Summary
ここでは、分子ビーコン、スピニングディスク共焦点顕微鏡、オープンソース分析を用いたライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNA人身売買の可視化、検出、分析、追跡のためのプロトコルを提示する。ソフトウェア。
Abstract
蛍光ベースのイメージング技術は、光顕微鏡の開発と組み合わせることで、細胞生物学者が生細胞イメージング研究を行う方法に革命を起こしました。RNAを検出する方法は、セミナル研究が遺伝子発現調節に部位特異的mRNA局在化を結合して以来、大幅に拡大してきました。動的mRNAプロセスは、mRNAを検出するアプローチを介して可視化することができ、分子挙動の動的範囲を捕捉するのに十分な速さである顕微鏡検査のセットアップと組み合わされます。分子ビーコン技術は、生細胞内の内因性転写物を直接検出できるハイブリダイゼーションベースのアプローチです。分子ビーコンは、ヘアピン状、内部的にクエンチされた、単一ヌクレオチド識別核酸プローブであり、これは、ユニークな標的配列へのハイブリダイゼーション時にのみ蛍光する。高度な蛍光顕微鏡と高解像度イメージングと組み合わせることで、mRNAの細胞内移動の空間的および時間的な追跡を行うことが可能になります。この技術は内因性転写物を検出できる唯一の方法ですが、細胞生物学者は、生細胞イメージングのためのそのようなプローブの設計が困難なため、この技術をまだ完全に受け入れていません。新しいソフトウェアアプリケーションPinMolは、生きている細胞内のmRNA標的領域に効率的にハイブリダイズするのに最適なプローブの強化され、迅速な設計を可能にします。さらに、高解像度のリアルタイム画像取得と現在のオープンソース画像解析ソフトウェアにより、洗練されたデータ出力が可能になり、mRNAのライフサイクルに関与する動的プロセスの基礎となる複雑さの詳細な評価が可能になります。
ここでは、ショウジョウバエメラメラノガスター卵室に分子ビーコンを設計し、提供するための包括的なプロトコルを提示します。内因性mRNAの直接的かつ非常に特異的な検出および可視化は、紡糸ディスク共焦点顕微鏡を介して行われる。イメージングデータは、氷のソフトウェアで物体検出とトラッキングを使用して処理および分析され、卵母細胞内の特殊な領域に輸送およびローカライズされるmRNAの動的な動きに関する詳細を取得します。
Introduction
空間的および時間的分解能で動的事象を可視化する細胞生物学研究は、蛍光ベースのライブ細胞イメージング技術の開発によって可能になった。現在、生体内mRNAビジュアライゼーションは、RNAアプタマータンパク質相互作用、有機色素および核酸プローブのRNAアプタマー誘導蛍光1、2に基づく技術を介して達成される。3.それらはすべて高い特異性、感度および信号対バックグラウンド比を提供する。しかし、RNAアプタマー中心のアプローチは広範な遺伝子操作を必要とし、トランスジーンはタンパク質または有機色素結合に必要な人工構造モチーフを持つRNAを発現するように設計される。例えば、MS2/MCPシステムは、バクテリオファージMS2コートタンパク質(MCP)に対する結合配列の複数のタンデム反復を含むRNA構築物を発現するトランスジーンの同時発現と、蛍光タンパク質をコードする別のトランスジーンを必要とする。MCP 4に融合,5.このような二次構造モチーフをRNAに添加することは、かさばる蛍光タンパク質と共に、天然RNAプロセスが6に影響を与えるかもしれないという懸念を提起している。この懸念に対処し、追加のユニークな利点を提供する技術は、核酸ベースのアプローチ、分子ビーコン(MB)です。MBは、内因性mRNAの多重検出、単一ヌクレオチド変動の判分、および標的mRNA7,8とのハイブリダイゼーションの高速運動学を可能にする。MBは、標的にハイブリダイズした後に蛍動体形成的な立体構造変化を受ける前に、クエンチングヘアピンフォールドに残るオリゴヌクレオチドプローブである(図1C)9。いくつかのグループは、非コードRNA(マイクロRNAおよびlncRNA)10、11、12、13、RNAレトロウイルス14および動的DNAタンパク質の両方を検出するためにMBを使用することに成功しました。インタラクション15.ゼブラフィッシュ胚16、ニューロン13、腫瘍組織17、心筋細胞18、サルモネラ菌など、様々な生物や組織でのイメージングに成功しています。19.
ここでは、生きているD.メラノガスター卵室における内因性mRNAの設計、送達および検出アプローチについて、活性分子輸送の動的範囲を捕捉するのに十分な速さである顕微鏡検査のセットアップと相まって説明する。D.メラノガスター卵室は、初期の生殖細胞分裂や母体遺伝子発現からセグメントボディプラン20の生成まで、幅広い発達研究のための理想的な多細胞モデルシステムとして機能してきました。 21.卵室は、簡単に単離され、大きく半透明であり、外生分析の時間に耐えることができるので、イメージング実験に非常に適しています。多くの研究は、積極的に翻訳される前に離散的な細胞領域への母体転写の非対称的な局在化に焦点を当ててきた。特に、オスカーmRNA局在化およびその後の卵母細胞の後極でのその後の翻訳は、致命的な二頭上胚表現型22を避けるために厳密に規制された方法で起こらなければならない。oskar mRNAは、ナース細胞と呼ばれる15個の生殖細胞に転写され、環管と呼ばれる細胞質の橋を通って積極的に卵母細胞に輸送され、成熟卵となり最終的に受精される生殖細胞(図1A)).オスカーmRNPとの間のタンパク質因子の動的な募集と交換に関して既に入手可能なかなりの量の情報は、その長距離細胞内旅行と共に、オスカーを研究する好ましい候補にするmRNAライフサイクルの多くのプロセス。MBは、mRNA局在化のプロセスに関する詳細を明らかにし、ショウジョウバエの発生時にmRNA輸送を制御するタンパク質因子の調節と機能を解読するのに役立ってきました。特に、看護師細胞にMBをマイクロ注入し、生細胞イメージング実験を行うことにより、内因性mRNAの追跡が可能である8,23。
ここで示すロードマップは、MBを用いてライブ細胞イメージング実験を行うことから、イメージングデータを取得すること、そのネイティブ細胞環境で内因性mRNAを追跡するためのデータ分析を実行することまで、完全なプロセスのステップを提供します。ステップは、独自のラボ設定内で他の組織/細胞タイプを扱う研究者のニーズを満たすために変更し、さらに最適化することができます。
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Protocol
1. 生細胞イメージング用MBの設計
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ターゲットRNA配列を折りたたみ、mfoldサーバからの「RNA形態」を用いてmRNAターゲットの二次構造を予測する(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form)。
- FASTA形式でターゲットシーケンスを貼り付け/アップロードし、5%または10%のサブ最適性(MFE値の5%または10%以内の自由エネルギーを持つ構造)を選択し、それに応じて計算された折りたたみの最大数を調整します(例えば、10%の場合は大きい)。サブオプティマイティ)。
注: MB を設計する際に最適でない二次構造を含めることで、最小自由エネルギー(MFE)構造のみの予測よりも柔軟または剛性が高いターゲットmRNA内の領域の同定が可能となり、生細胞イメージングに適したMBの全体的な設計。 - 800ヌクレオチド(nt)のmRNAターゲットの「即時ジョブ」を選択するか、801~8,000 ntのmRNA長さの「バッチ・ジョブ」を選択します。
- FASTA形式でターゲットシーケンスを貼り付け/アップロードし、5%または10%のサブ最適性(MFE値の5%または10%以内の自由エネルギーを持つ構造)を選択し、それに応じて計算された折りたたみの最大数を調整します(例えば、10%の場合は大きい)。サブオプティマイティ)。
-
ステップ1.1で得られた「ssカウント」ファイルを、目的のパラメータを持つPinMolプログラム(https://bratulab.wordpress.com/software/)の入力として使用し、mRNAターゲット用のいくつかのMBを設計する(PinMolプログラムの使用法を説明するチュートリアルを参照)。24 https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/)で)
- BLAST分析を実行して選択されたMBの特異性を決定する:適切なデータベースで「ブラストン」を使用する(例えば、oskar mRNA特異的MBは「refseq-rna」データベースおよびショウジョウバエメラノガスター生物を使用する)。
- mRNA標的の組織特異的発現(例えば、oskar mRNA Flybase> ハイスループット発現データ> FlyAtlas解剖学マイクロアレイまたはmodENCODE解剖学RNA-Seq;http://flybase.org/reports/FBgn0003015)を同定し、任意の肯定的なBLASTヒット。目的の組織/細胞でも発現される他のmRNAとの>50%クロス相同を示すプローブを排除します。
- ライブセルイメージングを実行するために利用可能な顕微鏡検査のセットアップに適した蛍光素とクエンチャーのペアを選択します(例えばCy5/BHQ2)25。
2. MB合成、精製、特性分類
- 前述の7、または商用プロバイダからのサービスとして社内合成と精製を使用して、1~5MB(上記注を参照)を合成および精製し、次のラベリングスキームを使用して[5'(C3またはC6リンカー)-(2'-O)-メチルMB配列)-(クエンチャー)3']。リバースフェーズHPLCを使用して、社内で、または商用プロバイダのサービスを使用してMBを浄化します。
注:自動プローブ合成に使用されるリンアミドは、2'-O-メチルリボヌクレオチド修飾を持っている必要があります。また、連結核酸(LNA)と2'-O-メチル修飾のキメラを使用して、より短いMBとその標的mRNA26との間のハイブリッドの安定性を高めることができる。 - 標的RNA領域の配列に一致し、従ってMBのプローブ領域に相補的であるDNAオリゴヌクレオチドを合成し、インビトロキャラクタリゼーションで使用する(上記の手順2.3から2.5;上記の注記を参照)。DNA-オリゴヌクレオチド標的模倣を伴うMBのハイブリダイゼーションを最大化し、標的mRNA配列に見られるように4つの追加ヌクレオチドをDNA標的の各端に含む。
注:標的配列を検出するMBの効率のより厳密な特性化は、相補的なDNAオリゴヌクレオチド8の代わりにインビトロ合成RNA標的を用いて行うことができる。 - MB単独の熱変性を行い、その融解温度(Tm)を測定し、MBが生理的温度で所望のヘアピン形状を想定していることを確認する。我々は60と90 °Cの間のTm値を観察した。
- DNAオリゴヌクレオチド標的の存在下でMBの熱変変化を行い、前述の7としてMB:DNA標的ハイブリッドのTmを測定する。MB:DNAハイブリッドには55~60°CのTmが望まれています。
- 対応するDNAオリゴヌクレオチド標的とのインビトロハイブリダイゼーション反応を行い、生理学的温度でのMB:DNAハイブリッド形成の効率を決定し、前述の7.DNA標的模倣による高速ハイブリダイゼーション動態が望まれるが、DNA標的との高いハイブリダイゼーション効率を示さないMBは、インビトロおよび/またはインビボにおける標的mRNAとのより良い性能を持つ可能性がある。
3. マイクロインジェクションのための個々の卵室の解剖と準備
- 新鮮な酵母ペーストで2〜3日間、新しく孵化した雌を飼育します。
- CO2パッド上のハエを麻酔し、細かいピンセット(dumont#5)を使用して、ガラスカバースリップ上のハロカーボンオイル700の滴に1-2メスを転送します。
- ピンセットのペアを使用して、ステレオ顕微鏡の下で後ろ側を上にハエを向けます。後端に小さな切開を行い、女性の腹部を解剖し、卵巣のペアをオイルに静かに絞ります。
- 卵巣を新しいカバースリップのオイルドロップに置き植えます。オバリオレの最も若いステージを他のピンザーでつまみながら、1つのピンザーで1つの卵巣をそっと保持します。oskar mRNAは、中年発生後および中間発生後に積極的に局在化し(ステージ>7)、若い卵室(ステージ<7)は注入がより困難であり、長く生き残らない。個々の卵巣または卵室が分離され、垂直に整列されるまで、カバースリップ(下向きの動きで)をゆっくりとドラッグします。さらに、卵巣卵鎖から不要な段階を置き換えることによって、単一の卵室を分離する。
注:個別にからかわれた卵室が油に浮かばず、カバースリップに付着していることを確認します。これは、マイクロインジェクションと画像集録の両方で重要です。
4. 卵室のナース細胞へのMBのマイクロインジェクション
- MB溶液を、1つの分子ビーコン(例えばosk2216Cy5)を用いて、または異なるmRNAを標的とし、スペクトル的に異なる蛍光体で標識された2つのMBの混合物(例えばosk2216Cy5およびdrongo111Cy3)を用いて調記する。HybBuffer(50 mMトリス-HCl - pH 7.5、1.5 mM MgCl2および100 mM NaCl)で各MBの濃度200-300 ng/μLを使用してください。HybBufferでそれぞれ200 ng/μLで同じmRNAを標的とする同じ蛍次眼素で標識された4つのMBのカクテル(例えばosk82、osk1236、osk2216)。マイクロインジェクション用の針をロードする直前にMB溶液をスピンダウンします。
- 目的を選択します。40倍のオイルの目的は、適切な卵室を見つけ、マイクロインジェクションを行うための推奨されます。
- 解剖卵室でカバースリップを顕微鏡ステージに取り付けます。フォーカス位置で目的を持ち上げ、マイクロインジェクションのために適切に配向された中間から後期の発達段階で卵室を特定する(すなわち、AáP軸が針先に垂直で、看護師内で容易な注入を可能にする)卵母細胞に近位の細胞)。
- 約1 μL MB溶液(ステップ4.1参照)で針(市販またはハウス27で調製)をロードし、マイクロインジェクターに接続します。D.メラノガスター卵室のマイクロインジェクションの場合は、複数の看護師細胞に穿刺されないように、針(材料の表を参照)を顕微鏡段階(例えば30°)に向けます。
- 500-1,000 hPaの注入圧力および100-250 hPaの補償圧力が付いている注入器を組み立てなさい(材料のテーブルを参照)。
- ゆっくりとステージを移動して、卵室のオイルドロップボイドの領域を視野に入れます。
- マイクロマニピュレータジョイスティックを使用して、オイルドロップに針を静かに下げ、視野の周辺に向かってその先端に焦点を当てます。
- 針の先端から空気を取り除き、針からの流れがあることを確認するために「クリーン」機能を実行します。
- 家の位置に針を持参し、マイクロ注入される卵室に焦点を当て、その後、焦点に戻って、卵室の端の近くに配置します。
- 看護師細胞から卵胞細胞を分離する膜が焦点を合わせ始めるような目的のZ位置の微調整を行う。
- 看護師の細胞に針を挿入し、2-5 sの注射を行う。
- 針をそっと取り外し、ホームポジションに引き込みます。
- 画像取得(60-63xまたは100x)の目的倍率に目標を変更し、卵室に焦点を当て、取得を開始します。
5. スピニングディスク共焦点顕微鏡設定によるデータの取得
注:特定の設定については、資料の表を参照してください。
- 8-16 ビット・イメージの XYZCt スタックを記録する集録プロトコルを設定します (XYZ = ボリューム、C = チャネル、t = 時間)。
- 目的のチャネル(例えば、Cy5の場合は641nmレーザー、GFPの場合は491 nm)のレーザーラインを選択し、チャンネルを順番に取得します:最初に各チャンネルの蛍光信号を取得し、次にZ位置を変更して、適切なコローカリゼーション解析を可能にします。
- Z ステップ (0.3 μm など) を選択し、上下の Z限界 (-2 μm から 2 μm など) を選択します。
- 集録時間とサンプリングレートを入力します(例えば、1時間まで15〜30sごとに)。
- 取得を開始します。
6. トラッキングおよびコローカリゼーション情報の取得のためのデータ分析、およびビデオファイルの準備
- 画像処理
- バイオイメージ情報学のためのオープンコミュニティプラットフォームであるIcyをダウンロード、アンパック、オープン(http://icy.bioimageanalysis.org/)
- ステップ 5: イメージ/シーケンス >ファイル >開く XYZCt スタックを開きます。
- スタックを ImageJ に変換する: ImageJ> ツール > IJ に変換し、デタッチモードをオンにしました。
- サブスタックを作成する (さらに分析する Z ステップとタイム ポイントの範囲の選択): ImageJ>イメージ>スタック>ツール>サブスタックを作成...;目的のチャンネル、Zステップ、タイムポイントを選択します。
- サブスタックを TIFF ファイルとして保存する: ImageJ>ファイル>保存 As>Tiff...;このファイルを後続の手順に使用します。
- スプリットチャンネル: ImageJ>イメージ>カラー>スプリットチャンネル。
- 背景スタックを使用して背景を減算する: ImageJ>プロセス>画像計算機...、またはローリングボールオプションを使用して:ImageJ>プロセス>減算背景...、ローリングボール半径を選択します。選択した半径の画像をプレビューしてから、「同意する」を選択します。
注: バックグラウンド信号は、主にフルロフォアの不適切な消光によって発生します。信号:背景比(S:B)はMBの「明るさ」の指標としてよく使用され、MBおよびDNA標的オリゴヌクレオチドのインビトロハイブリダイゼーション実験から測定される。たとえば、MB osk1236 と osk2216 はそれぞれ S:B が ~81 と ~120 です。 - 各チャンネルの明るさとコントラストを調整する: ImageJ>Image>調整>明るさ/コントラスト、[適用]を選択します。
- 各チャネルを別々の TIFF ファイルとして保存する: ImageJ>ファイル>保存 As>Tiff....
- 2 つのチャネルをマージする: ImageJ>イメージ>カラー>チャンネルのマージ...チャンネルを選択します。新しいスタックを新しい TIFF ファイルとして保存します (手順 6.1.8を参照)。
- スポット検出とトラッキング
- 氷に戻す: ImageJ>ツール>氷に変換します。
- スケールバーは、スケールバープラグインがインストールされている場合、Icyへの変換時に自動的にスタック上にオーバーレイされます[プラグイン>セットアップ>オンラインプラグインを使用して検索]。必要に応じて、[インスペクタ]ウィンドウ(画面の右側)でスケールバーを編集します>レイヤータブ>[名前]>スケールバーを編集します。
- [レイヤー] タブ>[名前] から [スケール] バーの 「目」アイコンの選択を解除/無効にすると、元のスタックからスケール バーが削除されます。最終的なスタックで再アクティブ化できます。
- イメージ ウィンドウのメニュー バーから "カメラ" アイコンを使用してスクリーンショットを撮り、"現在のビューのスクリーンショットを撮る"、および File>Tiff....
- スポット感度パラメータが既に決定されている場合は、ステップ 6.2.7 に移動します。
- スポットの検出: 分析する画像またはスタックを持つウィンドウを選択し、検出&トラッキング>検出>スポットディテクタを選択し、設定パラメータを入力します。
- 入力の場合は、「現在のシーケンス入力検出」(デフォルト)を選択します。
- 前処理の場合は、[インスペクタ]ウィンドウ>シーケンスタブで番号を相互参照して「チャンネル0」(デフォルト)または目的のチャンネルを選択します。
- 検出器の場合は、「暗い背景の上に明るいスポットを検出する」を選択し、解析を実行するのに十分な Z スライスがスタックにない場合にのみ、「3D 用 2D ウェーブレットの強制使用」を使用します。スケールごとに「スケール」と「感度」を選択します(大きなスポットにスケールを追加します)。スケールと感度(検出の感度が高いほど、最大140は氷で示唆される)は試行錯誤変数であり、その後視覚的にチェックして決定する必要があります。
- 対象地域の場合は、「ROIfromSequence」(デフォルト)を使用します。
- フィルタリングの場合は、「フィルタリングなし」(デフォルト)を使用するか、「サイズフィルタリング」を選択して「受け入れられたオブジェクトの範囲(ピクセル単位)」を定義します。
- 出力: XLS または XML 出力設定を選択します (2007 MS Excel 以前を使用している場合は XML 形式を選択し、>65,000 スポットがあります)。スポット検出器の結果をトラッキング解析に使用する場合は、「スイミングプールにエクスポート」も選択します。
- スポットのすべてまたは大部分が検出されるまで、さまざまなスケール/感度値を使用してスポットを繰り返し検出します。すべての最後のパラメータを記録します。
- コローカリゼーション分析では、他のチャネルのスポット検出を繰り返します。
- スポットを追跡するには、[検出&トラッキング>スポットトラッキング>スポットトラッキング>ステップ6.2.6.からパラメータを使用してスポット検出器を実行する]を選択するか、プルダウンメニューを使用して既存のデータセットを選択します(このため、スポット検出器ウィンドウを保持します)。ステップ6.2.5から開きます)。「パラメータの推定」ボタンを押し、パラメータ推定ポップアップウィンドウで目的のターゲットモーションを選択します(例えば、「拡散と指向の両方」)。「トラッキングを実行」ボタンを押します。
- マルチチャネル スタックのスポットを追跡する際に、ステップ 6.2.6 および 6.2.7 の手順に従って、ステップ 6.2.7 から生成されたスタックから始めて、他のチャネルのスポット検出と追跡を繰り返します。
- トラックを視覚化するには、[検出&トラッキング>トラッキングマネージャ] - トラッキング実行の完了時に自動的に開きます。「カラートラックプロセッサ」で「有効にする」を選択し、トラックの色の表現を選択します。関連するトラックプロセッサは、「トラックプロセッサを追加...」を介してアクセスすることができます。プルダウンメニュー(例:「トラックプロセッサタイムクリップ」を選択し、「トラッククリッパー」ウィンドウを有効にし、現在の時点の前後に表示される検出の必要な数を選択します)。
- トラック情報を XML トラック ファイルとして保存する: 検出&トラッキング >トラッキング マネージャ >ファイルとして保存する...
- 画像ウィンドウのメニューバー「現在のビューのスクリーンショットを撮る」から「カメラ」アイコンを使用してスクリーンショットを撮って結果を保存します。スクリーンショットは、検出されたスポットやトラックと一緒に、インスペクタウィンドウで見つかった対応する目のアイコンをアクティブ/非アクティブ化するだけで撮影できます。>レイヤータブ>オーバーレイラッパー。
- タイムスタンプオーバーレイプラグインをインストールする: プラグイン>セットアップ>オンラインプラグイン>タイムスタンプオーバーレイ>インストール。
- タイムスタンプを追加する: プラグイン>タイムスタンプオーバーレイ (新規)タイムスタンプの配置と書式設定の手順については、ポップアップ ウィンドウ (画面の右下隅) の指示に従います。時間間隔は、インスペクタ ウィンドウ >シーケンス タブ>シーケンスプロパティ>編集で追加または変更できます。
- 別のスクリーンショットを撮って結果を保存します。画像を 1) Tiff 形式、2) AVI 形式として保存します。AVI 形式の場合、最初に RGB レンダリング (イメージ/シーケンス>レンダリング>RGB イメージ) に変換します。
- 画像を目的の向きに回転させる: インスペクタ ウィンドウ>シーケンスタブ>キャンバス>回転。
- 「現在のビューのスクリーンショットを撮る」によって回転画像を保存します。スケールバーの「目」アイコンが選択解除されていることを確認します。
- ROI を選択してトリミングする: [関心のある領域]を選択します>2D ROI>ROI シェイプを選択し、画像上に ROI を作成/描画します。画像/シーケンス>平面(XY)>高速トリミング。
- コローカリゼーション分析
- コローカライズ プロトコルを準備します。いくつかの例は、氷のウェブサイト(http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/List)で提供されています(補足資料を参照)。
- ロードコローカリゼーションプロトコル: ツール>Scripting>プロトコル>ロード、および相互作用ブロック内のパラメータを調整します(例:「ウェーブレットスポット検出」ブロックの使用パラメータはステップ6.2.6で決定されます)。
- パーティクルのサイズをピクセル単位で測定し、コローカライズ距離を決定し、「コローカライザ」ブロックに「最大距離」として入力します。
注:ピクセル単位の粒子のサイズは、検出システムによって異なります。サイズを測定するには、単一のパーティクルにズームインし、信号の幅にまたがるピクセルを手動でカウントします。少なくとも3つの粒子からの測定値を平均化します。コローカライズに設定する最大距離は、パーティクルのサイズをピクセル単位で表します(これは、接触する 2 つのパーティクルの半径の最大合計を表します)。 - 必要に応じて、コローカライズ分析用に 1 つ以上の ROI を選択します: 関心のある領域>2D ROI>ROI シェイプ>イメージに ROI を描画します。
- トリミング ROI(上):イメージ/シーケンス>平面 (XY)>高速トリミング。
- コローカライズの実行: プロトコル エディタ ウィンドウ >選択したプロトコル タブ>実行。プロトコル エディタ ウィンドウの最後のブロックには、スポット検出に基づく全体的なコローカライズの割合が含まれますが、各時点の情報は [インスペクター] ウィンドウ > 出力タブで確認できます。
- ステップ 6.2.7(スポットを追跡)に従って、コローカライズされたパーティクルと単一のパーティクルを追跡します。
- 手順 6.2.16 で説明したように保存します。
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Representative Results
PinMolを使用して、複数の MB を 1 つの mRNA ターゲットに対して設計できます (図 1B-C)。合成および精製後、選択されたMBはインビトロ分析を用いて特徴付け、比較される。
図1:内因性mRNAの生細胞イメージングのための技術および組織記述。(A) マイクロインジェクションに使用される中段ショウジョウバエ卵室の描写。マイクロインジェクション針(緑色)は、オスカーmRNAに特有の分子ビーコンのカクテルを提供します。ナース細胞への迅速な注入により、卵母細胞への輸送中のmRNAの検出と、後皮質での既に局在化したmRNAの可視化が可能になります。(B) 分子ビーコンを標的とするオスカーmRNA(C)オスカーmRNA内の二次構造領域を標的とする分子ビーコンランキングのPinMolソフトウェア出力。 (C')オスカー-特異的分子ビーコンosk2216の配列および折りたたみ。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
MBの最適な性能がインビトロ特性評価によって確認された後、プローブは内因性標的mRNAのライブ可視化に使用される。オセシスの様々な段階でのオスカーmRNA輸送および局在化のパターンを可視化することが可能であり、特に中性発生後(7-10)(図2A-B)。その小さなサイズのために、非常に初期の段階(1-4)で卵室を注入することは困難です。同じ段階の卵室に個別に注入した場合、oskar-特異的MBは同じパターンの局在化を示す(図2、osk1236対osk2216)。
図2:取得開始後のt=0、10、および30分の時点における野生型卵室におけるオスカーmRNAの時間配列。(A)ステージ6-7卵室および(B)ステージ9卵室における2つのoskar特異的分子ビーコン(osk1236およびosk2216)のナース細胞注射。 スケールバー = 20 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
異なるmRNA標的は、スペクトル別に標識されたMBを用いて共に可視化することができる(図3)。MB溶液は、ナース細胞(図3A)または卵母細胞(図3B)にマイクロ注入することができる。ナース細胞の細胞質に注入されたMBは、他のナース細胞や卵母細胞に自由に拡散し、マイクロインジェクション部位以外の部位で標的を見つけて蛍光シグナルを生成することができる。例えば、後期卵形成期(9-10)卵室の看護師細胞でマイクロインジェクションを行う場合、卵母細胞内で可視化された蛍光シグナルのほとんどは、すでに局在化したオスカーmRNAによって生成され、積極的に輸送される。初期の段階(7-8)でより一般的であるトランスクリプト。古典的なMBは、核内の非特異的シグナルを生じ、したがって、卵室の細胞質領域に分析を制限することに注意してください。NeutrAvidinまたは金ナノ粒子などの追加の修飾は、この非特異的信号28、29を低減または排除するために採用されている。この核非特異的シグナルにもかかわらず、オスカーmRNAの生体内検出のためのMBの特異性は、FRETアプローチ8を用いて確立され、MBはインビトロ転写OSkar mRNAと共噴射した。MBのラベル23とは異なる蛍光素でラベル付け。
図3:生卵室における2つのmRNA種の共視覚化oskarの共注射-およびドロンゴ-(A)ナース細胞および(B)ステージ8-9卵室の卵母細胞における特異的分子ビーコン。オスカー(赤)とドロンゴ(緑色)mRNAは、卵母細胞の後端(アステリックス)でコローカライズし、ドロンゴはまた、ドルソ前部蓄積(矢印)を示す。スケールバー = 20 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
低発現レベルを示すmRNA標的の場合、mRNA分子当たりの蛍光シグナルは、少なくとも2つのMBを含むカクテル溶液を注入することによって増加し、それぞれが異なる標的領域に結合する(図4および5)。
図4:MBおよびMS2-GFPシステムの両方を用いてオスカーmRNAを可視化する。osk-MS2::MCP-GFP 30(GFP)を発現する卵室におけるMBカクテル溶液(MB)のマイクロインジェクション。ナース細胞のマイクロインジェクション後、画像は30秒ごとに20分間取得した。対象領域は、看護師細胞に1つ、卵母細胞に1つのROIの2つの領域が選択された。スポットを検出するために、ROIごとに異なる感度が使用されました。ROIナースセル:スケール2、GFPおよびMBの感度100。ROI卵母細胞:スケール2、GFPの感度50、MBの110。コローカライズ距離は、両方の ROI で 4 ピクセルです。卵室全体と看護師細胞のズームインは12分の時点で示され、卵母細胞のズームインは14分の時点で示されます。MBスポット(赤い円)とGFPスポット(緑色の円)は、各アプローチによって検出されたオスカーmRNA粒子を識別し、コローカライズされた粒子(黄色)は、MBおよびGFPスポットが最も4ピクセル離れている場所を示します。 0.3 μmのステップの14 Z光学スライスのXY投影。63xの目的(オイル、NA = 1.4)、XY = 0.24 μm、露光時間500ミリ秒、641 nmおよび491 nmレーザーの5.23および5.39 mWレーザーパワーを持つ16ビットデータとして取得されました。スケールバー = 10 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:オスカーmRNA特異的MBを有するナース細胞マイクロインジェクション後の卵母細胞における追跡分析。MB粒子は感度110のスケール2で検出され、現在の時間枠の前後に8つの時点が表示されます。MB スポット (赤い円) は、卵母細胞の体積で追跡されます。トラックは、示された12分の時点の前後の8つの時点からの検出情報を表します。各色は、個々のトラックを表します。0.3 μmのステップの14 Z光学スライスのXY投影。スケールバー = 10 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
MB対MS2/MCPで検出されたオスカーmRNAの人身売買を比較する場合、オスカー特異的MBによって生成された蛍光シグナルは、10 GFPで標識されたトランスジェニックオスカーmRNAの輸送および局在化に関する忠実な文書化MS2/MCPシステムを介した分子(図4)。oskar-MS2/MCP-GFPトランスジェニック卵室では、遺伝子組み換えオスカーの蛍光シグナル間の広範なコローカライズを示した-MS2 mRNAは、MBとGFPタグ付けを用いて検出された.12分と14分のインジェクション後で、57%(7 MBオブジェクトと13個のGFPオブジェクト、4つのコローカライズされたオブジェクトを持つ)と93%(30 MBオブジェクトと51個のGFPオブジェクト、28個のコローカライズされたオブジェクト)が、看護師細胞と卵母細胞のGFP粒子と共局動性を持つ検出されたMB粒子の、それぞれ。我々の分析は、それぞれ看護師細胞および卵母細胞の細胞質内のMBで検出されたOSkar mRNAを有するoskar-MS2 mRNAの31%および55%のコローカリゼーションパーセンテージを得た。さらに、5Dスタックをさらに分析して、看護師細胞と卵母細胞細胞質の両方における長距離輸送のためのオスカーmRNA軌道を決定することができる(図5)。
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Discussion
ショウジョウバエの卵室における内因性mRNAの密有性のライブ可視化は、PinMolソフトウェアを使用して簡単に設計できる特定の、効率的な、ヌクレアーゼ耐性MBの使用に依存しています。MBは、標的mRNA内の一意の配列(好ましくは二次構造のない領域)を検出するように設計された特定のプローブであり、転写物の高度に解決された検出を可能にする。他の組織/細胞タイプにこの技術/プロトコルを採用する場合の唯一の制限は、目的の標本に対するMB送達の効率です。他のアプローチでは、1つの標的mRNA(例えばMS2/MCP系)を可視化するために蛍光タンパク質でタグ付けされたアプタマーとRNA結合タンパク質を発現するために組織の遺伝子操作が必要ですが、多重化は、せいぜい2つの転写のために可能です。MB技術は、生細胞内の内因性mRNAを検出するための単独で立ち上がり、2種以上のmRNA種の共視覚化を可能にする唯一の技術です。
MBは広範囲の蛍光部分で標識することができ、2'-O-メチルリボヌクレオチドまたはロック核酸26、31などの修飾ヌクレオチドから合成すると、細胞環境内で安定である。これらのバックボーンの変更により、ターゲットに対する MB の親和性も高くなります。平均長さのターゲット mRNA に対して、複数の MB を簡単に設計できます。ただし、短いターゲットや高度に構造化されたターゲットでは、いくつかの制限が発生する場合があります。これは、プローブ領域が古典的なMBプローブ31の長さの約半分である私たちの小さな分子ビーコンを採用することによって克服することができます。試料の種類に応じて、MBはエレクトロポレーションを介して細胞に送達され、細胞貫通ペプチド、リポフェクション、またはマイクロインジェクション23、32、33、34にリンクする。ライブ細胞イメージング実験におけるMBの性能効率は、標的構造によって決定されるmRNA標的内の対応する相補配列にハイブリダイズするプローブ配列の能力に傾いている。in vitro測定熱力学パラメータを用いて得られた予測MFE RNA二次構造は、標的のアクセシビリティを評価する上で有益であるが、最終的には生体内標的構造および他の細胞との標的相互作用である。生細胞イメージングに対するMBの適合性を決定する要因。RNA二次構造のゲノム全体の分析は、多くのRNAがインビトロ35よりもインビボでの構造が低いことを示唆している。MBを用いったインビボターゲット検出の効率は主に結合部位のアクセシビリティに依存しますが、特定のMB機能を最適化することで、mRNAターゲットの視覚化が強化されます。具体的には、次のパラメータの慎重な選択を行う必要があります:1)プローブの長さは18から26の間で変化することができ、プローブのヌクレオチド組成物は標的内の31~55%GC対の間にある:MBハイブリッド、2)5bpステム配列はG/Cであるべきである。豊富な、mRNAターゲットがない場合にヘアピン形状を維持し、不一致の差別を提供するために、3)変更されたバックボーンは、MBとターゲットの両方のヌクレアーゼに対する保護に使用されるべきである:MBハイブリッド、4)フッ素/クエンチャーペアは、追加を提供することができますMBの茎に適度な安定性、および5)フッ素は、長いイメージング時間間隔の間に安定している必要があります。さらに、古典的なMBは通常、核非特異的信号34を生成し、我々の場合はデータ処理と分析に適度な影響しか与えなさない。しかし、細胞レベルでのmRNA人身売買可視化の場合、この非特異的シグナルが問題になることがある。いくつかのグループは、tRNA、ペプチドおよびナノ粒子などの修飾またはタグを提案しており、これは、核へのMBの送達を防止し、したがって、この可能な非特異的シグナル33、36を排除する。
このアプローチの最大の欠点は、生細胞イメージング用のMBの手動設計です。これに対処するために、我々は、MFEに加えて、最適でない二次構造を考慮することにより、mRNA内のアクセス可能なターゲットサイトを容易に識別するPythonベースのプログラム(PinMol)を書き、ヘアピンプローブを設計しました。生細胞24におけるmRNAの検出に適しています。PinMolは、エネルギー最小化アプローチによって予測される標的RNAの二次構造からの構造情報を使用し、最適でない構造からの情報を含むことで、特定の標的領域の柔軟性または剛性は、MB を設計する際に評価されます。対象領域のアクセシビリティ、および選択した各プローブの分子間および分子内相互作用を考慮に入れます。さらに、これらの領域はMBの非効率的な結合をもたらす可能性があるため、プローブを選択する際に、高度に調節されたRNA(例えばマイクロRNAまたはRNA結合タンパク質の結合部位)は標的部位と見なされるべきではない。ユーザーは、これらのサイトを対象とするプローブを評価して排除したり、PinMol が使用するターゲット領域を制限してプローブを設計し、そのようなサイトを含めないようにすることができます。PinMolの相対的な能力は、PinMol設計されたMBのランキングと手動で設計されたMB24の実験結果を比較することによって実証された。Pinmolは、同様の標的領域用のMBを選択および設計し、mRNA上の新しいアクセス可能な部位を同定した。これは、蛍光信号をバックグラウンドの上に増やす必要がある低コピー数転写物の検出に不可欠です。標的mRNA上の複数のアクセス可能な部位に効果的にハイブリダイズするMB数をスケールアップすることにより、シグナル増幅を達成することができます。したがって、このプログラムは、標的mRNAあたり複数のMBを設計し、同時に生細胞内の多数のmRNAを可視化するための迅速なアプローチを容易にする。
卵室内で輸送されたmRNAの高品質な5D(XYZCt)取得データを達成するためには、個々の卵室の適切な解剖と看護師細胞への効果的なマイクロインジェクションが重要です。開発の初期段階の研究では、マイクロインジェクションは卵室の生存率に有害であり、したがって、生細胞イメージング実験の長さが短縮される(<20分)。マイクロインジェクション実験の成功率の増加は、市販の超微細針を用いることによって保証することができる。さらに、インジェクション後の早期のタイムポイントを取得できるように、取得設定の迅速な設定が重要です。スポット検出およびトラッキングデータの品質は、取得した画像の品質と同じくらい良好です。
画像取得時には、後続の解析手順も慎重かつ正確に完了することが不可欠です。取得後の処理と分析は独自の困難を提供しますが、特定の実験やサンプルに適したソフトウェアを選択することで合理化できます。現在の既存のプログラムには、ヴォロシティ(パーキンエルマー)、イマリス(ビットプレーン)、ImageJ/フィジー、アイシー37が含まれます。3つのうち、Icyは(ImageJを介して)処理とイメージングデータの分析の両方を可能にするオープンコミュニティプラットフォームなので、いくつかの利点を提供します。ここでは、Icyを用いたRNAイメージングデータの効率的な処理と解析に必要な手順について説明する。我々の結果は、卵室全体で2つのmRNA種を共に可視化し、MB技術とMS2/MCPシステムを介してmRNAを追跡することによって得られたデータの代表的な結果である。
Icyソフトウェアによる取得後処理は、画像処理(明るさ、コントラストなど)と分析(例えば、スポットとしての蛍光粒子の検出感度の閾値/カットオフ設定)でユーザーの柔軟性を提供します。.Icyはまた、プロトコルエディタの実行の各ブロック内の制御関連パラメータを可能にします(例えば、コローカライズ距離を決定し、「コローカライザ」ブロックへの「最大距離」として使用します)。Icyソフトウェアは起動時に更新され、問題のトラブルシューティングに信頼性の高いオンラインサポートを提供しています。記載されたプロトコルは、oskar mRNAを検出するために設計され、代表的な結果は、検出および追跡されるmRNA粒子の種類に最適化されたパラメータを使用して得られた。例えば、oskar mRNAは、主に卵母細胞の中間段階で輸送される豊富な転写物であり、微小管ネットワークを利用し、卵母細胞の発達を通じて様々なタンパク質因子と動的に関連付ける。我々は以前に、oskar mRNPが胎児細胞から卵母細胞への輸送中に広範な改造を受けると報告した。さらに、MBを用いて、内因性オスカーmRNA人身売買の時間的および空間的特性を特徴付け、数百のオスカー転写コピーを組み込んで大きなoskar mRNAを形成できることを見出した。
コローカリゼーションとトラッキングのための取得後の分析は、イマリス、ImageJ/フィジー、ボロシティなどの他のソフトウェアを使用して実行することもできます。Icyは、高感度およびトラッキング機能を備えた蛍光粒子を閾値化し、アノテートする能力のために選ばれました。ここでは、オブジェクトベースのコローカリゼーションについて説明しますが、トラッキングを行わずにコローカリゼーションを行うことで、IcyとImageJプラグイン(Colocalization studio、JACoP)を用いたPCC(Costes)解析を用いてコローカリゼーションの重なり合いと度合いを定量することもできます。38歳,39.
将来的には、卵室の生存期間を延長するために、最適化された長期イメージングプロトコルが望まれている。これは、長距離mRNAの人身売買研究に関連するデータを分析するために、より長い取得を提供します。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていない。
Acknowledgments
サルヴァトーレA.E.マラス(ラトガース大学公衆衛生研究所センター)が分子ビーコンの合成、標識、精製を行い、ダニエル・セント・ジョンストン(ケンブリッジ大学ガードン研究所)がオスカー-MS2/ MCP-GFPトランスジェニックフライストック。この作品は、国立科学財団キャリア賞1149738とDPBに専門スタッフ会議-CUNY賞によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectrofluorometer | Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon | n/a | Photon counting spectrofluorometer |
| Quartz cuvette | Fireflysci (former Precision Cells Inc.) | 701MFL | |
| Dumont #5 tweezer | World Precision Instruments | 501985 | Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Cover slip No.1 22 mm x 40 mm | VWR | 48393-048 | |
| Dissecting microscope | Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. | n/a | |
| CO2 fruit fly anesthesia pad | Genesee Scienific | 59-114 | |
| Tris-HCL pH 7.5 | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Spinning disc confocal microscope | Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. | n/a | |
| Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera | Hamamatsu | n/a | |
| PatchMan NP 2 Micromanipulator | Eppendorf Inc. | 920000037 | |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf Inc. | 920010504 | |
| Injection needle: Femtotips II | Eppendorf Inc. | 930000043 | |
| Loading tip: 20 μL Microloader | Eppendorf Inc. | 930001007 | |
| Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm | VWR | 48393-026; 48393-172 | |
| Dry yeast | Any grocery store | n/a | |
| Computer, > 20 GB RAM | Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing |
References
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