Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisering en opvolging van endogene Mrna's in levende Drosophila melanogaster Eier kamers

Published: June 4, 2019 doi: 10.3791/58545
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1,2
1Biological Sciences Department Hunter College, City University of New York, 2Program in Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Graduate Center, City University of New York

Summary

Hier presenteren we een protocol voor de visualisatie, detectie, analyse en tracking van endogene mRNA-handel in levende Drosophila melanogaster Eier kamer met behulp van moleculaire bakens, draaiende schijf confocale microscopie en open-source analyse Software.

Abstract

Fluorescentie-gebaseerde beeldvormingstechnieken, in combinatie met ontwikkelingen in lichte microscopie, hebben een revolutie teweeggebracht in de manier waarop celbiologen Live-celbeeldvormings onderzoeken uitvoeren. De methoden voor het opsporen van Rna's zijn sterk toegenomen sinds de seminale studies de locatiespecifieke mRNA-lokalisatie hebben gekoppeld aan de genexpressie verordening. Dynamische mRNA-processen kunnen nu worden gevisualiseerd via benaderingen die Mrna's detecteren, in combinatie met microscopie-opstellingen die snel genoeg zijn om het dynamische bereik van moleculair gedrag vast te leggen. De moleculaire baken technologie is een hybridisatie gebaseerde benadering die in staat is om de endogene transcripten in levende cellen direct te detecteren. Moleculaire bakens zijn haarspeld vormige, intern quenched, single-nucleotide discriminerende nucleïnezuur sondes, die alleen fluoresceren bij hybridisatie tot een unieke doel sequentie. In combinatie met geavanceerde fluorescentiemicroscopie en hoge resolutie beeldvorming, kunnen ze een ruimtelijke en temporele tracking van intracellulaire beweging van Mrna's uitvoeren. Hoewel deze technologie de enige methode is die in staat is om endogene transcripten te detecteren, hebben celbiologen deze technologie nog niet volledig omarmd vanwege moeilijkheden bij het ontwerpen van dergelijke sondes voor Live-celbeeldvorming. Een nieuwe softwaretoepassing, Pinmol, zorgt voor een verbeterd en snel ontwerp van sondes die het meest geschikt zijn om efficiënt te hybridiseren naar mRNA-doelgebieden binnen een levende cel. Bovendien, hoge resolutie, real-time beeld verwerving en huidige, open source beeldanalyse software zorgen voor een verfijnde data-output, wat leidt tot een fijnere evaluatie van de complexiteit van de dynamische processen die betrokken zijn bij de levenscyclus van de mRNA.

Hier presenteren we een uitgebreid protocol voor het ontwerpen en leveren van moleculaire bakens in Drosophila melanogaster Eier kamers. Directe en zeer specifieke detectie en visualisatie van endogene maternale Mrna's wordt uitgevoerd via draaiende schijf confocale microscopie. Imaging gegevens worden verwerkt en geanalyseerd met behulp van objectdetectie en tracking in Icy software om informatie te verkrijgen over de dynamische verplaatsing van Mrna's, die worden vervoerd en gelokaliseerd in gespecialiseerde gebieden binnen de eicel.

Introduction

Celbiologie studies die dynamische gebeurtenissen visualiseren met ruimtelijke en temporele resolutie zijn mogelijk gemaakt door de ontwikkeling van fluorescentie-gebaseerde Live Cell Imaging technieken. Momenteel wordt in vivo mRNA-visualisatie verkregen via technologieën die zijn gebaseerd op RNA aptamer-eiwit interacties, RNA aptamer-geïnduceerde fluorescentie van organische kleurstoffen en nucleïnezuur sondegloeien1,2, 3. ze bieden allemaal een hoge specificiteit, gevoeligheid en signaal-naar-achtergrond ratio. RNA aptamer-gecentreerde benaderingen vereisen echter uitgebreide genetische manipulatie, waarbij een transgen is ontworpen om een RNA uit te drukken met kunstmatige structurele motieven die nodig zijn voor eiwitten of organische kleurstof binding. Het MS2/MCP-systeem vereist bijvoorbeeld de co-expressie van een transgen dat een RNA-constructie met meerdere tandem herhalingen van de bindings sequentie voor de bacteriofaag ms2 Coat protein (MCP) en een ander transgen codeert met een fluorescerende proteïne gesmolten tot MCP4,5. De toevoeging van dergelijke secundaire structurele motieven aan het RNA, samen met een volumineus fluorescendig gelabeld eiwit, heeft bezorgdheid geuit dat inheemse RNA-processen kunnen worden beïnvloed6. Een technologie die deze bezorgdheid behandelt en extra unieke voordelen biedt, is de op nucleïnezuur gebaseerde benadering, moleculaire bakens (MBs). MBS zorgen voor de multiplex detectie van endogene mrna's, discriminatie van enkelvoudige nucleotide variaties, en snelle kinetiek van hybridisatie met target mRNA7,8. MBs zijn oligonucleotide-sondes die in een afgestelde haarspeld plooi achterblijven voordat ze een fluorogene conformationele verandering ondergaan zodra ze hun doelen hybridiseren (figuur 1c)9. Verschillende groepen hebben succes gehad met het gebruik van MBS om zowel niet-Codeer rna's (microRNAs en lncrnas) te detecteren10,11,12,13, RNA retrovirussen14 en dynamische DNA-eiwitten interacties15. Ze zijn met succes gebruikt voorbeeld vorming in verschillende organismen en weefsels, zoals zebravis embryo's16, neuronen13, tumorweefsel17, differentiërende cardio myocytes18, en salmonella 19.

Hier beschrijven we de ontwerp-, leverings-en detectie benadering voor endogene Mrna's in Living D. melanogaster Eier kamers in combinatie met een microscopie set-up die snel genoeg is om het dynamische bereik van actief moleculair transport vast te leggen. De D. melanogaster Eier kamer heeft gediend als een ideaal multicellulair modelsysteem voor een breed scala aan ontwikkelingsstudies, van vroege kiembaan stamcel deling en maternale genexpressie tot de generatie van het segmentale Body plan20, 21. Eier kamers zijn gemakkelijk geïsoleerd, groot en doorschijnend en kunnen uren van ex- vivo -analyse weerstaan, waardoor ze zeer vatbaar zijn voor Imaging-experimenten. Veel werk heeft zich geconcentreerd op de asymmetrische lokalisatie van moederlijke transcripten aan discrete subcellulaire regio's voordat ze actief werden vertaald. In het bijzonder moet de lokalisatie van Oskar mRNA en de daaropvolgende vertaling ervan op de achterste pool van de eicel op een strak geregelde wijze plaatsvinden om een dodelijk bicaudale embryo-fenotype22te vermijden. Oskar mRNA wordt getranscribeerd in de 15 kiembaan cellen, verpleegkundige cellen genoemd, en actief getransporteerd door cytoplasmische bruggen, zogenaamde ring grachten, in de eicel, de germlijncel die het volwassen ei wordt en is uiteindelijk bevruchte (Figuur 1a ). De aanzienlijke hoeveelheid informatie die al beschikbaar is met betrekking tot de dynamische werving en uitwisseling van eiwit factoren van en naar Oskar mrnp, samen met zijn lange-afstand intracellulaire reizen, maken van Oskar een voorkeurs kandidaat om te studeren de vele processen van de mRNA-levenscyclus. MBs zijn instrumentaal in het onthullen van Details over het proces van mRNA lokalisatie en het ontcijferen van de verordening en functie van eiwit factoren die controle mRNA transport tijdens Drosophila oogenesis. In het bijzonder, door het microinjecteren van MBS in verpleeg cellen en het uitvoeren van Live Cell Imaging experimenten, is het volgen van endogene mrna's mogelijk8,23.

De roadmap die hier wordt gepresenteerd, biedt de stappen van een compleet proces, van het uitvoeren van een live-celbeeldvormings experiment met MBs, het verkrijgen van Imaging gegevens tot het uitvoeren van data-analyse om endogene mRNA in zijn native cellulaire omgeving te volgen. De stappen kunnen worden aangepast en verder geoptimaliseerd om te voldoen aan de behoeften van onderzoekers die werken met andere weefsels/celtypen binnen hun eigen lab-instelling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ontwerp van MBs voor Live-Celbeeldvorming

  1. Vouw de doel-RNA-sequentie om de secundaire structuur van het mRNA-doelwit te voorspellen met behulp van de "RNA-vorm" van de mfold -server (http://unafold.RNA.Albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
    1. Plak/upload de doel volgorde in het fasta-formaat, selecteer 5 of 10% sub-optimaliteit (structuren met een vrije energie van vouwen binnen 5 of 10% van de MFE-waarde, respectievelijk) en pas het maximum aantal berekende vouwen dienovereenkomstig aan (bijv. groter voor 10% sub-optimaliteit).
      Opmerking: de opname van suboptimale secundaire structuren bij het ontwerpen van MBs maakt het mogelijk om regio's binnen het beoogde mRNA te identificeren die flexibeler of stijver kunnen zijn dan zoals voorspeld voor de minimale vrije energie (MFE)-structuur alleen, wat de algemeen ontwerp van MBs geschikt voor Live-celbeeldvorming.
    2. Selecteer een "onmiddellijke taak" voor mRNA-doelen van 800 nucleotiden (NT), of een "batchtaak" voor mRNA lengtes tussen 801 en 8.000 NT. Sla het "SS-Count" bestand op als eenvoudig tekstbestand.
  2. Gebruik de "SS-Count" bestand verkregen in stap 1,1 als input voor de pinmol programma (https://bratulab.WordPress.com/software/) met de gewenste parameters, voor het ontwerpen van verschillende MBS voor de mRNA target (Zie tutorials beschrijven gebruik van pinmol programma 24 op https://bratulab.WordPress.com/tutorial-pinmol-Mac/).
    1. Bepaal de specificiteit van geselecteerde Mb's door BLAST-analyse uit te voeren: gebruik "blastn" met de juiste database (bijv. voor Oskar mRNA-specifieke mb's gebruiken de "refseq-RNA" database en het Drosophila melanogaster organisme).
    2. Identificeer een Weefselspecifieke uitdrukking van het mRNA-doel (bijv. voor Oskar mRNA flybase ≫ expressie gegevens met hoge doorvoer ≫ Flyatlas Anatomy Microarray of MODENCODE Anatomy RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) en vergelijk met elke positieve BLAST hits. Elimineer sondes die > 50% cross-homologie met andere Mrna's tonen die ook worden uitgedrukt in het weefsel/de cel van belang.
  3. Selecteer de combinatie van de en dorstlesser die geschikt is voor het instellen van de microscopie die beschikbaar is voor het uitvoeren van Live-celbeeldvorming (bijv. Cy5/BHQ2)25.

2. MB synthese, zuivering, en karakterisering

  1. Gebruik in-House synthese en zuivering zoals eerder beschreven7, of diensten van commerciële aanbieders, voor het synthetiseren en zuiveren van één tot vijf MBS (zie bovenstaande noot), met behulp van de volgende etiketterings schema: [5 ' (Fluorophore)-(C3 of C6 linker)-(2 '-O -METHYL MB sequentie)-(quencher) 3 ']. Purify MBs met behulp van omgekeerde fase HPLC, in huis of gebruik van de diensten van de commerciële aanbieder.
    Opmerking: De fosforamidites die voor geautomatiseerde sonde synthese worden gebruikt, moeten de 2 '-O-methyl-ribonucleotide-modificatie hebben. Men kan ook chimeras van afwisselend vergrendeld-nucleïnezuur (LNA) en 2 '-O-methyl-modificaties gebruiken om de stabiliteit van een hybride tussen een kortere MB en het beoogde mRNA26te verhogen.
  2. Synthetiseren van DNA-oligonucleotiden die overeenkomen met de volgorde van de beoogde RNA-regio en dus complementair zijn aan de sonde regio van MBs, voor gebruik in in vitro karakterisatie (zie stappen 2,3 tot 2,5; bovenstaande noot). Maximaliseer hybridisatie van de MB met het DNA-oligonucleotide doelwit nabootsen, door het opnemen van elk uiteinde van het DNA doelwit vier extra nucleotiden, zoals gevonden in de target mRNA sequentie.
    Opmerking: een striktere karakterisering van de MB-efficiëntie om de beoogde sequentie te detecteren kan worden uitgevoerd met behulp van in vitro gesynthetiseerde RNA-doelen in plaats van complementaire DNA-oligonucleotiden8.
  3. Voer thermische denaturatie van de MB alleen uit, meet de smelttemperatuur (TM) en bevestig dat de MB de gewenste haarspeld vorm op fysiologische temperatuur aanneemt. We hebben TM waarden waargenomen tussen 60 en 90 °C.
  4. Voer thermische denaturatie van de MB uit in aanwezigheid van het DNA-oligonucleotide-doel en meet de MB: DNA target Hybrid TM, zoals eerder beschreven7. Een TM tussen 55 en 60 °C is gewenst voor de MB: DNA Hybrid.
  5. Voer in vitro hybridisatie reacties uit met het corresponderende DNA oligonucleotide doelwit en bepaal de efficiëntie van MB: DNA hybride vorming op fysiologische temperatuur, zoals eerder beschreven7. Snelle hybridisatie kinetiek met de DNA-doel nabootsen is gewenst, maar MBs die geen hoge hybridisatie efficiëntie met DNA-doelen vertonen, kunnen een betere prestatie hebben met het doelwit mRNA in vitro en/of in vivo.

3. dissectie en bereiding van individuele Eier kamers voor micro injectie

  1. Voer nieuw uitgekomen, gedekt vrouwtjes voor 2-3 dagen met verse gist pasta.
  2. Anesthetize vliegt op een CO2 -pad en, met behulp van fijne pincet (Dumont #5), Transfer 1-2 vrouwtjes in een druppel Halo carbon olie 700 op een glazen afdekplaat.
  3. Met behulp van een paar pincet, oriënteer de vlieg met de rugzijde onder een stereomicroscoop. Ontleden de vrouwelijke buik door een kleine incisie aan het achterste uiteinde te maken en zachtjes het paar eierstokken in de olie te persen.
  4. De eierstokken uitplanten op een olie druppel op een nieuwe dekslip. Houd één eierstok met één pincet vast terwijl u de jongste stadia van de ovariole met de andere pincet afknijk. Oskar mRNA is actief gelokaliseerd op en na mid-oogenesis (stadia > 7), en jongere Eier kamers (stadia < 7) zijn moeilijker te injecteren en overleven niet zo lang. Sleep langzaam op de Afdekstrook (met een neerwaartse beweging) totdat afzonderlijke ovariolen of Eier kamers zijn geïsoleerd en verticaal zijn uitgelijnd. Andere afzonderlijke Eier kamers door de ongewenste stadia van de Eier ketting ovariole te verplaatsen.
    Opmerking: Zorg ervoor dat individueel gekaarde Eier kamers niet in de olie drijven en dat ze zich aan de Afdekstrook houden. Dit is belangrijk voor zowel succesvolle micro Injection als Image Acquisition.

4. micro injectie van MBs in de verpleeg cellen van de Eier kamers

  1. Bereid de MB-oplossing met behulp van één moleculair baken (bijv. osk2216Cy5) of een mix van twee Mb's die gericht zijn op verschillende Mrna's en die zijn gelabeld met spectraaal verschillende fluor Foren (bijvoorbeeld osk2216Cy5 en drongo1111Cy3). Gebruik een concentratie van 200-300 ng/μL per MB in HybBuffer (50 mM tris-HCl-pH 7,5, 1,5 mM MgCl2 en 100 mm NaCl). Voor een cocktail van vier mb's gelabeld met dezelfde de die gericht zijn op dezelfde mRNA op 200 ng/μL elk in hybbuffer (bijvoorbeeld osk82, osk1236, osk2216). Draai de MB-oplossing direct vóór het laden van de naald voor micro injectie.
  2. Selecteer de doelstelling. Een 40x-olie doelstelling wordt aanbevolen voor het vinden van een geschikte Eier kamer en voor het uitvoeren van micro injectie.
  3. Monteer de dekslip met ontleed Eier kamer op de Microscoop. Breng het doel in de focus positie en Identificeer een Eier kamer in een mid-to-late ontwikkelingsfase, die goed is georiënteerd voor micro injectie (d.w.z., met de AàP-as loodrecht op de naaldpunt om gemakkelijke injectie binnen een verpleegkundige mogelijk te maken cel proximale tot de eicel).
  4. Plaats een naald (commercieel of voorbereid in huis27) met ~ 1 μL MB oplossing (Zie stap 4,1) en sluit deze aan op de micro injector. Voor micro injecties in D. melanogaster Eier kamers, oriënteer de naald (Zie tabel van de materialen) onder een hoek < 45 ° tot de Microscoop fase (bv. 30 °) om te voorkomen dat verschillende verpleeg cellen worden geprikt.
  5. Stel de injector in met een injectiedruk van 500-1000 hPa en een compensatie druk van 100-250 hPa (Zie tabel met materialen).
  6. Verplaats het podium langzaam om een gebied van de olie druppel leegte van de Eier kamers op het gezichtsveld te brengen.
  7. Gebruik de micromanipulator-joystick om de naald zachtjes in de olie druppel te laten vallen en de punt in de richting van de omtrek van het gezichtsveld te brengen.
  8. Voer een ' clean ' functie uit om de lucht van de punt van de naald te verwijderen en om ervoor te zorgen dat er stroom van de naald is.
  9. Breng de naald naar de thuispositie en concentreer u op de Eier kamer om microgeïnjecteerd te worden, breng de naald dan weer in de focus en plaats deze in de buurt van de rand van de Eier kamer.
  10. Voer een fijnafstelling uit van de Z-positie van de doelstelling, zodat het membraan dat de follikel cellen van verpleeg cellen scheidt, scherp is.
  11. Steek de naald in een verpleeg cel en voer een injectie uit voor 2-5 s.
  12. Verwijder voorzichtig de naald en trek deze in de startpositie.
  13. Verander de doelstelling naar de gewenste vergroting voorbeeld verwerving (60-63x of 100x), focus op de Eier kamer en begin met acquisitie.

5. acquisitie van gegevens met behulp van een draaiende schijf confocale Microscoop Setup

Opmerking: Zie de tabel met materialen voor onze specifieke instellingen.

  1. Het acquisitie protocol instellen om een XYZCt-stapel van 8-16-bits afbeeldingen op te nemen (XYZ = volume, C = Channel, t = time).
  2. Selecteer laserlijnen voor de gewenste kanalen (bijv. 641 nm laser voor Cy5 en 491 nm voor GFP) en verkrijg de kanalen opeenvolgend: eerst het fluorescentie signaal in elk kanaal en verander vervolgens de Z-positie, om een goede colokalisatie analyse mogelijk te maken.
  3. Selecteer de Z-stap (bijvoorbeeld 0,3 μm) en de boven-en onderz-grenswaarden (bijv. -2 μm tot 2 μm).
  4. Voer de aanschaf tijd en de bemonsteringsfrequentie in (bijvoorbeeld elke 15-30 s voor maximaal 1 uur).
  5. Overname starten.

6. verwerking, gegevensanalyse om tracking-en Colokalisatie-informatie te verkrijgen en voorbereiding van video bestanden

  1. Beeldverwerking
    1. Download, pak en open Icy, een open community platform voor bioimage informatica (http://Icy.bioimageanalysis.org/)
    2. Open de XYZCt stack verworven in stap 5: Image/sequence > bestand > geopend.
    3. Converteer stack naar ImageJ: ImageJ > tools > converteren naar IJ, hebben de modus vrijstaand ingeschakeld.
    4. Maak een substack (een selectie van een reeks Z-stappen en tijdpunten die verder moet worden geanalyseerd): ImageJ > Image > Stacks > tools > Substack maken...; Selecteer de gewenste kanalen, Z-stappen en tijdpunten.
    5. Substack opslaan als TIFF-bestand: ImageJ >-bestand > opslaan als > TIFF...; Gebruik dit bestand voor de volgende stappen.
    6. Gesplitste kanalen: ImageJ > Afbeelding > Kleur > gesplitste kanalen.
    7. Achtergrond aftrekken met behulp van een achtergrond stack: ImageJ > process > Image Calculator..., of met de optie rolling ball: ImageJ > proces > achtergrond aftrekken..., selecteer de Rolling Ball RADIUS. Bekijk de afbeelding voor de geselecteerde straal voordat u ' accepteren ' selecteert.
      Opmerking: achtergrond signaal zal voornamelijk voortvloeien uit het onjuist blusen van de flurorophore. De signaal: achtergrond ratio (S:B) wordt vaak gebruikt als indicator voor de "helderheid" van een MB, en wordt gemeten uit in vitro hybridisatie experimenten van de MB en DNA doel oligonucleotide. Bijvoorbeeld, MBs osk1236 en osk2216 hebben een S:B van ~ 81 en ~ 120, respectievelijk.
    8. De helderheid en het contrast voor elk kanaal aanpassen: ImageJ > Afbeelding > > Helderheid/contrast aanpassen, selecteer toepassen.
    9. Sla elk kanaal op als een afzonderlijk TIFF-bestand: ImageJ >-bestand > opslaan als > TIFF....
    10. Voeg de twee kanalen samen: ImageJ > Afbeelding > Kleur > kanalen samenvoegen...; Selecteer de kanalen. Sla de nieuwe stapel op als een nieuw TIFF-bestand (Zie stap 6.1.8).
  2. Detectie en tracering van vlekken
    1. Converteer terug naar Icy: ImageJ > tools > omzetten naar Icy.
    2. Een schaalbalk wordt automatisch op de stapel geplaatst bij conversie naar Icy, als de plug-in schaalbalk is geïnstalleerd [zoeken met plug-ins > Setup > Online plugin]. Bewerk indien nodig de schaalbalk via het Inspector-venster (rechterkant van het scherm) > laag tabblad > naam > schaalbalk.
    3. Schakel het pictogram ' oog ' voor schaalbalk van het tabblad laag uit > naam om de schaalbalk uit de oorspronkelijke stapel te verwijderen. Het kan opnieuw worden geactiveerd op de laatste stapel.
    4. Sla de nieuwe verwerkte stapel op door een screenshot te maken met het pictogram "camera" in de menubalk van het afbeeldingsvenster, "Maak een screenshot van de huidige weergave" en sla het bestand > op als > TIFF....
    5. Bepaal de gevoeligheid van de spot, als de parameters voor de spot gevoeligheid al zijn vastgesteld Ga naar stap 6.2.7.
    6. Vlekken detecteren: Selecteer het venster met de te analyseren afbeelding of stapel, detectie & Tracking > detectie > Spot detector en vul de instellingsparameters in:
      1. Voor invoer, selecteer "currentSequenceInputDetection" (standaard).
      2. Voor pre-processing selecteert u ' kanaal 0 ' (standaard) of gewenst kanaal doorkruis verwijzing naar het nummer in het Inspector-venster > tabblad reeks.
      3. Voor detector, selecteer "Detecteer Bright spot on dark background;" gebruik "Forceer gebruik van 2D-wavelets voor 3D" alleen als er niet genoeg Z-slices in de stapels zijn om de analyse uit te voeren. Selecteer "scale (s)" en "sensitivity" voor elke schaal (Voeg meer weegschalen toe voor grotere vlekken). De schaal en gevoeligheid (hoe groter het getal de meer gevoelige is de detectie, een maximum van 140 wordt gesuggereerd door Icy) zijn trial and error variabelen, dat moet achteraf visueel worden gecontroleerd en besloten op.
      4. Voor regio van belang, gebruik "ROIfromSequence" (standaard).
      5. Voor het filteren gebruikt u ' NoFiltering ' (standaard) of selecteert u ' SizeFiltering ' om het ' bereik van geaccepteerde objecten (in pixels) ' te definiëren.
      6. Uitvoer: Selecteer XLS-of XML-uitvoerinstelling (Selecteer XML-indeling bij gebruik van 2007 MS Excel of eerder en er zijn > 65.000 plaatsen). Als de spot detector resultaten worden gebruikt voor de tracking-analyse, ook selecteren "exporteren naar zwembad".
      7. Herhaalde detectie van vlekken met behulp van verschillende schaal/gevoeligheids waarden totdat alle of de meeste van de vlekken zijn gedetecteerd. Noteer alle laatste parameters.
      8. Voor colokalisatie analyse, herhalings detectie voor het andere kanaal.
    7. Als u vlekken wilt bijhouden, selecteert u detectie & Tracking > Tracking > Spot Tracking > de spot detector uitvoeren met parameters uit stap 6.2.6., of gebruik "Selecteer detectieresultaten hier" pull-down menu om een bestaande gegevensset te selecteren (voor dit, keep spot detector venster Open vanaf stap 6.2.5). Druk op de knop "Ramings parameters" en selecteer de gewenste doel beweging in het pop-upvenster parameters raming (bijvoorbeeld "is zowel diffusief als gericht"). Druk op de knop "run tracking".
    8. Herhaal detectie en tracering voor andere kanalen bij het volgen van vlekken van meerkanaalsstapels, volgende stappen 6.2.6 en 6.2.7, te beginnen met de stack die is gegenereerd op basis van stap 6.2.7.
    9. Als u tracks wilt visualiseren, selecteert u detectie & Tracking > Tracking > track manager – dit venster wordt automatisch geopend na voltooiing van een tracking-run. Voor "Color track processor" selecteert u "Enable" en kiest u de gewenste kleurweergave voor de tracks. Relevante track processors zijn toegankelijk via de "track processor toevoegen..." pull-down menu (Selecteer bijvoorbeeld "track processor time clip", schakel het venster "track Clipper" in en kies het gewenste aantal detecties dat moet worden weergegeven voor en na het huidige tijdpunt.)
    10. Informatie over tracks opslaan als een XML-trackbestand: detectie & Tracking > Tracking > track Manager > bestand > opslaan als....
    11. Sla resultaten op door een screenshot te maken met het pictogram "camera" in de menubalk van het afbeeldingsvenster, "Maak een screenshot van de huidige weergave". Screenshots kunnen worden genomen met de gedetecteerde vlekken en/of de tracks gewoon door het activeren/deactiveren van de bijbehorende Eye icon (s) gevonden in Inspector venster > laag tabblad > naam > overlay wrapper.
    12. Installeer de TimeStamp overlay plugin: plugins > Setup > Online plugin > TimeStamp overlay > installeren.
    13. Tijdstempel toevoegen: plugins > TimeStamp overlay (nieuw). Volg de instructies in het pop-upvenster (rechtsonder in het scherm) voor aanwijzingen over het plaatsen en opmaken van de tijdstempel. Het tijdsinterval kan worden toegevoegd/gewijzigd in het Inspector-venster > sequence-tabblad > sequence-eigenschappen > bewerken.
    14. Sla resultaten op door een ander screenshot te maken. Afbeelding opslaan als 1) TIFF-formaat, en 2) als AVI-formaat; voor AVI-indeling eerst converteren naar RGB-rendering (afbeelding/volgorde > Rendering > RGB-afbeelding).
    15. Afbeelding roteren naar gewenste oriëntatie: Inspector-venster > sequence-tabblad > Canvas > rotatie.
    16. Sla de geroteerde afbeelding op door "Maak een screenshot van de huidige weergave". Zorg ervoor dat het pictogram "oog" voor de schaalbalk is uitgeschakeld, omdat het ook met de afbeelding zal draaien.
    17. ROI kiezen en bijsnijden: Selecteer interessegebied > 2D-ROI > Kies ROI-vorm en vervolgens ROI maken/tekenen op de afbeelding; Afbeelding/sequentie > vlak (XY) > snel bijsnijden.
  3. Colokalisatie-analyse
    1. Een colokalisatie-protocol voorbereiden; verschillende voorbeelden zijn beschikbaar op de Icy website (http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/List) (Zie aanvullende materialen).
    2. Colokalisatie protocol laden: Hulpprogramma's > Scripting > protocollen > laden, en parameters in de interactie blokken aanpassen (bijvoorbeeld in de "wavelet detectie" blok gebruik parameters bepaald in stap 6.2.6.).
    3. Meet de grootte van een deeltje in pixels, bepaal de afstand van de colokalisatie en voer het in "Colocalizer"-blok als "maximale afstand".
      Opmerking: De grootte van het deeltje in pixels is afhankelijk van het detectiesysteem. Als u de grootte wilt meten, zoomt u in op één deeltje en telt u handmatig de pixels die de breedte van het signaal beslaan. Gemiddelde van de metingen van ten minste drie deeltjes. De maximale afstand die moet worden ingesteld voor colokalisatie is de grootte van het deeltje in pixels (dit staat voor de maximale som van de straal van twee deeltjes die aanraken).
    4. Indien gewenst, selecteert u een of meer ROIs voor colokalisatie analyse: regio van belang > 2D ROI > Kies ROI vorm > ROI op afbeelding tekenen.
    5. Opbrengst ROI (s): afbeelding/volgorde > vlak (XY) > snel uitsnijden.
    6. Uitvoeren colokalisatie: protocollen editor venster > gekozen protocol tabblad > uitvoeren. Het laatste blok in het venster van de protocollen-editor bevat het algehele colokalisatie percentage op basis van spot detectie, terwijl de informatie op elk tijdstip kan worden gevonden in het Inspector-venster > tabblad uitvoer.
    7. Spoor cogelokaliseerde en enkelvoudige deeltjes op door stap 6.2.7 (track spots) te volgen.
    8. Opslaan zoals beschreven in stap 6.2.16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Met behulp van Pinmolkunnen verschillende MBS worden ontworpen voor één mRNA-doel (Figuur 1b-C). Na synthese en zuivering, de geselecteerde MBs worden gekenmerkt en vergeleken met behulp van in vitro analyse.

Figure 1
Figuur 1: techniek en weefsel beschrijving voor Live-celbeeldvorming van endogene Mrna's. A) voorstelling van een mid-stage Drosophila Eier kamer die wordt gebruikt voor micro injectie. De micro injectienaald (groen) levert een cocktail van moleculaire bakens die specifiek zijn voor Oskar mRNA. Een snelle injectie in een verpleegkundige cel maakt detectie mogelijk van Mrna's in transit naar de eicel, evenals visualisatie van reeds gelokaliseerde mRNA bij de posterieure cortex. (B) pinmol software output van moleculaire baken ranking voor targeting Oskar mRNA (C) secundaire structuur regio binnen Oskar mRNA getarget door een moleculair baken. (C ') Opeenvolging en vouwen van Oskar-specifieke moleculaire baken, osk2216. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Na optimale prestaties van MBs wordt bevestigd via in vitro karakterisatie, worden de sondes gebruikt voor Live visualisatie van endogene doelwit mRNA (s). Het is mogelijk om de patronen van Oskar mRNA transport en lokalisatie te visualiseren in verschillende stadia van de oogenesis, en in het bijzonder op en na mid-oogenesis (7-10) (Figuur 2a-B). Vanwege hun geringe omvang is het moeilijk om Eier kamers in zeer vroege stadia te injecteren (1-4). Wanneer individueel geïnjecteerd in dezelfde fase Eier kamers, Oskar-specifieke MBS presenteren dezelfde patronen van lokalisatie (afbeelding 2, osk1236 VS osk2216).

Figure 2
Figuur 2: tijd sequentie van Oskar mRNA in wild type Eier kamer bij t = 0, 10 en 30 min tijdpunten, na aanvang van de overname. Verpleegkundige celinjecties van twee Oskar-specifieke moleculaire bakens (osk1236 en osk2216) in (a) fase 6-7 Eier kamers en (B) fase 9 Eier kamers. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Verschillende mRNA-targets kunnen worden gevisualiseerd door gebruik te maken van spectraaal verschillende fluorescendig gelabelde MBs (Figuur 3). De MB-oplossing kan microgeïnjecteerd worden in een verpleegkundige cel (Figuur 3a) of in de eicel (Figuur 3b). MBs geïnjecteerd in een verpleegkundig cel cytoplasma zal vrij diffuus in de andere verpleegkundige cellen, alsmede in de eicel, en dus zijn in staat om hun doelwit te vinden en het genereren van fluorescentie signaal op andere plaatsen dan de micro-injectieplaats. Bijvoorbeeld, bij het uitvoeren van micro injecties in een verpleegkundige cel van een late oögenese stadium (9-10) Eier kamer, het grootste deel van het fluorescentie signaal gevisualiseerd binnen de eicel wordt gegenereerd door de reeds gelokaliseerde Oskar mRNA, en minder door actief vervoerd Transcripten, die vaker voorkomen in eerdere stadia (7-8). Merk op dat klassieke Mb's aanleiding geven tot een niet-specifiek signaal binnen de kernen, waardoor de analyse wordt beperkt tot de cytoplasmische gebieden van de Eier kamer. Aanvullende modificaties, zoals neutravidin of goud nanodeeltjes, zijn gebruikt om dit niet-specifieke signaal28,29te verminderen of te elimineren. Ondanks dit nucleaire niet-specifieke signaal is de specificiteit van MBs voor in vivo detectie van Oskar mRNA vastgesteld met behulp van een fret APPROACH8, en MB co-Injection met in-vitro getranscribeerd Oskar mRNA gelabeld met een de spectraal verschillend van het MB-label23.

Figure 3
Figuur 3: Co-visualisatie van twee mRNA-soorten in levende Eier kamers. Co-injecties van Oskar-en Drongo-specifieke moleculaire bakens in de (A) verpleegkundige cel en (B) eicel van fase 8-9 Eier kamers. Oskar (rood) en Drongo (groen) mrna's colocaliseren aan het achterste uiteinde van de oöcyt (Asterix), en Drongo toont ook dorso-anterieure accumulatie (pijlpunt). Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Voor mRNA-doelen die lage uitdrukkings niveaus vertonen, wordt het fluorescentie signaal per mRNA-molecuul verhoogd door een cocktail oplossing te injecteren die ten minste twee Mb's bevat, elke binding aan verschillende doelgebieden (figuren 4 en 5).

Figure 4
Figuur 4: visualisatie van Oskar mRNA met zowel MBS als ms2-GFP-systeem. Micro injecties van een MB cocktail Solution (MB) in een Eier kamer die OSK-ms2:: MCP-GFP30 (GFP) uitdrukken. Na de micro injectie van een verpleegkundige cel werden de beelden elke 30 s gedurende 20 minuten verworven. Twee gebieden van belang werden geselecteerd, één ROI in een verpleegkundige cel en één in de eicel. Verschillende gevoeligheid werd gebruikt voor elke ROI om de vlekken te detecteren. ROI Nurse Cell: schaal 2, gevoeligheid 100 voor GFP en MB. ROI oocyte: schaal 2, gevoeligheid 50 voor GFP en 110 voor MB. Colokalisatie afstand is 4 pixels voor beide ROIs. De hele Eier kamer en de zoom in op de verpleegkundige cel worden getoond op het tijdspunt van 12 minuten en de zoom in op de eicel wordt getoond op het tijdpunt van 14 minuten. MB vlekken (rode cirkels) en GFP vlekken (groene cirkels) identificeren Oskar mRNA deeltjes gedetecteerd door elke benadering, en de cogelokaliseerde deeltjes (geel) geven waar MB en GFP vlekken zijn maximaal 4 pixels uit elkaar. XY-projecties van 14 Z optische segmenten bij stappen van 0,3 μm. Verworven als 16-bits gegevens met een 63x doelstelling (olie, NA = 1,4), XY = 0,24 μm, belichtingstijd 500 MS, bij 5,23 en 5,39 mW Laser vermogen voor respectievelijk de 641 nm en 491 nm laser. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Traceer analyse in de eicel, na verpleegkundige celmicro injectie met Oskar mRNA-specifieke mb's. MB-deeltjes werden gedetecteerd op schaal 2 met gevoeligheid 110, en 8 tijdpunten worden weergegeven voor/na het huidige tijdsbestek. MB vlekken (rode cirkels) worden bijgehouden in het volume van de eicel; tracks vertegenwoordigen detectie-informatie van 8 tijdpunten voor/na de getoonde 12 min tijdpunt. Elke kleur vertegenwoordigt een afzonderlijke track. XY-projecties van 14 Z optische segmenten bij stappen van 0,3 μm. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Bij het vergelijken van de handel in Oskar mRNA zoals gedetecteerd met MBS versus ms2/MCP, het fluorescentie signaal gegenereerd door Oskar-specifieke MBS getrouw documenten over het transport en lokalisatie van transgene Oskar mRNA gelabeld met 10 GFP moleculen via het MS2/MCP-systeem (Figuur 4). In Oskar-ms2/MCP-GFP transgene Eier kamers bij mid oogenesis, toonde acquisitie data analyse een uitgebreide colokalisatie tussen fluorescerende signalen van genetisch gemanipuleerde Oskar-ms2 mRNA gedetecteerd met behulp van MBS en GFP-tagging . Bij 12 en 14 minuten na de injectie, 57% (7 MB-objecten en 13 GFP-objecten, met 4 cogelokaliseerde objecten) en 93% (30 MB-objecten en 51 GFP-objecten, met 28 gelokaliseerde objecten) van gedetecteerde MB deeltjes cogelokaliseerd met GFP-deeltjes in de verpleegkundige cellen en eicel, Respectievelijk. Onze analyse levert 31% en 55% colokalisatie percentages van Oskar-ms2 mRNA met Oskar mRNA gedetecteerd met MBS binnen het cytoplasma van een verpleegkundige cel en de eicel, respectievelijk. Bovendien kunnen 5D-stacks verder worden geanalyseerd om de Oskar mRNA-trajecten voor langeafstandstransporten te bepalen in zowel de verpleegcel als het cytoplasma van de eicel (Figuur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Live visualisatie van endogene mRNA-handel in Drosophila Egg Chambers vertrouwt op het gebruik van specifieke, efficiënte en Nuclease-resistente MBS, die nu gemakkelijk met pinmol -software kunnen worden ontworpen. MBs zijn specifieke probes ontworpen voor het detecteren van unieke sequenties binnen een doel mRNA (bij voorkeur regio's vrij van secundaire structuur), waardoor een zeer opgeloste detectie van een transcript. De enige beperking bij het aannemen van deze techniek/protocol voor andere weefsels/celtypen is de efficiëntie van MB levering voor het specimen van belang. Terwijl andere benaderingen genetische manipulatie van het weefsel vereisen om een aptamer uit te drukken en een RNA-bindend eiwit gelabeld met een fluorescerend eiwit om één doelwit mRNA (bijv. MS2/MCP-systeem) te visualiseren, is multiplexing mogelijk voor, maximaal, twee transcripten. MB-technologie staat alleen voor het opsporen van endogene Mrna's in levende cellen, en het is de enige techniek die de co-visualisatie van meer dan twee mRNA-soorten toelaat.

MBS kunnen worden gelabeld met een breed scala aan fluorescerende moties en zijn stabiel binnen de cellulaire omgeving wanneer gesynthetiseerd uit gemodificeerde nucleotiden zoals 2 '-O-methylribonucleotiden of vergrendeld-nucleïnezuren26,31. Deze backbone wijzigingen verhogen ook de affiniteit van MBs voor hun doel. Verschillende Mb's kunnen eenvoudig worden ontworpen voor doel-Mrna's van gemiddelde lengte. Echter, sommige beperkingen kunnen worden aangetroffen voor korte en/of sterk gestructureerde doelen. Dit kan worden overwonnen door het aannemen van onze kleine moleculaire bakens, waarvoor de sonde gebied is ongeveer de helft van de lengte van een klassieke MB sonde31. Afhankelijk van het type specimen, worden MBS in cellen geleverd via elektroporation, linken naar celpenetrerende peptiden, lipofectie of micro Injection23,32,33,34. De prestatie-efficiëntie van een MB in Live-celbeeldvormings experimenten leunt op de mogelijkheid van de probe-sequentie om te hybridiseren tot de corresponderende complementaire sequentie binnen het mRNA-doel, die wordt bepaald door de doel structuur. De voorspelde MFE RNA secundaire structuur verkregen met behulp van in vitro gemeten thermodynamica parameters is waardevol bij het beoordelen van de beoogde toegankelijkheid, maar uiteindelijk is het de in vivo doel structuur en de doel interactie met andere cellulaire factoren die bepalend zijn voor de geschiktheid van MB voor Live-celbeeldvorming. Genoom-brede analyse van RNA secundaire structuur suggereert dat veel Rna's minder gestructureerd zijn in vivo dan in vitro35. Hoewel de efficiëntie van in vivo doel detectie met behulp van MBs voornamelijk afhankelijk is van de toegankelijkheid van de binding site, zal het optimaliseren van bepaalde MB-functies zorgen voor een verbeterde visualisatie van het mRNA-doel. In het bijzonder moet een zorgvuldige selectie van de volgende parameters worden uitgevoerd: 1) de sonde lengte kan variëren tussen 18 en 26, zodat de nucleotide samenstelling van de sonde tussen 31 en 55% GC paren in het doel: MB hybride, 2) de 5 BP stam sequentie moet G/C rijk, om de haarspeld vorm te behouden in afwezigheid van mRNA-doelwit en om mismatch-discriminatie te bieden, 3) een gemodificeerde ruggengraat moet worden gebruikt voor bescherming tegen nucleasen van zowel MB als target: MB hybride, 4) het fluorophore/quencher-paar kan een extra bescheiden stabiliteit aan de steel van de MB en 5) de de moet stabiel zijn tijdens lange beeldvormings intervallen. Bovendien genereren klassieke MBs meestal een nucleair niet-specifiek signaal34, wat in ons geval slechts matig de gegevensverwerking en-analyse beïnvloedt. Echter, voor mRNA mensenhandel visualisatie op cellulair niveau, dit niet-specifieke signaal kan problematisch worden. Verschillende groepen hebben wijzigingen of Tags voorgesteld, zoals tRNA, peptiden en nanodeeltjes, die de levering van MBS in de Nucleus voorkomen en zo dit mogelijke niet-specifieke signaal33,36elimineren.

Het grootste nadeel van deze aanpak is het handmatig ontwerpen van MBs voor Live-celbeeldvorming. Om dit aan te pakken, hebben we een op python gebaseerd programma (Pinmol) geschreven dat gemakkelijk toegankelijke doel sites binnen een mRNA identificeert door suboptimale secundaire structuren naast de MFE te overwegen, evenals ontwerpen haarspeld voelers, die het beste zijn geschikt voor de detectie van Mrna's in levende cellen24. Pinmol maakt gebruik van structurele informatie uit secundaire structuren van het doel-RNA voorspeld via energie minimalisatie benaderingen, en door het opnemen van informatie van suboptimale structuren, is de flexibiliteit of stijfheid van specifieke doelgebieden beoordeeld bij het ontwerpen van MBs. Er wordt rekening gehouden met de toegankelijkheid van de beoogde regio's, evenals met de inter-en intramoleculaire interacties van elke geselecteerde sonde. Bovendien moeten sterk gereguleerde gedeelten van RNA (bijv. binding sites voor microRNAs of RNA-bindende eiwitten) niet worden beschouwd als doel sites bij het selecteren van probes, omdat deze regio's kunnen resulteren in inefficiënte binding van de MBs. De gebruiker kan testen en elimineren van tests die gericht zijn op deze sites, of beperken van de doelregio die wordt gebruikt door Pinmol voor het ontwerpen van tests, zodat deze sites niet worden opgenomen. De relatieve capaciteit van pinmol werd aangetoond door het vergelijken van de ranking van pinmol ontworpen MBS met de experimentele resultaten van handmatig ontworpen MBS24. Pinmol selecteerde en ontwierp MBS voor soortgelijke doelregio's en identificeerde nieuwe toegankelijke sites op de mRNA. Dit is essentieel voor de detectie van lage kopie nummer transcripten waar het fluorescerende signaal moet worden verhoogd boven de achtergrond. Door het opschalen van de MB-nummers die effectief hybridiseren aan verschillende toegankelijke sites op een doel-mRNA, signaalversterking kan worden bereikt. Daarom vergemakkelijkt dit programma een snelle aanpak om meerdere Mb's per doel-mRNA te ontwerpen en tegelijkertijd talrijke Mrna's in een live-cel te visualiseren.

Om hoge kwaliteit 5D (XYZCt) acquisitie gegevens van vervoerde Mrna's in de Eier kamer te bereiken, zijn de juiste dissectie van individuele Eier kamers en effectieve micro injectie in verpleeg cellen van cruciaal belang. Voor studies in de vroege stadia van ontwikkeling, kan micro injectie schadelijk zijn voor de levensvatbaarheid van de Eier kamer en dus wordt de lengte van een live-celbeeldvormings experiment verkort (< 20 min). Een verhoogd succespercentage van de Microinjection experimenten kan worden verzekerd door gebruik te maken van commercieel verkrijgbare ultrafijne naalden. Daarnaast is een snelle set-up van de acquisitie instellingen belangrijk, zodat de vroege, post-injectie tijdpunten kunnen worden vastgelegd. De kwaliteit van de spot detectie-en traceergegevens is slechts zo goed als de kwaliteit van de verworven beelden.

Bij het verzamelen van afbeeldingen is het essentieel dat volgende analysestappen ook zorgvuldig en nauwkeurig worden uitgevoerd. Hoewel de verwerking en analyse van post-acquisitie hun eigen reeks moeilijkheden bieden, kunnen ze worden gestroomlijnd door de juiste software te kiezen voor iemands specifieke experiment of monster. Huidige bestaande Programma's zijn Volocity (PerkinElmer), Imaris (Bitplane), ImageJ/Fiji en Icy37. Van de drie, Icy biedt verschillende voordelen, omdat het een open community-platform is dat zowel de verwerking (via ImageJ) als de analyse van Imaging data mogelijk maakt. Hier beschrijven we de stappen die nodig zijn voor een efficiënte verwerking en analyse van RNA Imaging data met behulp van Icy. Onze resultaten zijn representatief voor de gegevens die zijn verkregen door de co-visualisering van twee mRNA-soorten in een hele Eier kamer en door het volgen van een mRNA via de MB-technologie en het MS2/MCP-systeem.

De verwerking na overname met Icy software biedt gebruikers flexibiliteit bij de beeldverwerking (bijv. helderheid, contrast) en analyse (bijv. de drempels/cut-offs instellingen voor de gevoeligheid van de detectie van de fluorescerende deeltjes als vlekken) . Icy maakt ook de controle relevante parameters binnen elk blok van de protocollen editor run (bijvoorbeeld bepalen de colokalisatie afstand en gebruik het als "Max afstand" in de "Colocalizer" blok). Icy software wordt bijgewerkt bij de lancering en heeft betrouwbare online ondersteuning om eventuele problemen op te lossen. Het beschreven protocol is ontworpen voor het opsporen van Oskar mRNA en de representatieve resultaten werden verkregen met behulp van parameters die zijn geoptimaliseerd voor het soort mRNA deeltje dat moet worden opgespoord en bijgehouden. Bijvoorbeeld, Oskar mRNA is een overvloedige transcriptie die voornamelijk wordt getransporteerd tijdens mid stadia van oogenesis, met behulp van het microtubulnenetwerk en dynamisch associëren met verschillende eiwit factoren tijdens de ontwikkeling van de eicel. Eerder rapporteerden we dat Oskar mrnp een uitgebreide verbouwing ondergaat tijdens het transport van de verpleeg cellen naar de oöcyt23. Bovendien, met behulp van MBs we gekenmerkt de temporele en ruimtelijke kenmerken van de endogene Oskar mRNA handel, en vond dat honderden van Oskar afschrift kopieën kunnen worden opgenomen in de vorm van grote Oskar mrnps.

Post-acquisitie analyse voor colokalisatie en tracking kan ook worden uitgevoerd met behulp van andere software zoals Imaris, ImageJ/Fiji en Volocity. Icy werd geselecteerd voor zijn vermogen om te drempels en annoteren fluorescerende deeltjes met hoge gevoeligheid en tracking mogelijkheden. Hier beschrijven we objectgebaseerde colokalisatie, maar colokalisatie, zij het zonder tracking, kunnen ook worden gekwantificeerd door het bepalen van de overlapping en mate van colokalisatie met behulp van PCC (Costes) analyse met behulp van Icy en ImageJ plugins (Colokalisatie Studio, JACoP) 38 , 39.

In de toekomst is een geoptimaliseerd beeldvormings protocol op lange termijn gewenst om een verlengde overleving van de Eier kamer te garanderen. Dit zou een langere overname bieden om gegevens met betrekking tot mRNA-handel in lange afstand te analyseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflict te onthullen.

Acknowledgments

We danken Salvatore A.E. Marras (Public Health Research Institute Center, Rutgers University) voor de synthese, etikettering en zuivering van moleculaire bakens, en Daniel St Johnston (het Gurdon Institute, University of Cambridge) voor de Oskar-ms2/ MCP-GFP transgene Fly Stock. Dit werk werd gesteund door een National Science Foundation CAREER Award 1149738 en een professionele staff Congress-CUNY Award voor DPB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrofluorometer Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon n/a Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette Fireflysci (former Precision Cells Inc.) 701MFL
Dumont #5 tweezer World Precision Instruments 501985 Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm VWR 48393-048
Dissecting microscope Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad Genesee Scienific 59-114
Tris-HCL pH 7.5 Sigma-Aldrich 1185-53-1
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 7791-18-6
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
Spinning disc confocal microscope Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera Hamamatsu n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator Eppendorf Inc. 920000037
FemtoJet Microinjector Eppendorf Inc. 920010504
Injection needle: Femtotips II Eppendorf Inc. 930000043
Loading tip: 20 μL Microloader Eppendorf Inc. 930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm VWR 48393-026; 48393-172
Dry yeast Any grocery store n/a
Computer, > 20 GB RAM Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
  2. Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).
  3. Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. Current techniques for visualizing RNA in cells. F1000Research. 5, (2016).
  4. Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
  5. Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
  6. Garcia, J. F., Parker, R. MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system. RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).
  7. Bratu, D. P. Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells. Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).
  8. Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).
  9. Tyagi, S., Kramer, F. R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).
  10. Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).
  11. Liu, Y., et al. Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).
  12. Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Research. 40 (2), e13 (2012).
  13. Ko, H. Y., et al. A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis. Scientific Reports. 4, 4626 (2014).
  14. Vet, J. A., et al. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).
  15. Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. Molecular beacons for protein-DNA interaction studies. Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).
  16. Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).
  17. Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells. Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).
  18. Ban, K., et al. Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4. Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).
  19. Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples. BMC Microbiology. 9, 97 (2009).
  20. McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).
  21. Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
  22. Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein. Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).
  23. Mhlanga, M. M., et al. In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte. PLoS One. 4 (7), e6241 (2009).
  24. Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs. bioRxiv. , (2018).
  25. Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. Nucleic Acids Research. 30 (21), e122 (2002).
  26. Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection. Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).
  27. Dean, D. A. Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection. Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).
  28. Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
  29. Jackson, S. R., et al. Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells. Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).
  30. Zimyanin, V. L., et al. In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization. Cell. 134 (5), 843-853 (2008).
  31. Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells. ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).
  32. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), e69 (2008).
  33. Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Research. 32 (6), e58 (2004).
  34. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Research. 35 (16), e105 (2007).
  35. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).
  36. Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
  37. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).
  38. Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
  39. Trcek, T., et al. Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters. Nature Commununications. 6, 7962 (2015).

Tags

Biologie uitgave 148 moleculaire baken Live-celbeeldvorming endogene mRNA-visualisatie mRNA-handel Drosophila melanogaster Eier kamer eier kamer Microinjection colokalisatie deeltjes tracering.
Visualisering en opvolging van endogene Mrna's in levende <em>Drosophila melanogaster</em> Eier kamers
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar,… More

Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers. J. Vis. Exp. (148), e58545, doi:10.3791/58545 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter