Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

النباتات النمو والتحول فلورال-تراجع المتبعة بوساطة من اكستريموفيتي بارفولا شرينكيلا

doi: 10.3791/58544 Published: January 7, 2019

Summary

التحول المتبعة بوساطة استخدام أسلوب الأزهار تراجع يمكن أن تستخدم بنجاح لإنشاء خطوط المعدلة وراثيا مستقرة من طراز اكستريموفيتي بارفولا شرينكيلا. نحن نقدم على بروتوكول تعديل من أن نبات التمويل، النظر في عادات مختلفة للنمو والخصائص الفسيولوجية اكستريموفيتي.

Abstract

بارفولا شرينكيلا اكستريموفيتي تكييف الإجهادات اللاأحيائية المختلفة، بما في ذلك عدة تؤكد سمية أيون. على الرغم من الموارد المجينية عالية الجودة المتاحة لدراسة كيفية تكييف النباتات للبيئة تؤكد، قيمته كنموذج الجينوم وظيفي وأداة كان محدودا بسبب الافتقار إلى نظام التحول ممكناً. في هذا البروتوكول، ونحن تقرير كيفية توليد المعدلة وراثيا مستقرة س. بارفولا خطوط باستخدام أسلوب الأزهار تراجع المتبعة بوساطة. قمنا بتعديل البروتوكول التحويل المستخدمة التمويل (أ) لحساب الصفات الفريدة من س. بارفولا، مثل عادة مزهرة غير محددة ومحتوى شمع ابيكوتيكولار عالية على أوراق. باختصار، كانت طبقات البذور بارفولا س. عند 4 درجة مئوية لمدة خمسة أيام قبل الغرس. كانت تزرع النباتات في كبيرة ضوء ح 14 و 10 ح الظلام و 130 µmol م-2s-1 كثافة ضوء، عند 22 درجة مئوية إلى 24 درجة مئوية. تم اختيار ثمانية إلى تسعة مصانع منذ أسابيع مع إينفلوريسسينسيس متعددة للتحول. كانت انخفضت هذه إينفلوريسسينسيس في حل تسلل من GV3101 tumefaciens المتبعة يحمل بلازميد pMP90RK . ونحن إجراء جولتين من غمس الزهور مع الفاصل زمني من ثلاثة إلى أربعة أسابيع لزيادة كفاءة التحويل. تم جمع بذور T1 وتجفف لمدة أربعة أسابيع في حاوية مع ﻣﺟﻓﻓﺍﺗ قبل الإنبات على الشاشة لمرشح تحويل خطوط. واستخدمت المقاومة إلى باستا للشاشة النباتات T1. نحن رش الحل باستا ثلاث مرات بفاصل زمني لمدة ثلاثة أيام بدءاً من المحطتين أسبوع الحد من إيجابيات كاذبة. وأجرى اختبار إسقاط باستا على الباقين على قيد الحياة محطات فردية لتحديد ترانسفورمانتس إيجابية حقيقية. وكان كفاءة التحويل 0.033%، مما أسفر عن 3 – 4 النباتات المعدلة وراثيا كل بذور T1 10,000 روج.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في هذا البروتوكول، يصف لنا النمو وإنشاء خطوط المعدلة وراثيا مستقرة لنموذج اكستريموفيتي بارفولا شرينكيلا. توافر نظام التحويل الفعال السمة مميزة لأي نموذج الوراثية تنوعاً. النباتات التي تزدهر في البيئات المتطرفة، المشار إليها اكستريموفيتيس، توفر موردا بالغ الأهمية لفهم التعديلات النبات للضغوط البيئية. بارفولا شرينكيلا (سابقا بارفولا ثيلونجيلا وبارفولوم يوتريما) نموذج اكستريموفيتي واحد مثل هذا، مع توسيع نطاق الموارد المجينية1،2،3،،من45. ومع ذلك، بروتوكولات التحول لم بعد تم تبلغ عن س. بارفولا في الدراسات المنشورة.

جينوم بارفولا س. الجينوم اكستريموفيتي المنشورة الأولى في الفصيلة الكرنبيه (الخردل-الملفوف الأسرة) ويظهر سينتيني جينوم شاملة واسعة النطاق مع النموذج غير اكستريموفيتي، أعطيت التمويل1. وهكذا، دراسات مقارنة بين التمويل أ وس. بارفولا يمكن أن تستفيد من ثروة الدراسات الجينية التي أجريت على التمويل (أ) جعل الفرضيات الزاخر بالمعلومات عن كيفية تطور الجينوم س. بارفولا وينظم بطريقة مختلفة للتعامل مع تشدد المتطرفة البيئية5،،من67. س. بارفولا واحد من الملوحة أكثر الأنواع (استناداً إلى التربة كلوريد الصوديوم LD50) بين الأقارب البرية المعروفة التمويل (أ)8. وبالإضافة إلى التسامح كلوريد الصوديوم، بارفولا س. على قيد الحياة، ويكمل دورة حياته حضور عدة أيونات الملح في تركيزات عالية السمية لمعظم النباتات7. استجابة للضغوط اللاأحيائية السائدة في بيئتها الطبيعية، قد تطورت سمات مختلفة، ومنها عدة وقد درست في الكيمياء الحيوية أو الفسيولوجية المستوى 8،9،10، 11.

منذ عام 2010، هناك ما يزيد على 400 الأقران-اطلعت المنشورات التي تستخدم بارفولا س. كأنواع مستهدفة أو استخدامه في مقارنة مع جينومات النباتات الأخرى. ومع ذلك، يمكن تحديد اختناق واضح مع إلقاء نظرة فاحصة لنوع ما من دراسات قد أجريت. غالبية هذه التقارير مناقشة إمكانية استخدام س. بارفولا في الدراسات المستقبلية أو استخدامه في مقارنة الجينوم أو الدراسات فيلوجينوميك. نظراً لعدم وجود بروتوكول التحول من مفهوم الإثبات المحددة س. بارفولا، فإنه لم يتم استخدامه في الدراسات الجينومية الوظيفية، على الرغم من وجود واحدة من أعلى نوعية النبات الجينوم المتاحة حتى الآن (> 5 ميغابايت contig N50) تجميع و المشروح في مستوى الكروموسوم بسيودوموليكوليس1.

وأصبحت الطريقة المتبعة بوساطة تحويل الأزهار تراجع الأسلوب الأكثر على نطاق واسع المستخدمة لإنشاء خطوط تراسنجينيك في التمويل (أ)، وتطوير نظام استنساخه من التحول كان عاملاً حاسما في نجاحها نموذج الوراثية12،13. ومع ذلك، تبين أن تتحول بنجاح باستخدام الأسلوب الأزهار تراجع المتقدمة التمويل (أ)ليست كل الفصيلة الكرنبيه الأنواع. خصيصا، والأنواع الثانية النسب الفصيلة الكرنبيه التي تتضمن بارفولا س. قد المعاندة للإزهار تراجع التحول يستند إلى أساليب14،15.

عادة النمو المزهرة غير محدد س. بارفولا، جنبا إلى جنب مع مورفولوجيا أوراق ضيقة، جعلت تحديا اعتماد الطريقة القياسية المتبعة بوساطة الأزهار تراجع التحول. في هذه الدراسة، ونحن تقرير البروتوكول المعدل وضعنا للتحول استنساخه من س. بارفولا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. نمو النبات

  1. تعقيم البذور (اختياري)
    1. يعد التبييض 50% في الماء المقطر مزدوجة (ddH2س) مع 1 أو 2 قطرات من المنظفات غير الأيونية (انظر الجدول للمواد) في أنبوب 50 مل. عكس الأنبوبة عدة مرات لخلط الحل.
      ملاحظة: فمن الأفضل إجراء تعقيم البذور في تدفق الصفحي مجلس الوزراء مع سطح معقمة الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
    2. إضافة حل التبييض ل ~ 100-200 س. بارفولا البذور في أنبوب 1.5 مل. مزيج دقيق وترك الأنبوب الجلوس لمدة 5 دقائق.
    3. إزالة المبيض من الأنبوب وإضافة الإيثانول 70%. تغسل البذور التي بيبيتينج عدة مرات، ثم قم بإزالة الحل الإيثانول فورا.
    4. تغسل البذور في الماء المعقم لإزالة الزائدة التبييض والايثانول، ثم إزالة الماء. كرر هذه الخطوة من 5 إلى 6 مرات.
  2. بذور التقسيم الطبقي
    1. تزج البذور في الماء المعقم وتخزينها لمدة 5 إلى 7 أيام في 4 درجات مئوية. بدلاً من ذلك، زرع بذور معقمة المجفف مباشرة في التربة الرطبة، ووضع علبة التربة لمدة 5 إلى 7 أيام في 4 درجات مئوية.
  3. زراعة نباتات استعدادا للتحول
    1. تعبئة التربة مزيج (انظر الجدول للمواد) في 7 × 6 سم2 الأواني ونقع الأواني في الماء، ورش المياه من الأعلى لضمان وسيلة نمو رطب شكل موحد. إضافة الخرز 5 – الأسمدة (انظر الجدول للمواد) على سطح التربة لكل وعاء.
      ملاحظة: وبقدر ما شهدناه، بارفولا س. ينمو جيدا على أي مزيج التربة حيث يمكن أن تنمو التمويل (أ) .
    2. استخدام مسواك رطب، نقل 20 ~ 25 البذور لكل وعاء على سطح التربة.
      ملاحظة: ممارسة مريحة وضع مجموعة بذور 4-5 في الزوايا الأربعة ووسط الوعاء (الشكل 1، 15 يوما، ترك الفريق).
    3. تغطي صينية وعاء مع قبة واضحة للحفاظ البذور تحت رطوبة عالية أثناء الإنبات.
    4. تبقى في علب النبات في دائرة نمو بكثافة ضوء في 130 µmol م2 ق1 الضوء ودرجة الحرارة 22 – 24 درجة مئوية وح 14 يوم/10 ح كل دورة لليلة الواحدة. إزالة القباب بعد 7-10 أيام بعد الإنبات. إضافة المياه من أسفل الدرج للحفاظ على التربة مبلل موحد على مستوى المرغوب فيه.
    5. تخلص من الشتلات الزائدة وترك فقط 4 – 5 شتلات سليمة كل وعاء جيدا مفصولة عن بعضها البعض (الشكل 1، 15 يوما، اللوحة اليمنى).
    6. بلطف ري النباتات كل يومين وتسميد مع 0.2 x تعرضنا للحل16 مرة كل أسبوعين.
      ملاحظة: الحفاظ على رطوبة التربة عند مستوى موحد هو المفتاح إلى تزايد س. بارفولا دائماً وصحيا.
    7. الاستمرار في زراعة النباتات لمدة 8 – 10 أسابيع حتى inflorescences متعددة تنتج براعم الأزهار 100 – 150 كل النبات (الشكل 1، اليوم 60 – 80). اليوم تخطط لتحويل استناداً إلى تراجع الأزهار (الخطوة 4، 5)، قم بإزالة جميع سيليكويس الناضجة والنامية من النباتات.

