार (प्रशिक्षण डेटासेट का हिस्सा नहीं) के तीन यादृच्छिक सबसेट के साथ प्रशिक्षित सोम का उपयोग करके परीक्षण किया गया था । इस इनपुट के लिए सोम की प्रतिक्रिया एक बहुत ही समान प्रतिक्रिया (आंकड़ा 3सी, सबसेट 1-3) प्रदर्शित करता है, हमारे दृष्टिकोण की मजबूती का प्रदर्शन ।

समय-निर्भर कक्ष आकृति परिवर्तन ठीक DFT द्वारा विशेषता है
DFT घटकों पर कक्ष आकृति के समय-निर्भर परिवर्तनों के प्रभाव की जांच करने के लिए, एक उप-समूह ( चित्र4 देखें) प्रति तीन कक्षों को 13 से 28 समय बिंदुओं के लिए ट्रैक किया गया था । चित्रा 4 एक मोबाइल सेल (चित्र 4a) और एक बातचीत सेल (चित्रा 4b) है, जो समय के एक समारोह के रूप में रची गई थी की पहली दस DFT घटकों से पता चलता है । मोबाइल सेल एक स्थाई रूप से बदल आकार प्रदर्शित (अनुपूरक 8में 4 वीडियो देखें), जो किसी न किसी DFT सतह से परिलक्षित होता है । बातचीत सेल के लिए समय पाठ्यक्रम के पहले तीसरे में DFT आयाम के फटने तेज और विशाल सेल आकार में परिवर्तन के साथ मेल खाना 8में अनुपूरक वीडियो 5 में दिखाया गया है ।

सभी 19 DFT घटकों के समय पाठ्यक्रम भी एक मोबाइल सेल (चित्रा 5) और एक बातचीत सेल (चित्रा 5b) की ट्रैकिंग के दौरान तीन अलग समय बिंदुओं पर इन दो कोशिकाओं के लिए विशेषता थी । सीधा अक्ष इसके द्वारा छह रोटेशन कोण का प्रतिनिधित्व करते है और संकेत मिलता है कि सभी अनुमानों दोनों प्रकार के कोशिका के लिए आकार के लक्षण वर्णन के लिए समान रूप से महत्वपूर्ण हैं ।

Figure 1
चित्र 1. कक्षों के आकार पर आधारित कक्ष क्लस्टरिंग की पहचान करने के लिए डेटा संसाधन का चरण दर चरण वर्कफ़्लो । 3 डी में पुनर्निर्माण सतहों स्वचालित 3 डी-2d अनुमानों के लिए ब्लेंडर के लिए इनपुट के रूप में इस्तेमाल किया गया । प्रत्येक प्रक्षेपण की परिधि स्थित थी और DFT घटकों की गणना की गई थी. घटक Matlab में एक प्रशिक्षित सोम को या तो एक इनपुट के रूप में सेवा की है, या एक नया सोम ट्रेन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. माउस के ठेठ उपस्थिति नियंत्रण शर्तों के तहत cortical microglia कोशिकाओं (ए) और कैंसर ऊतक में (ख) reconstructed microglia सतहों के स्क्रीनशॉट । सोम अनुमानों माउस प्रांतस्था से microglia नमूनों के तीन समूहों से बनाए गए थे: नियंत्रण (गैर-ट्यूमर) कोशिकाओं (ग), ट्यूमर कोशिकाओं (घ), और कोशिकाओं की एक मिश्रित जनसंख्या (ई). यह आंकड़ा8अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. (a, left) स्वयं एक माउस के नक्शे का आयोजन microglia डेटासेट ७६८ इनपुट सुविधा वैक्टर शामिल । डेटासेट एक 12x12 कृत्रिम तंत्रिका नेटवर्क को प्रशिक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, षट्कोणीय पड़ोस ज्यामिति, यादृच्छिक प्रारंभ और २००० कछु का उपयोग. (a, right) इसी सोम इनपुट विमानों के पहले 10 DFT घटकों (ख) में चित्रित सोम की प्रतिक्रियाएं (क), एक यादृच्छिक VRML फ़ाइल सबसेट चार सेल प्रकार से प्रत्येक के लिए "मोबाइल," "बातचीत," "आराम," और "phagocytic" पहले के रूप में चित्रा 5 में वर्णित Bayerl एट अल. 18. (ग) के रूप में एक ही सोम के जवाब में (एक, बाएं) पूरे डेटासेट के तीन यादृच्छिक सबसेट (जो इस प्रकार प्रशिक्षण डेटासेट का हिस्सा नहीं थे) के "आराम कोशिकाओं"-प्रकार 3d सतहों । तीन प्रतिक्रियाओं के बीच समानता उल्लेखनीय है । यह आंकड़ा8अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. (एक) माउस microglia के एक intravital इमेजिंग प्रयोग के दौरान पहले 10 DFT घटकों के समय निर्भरता । यह पैनल "मोबाइल सेल" प्रकार के एक सेल के लिए डेटा दिखाता है । x-अक्ष ६० s समय रिज़ॉल्यूशन पर प्रयोग के समय बिंदुओं से मेल खाती है, y-अक्ष DFT घटकों के आयाम को मनमाने ढंग से इकाइयों (a.u.) में दिखाता है, जबकि z-अक्ष 1 से 10 तक DFT घटक से मेल खाती है. (ख) के रूप में (क) लेकिन "बातचीत की कोशिकाओं" प्रकार के एक सेल के लिए । यह आंकड़ा8अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5. (a) प्रारंभ में, मध्य में और प्रयोग के अंत में "मोबाइल कक्ष" प्रकार के किसी कक्ष के सभी 19 DFT घटकों का व्यवहार । x-अक्ष पर संख्या 1 से 19 तक DFT घटक ID से संबंधित है । y-अक्ष DFT घटक आयाम में मनमाने ढंग से दिखाता है इकाइयों (a.u.), whilst z-अक्ष छह यादृच्छिक रोटेशन कोण के निशान । (b) समान रूप में (a) लेकिन "सहभागिता कक्ष" प्रकार के कक्ष के लिए । यह आंकड़ा8अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

छोटे, बरकरार ऊतक नमूनों का उपयोग कर संभावित रोग की स्थिति की पहचान उच्च महत्व का है । ऐसी तकनीक संक्रामक रोगों और आक्रामक प्रकार के कैंसर के लिए एक समय पर प्रतिक्रिया का आश्वासन देगा । विभिंन प्रतिरक्षा कोशिकाओं के काइनेटिक और रूपात्मक प्रतिक्रियाओं, जैसे, microglia और मैक्रोफेज, शरीर की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की विशेषता है । हालांकि ज्यादातर मामलों में यह व्यावहारिक या भी इन कोशिकाओं के काइनेटिक व्यवहार पर नजर रखने के लिए संभव नहीं है, यह काफी 3 आयामी छवियों को प्राप्त करने के लिए अपने आकार को पुनः प्राप्त सरल है । आमतौर पर, प्रतिरक्षा कोशिकाओं को स्वस्थ ऊतक में एक जटिल आकार और सूजन या कैंसर की स्थिति के तहत एक बहुत सरल रूप ग्रहण18। इस तरह के आकार परिवर्तन के समय निर्भर विशेषताओं Whilst प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विकास की हमारी समझ में जोड़ना होगा, केवल कोशिकाओं के एक प्रतिनिधि समूह के 3d आकार का उपयोग भी स्वस्थ या रोग प्रकृति निर्धारित करने के लिए पर्याप्त हो सकता है ऊतक के ।

निस्र्पक एक सेल के 3-आयामी सतह एक सरल काम नहीं है । गोलाकार harmonics के आवेदन11,12घटकों के एक अपेक्षाकृत बड़ी संख्या (50-70) के साथ एक 3d सतह का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक तरीका है. इसके अलावा, गोलाकार harmonics निर्धारण गणना महंगा है; इकाई क्षेत्र पर बहुत जटिल आकार पेश या तो असंभव है या बहुत इकाई क्षेत्र पर विभिन्न सुंदरता के कई ग्रिड लागू करने के लिए की वजह से मुश्किल; अंतत:, गोलाकार harmonics घटकों के स्पेक्ट्रा की सार्थक व्याख्या तुच्छ होने से दूर है.

हमारे यहाँ प्रस्तुत काम में, हम रोग स्थितियों की पहचान करने के लिए पर्याप्त रूपात्मक जानकारी हासिल करने के लिए मूल सतह के 2d अनुमानों का उपयोग करने के बहुत सरल दृष्टिकोण के साथ प्रत्यक्ष 3 डी सतह विश्लेषण के कठिन काम की जगह । हम माइलॉयड कोशिकाओं से 3 डी सूक्ष्म डेटा का उपयोग करके इस कार्यप्रवाह के हर कदम का प्रदर्शन किया, स्पष्ट रूप से इशारा करते हुए कि सभी कदम को पूरा सरल थे, और जिसके परिणामस्वरूप 2 आयामी नक्शे की व्याख्या करने के लिए आसान थे ।

स्वाभाविक रूप से, एक 3d-2d प्रक्षेपण सतह की संरचना के बारे में जानकारी के नुकसान को बढ़ावा मिलेगा । एक माउस cortical ट्यूमर मॉडल में microglia के हमारे उदाहरण डेटासेट में, यह 2d अनुमानों को बनाते समय छह कोणों का उपयोग करने के लिए पर्याप्त था । हालांकि, अधिक जटिल आकृतियों, या कम प्रमुख रूपात्मक परिवर्तनों की आवश्यकता हो सकती है कि अनुमानों की एक बड़ी संख्या के रूप में बनाया है ताकि मज़बूती से सोम के साथ सेल उपसमूह की पहचान करने में सक्षम हो । इस कारण से, हमारे दृष्टिकोण को उत्पंन करने और अनुमानों के किसी भी संख्या का विश्लेषण करने में सक्षम होने के लिए डिज़ाइन किया गया है । बस अधिक जटिल आकार के लिए अनुमानों की एक उच्च संख्या का चयन करके, यह एक संतोषजनक ंयूनतम करने के लिए सूचना हानि पैमाने पर संभव है । एक उदाहरण के रूप में, चित्रा 4a और 4b में बातचीत सेल प्रकार अनुमानों की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता होगी क्रम में जटिल सतह का प्रतिनिधित्व करने के लिए ठीक है ।

किसी भी अनुमानित विधि के रूप में, इसके द्वारा प्रस्तावित कार्यप्रवाह18microglia के एक मैनुअल वर्गीकरण प्रक्रिया के परिणामों के खिलाफ परीक्षण किया जाना था । पहले प्रस्तुत परिणामों ने स्वचालित कार्यप्रवाह की विश्वसनीयता की पुष्टि की । इसके अलावा, कार्यप्रवाह पारंपरिक विश्लेषण की तुलना में अधिक कुशल समय है । microglia कोशिकाओं को वर्गीकृत करने वाले चिकित्सा विशेषज्ञ अपने डेटासेट के विश्लेषण के लिए लगभग 4 हफ्तों की जरूरत है, जबकि हमारे कार्यप्रवाह के बारे में केवल 1 दिन की जरूरत है । हमारे दृष्टिकोण की मजबूती भी स्पष्ट रूप से एक ही सेल प्रकार से संबंधित डेटा का एक सबसेट के लिए प्रशिक्षित सोम के reproducibility द्वारा सिद्ध किया गया था, लेकिन सोम ट्रेन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया था, चित्र 3सी में दिखाने के रूप में.

हालांकि हमारे दृष्टिकोण काइनेटिक जानकारी पर विचार नहीं किया, हम DFT आधारित आकार विश्लेषण पर समय के प्रभाव की जांच की । समय पर निर्भर व्यवहार के लिए सबसे विशिष्ट उदाहरण मोबाइल सेल की आबादी है, जहां उच्च अनुक्रमित DFT घटकों से योगदान स्पष्ट रूप से देख रहा था, के रूप में चित्र 4aके बीच में पाया गया । यह DFT घटकों के एक उच्च पर्याप्त संख्या के उपयोग के महत्व को ध्यान कॉल जब कोशिका प्रकार है कि एक बहुत समय निर्भर तरीके से व्यवहार करने की संभावना है के साथ काम । कारण स्वचालित प्रकृति और हमारे सॉफ्टवेयर उपकरण के उच्च निष्पादन की गति, DFT घटकों और अनुमानों की वृद्धि हुई संख्या परिशुद्धता और परिणामों की विश्वसनीयता में वृद्धि होगी, whilst वे appreciably गणना प्रदर्शन में बाधा नहीं होगा ।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

लेखक उपयोगी चर्चा और उनके समर्थन के लिए बिंयामीन Krause धंयवाद । लेखक आगे जी सेल माइक्रोस्कोपी के साथ उनकी सहायता के लिए रॉबर्ट गुंठर धंयवाद ।

इस कार्य को DFG वित्तीय सहायता NI1167/3-1 (जिमी) से R.N. और Z.C., DFG वित्तीय सहायता सीआरसी १२७८ PolyTarget परियोजना Z01 के लिए Z.C., C01 में TRR130 के लिए R.N. और SFB633, TRR130, Exc257 को A.E.H. और J.B.S. के द्वारा समर्थित किया गया F. L K और अल के लिए बीएफआर अंदर सहायता SFP1322-642 प्रदान की गई

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Imaris 9.1.2, software Bitplane, Zürich, Switzerland v.9.1.2 3D image reconstruction and surface generation; this was used by us!
Blender 2.75a, software https://www.blender.org/ v.2.75a 3D and 4D open source animation software; 2.75a is the required version for this Python
Fiji /ImageJ, software https://fiji.sc/ ImageJ v.1.52b Open source multi-D image analysis toolkit
MATLAB MathWorks, www.mathworks.com R2017b General computational mathematical software
MATLAB Machine Learning kit MathWorks, www.mathworks.com R2017b Can only be used together with MATLAB
Fiji plugins: SHADE https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis v.1.0
Fiji plugins: ActiveContour http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?
id=plugin:segmentation:active_contour:start		 absnake2
Computer Any NA See Imaris instructions for minimum computer requirements

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Kriegel, F. L., Köhler, R.,… More

Kriegel, F. L., Köhler, R., Bayat-Sarmadi, J., Bayerl, S., Hauser, A. E., Niesner, R., Luch, A., Cseresnyes, Z. Morphology-Based Distinction Between Healthy and Pathological Cells Utilizing Fourier Transforms and Self-Organizing Maps. J. Vis. Exp. (140), e58543, doi:10.3791/58543 (2018).

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