Summary
利用花浸法进行农杆菌介导的转化, 可以成功地利用这种方法, 创造出稳定的极端植物模型schrenkiella parvula的转基因线。考虑到不同的生长习性和四肢的生理特性, 我们提出了一种从这种方法中修改的方案。
Abstract
夏氏叶炎是一种适应各种非生物胁迫的极端植物, 包括多重离子毒性胁迫。尽管有高质量的基因组资源可用于研究植物如何适应环境压力, 但由于缺乏可行的转化系统, 其作为功能基因组学模型和工具的价值受到限制。在这个协议中, 我们报告如何产生稳定的转基因s.类似线使用农杆菌介导的花浸法。我们修改了用于罗非鱼的转化协议, 以考虑到罗非鱼的独特特征, 如不确定的开花习惯和高表观蜡含量的叶子。简单地说, 在种植前,将其在4°c 下分层5天。植物生长在14小时的光和10小时黑暗的光周期和 130μmol m-2-1 的光强, 在 22°c 至24°c。选择了8至9个具有多个花序的周龄植物进行改造。这些花序被浸入携带 mp90rk质粒的农杆菌 gv3101 的浸润溶液中。我们在三到四周的时间间隔内进行了两轮插花, 以提高转化效率。t1 种子在萌发前在容器中收集并干燥四周, 以筛选出候选转化线。对 basta 的抗性被用来筛选 t1 植物。我们在两个为期一周的工厂喷洒了三次基本服务溶液, 间隔为三天, 以减少假阳性。对存活的单个植物进行了基本程度的空投试验, 以确定真正的阳性转化物。转化效率为 0.033, 每繁殖 10, 000 种 t1 种子产生3-4 个转基因植株。
Introduction
在这个协议中, 我们描述了生长和建立稳定的转基因线的极端植物模型雪伦基耶拉帕维拉。有效的转化系统的可用性是任何多功能遗传模型的标志。在极端环境中茁壮成长的植物, 被称为极端植物, 为了解植物对环境压力的适应提供了重要资源。施伦基耶拉·帕弗拉(原thellungiella parvula和eutrema parvula) 就是这样一种极端植物模型, 具有不断扩展的基因组资源1,2, 3,4, 5.然而, 在已发表的研究中, 还没有报道 s . parvula 的转化协议。
帕拉维的基因组是布拉西卡科 (芥末科) 首次公布的极生植物基因组, 并与非极生植物模型拟南芥1进行了广泛的整体基因组联合。因此,对塔利亚纳和阴道的比较研究可以受益于在塔利亚纳进行的大量基因研究, 以便对阴道基因组是如何进化和调控的做出信息性假设以应对极端环境压力5,6,7。在已知的野生亲缘植物中,黄花是最耐盐的物种之一 (基于土壤 ncl ld50)。除了氯化钠耐受性外, 在高浓度对大多数植物有毒的情况下, s. parvula还存活并完成其生命周期.为了应对其自然栖息地普遍存在的非生物胁迫, 它进化了各种性状, 其中一些已在生化或生理水平8,9,10, 11个。
自2010年以来, 有400多种同行更新的出版物将s. parvula作为目标物种, 或将其用于与其他植物基因组的比较。然而, 通过更仔细地研究已经进行了哪些类型的研究, 可以确定一个明显的瓶颈。这些报告大多讨论了在未来研究中的潜在用途, 或将其用于比较基因组或系统学研究。由于没有为s. parvula制定概念验证转换协议, 尽管迄今为止已将最高质量的植物基因组之一组装和组装, 但该协议尚未用于功能基因组研究。注释成染色体级的假分子1。
农杆菌介导的花浸转化方法已成为在塔利亚纳中最广泛使用的产生植物基因的方法, 开发可复制的转化系统是其成功的关键因素。遗传模型12,13。然而, 并非所有的布拉西卡科物种都已被证明是成功地转化使用了为a.thaliana 开发的花浸法。特别是包括白斑的 Brassicaceae 系 ii 种一直对以植物浸渍为基础的转化方法14,15。
由于罗非鱼开花习性不确定, 加上叶片形态狭窄, 采用标准农杆菌介导的花浸转化方法具有挑战性。在这项研究中, 我们报告了我们为s. parvula的可重复转化而开发的修改后的协议。
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Protocol
1. 植物生长
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种子灭菌 (可选)
- 在双蒸馏水 (ddh2o)中制备50% 的漂白剂, 在50毫升管中制备1或2滴非离子洗涤剂 (见材料表)。将管反转多次, 混合溶液。
请注意:最好在具有紫外线灭菌表面的层流柜中进行种子灭菌15分钟。 - 在 1.5 ml 管中加入漂白剂溶液, 加入 ~ 100–200 s. parvula 种子。充分混合, 让管坐5分钟。
- 从试管中取出漂白剂, 加入70% 的乙醇。用移液多次清洗种子, 然后立即取出乙醇溶液。
- 将种子在灭菌水中清洗, 去除多余的漂白剂和乙醇, 然后将水分取出。重复此步骤5至6次。
- 在双蒸馏水 (ddh2o)中制备50% 的漂白剂, 在50毫升管中制备1或2滴非离子洗涤剂 (见材料表)。将管反转多次, 混合溶液。
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种子分层
- 将种子浸泡在灭菌水中, 并在4°c 下存放5至7天。或者, 直接在潮湿的土壤上播种未消毒的干燥种子, 并在4°c 下放置土壤托盘5至7天。
-
正在准备转化的植物
- 将土壤混合物 (见材料表) 填充到 7 x6厘米2罐中, 将锅浸泡在水中, 并从顶部喷水, 以确保均匀的湿生长介质。在每个锅的土壤表面加入5–肥料珠 (见材料表)。
请注意:就我们所经历的情况而言, 在任何可以生长的土壤混合物上, 都生长得很好。 - 使用湿牙签, 在土壤表面上每罐转移 20 ~ 25个种子。
请注意:一个方便的做法是把一批4-5 种子在四个角落和锅的中心 (图 1, 第15天, 左面板)。 - 在锅盘上盖上一个透明的圆顶, 使种子在高湿度下发芽。
- 将植物托盘放在生长室中, 其光强设置为 130μmol m-2-秒-1光、22-24°c 温度和每天 14小时/每晚10小时.发芽后7-10天取出圆顶。加入托盘底部的水, 使土壤均匀地湿润在理想的水平。
- 除草额外的幼苗, 并留下只有4-5 健康的幼苗, 每个锅很好地分离之间 (图 1, 第15天, 右面板)。
- 每两天轻轻给植物浇水, 每两周用0.2x 霍格兰的解决方案16一次施肥.
请注意:保持土壤水分在均匀水平是持续健康地生长的关键。 - 继续种植植物 8-10周, 直到每个植物产生100–150个花蕾 (图 1, 第60-80 天)。在计划的天为花浸为基础的变革 (步 4.5), 从植物中去除所有成熟和开发的 siliques。
- 将土壤混合物 (见材料表) 填充到 7 x6厘米2罐中, 将锅浸泡在水中, 并从顶部喷水, 以确保均匀的湿生长介质。在每个锅的土壤表面加入5–肥料珠 (见材料表)。
2. 将感兴趣的基因组元素克隆为植物转化的载体
- 根据试剂盒协议或使用琼脂糖凝胶纯化 dna 的任何其他适当方法, 使用聚合酶链反应 (pcr) 17 扩增目标 dna 片段, 并使用凝胶提取试剂盒 (见材料表)分离 pcr 产品电泳17,18。通过 sanger 测序19验证分离后的 pcr 产物的序列。
- 按照制造商的指导, 将所需的 pcr 产品克隆到克隆载体中, 并按照制造商的准则, 使用基于拓扑体的克隆试剂盒 (见材料表) 将克隆的结构转化为合格的大肠杆菌细胞。
- 用适当的抗生素 ( 如50μgl/ml 亚太区霉素), 在 luria-bertani 20 (lb) 琼脂细菌生长介质 (表 1) 上传播50μl 转化后的产品, 并在37°孵育c 一夜。
- 第二天, 选择5-10 个单一菌落, 用适当的抗生素接种液体 lb 培养基, 并在37°c 下进行夜间温和晃动孵育。
- 使用质粒隔离试剂盒 (见材料表) 分离质粒, 并通过 sanger 测序19验证2.1 中放大的目标序列是否得到了正确的克隆。
- 使用重组酶酶混合试剂盒 (见材料表), 将克隆和验证的 pcr 产品转移到与基于重组的克隆兼容的植物转化目标载体 (见材料表), 以下内容套件制造商的说明。重复步骤2.3 到步骤 2.5, 分离并验证具有适当质粒结构的克隆。
3. 将植物转化为农杆菌的载体构造转化为农杆菌
- 将载体结构的质粒从2.6 转化为gv3101: mpm90rk 21 菌株, 该菌株含有用于染色体背景选择的利福平耐药基因。使用适当的抗生素, 例如庆大霉素或卡那霉素 (见材料表), 选择植物转化结构 (ti 质粒)。第3.2 节简要介绍了电穿孔转化a. 肿瘤的方法。
-
电穿孔法转化肿瘤
- 在冰上解冻有能力的细胞22 。将从2.6 中制备的质粒0.1–1μg 混合, 溶于1-2μl 的 ddh 2o,并在冰上培养良好的细胞。将混合物转移到电穿孔材料中 (见材料表)。
- 按照制造商的准则, 使用电孔 (见材料表), 对3.2.1 的质粒和合格细胞的混合物进行电穿孔。
请注意:在开始电穿孔之前, 请先清洁杯的表面。 - 将反应混合物从试剂盒转移到含有 1.5 ml 液体 lb 的微离心管中, 在28°c 下与移液混合良好, 在28°c 下孵育 1小时, 轻轻晃动。
- 接种转化后的a.在含有适当选择抗生素的 lb 板上, 从第3.2 节中提取的肿瘤 (例如, 卡那霉素25μg/ml、亚太区霉素50μg/ml、庆大霉素25μg/ml 和利福平 50μg/ml), 并在28°c 下孵育3天。
4. 农杆菌介导的阴道的转化
- 在无菌50毫升锥形管中, 将从板材转化为含有抗生素的 lb 液体介质的单转化菌落接种 (与3.3 中相同) 的10毫升 (见材料表)。在28°c 的下午 250 r. 时, 在晃动的孵化器中孵育 24小时 (见材料表)。
- 将细菌溶液从3.4.1 转移到无菌250毫升的烧瓶中, 用适当的抗生素加入40毫升的 lb 液体介质, 孵育 12小时, 直到600纳米波长 (od600) 的光学密度达到2.0 左右。
- 以 3, 100 x g 的离心剂, 在40毫升的肿瘤浸润液中去除上清液并重新悬浮细菌培养 (表 1) .
- 用渗透溶液稀释重新悬浮的 a. 肿瘤,使其最后的 od600为0.8。将25μl 表面活性剂溶液 (表 1) 加入50毫升的稀释的肿瘤溶液中, 通过多次倒置进行混合。
- 将植物的花序浸入在第4.4 节中制备的20 s 中制备的 a. tumefaciens 溶液中, 在从六个锅中浸出花序后, 使用新鲜的细菌溶液。确保所有的花都与溶液接触。如果不能浸入溶液中, 将细菌溶液直接输送到位于花序下部的花上。
请注意:对于第一轮的转变, 一定要用锋利的手术刀或小剪刀摘除所有成熟和发育中的。如果第二次执行转换, 请不要删除 siliques。
5. 改造后植物护理与二次改造
- 将花浸植物水平放置在带圆顶的干净托盘中, 以覆盖植物, 并放置在黑暗的生长室1-2天。
请注意:在这一阶段, 保持鲜花在高湿度下很重要 (图 1, 改造后的植物)。 - 将植物恢复到直立的位置, 并将植物转移到生长室, 每晚10小时, 130 微米 m-2-1光强和22至24°c 的温度.
- 监测下一周内的浸渍花序。如果大量的花流产 (图 2), 重复花浸渍 (步骤 4) 后约4周或后, 大量的花已新开发。
请注意:与第一个转换的准备步骤 (步骤 1.3.7) 不同, 不要在第二轮转换之前删除预先存在的或正在开发的 siliques (图 2)。 - 种植植物, 直到种子成熟, 收获种子在 ~ 21周。
- 干燥种子在室温下在一个密封的容器中, 盛满干燥剂 (见材料表)。
6. 阳性转化剂的选择
- 在步骤1.2 至1.3 中种植野生种子所描述的 t1 种子。
- 生长植物, 直到前两个真正的叶子发展, 大约10-14天后发芽。
-
执行第一个抗除草剂选择 (图 3a 和 3b), 详见下文。
- 稀释葡萄糖酸铵 (11.3) 除草剂 (或 basta) (表 1) 至 1:1000 (v/v)。在幼苗上喷洒稀释的 basta 溶液, 用圆顶覆盖一夜。
- 每5-7天重复一次 basta 喷洒2-3次。
-
使用 basta 放置测试执行第二个选择, 如下所述。
- 使用 basta 解决方案喷洒3-4 次后存活下来的植物。将植物再生长 2-3周, 直到3-5 叶形成相对较大的表面积。
- 选择每株最大的成熟叶片, 用手指轻轻摩擦叶子表面, 去除蜡层, 并放置一滴稀释的 basta 溶液 (从步骤 6.3.1)。
请注意:通过在最近的茎上放置纸带, 标记应用于 basta 落差的叶子的位置。 - 监测应用的叶子与巴斯塔下降的迹象枯萎长达一个星期。选择叶子不受巴斯塔水滴影响的植物。
请注意:大多数假阳性植物的叶子在两天内开始枯萎, 而来自真品的叶子即使在基本剂量溶液的滴干之后也会完生 (图 3c)。
-
使用基因组 pcr 确认阳性转化剂。
- 在6.4.5 的台阶上收集存活植物的2-3 片叶子。
- 使用 ctab 方法23或任何其他适当的 dna 提取方法从叶子中提取基因组 dna。
- 使用从目标植物、野生类型植物 (作为阴性对照) 和步骤3.1 中的质粒结构 (作为阳性对照) 提取的基因组 dna 样本进行 pcr。使用针对选择性标记基因的适当的一对 pcr 引物, 例如,对于耐巴塔标记基因 (bar)、tggggggggtaga (转发) 和 ggccacacacacacacaggaca (反向)。
- 例如, 针对棒状基因的 pcr 引物, 使用以下 pcr 条件: 在98°c 下的初始变性步骤为 30秒;其次是在98°c 下的变性周期为 30秒, 在59°c 下退火 30秒, 在72°c 下延长 30秒;在72°c 下的最后一次延长5分钟。
请注意:为了确保整个 t-dna 的插入, 我们还建议使用选择性标记基因中的 pcr 引物和另一个特定于在步骤中克隆到植物转化载体的目标序列的 pcr 引物进行基因组 pcr
- 例如, 针对棒状基因的 pcr 引物, 使用以下 pcr 条件: 在98°c 下的初始变性步骤为 30秒;其次是在98°c 下的变性周期为 30秒, 在59°c 下退火 30秒, 在72°c 下延长 30秒;在72°c 下的最后一次延长5分钟。
- 通过琼脂糖凝胶电泳17 (图 4 a) 的目标样品 (图 4a) 以及通过对分离的 pcr 产物19进行测序, 确认扩增棒pcr 产物的预期大小。步骤2.1 中的过程相同。
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Representative Results
我们开发了一个转化协议, 可以在150天内收获 t 0 种子, 使用的是从 a. thaliana的花浸法修改的方法.图 1显示了时间线和s. parvula 植物的摘要, 它们代表了通过花浸执行转换的最佳阶段。我们选择了在萌发后60-80天内具有70-80 朵花的植物作为转化的目标阶段。在这一阶段, 少量先前存在的开放或受精卵和花在植物浸润之前被花浸法去除。感染a. 肿瘤导致一些花流产 (图 2, 支架 (a))。在花浸后完全发育起来的西力克很可能含有转化后的种子 (图 2, 支架 (b))。即使在转化后, 只要植物保持健康, s. parvula就会继续开发新的花序和花 (图 2, 白色箭头)。由于这种不确定的开花习惯, 如果植物没有表现出压力或衰老的迹象, 可以进行第二轮的转变。图 2a和2b 分别显示了 s. parvula植物在第一轮和第二轮转化后的例子, 彼此相差25天。在第二个转化过程中, 不应去除现有的子, 因为它们可能含有转基因种子。此外, 还可以通过将渗透溶液 (表 1) 移液 (表 1) 移液进入新出现的花簇来应用, 而不是将整个拍摄浸入溶液中, 从而最大限度地减少从第一颗花样开始对 siliques 造成的损害. 转型。
转化效率为 0.033, 每 10, 000 种 t1 种子使用现行协议繁殖, 产生3-4 个转基因植物。这一估计是基于在10次独立转化尝试中测试的 ~ 50, 000个 t1 种子。虽然效率低于拟南芥, 但与另一种目的植物欧提莫盐子24和一些拟南芥生态型25 的转化相当.采用替代农杆菌菌株, 并对表面活性剂和渗透溶液进行改性, 可以进一步优化转化效率。多次基本考试 (步骤6.3 和 6.4) 对于识别真正的阳性变压器和减少使用步骤6.5 中的 pcr 确认测试的样本数量至关重要 (图 4a)。如果克隆序列包括记者基因, 则可以用记者基因表达来检查转化的进一步确认 (图 4b)。
图 1: s. parvula变换的时间轴.请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:s. parvula 植物 在通过花浸渍转化后.植物在第60天 (a) 天第一次浸花后10天和第85天 (b) 第二轮花浸水后25天被拍到。与农杆菌渗透可能会中止花的发展, 如括号a所示。在花浸后完全发育起来的西力克很可能含有转化后的种子 (括号b)。白色箭头表示每次变换后新出现的花和花序。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 基于 basta 电阻的s. parvula变压器的选择.(a) 在巴斯塔喷施之前的 t1 幼苗。(b) 红色圆圈表示在第一轮选择中幸存下来的候选人变形金刚。(c) 第二轮选择由巴斯塔落差试验。一个误报 (顶部面板) 和真正的转基因植物 (下面板) 的例子显示。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4:确认 s. 阴道变换.(a) 从从 s. parvula植物中提取的基因组 dna 中扩增棒基因。第1车道和第13巷: 大小标记;车道 2: 负控制;车道 3-5: 野生型s.阴道;车道 6-10: 转基因s. 阴道候选;第11、12车道: 矢量控制。车道7、8和9是积极的转化物的典范。(b) gus记者基因表达的例子在一个积极的 s. vula 转化。请点击这里查看此图的较大版本.
| 媒体/解决方案 | 试剂 | 量 |
| luria-bertani (lb) 细菌生长介质 | Nacl 色氨酸 酵母提取物 琼脂 (用于板材) ddh2o |
10克 10克 5克 20克 955毫升 |
| 农杆菌渗透液 | ms 盐 (半 x) b5 维生素 (1x) 蔗糖 (5m w/v) Mes n6-苯基氨基吡啶 (ba) silwet l-77 (0.05 千克 vv) Ph |
2.16 克 1毫升 50克 0.5 克 10μl 500μl 5。7 |
表 1: 细菌生长介质的组成和农杆菌渗透解决方案.
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Discussion
植物的生理状态对转化效率有显著影响.利用健康而有活力的植物进行转化是成功转化的关键要求。与理想转化的健康植物相比, 水或光有压力的植物的花将更少 (图 1, 中心面板)。在低于 130μmol m-2 s-1 的光强下生长, 但植物往往更脆弱;这样的植物会导致更多的流产花后, 花浸水。帕鲁拉倾向于以高于塔利亚纳的速度中止农杆菌浸渍的花。因此, 在a.肿瘤浸润溶液中浸渍时, 为最大限度地减少流产的花朵而采取的每一步都有助于提高转化效率。我们建议每天的轻期不超过14小时。通常情况下,在长天条件下 (例如18小时轻, 6 小时黑暗) 甚至在连续光线下生长的植物上进行的转化。然而, 我们发现, 这种做法导致弹性较低的 s. parvula植物, 并导致较低的转化效率。
花蕾在乳汁的花序轴上不断产生 (图 2, 白色箭头)。因此, 允许新花转化将大大增加获得正转化的机会。第二个荧光浸 (步骤 5.3) 不是必需的, 但强烈建议。然而, 与花浸相比, 这一步骤相对耗时, 因为产生多个花序轴。
野生型s. parvula 对basta 很敏感, 尽管使用 basta 喷雾 (步骤 6.3) 进行阳性转化的初始屏幕将使100个种子中的5-8 株存活下来的植物发芽 (图 3a和3b)。这其中大部分 (gt;80%) 将是误报。这主要是由于叶形狭窄和叶角的 s. parvula,这不能提供足够的叶表面在适当的方向, 以保留基本的基础足够长的时间来观察表型。此外, 由于帕武拉 10号的正面叶片表面蜡含量较高, 往往会产生更不透水的巴斯塔表面。因此, 使用星期日达氏滴在单个叶片上的阳性转化物进行第二次筛选 (步骤 6.4,图 3c) 是避免对数百种假阳性进行 pcr 检测的重要步骤 (步骤 6.5)。
用携带 mp90rk质粒的 a. tumefaciens 菌株 gv3101 对目前的方案进行了测试。其他a.肿瘤菌株, 包括 abi 菌株、lmg20 菌株和 c58c1 rifr 菌株, 其转化效率可能会提高, 据报告, pMP90 90 毒力质粒可提高大麻的转化效率。25. 与a.thaliana 1 相比,甘蓝型和 eutrema物种在分类上与的关系更为密切。因此, 成功用于转化甘蓝型油菜的金银花菌株 lba4404 和成功用于转化苦瓜的 eha105 菌株可能具有较高的转化率。效率高于目前所报告的应变效率 26,27,28。
减少转换协议所需的时间和人力是提高转换效率的另一个重要因素。将单独的 basta 放置在叶子上, 并在多个植物上监测叶子一周 (步骤 6.4) 是乏味的。未来提高转化效率的努力可以寻找合适的可选择标记基因29。
一个既定的转化协议的可用性将大大提高我们识别基因和新机制的能力, 使极端植物模型植物能够在多个非生物压力2,4中存活。在相对于应力敏感的模型 a . thaliana 中, 新的遗传变异将提供更广泛的遗传变异池, 而这些遗传变异是无法从相对压力敏感模型 a . thaliana中被确定为应力反应基因的集体等位基因变异中挖掘出来的泛基因组 5,6。因此, 我们为类似的 s. 阴道发育的 a . 肿瘤介导的转化协议将填补一个空白, 因为在与 a密切相关的极值模型中, 需要这样的工具来进行功能基因组实验。塔利亚纳。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家科学基金会 mcb 1616827 奖的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | VWR International, Radnor, PA | 90000-762 | Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics |
| B5 vitamins | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1019 | Gamborg’s Vitamin Solution |
| Desiccant | W A Hammond Drierite, Xenia, OH | 22005 | Indicating DRIERITE 6 mesh |
| Destination vector for plant transformation | TAIR | Vector:6531113857 | pKGWFS7 |
| Electroporation cuvette | USA Scientific | 9104-5050 | Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap |
| Electroporator | BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA | 1652100 | MicroPulser Electroporator |
| Fertilizer beads | Osmocote Garden, Marysville, OH | N/A | Osmocote Smart-Release Plant Food Flower & Vegetable |
| Gel extraction kit | iNtRON Biotechnology, Boston, MA | 17289 | MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1914-5G | Gentamicin sulfate |
| Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA) | Bayer environmental science, Montvale, NJ | N/A | FINALE herbicide |
| Kanamycin | VWR International, Radnor, PA | 200004-444 | Kanamycin monosulfate |
| MES | Bioworld, Dublin, OH | 41320024-2 | MES, Free Acid |
| MS salt | MP Biomedicals, Santa Anna, CA | 092621822 | Hoagland's modified basal salt mixture |
| N6-benzylaminopurine (BA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B3274 | 6-Benzylaminopurine solution |
| NaCl | Sigma-Alrich | S7653 | Sodium chloride |
| Non-ionic detergent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 9005-64-5 | TWEEN 20 |
| Plasmid isolation kit | Zymo Research, Irvine, CA | D4036 | Zyppy Plasmid Kits |
| Recombinase enzyme mix kit | Life Technology | 11791-020 | Gateway LR Clonase II Enzyme mix |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | R3501-1G | Rifampicin, powder, ≥ 97% (HPLC) |
| Shaking incubator | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA | SHKE4450 | MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers |
| Soil mix | Sun Gro | SUN239223328CFLP | Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix |
| Spectinomycin | VWR International, Radnor, PA | IC15206705 | |
| Sterile 50 mL conical tubes | USA Scientific, Ocala, FL | 1500-1811 | 50 mL conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile |
| Sucrose | VWR International, Radnor, PA | 57-50-1 | Sucrose, ACS |
| Surfactant solution | Lehle seeds, Round Rock, TX | VIS-02 | Silwet L-77 |
| Topoisomerase-based cloning kit | Life Technologies, Carlsbad, CA | K240020 | pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
| Tryptone | VWR International, Radnor, PA | 90000-282 | BD Bacto Tryptone, BD Biosciences |
| Yeast Extract | VWR International, Radnor, PA | 90000-722 | BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences |
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