2-استنساخ الجينات/الجينوم عنصر الفائدة إلى ناقل لتحويل مصنع

  1. تضخيم جزء الحمض النووي المستهدف على استخدام بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد)17 وعزل مجموعة المنتج PCR تستخدم استخراج هلام (انظر الجدول للمواد) وفقا للبروتوكول طقم أو أي طريقة أخرى مناسبة لتنقية الحمض النووي باستخدام [اغروس] هلام التفريد17،18. التحقق من تسلسل المنتج بكر معزولة عن طريق سانغر التسلسل19.
  2. استنساخ المنتج بكر المطلوب في ناقل الاستنساخ والتحويل بناء المستنسخة في المختصة كولاي الخلايا باستخدام الاستنساخ على أساس topoisomerase كيت (انظر الجدول للمواد) اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  3. نشر 50 ميليلتر من المنتجات المحولة على وسائط لوريا بيرتاني20 (رطل) أجار النمو البكتيرية (الجدول 1) مع المضادات الحيوية المناسبة، مثل50 ميكروغرام/مل بالسبيكتينوميسين (انظر الجدول للمواد)، واحتضان في 37 درجة (ج) بين عشية وضحاها.
  4. في اليوم التالي، حدد 5 – 10 مستعمرات واحدة، تطعيم في السائل المتوسطة رطل مع المضادات الحيوية المناسبة، واحتضان مع الهز لطيف في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  5. عزل البلازميدات استخدام عزل من بلازميد كيت (انظر الجدول للمواد)، والتحقق عن طريق سانغر التسلسل19 عما إذا كان التسلسل الهدف تضخيم في 2.1 هو استنساخ بشكل صحيح.
  6. نقل المنتج بكر المستنسخة والمتحقق منها لناقل وجهة لتحويل مصنع متوافقة مع المستندة إلى جزئ الاستنساخ (انظر الجدول للمواد)، باستخدام مزيج إنزيم recombinase كيت التالية (انظر الجدول للمواد)، تعليمات الشركة المصنعة كيت. كرر الخطوات 2، 3 من الخطوة 2.5 لعزل والتحقق من الحيوانات المستنسخة إيواء بلازميد السليم بنيات.

3-تحويل "بناء ناقلات" "تحويل مصنع" tumefaciens المتبعة

  1. تحويل بلازميد بناء ناقلات من 2.6 إلى سلالة A. tumefaciens GV3101:pMP90RK21، الذي يأوي مورثة مقاومة ريفامبيسين لتحديد الخلفية الصبغية. استخدام المضادات الحيوية المناسبة، على سبيل المثال مع الجنتامايسين أو كاناميسين (انظر الجدول للمواد)، لاختيار المصنع بناء التحول (بلازميد). يتم تضمين بروتوكول مختصر للتحول A. tumefaciens عبر انهانسر في القسم 3.2.
  2. A. tumefaciens التحول من انهانسر
    1. ذوبان الجليد الخلايا المختصة A. tumefaciens 22 على الجليد. ميكس 0.1 – 1 ميكروغرام من بلازميد أعدت من 2.6، حله في 1 – 2 ميليلتر من ddH2س، مع الخلايا المختصة على الجليد. نقل الخليط إلى ومبومو انهانسر (انظر الجدول للمواد).
    2. تنفيذ انهانسر على المزيج من البلازميدات والخلايا المختصة من 3.2.1، باستخدام اليكتروبوراتور (انظر الجدول للمواد) اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: تنظيف سطح ومبومو قبل البدء في انهانسر.
    3. نقل الخليط رد فعل من ومبومو إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي يحتوي على 1.5 مل من السائل LB وتخلط جيدا مع بيبيتينج واحتضانها ح 1 في 28 درجة مئوية مع الهز لطيف.
  3. تطعيم تحولت tumefaciens ألف من القسم 3.2 في لوحات رطل المحتوية على المضادات الحيوية الاختيار المناسب (مثلاً كاناميسين 25 ميكروغرام/مل، بالسبيكتينوميسين 50 ميكروغرام/مل، مع الجنتامايسين 25 ميكروغرام/مل، ووالريفامبيسين 50 ميكروغرام/مل) واحتضان عند 28 درجة مئوية لمدة 3 أيام.

4-بوساطة المتبعة تحول بارفولا س.

  1. تلقيح واحد تحول أنبوب المستعمرات من لوحات في 10 مل رطل الوسائط السائلة التي تحتوي على المضادات الحيوية (نفس كما هو الحال في 3.3) في تعقيم 50 مل مخروطية (انظر الجدول للمواد). احتضانها ح 24 في حاضنة هز (انظر الجدول للمواد) في 250 r.p.m. في 28 درجة مئوية.
  2. نقل الحل البكتيرية من 3.4.1 إلى قارورة معقمة 250 مل إضافة 40 مل الإعلام LB السائل مع المضادات الحيوية المناسبة واحتضان ح 12 حتى الكثافة البصرية عند الطول الموجي 600 نانو متر (OD600) يصل إلى حوالي 2.0.
  3. الطرد المركزي توميفاسينس أ كولتوريت س 3,100 ز لأدنى 10 إزالة المادة طافية وإعادة تعليق ثقافة البكتيرية في 40 مل من A. tumefaciens تسلل الحل (الجدول 1).
  4. تمييع ريسوسبينديد A. tumefaciens بالتسلل إلى حل ل التطوير التنظيمي نهائي600 من 0.8. إضافة 25 ميليلتر للحل الفاعل (الجدول 1) إلى 50 مل من المخفف A. tumefaciens الحل والمزيج بعكس عدة مرات.
  5. وتراجع في نورات النباتات في حل توميفاسينس (أ) أعدت في القسم 4.4 20 س. حلاً بكتيرية جديدة بعد غمس نورات من الأواني ستة. تأكد من أن كل الزهور على اتصال مع الحل. بيبيت الحلول البكتيرية مباشرة على الزهور الموجودة في الجزء السفلي من نورات إذا أنهم لا يمكن أن يكون انخفض إلى الحل.
    ملاحظة: لتحويل الجولة الأولى، تأكد من إزالة جميع سيليكويس الناضجة والنامية باستخدام مشرط حاد أو مقص صغير. لا تقم بإزالة سيليكويس إذا كان أداء التحول للمرة الثانية.

5-رعاية النباتات ما بعد التحول، والتحول الثاني

  1. ضع النباتات الزهرية انخفضت أفقياً في علب نظيفة مع القباب لتغطية النباتات ووضع في غرفة مظلمة نمو لأيام 1-2.
    ملاحظة: حفظ الزهور تحت رطوبة عالية من المهم في هذه المرحلة (الشكل 1، والنباتات بعد التحول).
  2. إرجاع المعامل في وضع رأسي ونقل النباتات إلى غرفة نمو مع ح 14 كل يوم/10 ح كل دورة الليل، 130 م µmol-2 s-1 شدة الضوء ودرجة الحرارة 22 إلى 24 درجة مئوية.
  3. رصد inflorescences انخفضت في الأسبوع التالي. إذا إحباط عدد كبير من الزهور (الشكل 2)، كرر تراجع الأزهار (الخطوة 4) بعد حوالي 4 أسابيع أو بعد عدد كبير من الزهور وضعت حديثا.
    ملاحظة: وخلافا لخطوة الإعداد للتحول الأولى (الخطوة 1.3.7)، لا تقم بإزالة الموجودة مسبقاً أو وضع سيليكويس (الشكل 2) قبل الجولة الثانية من التحول.
  4. تنمو النباتات حتى البذور الناضجة وحصاد البذور في ~ 21 أسبوعا.
  5. البذور الجافة لمدة 2 – 3 أسابيع في درجة حرارة الغرفة في وعاء محكم مع مليئة ﻣﺟﻓﻓﺍﺗ (انظر الجدول للمواد).

6-اختيار ترانسفورمانتس الإيجابية

  1. زرع بذور T1 كما هو موضح للبذور البرية نوع في الخطوات من 1.2 إلى 1.3.
  2. تنمو النباتات حتى وضع الأوراق الحقيقية الأولى 2، 10 – 14 يوما تقريبا بعد الإنبات.
  3. إجراء التحديد الأولى لمبيدات الأعشاب المقاومة (الشكل 3ألف و 3B) كما هو مفصل أدناه.
    1. تمييع مبيد الأعشاب جلوفوسيناتي-الأمونيوم (11.3 في المائة) (أو باستا) (الجدول 1) إلى 1:1,000 (v/v). الرش المخفف باستا الحل على الشتلات وتغطية النباتات مع القباب بين عشية وضحاها.
    2. كرر باستا الرش 2 – 3 مرات كل 5 – 7 أيام.
  4. إجراء التحديد الثاني باستخدام اختبار إسقاط باستا كما هو مفصل أدناه.
    1. تحديد النباتات التي البقاء على قيد الحياة بعد يجري رش 3 – 4 مرات مع باستا الحل. تنمو النباتات لمدة 2-3 أسابيع حتى يترك 3-5 تطوير مساحة سطحية كبيرة نسبيا.
    2. حدد ورقة ناضجة أكبر كل مصنع وفرك سطح ورقة بلطف بواسطة إصبع لإزالة طبقة الشمع ووضع قطره من الحل باستا المخفف (من الخطوة 6.3.1).
      ملاحظة: وضع علامة على موقع أوراق تطبيقها مع انخفاض باستا بوضع شريط ورق على ساق أقرب.
    3. رصد يترك تطبيقها مع انخفاض باستا لعلامات ذبول لمدة تصل إلى أسبوع واحد. تحديد النباتات بأوراق غير متأثرة بقطرات باستا.
      ملاحظة: أوراق من النباتات الأكثر إيجابية كاذبة تبدأ في الذبول خلال اليومين الماضيين، بينما يترك من إيجابيات الحقيقية سليمة حتى بعد أن يجف قطره حل باستا (الشكل 3ج).
  5. تأكيد ترانسفورمانتس إيجابية باستخدام PCR الجينوم.
    1. جمع 2 – 3 أوراق من النباتات الباقين على قيد الحياة في خطوة 6.4.5.
    2. استخراج الحمض النووي من الأوراق باستخدام أسلوب كتاب23 أو أي الأخرى الحمض النووي استخراج الأسلوب المناسب.
    3. إجراء PCR باستخدام عينات الحمض النووي الجينومي المستخرجة من النباتات المستهدفة، والنباتات البرية من نوع (كعناصر سلبية)، وفي بناء بلازميد من الخطوة 3.1 (كعنصر إيجابي). استخدم على زوج مناسب من [بكر] كبسولة تفجير محددة للجينات ماركر انتقائية، مثل، للجين المقاوم باستا (بار)، تكاجكاجتججتجتاجا (إلى الأمام) وجتكاككاكتاكاتكجاجاكا (العكسية).
      1. للإشعال PCR المثال استهداف الجين بار ، استخدام PCR الشروط التالية: أن الخطوة الأولى تمسخ عند 98 درجة مئوية لمدة 30 ق؛ تليها دورات 30 يشوه عند 98 درجة مئوية لمدة 30 s، الصلب في 59 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، وتمتد في 72 درجة مئوية لمدة 30 ق؛ وهذا التمديد هو الأخير في 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
        ملاحظة: لضمان إدراج كامل تي-الدنا، نوصي أيضا أداء بكر الجينوم باستخدام PCR تمهيدي من المورثة ماركر انتقائية وآخر التمهيدي PCR المحددة لتسلسل الهدف المستنسخة لناقلات تحول المصنع في الخطوة
    4. تأكيد وجود الحجم المتوقع للمنتج [بكر] تضخيم شريط [اغروس] هلام التفريد17 للعينات المستهدفة (الشكل 4أ) وكذلك تسلسل استخدام19 معزولة المنتج بكر نفس الإجراء كما هو الحال في الخطوة 2، 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

قمنا بتطوير بروتوكول تحويل التي تمكن من حصاد البذور0 ر خلال 150 يوما، استخدام أسلوب الأزهار تراجع معدلة من أن التمويل (أ). ويبين الشكل 1 موجزاً للجدول الزمني والنباتات بارفولا س. التي تمثل المرحلة المثلى لتنفيذ هذا التحول عن طريق الأزهار تراجع. نحن تحديد معامل س. بارفولا مع زهور 70 –80 في inflorescences متعددة في 60 – 80 يوما بعد الإنبات في المرحلة المستهدفة للتحول. وأزيلت عدد صغير من الزهور مفتوحة أو المخصبة الموجودة من قبل وسيليكويس في هذه المرحلة قبل تسلل A. tumefaciens بواسطة الأسلوب الأزهار تراجع. وأسفرت العدوى مع A. tumefaciens الإجهاض لبعض الزهور (الشكل 2، قوس (أ)). سيليكويس نمواً كاملا بعد تراجع-الأزهار من المحتمل أن تحتوي على بذور محولة (الشكل 2، قوس (ب)). حتى بعد التحول، واصل بارفولا س. تطوير إينفلوريسسينسيس جديدة والزهور طالما أبقى النباتات صحية (الشكل 2، الأسهم البيضاء). بسبب هذه العادة المزهرة غير محددة، يمكن إجراء جولة ثانية للتحول إذا كان المصنع لا تظهر علامات الإجهاد أو الشيخوخة. الشكل 2 ألف و 2 باء إظهار أمثلة لنباتات بارفولا س. وبعد الجولة الأولى والثانية من التحول، على التوالي، 25 يوما بعيداً عن بعضها البعض. في عملية التحول الثاني، لا يجب إزالة سيليكويس القائمة لأنها قد تحتوي على البذور المعدلة وراثيا. أيضا، يمكن تطبيقها A. tumefaciens بواسطة بيبيتينج الحل تسلل (الجدول 1) إلى الناشئة حديثا ومجموعات زهرة، بدلاً من غمس النار كامل في الحل، للتقليل من الضرر إلى سيليكويس من أول التحول.

كفاءة التحويل هو 0.033%، مما أسفر عن 3 – 4 النباتات المعدلة وراثيا كل بذور T1 10,000 التي يتم نشرها باستخدام البروتوكول الحالي. ويستند هذا التقدير ~ 50,000 بذور T1 اختبارها خلال عشر تحول مستقلة المحاولات. في حين الكفاءة أقل من نبات التمويل، أنها قابلة للمقارنة لتحويل مصنع اكستريموفيتي آخر سالسوجينيوم يوتريما24 وبعض من اصطفاء التمويل نبات 25. يمكن كذلك تحسين كفاءة التحويل باستخدام البديلة المتبعة سلالات وإدخال تعديلات على السطح وتسلل الحلول. باستا عدة اختبارات الرذاذ وقطره (الخطوات 6.3 و 6.4) ستكون حاسمة لتحديد ترانسفورمانتس إيجابية حقيقية والحد من عدد عينات اختبار باستخدام تأكيد PCR في الخطوة 6، 5 (الشكل 4أ). يمكن التحقق من تأكيد آخر للتحول مع تعبير جينات مراسل، إذا كان يتضمن التسلسل المستنسخة جينات مراسل (الشكل 4ب).

Figure 1
الشكل 1 : الخط الزمني للتحول بارفولا س . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: س. بارفولا النباتات بعد التحول من الأزهار جبور النباتات تم تصويره بعد عشرة أيام من أول الأزهار-تراجع في 60 يوما (A) و 25 يوما بعد الجولة الثانية من الأزهار تراجع في اليوم 85 (ب). تسلل مع المتبعة قد إحباط التنمية خردلة من الزهور كما هو موضح في أقواس . سيليكويس نمواً كاملا بعد تراجع الأزهار من المحتمل أن تحتوي على بذور محولة (بين قوسين ب). وتشير الأسهم البيضاء إلى الزهور و inflorescences نشأ حديثا بعد كل تحويل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : اختيار ترانسفورمانتس بارفولا س. استناداً إلى المقاومة باستا. (أ) شتلة T1 قبل الرش باستا. (ب) دائرة حمراء تشير إلى ترانسفورمانت مرشح من الباقين على قيد الحياة اختيار الجولة الأولى برذاذ باستا. (ج) اختيار الجولة الثانية باستا اختبار السقوط. يتم عرض مثال المغلوطة (اللوحة العلوية) والنباتات المعدلة وراثيا الحقيقية (أسفل اللوحة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : تأكيد التحول بارفولا س . (أ) بكر التضخيم من شريط الجينات من السلطات الوطنية المعينة الجينوم المستخرجة من النباتات بارفولا س. . لين 1 و 13: حجم علامات؛ لين 2: مراقبة سلبية؛ لين 3-5: البرية من نوع بارفولا س. ؛ لين 6-10: المعدلة وراثيا المرشحين بارفولا س. ؛ لين 11، 12: مكافحة ناقلات الأمراض. يجسدون الممرات 7 و 8 و 9 ترانسفورمانتس إيجابية. (ب) مثال للتعبير الجيني مراسل غوس إيجابية ترانسفورمانت س. بارفولا . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

وسائل الإعلام/الحل كاشف المبلغ
وسائط النمو البكتيرية بيرتاني لوريا (رطل) كلوريد الصوديوم
تريبتوني
استخراج الخميرة
أجار (للوحات)
ddH2س
ز 10
ز 10
ز 5
ز 20
مل 955
الحل تسلل المتبعة مرض التصلب العصبي المتعدد الملح (س 1/4)
الفيتامينات B5 (س 1)
السكروز (5%w/v)
زاره التربية والعلم
ن6-بينزيلامينوبوريني (BA)
سلفيت L-77 (0.05%v/v)
الأس الهيدروجيني
ز 2.16
1 مل
50 غ
ز 0.5
10 ميليلتر
500 ميكروليتر
5.7

الجدول 1: تكوين وسائط النمو البكتيرية و المتبعة الحل تسلل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الدولة الفسيولوجية للنبات يؤثر إلى حد كبير كفاءة التحويل25. استخدام النباتات صحية ونشطة للتحول شرط رئيسي لنجاح عملية التحول في بارفولا س. وسيكون الماء أو النباتات وأكد الخفيفة الزهور أقل مقارنة بالنباتات صحية مثالية للتحول (الشكل 1، مركز لوحة). س. بارفولا يمكن أن تنمو كثافة ضوء µmol أقل من 130 م-2 s-1، ولكن النباتات التي تميل إلى أن تكون فرايلير؛ ستؤدي هذه النباتات إلى أكثر إحباط الزهور بعد تراجع الأزهار. س. بارفولا يميل إلى إحباط الزهور المتبعة انخفض بمعدل أعلى من التمويل أ. ولذلك، يساهم كل خطوة يتم اتخاذها للتقليل إلى أدنى حد من الزهور إحباط عندما انخفض في الحل تسلل A. tumefaciens إلى أعلى كفاءة تحويل. ونحن نوصي فترة ضوء لم يعد من ح 14 لليوم الواحد. وغالباً ما يتم التحول من التمويل (أ) في النباتات التي نمت في شرط طويلة أيام (18 ح الضوء والظلام ح 6) أو حتى تحت الضوء المستمر. ولكننا العثور على نتيجة هذه الممارسات في أقل مرونة س. بارفولا النباتات ويؤدي إلى كفاءة تحويل منخفضة.

براعم الزهور يتم إنتاجها بشكل مستمر على محاور نورات س. بارفولا (الشكل 2، الأسهم البيضاء). ولذلك، السماح بتحول زهور جديدة سيزيد كثيرا من فرصة الحصول على ترانسفورمانتس إيجابية. ثانية الأزهار-السباحة (الخطوة 5.3) ليست ضرورية، ولكن اقترح بشدة. هذه الخطوة غير تستغرق وقتاً طويلاً نسبيا مقارنة التمويل (أ) غمس الزهور، لأن بارفولا س. وتنتج متعددة المحاور نورات.

البرية من نوع بارفولا س حساس باستا، على الرغم من أن الشاشة الأولى ترانسفورمانتس الإيجابي مع رذاذ باستا (الخطوة 6.3) سيغادر 5 – 8 محطات الباقين على قيد الحياة من أصل 100 بذور نبتت (الشكل 3ألف و 3B). معظم هذه (> 80 ٪) وسوف تكون إيجابيات كاذبة. هذا إلى حد كبير بسبب شكل أوراق ضيقة وزاوية ورقة س. بارفولا، التي لم تقم بتوفير سطح أوراق كافية في اتجاه مناسب الإبقاء على الحل باستا لمدة كافية الالتزام النمط الظاهري. بالإضافة إلى ذلك، بسبب محتوى الشمع ارتفاع سطح نبات أداكسيال بارفولا س.10، أنه يميل إلى إنشاء سطح أكثر منيعة باستا. ولذلك، الفرز الثاني لايجابية ترانسفورمانتس باستخدام قطره باستا على أوراق فردية (الخطوة 6.4، الرقم 3ج) خطوة ضرورية لتجنب PCR التجارب على مئات إيجابيات كاذبة (الخطوة 6، 5).

تم اختبار البروتوكول الحالي مع سلالة A. tumefaciens GV3101 يحمل بلازميد pMP90RK . يمكن تحسين كفاءة التحويل مع سلالات A. tumefaciens الأخرى، بما في ذلك سلالات أبي، LMG20، و C58C1 ريفر، مع بلازميد فوعة pMP90 ذكرت لزيادة كفاءة التحويل في التمويل (أ) 25. وه الأنواع خردل ويوتريما هي أوثق صلة ب س. بارفولا مقارنة التمويل ألف-1. ولذلك، A. tumefaciens سلالة LBA4404 التي استخدمت بنجاح لتحويل نابوس خردل وسلالة EHA105 التي استخدمت بنجاح لتحويل سالسوجينيوم يوتريما قد تقدم تحولاً أعلى كفاءة من كفاءة المبلغ عنها من السلالة المستخدمة حاليا26،،من2728.

الحد من الوقت والعمل المطلوب بموجب بروتوكول تحويل عامل هام آخر في تحسين كفاءة التحويل. وضع الفردية باستا قطرات على أوراق ورصد الورقة لمدة أسبوع في محطات متعددة (الخطوة 6.4) مملة. جهدا مستقبلا لزيادة كفاءة التحويل يمكن البحث عن علامة اختيار البديل المناسب الجينات29.

توفر بروتوكول تحويل المنشأة ستعزز إلى حد كبير قدرتنا على تحديد الجينات وآليات الرواية التي تسمح للنباتات نموذج اكستريموفيتي البقاء على قيد الحياة متعددة تؤكد اللاأحيائية2،4. رواية التنوع الوراثي في بارفولا س. سوف توفر مجموعة أوسع نطاقا من التنوع الوراثي الذي لا يمكن استخراجه من التباين الاليلي الجماعية المحددة كالجينات تستجيب للإجهاد في النموذج نسبيا حساسة للضغط، و التمويل (أ) جينوم عموم5،6. ولذلك لدينا الأزهار تراجع أساس tumefaciens بوساطة تحويل البروتوكول وضع بارفولا س. سوف تسد ثغرة للحاجة إلى مثل هذه الأدوات القيام بتجارب الجينوم الوظيفي في نموذج اكستريموفيتي ارتباطاً وثيقا ب أ التمويل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل على جائزة مؤسسة العلوم الوطنية 1616827 المجلس.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar VWR International, Radnor, PA 90000-762 Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics
B5 vitamins Sigma-Aldrich, St. Louis, MO G1019 Gamborg’s Vitamin Solution
Desiccant W A Hammond Drierite, Xenia, OH 22005 Indicating DRIERITE 6 mesh
Destination vector for plant transformation TAIR Vector:6531113857 pKGWFS7
Electroporation cuvette USA Scientific 9104-5050 Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap
Electroporator BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA 1652100 MicroPulser Electroporator
Fertilizer beads Osmocote Garden, Marysville, OH N/A Osmocote Smart-Release Plant Food Flower & Vegetable
Gel extraction kit iNtRON Biotechnology, Boston, MA 17289 MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit
Gentamicin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO G1914-5G Gentamicin sulfate
Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA) Bayer environmental science, Montvale, NJ N/A FINALE herbicide
Kanamycin VWR International, Radnor, PA 200004-444 Kanamycin monosulfate
MES Bioworld, Dublin, OH 41320024-2 MES, Free Acid
MS salt MP Biomedicals, Santa Anna, CA 092621822 Hoagland's modified basal salt mixture
N6-benzylaminopurine (BA)  Sigma-Aldrich, St. Louis, MO B3274 6-Benzylaminopurine solution
NaCl Sigma-Alrich S7653 Sodium chloride
Non-ionic detergent Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 9005-64-5 TWEEN 20 
Plasmid isolation kit Zymo Research, Irvine, CA D4036 Zyppy Plasmid Kits
Recombinase enzyme mix kit Life Technology 11791-020 Gateway LR Clonase II Enzyme mix
Rifampicin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO R3501-1G Rifampicin, powder, ≥ 97% (HPLC)
Shaking incubator ThermoFisher Scientific, Waltham, MA SHKE4450 MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers
Soil mix Sun Gro SUN239223328CFLP Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix
Spectinomycin VWR International, Radnor, PA IC15206705
Sterile 50 mL conical tubes USA Scientific, Ocala, FL 1500-1811 50 mL conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile
Sucrose VWR International, Radnor, PA 57-50-1 Sucrose, ACS
Surfactant solution Lehle seeds, Round Rock, TX VIS-02 Silwet L-77
Topoisomerase-based cloning kit Life Technologies, Carlsbad, CA K240020 pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli
Tryptone VWR International, Radnor, PA 90000-282 BD Bacto Tryptone, BD Biosciences
Yeast Extract VWR International, Radnor, PA 90000-722  BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dassanayake, M., et al. The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula. Nature Genetics. 43, (9), 913-918 (2011).
  2. Oh, D. -H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. Life at the extreme: lessons from the genome. Genome Biology. 13, (3), 241 (2012).
  3. Whited, J. The Next Top Models. Cell. 163, (1), 18-20 (2015).
  4. Dassanayake, M., Yun, D. O. D., Bressan, R. A., Cheeseman, J. M., Bohnert, J. H. The scope of things to come: New paradigms in biotechnology. Plant Biotechnology and Agriculture: Prospects for the 21st Century. 19-34 (2009).
  5. Dittami, S. M., Tonon, T. Genomes of extremophile crucifers: New platforms for comparative genomics and beyond. Genome Biology. 13, (8), 166 (2012).
  6. Amtmann, A. Learning from evolution: Thellungiella generates new knowledge on essential and critical components of abiotic stress tolerance in plants. Molecular Plant. 2, (1), 3-12 (2009).
  7. Oh, D. -H., Hong, H., Lee, S. Y., Yun, D. -J., Bohnert, H. J., Dassanayake, M. Genome structures and transcriptomes signify niche adaptation for the multiple-ion-tolerant extremophyte Schrenkiella parvula. Plant Physiology. 164, (4), 2123-2138 (2014).
  8. Orsini, F., et al. A comparative study of salt tolerance parameters in 11 wild relatives of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 61, (13), 3787-3798 (2010).
  9. Uzilday, B., Ozgur, R., Sekmen, A. H., Yildiztugay, E., Turkan, I. Changes in the alternative electron sinks and antioxidant defence in chloroplasts of the extreme halophyte Eutrema parvulum (Thellungiella parvula) under salinity. Annals of Botany. 115, (3), 449-463 (2015).
  10. Teusink, R. S., Rahman, M., Bressan, R. A., Jenks, M. A. Cuticular waxes on Arabidopsis thaliana close relatives Thellungiella halophila and Thellungiella parvula. International Journal of Plant Sciences. 163, (2), 309-315 (2002).
  11. Jarvis, D. E., Ryu, C. H., Beilstein, M. A., Schumaker, K. S. Distinct roles for SOS1 in the convergent evolution of salt tolerance in Eutrema salsugineum and Schrenkiella parvula. Molecular Biology and Evolution. 31, (8), 2094-2107 (2014).
  12. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant Journal. 16, (6), 735-743 (1998).
  13. Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant Journal. 61, (6), 909-921 (2010).
  14. Bai, J., Wu, F., Mao, Y., He, Y. In planta transformation of Brassica rapa and B. napus via vernalization-infiltration methods. Protocol Exchange. 10, 1028 (2013).
  15. Sparrow, P. A. C., Goldsack, C. M. P., Østergaard, L. Transformation technology in the Brassicaceae. Genetics and Genomics of the Brassicaceae. 505-525 (2011).
  16. Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. California Agricultural Experiment Station Circular. 347, (347), 1-32 (1950).
  17. Saiki, R., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239, (4839), 487-491 (1988).
  18. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, cost-free method of purification of dna fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  19. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, (12), 5463-5467 (1977).
  20. Bertani, G. Studies on Lysogenesis I. The mode of phage liberation by lysogenic Eschericia coli. Journal of Bacteriolgy. 62, (3), 293-300 (1951).
  21. Koncz, C., Martini, N., Szabados, L., Hrouda, M., Bachmair, A., Schell, J. Specialized vectors for gene tagging and expression studies. Plant Molecular Biology Manual. 53-74 (1994).
  22. Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of Agrobacterium using electroporation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006, (30), (2006).
  23. Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research. 8, (19), 4321-4326 (1980).
  24. Inan, G. Salt cress. a halophyte and cryophyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles. Plant Physiol. 135, (3), 1718-1737 (2004).
  25. Ghedira, R., De Buck, S., Nolf, J., Depicker, A. The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26, (7), 823-832 (2013).
  26. Shaohong, F. U., Xianya, W. E. I., Yingze, N. I. U., Shixing, G. U. O. Transformation of Brassica napus with the method of floral-dip. Biotechnology: Genomics and Its Applications. 45-49 (2005).
  27. Li, J., Tan, X., Zhu, F., Guo, J. A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets. International Journal of Biology. 2, (1), 127 (2010).
  28. Li, H. Q., Xu, J., Chen, L., Li, M. R. Establishment of an efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated leaf disc transformation of Thellungiella halophila. Plant Cell Reports. 26, (10), 1785-1789 (2007).
  29. Wu, G., Rossidivito, G., Hu, T., Berlyand, Y., Poethig, R. S. Traffic lines: New tools for genetic analysis in Arabidopsis thaliana. Genetics. 200, (1), 35-45 (2015).
النباتات النمو والتحول فلورال-تراجع المتبعة بوساطة من اكستريموفيتي <em>بارفولا شرينكيلا</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, G., Pantha, P., Tran, K. N., Oh, D. H., Dassanayake, M. Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula. J. Vis. Exp. (143), e58544, doi:10.3791/58544 (2019).More

Wang, G., Pantha, P., Tran, K. N., Oh, D. H., Dassanayake, M. Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula. J. Vis. Exp. (143), e58544, doi:10.3791/58544 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter