Summary
여기에서, 우리는 분자 비콘, 회전 디스크 공초점 현미경 및 오픈 소스 분석을 사용하여 살아있는 Drosophila melanogaster 계란 챔버에서 내인성 mRNA 인신 매매의 시각화, 탐지, 분석 및 추적을위한 프로토콜을 제시합니다. 소프트웨어.
Abstract
형광 기지를 둔 화상 진찰 기술은, 가벼운 현미경 검사법에 있는 발달과 조합하여, 세포 생물학자가 살아있는 세포 화상 진찰 연구 결과를 수행하는 방법 혁명을 일으켰습니다. RNA를 검출하는 방법은 정액 연구 결과 유전자 발현 규칙에 사이트 특정 mRNA 현지화를 연결하기 때문에 크게 확장되었습니다. 동적 mRNA 프로세스는 지금 분자 행동의 동적 범위를 포착하기 위하여 충분히 빠른 현미경 설치와 결합된 mRNA를 검출하는 접근을 통해 구상될 수 있습니다. 분자 비콘 기술은 살아있는 세포에서 내인성 전사체를 직접 검출할 수 있는 혼성화 기반 접근법이다. 분자 비콘은 헤어핀 모양, 내부적으로 담금질, 단일 뉴클레오티드 차별 핵산 프로브이며, 이는 독특한 표적 서열로 혼성화될 때만 형광됩니다. 고급 형광 현미경 검사법 및 고해상도 이미징과 결합할 때, 그들은 mRNA의 세포 내 움직임의 공간적 및 시간적 추적을 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 내인성 전사체를 검출할 수 있는 유일한 방법이지만, 세포 생물학자는 살아있는 세포 화상 진찰을 위한 그 같은 탐사기를 디자인하는 어려움 때문에 아직 완전히 이 기술을 받아들이지 않았습니다. 새로운 소프트웨어 애플리케이션인 PinMol은살아있는 세포 내의 mRNA 표적 영역을 효율적으로 혼성화하는 데 가장 적합한 프로브의 향상된 신속한 설계를 가능하게 합니다. 또한 고해상도, 실시간 이미지 수집 및 현재 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어를 통해 정교한 데이터 출력을 통해 mRNA의 수명 주기에 관련된 동적 프로세스의 복잡성을 보다 세밀하게 평가할 수 있습니다.
여기에서 우리는 Drosophila melanogaster 계란 약실에 분자 비콘을 디자인하고 전달하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 내인성 모계 mRNAs의 직접적이고 고도로 구체적인 검출 및 시각화는 회전 디스크 공초점 현미경 검사법을 통해 수행됩니다. 이미징 데이터는 Icy 소프트웨어에서 물체 감지 및 추적을 사용하여 처리및 분석되어 oocyte 내의 특수 영역으로 이송되고 국한되는 mRNA의 동적 움직임에 대한 세부 정보를 얻을 수 있습니다.
Introduction
공간적 및 시간적 해상도로 동적 이벤트를 시각화하는 세포 생물학 연구는 형광 기반 라이브 세포 이미징 기술의 개발에 의해 가능해졌습니다. 현재, 생체 내 mRNA 시각화는 RNA aptamer-단백질 상호 작용, 유기 염료 및 핵산 프로브어닐링 1,2의RNA aptamer 유도 형광에 기초한 기술을 통해 달성된다. 3. 그들은 모두 높은 특이성, 감도 및 신호 대 배경 비율을 제공합니다. 그러나 RNA aptamer 중심 접근법은 광범위한 유전자 조작을 필요로하며, 여기서 이식유전자는 단백질 또는 유기 염료 결합에 필요한 인공 구조 모티브로 RNA를 발현하도록 설계되었습니다. 예를 들어, MS2/MCP 시스템은 박테리오파지 MS2 코트 단백질(MCP)에 대한 결합 서열의 다중 탠덤 반복을 포함하는 RNA 구성을 발현하는 이식유전자의 공동 발현을 필요로 하며, 또 다른 이식유전자는 형광 단백질을 코딩한다. MCP4,5에융합 . 이러한 이차 구조 모티프를 RNA에 첨가하고, 부피가 큰 형광 태그가 붙은 단백질과 함께, 네이티브 RNA 과정이6에영향을 받을 수 있다는 우려를 제기하고 있다. 이러한 우려를 해결하고 추가적인 고유한 이점을 제공하는 기술은 핵산 기반 접근법인 분자 비콘(MBs)입니다. MBs는 내인성 mRNA의 다중 검출을 허용하고, 단일 뉴클레오티드 변이의 차별, 및표적 mRNA 7,8을가진 혼성화의 빠른 역학. MB는 그들의 표적에 혼성화되면 형광 형성 변화를 겪기 전에 담금질된 헤어핀 폴드에 남아 있는 올리고뉴클레오티드 프로브(도1C)9. 몇몇 단은 비코딩 RNA (microRNAs 및 lncRNAs)10,11,12,13,RNA 레트로바이러스14 및 동적 DNA 단백질을 둘 다 검출하기 위하여 MB를 사용하여 성공했습니다 상호 작용15. 그(것)들은 zebrafish 배아16,신경13,종양 조직17,분화 심근세포18및 살모넬라와 같은 각종 유기체 및 조직에서 화상 진찰을 위해 성공적으로 채택되었습니다 19.
여기에서 우리는 살아있는 D. melanogaster 계란 약실에 있는 내인성 mRNAs를 위한 디자인, 납품 및 검출 접근을 액티브한 분자 수송의 동적 범위를 붙잡기 위하여 충분히 빠른 현미경 설치와 결합된 기술합니다. D. melanogaster 계란 챔버는 초기 생식줄기 세포 분열 및 모계 유전자 발현에서 분절 체계획의 생성에 이르기까지 광범위한 발달 연구를 위한 이상적인 다세포 모델 시스템으로 작용하고 있다20, 21. 계란 챔버는 쉽게 분리, 크고 반투명, 그리고 생체 외 분석의 시간을 견딜 수, 그(것)들을 화상 진찰 실험에 높게 순종하. 많은 일은 적극적으로 번역되기 전에 이산 세포 지역에 모계 전사체의 비대칭 국소화에 초점을 맞추고있다. 특히, 오스카 mRNA 국소화 및 난모세포의 후방 극에서의 후속 번역은 치명적인 이카우드 배아 표현형22를피하기 위해 엄격하게 조절된 방식으로 발생되어야 한다. oskar mRNA는 간호사 세포에게 불린 15 생식선 세포에서 전사되고, 고리 운하에게 불린 세포질 다리를 통해서 능동적으로 수송됩니다, 난모세포로, 성숙한 계란이 되고 궁극적으로 기름지게 되는 생식세포 (그림1A ). oskar mRNP를 오가는 단백질 요인의 동적 모집 및 교환과 관련하여 이미 이용 가능한 상당한 양의 정보와 장거리 세포 내 여행이 있어 오스카를 연구하기에 선호되는 후보로 만듭니다. mRNA 수명 주기의 많은 프로세스. MBs는 mRNA 국소화의 과정에 관하여 세부사항을 드러내고 Drosophila 난소 생성 도중 mRNA 수송을 통제하는 단백질 요인의 규칙 그리고 기능을 해독하는 에서 중요한 역할을 했습니다. 특히, 간호사 세포에 MB를 마이크로주입하고 살아있는 세포 영상 실험을 수행함으로써, 내인성 mRNA의 추적이 8,23이가능하다.
여기에 제시된 로드맵은 MBs를 사용하여 라이브 셀 이미징 실험을 수행하고, 이미징 데이터를 획득하는 것에서부터 네이티브 셀룰러 환경에서 내인성 mRNA를 추적하기 위한 데이터 분석 수행에 이르기까지 완전한 프로세스의 단계를 제공합니다. 단계는 그들의 자신의 실험실 조정 내의 그밖 조직/세포 모형으로 일하는 연구원의 필요를 충족시키기 위하여 수정되고 추가 로 최적화될 수 있습니다.
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Protocol
1. 라이브 셀 이미징을 위한 MB의 설계
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표적 RNA 서열을 접어 mfold 서버로부터 "RNA 형태"를 사용하여 mRNA 표적의 이차 구조를 예측한다(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
- FASTA 형식으로 대상 시퀀스를 붙여 넣기/업로드하고, 5 또는 10% 하위 최적도(MFE 값의 5 또는 10% 이내로 접는 자유 에너지가 있는 구조)를 선택하고 그에 따라 계산된 폴딩의 최대 개수를 조정합니다(예: 10% 더 큰 크기) 하위 최적성).
참고: MB를 설계할 때 최적 이하의 이차 구조를 포함하면 최소 자유 에너지(MFE) 구조에 대해 예측한 것보다 더 유연하거나 더 단단한 대상 mRNA 내 영역을 식별할 수 있습니다. 라이브 셀 이미징에 적합한 MB의 전반적인 설계. - 800개의 뉴클레오티드(nt)의 mRNA 대상에 대해 "즉각적인 작업"을 선택하거나 801~8,000nt 사이의 mRNA 길이에 대한 "배치 작업"을 간단한 텍스트 파일로 저장합니다.
- FASTA 형식으로 대상 시퀀스를 붙여 넣기/업로드하고, 5 또는 10% 하위 최적도(MFE 값의 5 또는 10% 이내로 접는 자유 에너지가 있는 구조)를 선택하고 그에 따라 계산된 폴딩의 최대 개수를 조정합니다(예: 10% 더 큰 크기) 하위 최적성).
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1.1단계에서 얻은 "ss-count" 파일을 원하는 매개 변수로 PinMol 프로그램(https://bratulab.wordpress.com/software/)에 대한 입력으로 사용하여 mRNA 대상에 대한 여러 MB를 디자인합니다(PinMol 프로그램의 사용을 설명하는 자습서 참조) 24에서 https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/).
- BLAST 분석을 수행하여 선택된 MB의 특이성을 결정합니다: 적절한 데이터베이스와 함께 "blastn"을 사용합니다(예: oskar mRNA 특이적 MB의 경우 "refseq-rna" 데이터베이스 및 드로소필라 멜라노가스터 유기체사용).
- mRNA 표적의 조직 특이적 발현을 식별하고(예: 오스카 mRNA Flybase> 고처리량 발현 데이터> FlyAtlas 해부학 마이크로어레이 또는 modENCODE 해부학 RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015)와 비교 모든 긍정적 인 폭발 안타. 관심 있는 조직/세포에서 발현되는 다른 mRNA와 >50% 교차 상동성을 보이는 프로브를 제거합니다.
- 라이브 세포 이미징(예: Cy5/BHQ2)을 수행하기 위해 사용할 수 있는 현미경 설정에 적합한 형광포및 퀘이커 쌍을 선택한다(예를 들어 Cy5/BHQ2)25.
2. MB 합성, 정화 및 특성화
- 앞에서 설명한대로사내 합성 및 정제 또는 상업 공급자의 서비스, 1~5개의 MB를 합성하고 정화하기 위해 (위 참고 참조), 다음 라벨링 방식을 사용하여 [5'(플루오로포어)-(C3 또는 C6 링커)-(2'-O) -메틸 MB 시퀀스)-(퀘이커)3']. 집에서 또는 상업 공급자의 서비스를 사용하여 역단계 HPLC를 사용하여 MB를 정화합니다.
참고: 자동화된 프로브 합성에 사용되는 인산염은 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드 변형이 있어야 한다. 하나는 또한 더 짧은 MB와 그 표적 mRNA26사이의 하이브리드의 안정성을 증가시키기 위해 교대로 잠긴 핵산(LNA) 및 2'-O-메틸 변형의 키메라를 사용할 수 있다. - 표적 RNA 영역의 서열과 일치하고 따라서 시험관 내 특성화에 사용하기 위해 MBs의 프로브 영역에 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드를 합성합니다(단계 2.3 to 2.5; 위 참고 참조). DNA-올리고뉴클레오티드 표적을 모방하여 MB의 혼성화를 최대화하고, 표적 mRNA 서열에서 발견되는 바와 같이 DNA 표적의 각 말단에 4개의 추가뉴클레오티드를 포함한다.
참고: 표적 서열을 검출하는 MB의 효율의 보다 엄격한 특성은 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드8대신 시험관내 합성 RNA 표적을 사용하여 수행될 수 있다. - MB단독의 열변성을 수행하고, 용융 온도(Tm)를 측정하고, MB가 생리적 온도에서 원하는 헤어핀 모양을 가정하고 있음을 확인한다. 우리는 60과 90 °C 사이에서 Tm 값을 관찰했습니다.
- 앞서 설명한바와같이 DNA 올리고뉴클레오티드 표적의 존재에서 MB의 열변성 및 MB:DNA 표적 하이브리드의 Tm을 측정한다. 55 및 60°C 사이의 Tm은 MB:DNA 하이브리드를 위해 요구된다.
- 상응하는 DNA 올리고뉴클레오티드 표적을 사용하여 시험관내 혼성화 반응을 수행하고, 앞서 설명한바와같이 생리적 온도에서 MB:DNA 하이브리드 형성의 효율을 결정한다. DNA 표적 모방을 가진 빠른 혼성화 역학이 요구되는, 그러나 DNA 표적을 가진 높은 혼성화 효율을 보여주지 않는 MBs는 시험관내 및/또는 생체내에서 표적 mRNA와 더 나은 성능을 가질 수 있다.
3. 미세 주입을위한 개별 계란 챔버의 해부 및 준비
- 신선한 효모 페이스트를 2-3 일 동안 새로 부화한 짝짓기 암컷에게 먹이.
- 마취는 CO2 패드에 파리를 하고, 미세 핀셋(Dumont #5)을 사용하여 1-2암컷을 유리 커버 슬립에 할로카본 오일 700 방울로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 넣습니다.
- 핀셋 한 쌍을 사용하여, 스테레오 현미경의 밑에 등쪽 쪽으로 비행을 방향을 지정합니다. 후부 끝에 작은 절개를함으로써 여성 복부를 해부하고 부드럽게 오일에 난소의 쌍을 짜내.
- 난소를 새로운 커버 슬립에 오일 드롭에 이식하십시오. 다른 핀처와 난소의 막내 단계를 꼬집는 동안 한 핀처로 난소를 부드럽게 잡습니다. oskar mRNA는 중난성 (단계 > 7) 및 후 활발하게 국한되고, 더 젊은 계란 챔버 (단계 < 7)는 주입하기가 더 어렵고 오래 생존하지 못합니다. 개별 난소 또는 달걀 챔버가 분리되고 수직으로 정렬 될 때까지 커버 슬립 (아래쪽 움직임)을 천천히 드래그합니다. 또한 난소 계란 사슬에서 원치 않는 단계를 변위하여 단일 계란 챔버를 분리.
참고: 개별적으로 조롱 계란 챔버가 오일에 떠 있지 않도록하고 커버 슬립에 부착되어 있는지 확인하십시오. 이것은 성공적인 미세 주입과 이미지 수집 모두에 중요합니다.
4. 계란 챔버의 간호사 세포에 MBs의 미세 주입
- 하나의 분자 비콘(예: osk2216Cy5) 또는 서로 다른 mRNA를 대상으로 하고 스펙트럼적으로 뚜렷한 형광단(예: osk2216Cy5 및 drongo111Cy3)으로 레이블이 지정된 두 개의 MB를 혼합하여 MB 용액을 준비합니다. HybBuffer에서 각 MB(50 mM Tris-HCl - pH 7.5, 1.5 mM MgCl2 및 100 mM NaCl)에서 각 MB의 농도를 200-300 ng/μL사용합니다. HybBuffer에서 각각 200 ng/μL에서 동일한 mRNA를 대상으로 하는 동일한 형광로피로 표지된 4개의 MB의 칵테일(예: osk82, osk1236, osk2216). 미세 주입을 위해 바늘을 적재하기 직전에 MB 용액을 스핀 다운하십시오.
- 목표를 선택합니다. 40x 오일 목적은 적절한 계란 챔버를 찾고 미세 주입을 수행하는 것이 좋습니다.
- 해부된 달걀 챔버로 커버슬립을 현미경 스테이지에 장착합니다. 포커스 위치에서 목표를 불러 오고 중후반 발달 단계에서 계란 챔버를 식별, 즉 제대로 미세 주입을 위해 지향된다 (즉, 간호사 내에서 쉽게 주입 할 수 있도록 바늘 팁에 수직 AàP 축으로 세포 근접).
- ~1 μL MB 용액 (4.1 단계 참조)으로 바늘 (상업용 또는 집에서 제조된 27)을로드하고마이크로 인젝터에 연결하십시오. D. melanogaster 계란 챔버에 있는 미세 주입을 위해, 여러 간호사 세포를 뚫는 것을 피하기 위하여 현미경 단계 (예를 들면 30°)에 각도 <45°에서 바늘을 방향(재료표 참조).
- 인젝터를 500-1,000 hPa의 사출 압력과 100-250 hPa의 보상 압력으로 설정합니다(재료 표참조).
- 천천히 계란 챔버의 오일 드롭 무효의 영역을 보기의 필드에 가지고 무대를 이동합니다.
- 마이크로 매니더스 조이스틱을 사용하여 바늘을 오일 드롭으로 부드럽게 내리고 팁을 시야 의 주변쪽으로 초점으로 가져옵니다.
- 바늘 끝에서 공기를 제거하고 바늘에서 흐르는 것을 확인하기 위해 '깨끗한'기능을 수행하십시오.
- 바늘을 집 위치로 가져와 서 계란 챔버에 초점을 맞추고 미세 주입 한 다음 바늘을 다시 초점으로 가져와 계란 챔버의 가장자리 근처에 놓습니다.
- 간호사 세포로부터 모낭 세포를 분리하는 막이 집중되도록 객관적인 Z 위치의 미세 조정을 수행한다.
- 간호사 세포에 바늘을 삽입하고 2-5 s에 대한 주입을 수행합니다.
- 바늘을 부드럽게 제거하고 홈 위치로 후퇴시.
- 이미지 수집을 위해 원하는 배율(60-63x 또는 100x)으로 목표를 변경하고, 계란 챔버에 초점을 맞추고, 수집을 시작합니다.
5. 회전 디스크 공초점 현미경 설정을 사용하여 데이터 수집
참고: 구체적인 설정은 재료 표를 참조하십시오.
- 획득 프로토콜을 설정하여 8-16비트 이미지의 XYZCt 스택을 기록합니다(XYZ = 볼륨, C = 채널, t = 시간).
- 원하는 채널(예: Cy5용 641nm 레이저, GFP의 경우 491nm)에 대한 레이저 라인을 선택하고 순차적으로 채널을 획득합니다: 먼저 각 채널의 형광 신호를 한 다음 Z 위치를 변경하여 적절한 국소화 분석을 허용합니다.
- Z 단계(예: 0.3 μm)와 상부 및 하부 Z 한계(예: -2 μm ~ 2 μm)를 선택합니다.
- 수집 시간 및 샘플링 속도(예: 최대 1시간마다 15-30s마다)를 입력합니다.
- 인수를 시작합니다.
6. 추적 및 공동 지역화 정보를 얻기 위한 처리, 데이터 분석 및 비디오 파일 준비
- 이미지 처리
- 바이오이미지 정보학을 위한 개방형 커뮤니티 플랫폼인 Icy를 다운로드, 풀기 및 오픈(http://icy.bioimageanalysis.org/)
- 5단계에서 획득한 XYZCt 스택을 엽니다: 이미지/시퀀스 >파일>열기.
- 스택을 ImageJ로 변환: ImageJ> Tools> IJ로 변환, 분리 모드 가 켜진 경우.
- 서브스택 만들기(추가 분석할 Z 단계 및 시간 점 범위 선택): ImageJ>Image>스택>도구>서브스택 만들기...; 원하는 채널, Z 단계 및 시간 포인트를 선택합니다.
- TIFF 파일로 서브 스택 저장: ImageJ>파일>저장 As>Tiff...; 이 파일을 사용하여 후속 단계를 수행하십시오.
- 분할 채널: ImageJ>이미지>컬러>분할 채널.
- 배경 스택을 사용하여 배경을 빼기: ImageJ>Process>이미지 계산기..., 또는 롤링 볼 옵션 사용: ImageJ>Process>배경 빼기..., 롤링 볼 반지름을 선택합니다. "수락"을 선택하기 전에 선택한 반지름에 대한 이미지를 미리 봅입니다.
참고: 배경 신호는 주로 플루로포어의 부적절한 담금질에서 발생합니다. 신호:배경 비율(S:B)은 종종 MB의 "밝기"에 대한 지표로 사용되며, MB 및 DNA 표적 올리고뉴클레오티드의 체외 혼성화 실험에서 측정됩니다. 예를 들어, MBs osk1236 및 osk2216은 각각 ~81 및 ~120의 S:B를 가한다. - 각 채널의 밝기와 콘트라스트 조정: ImageJ>이미지>조정>밝기/콘트라스트, 적용을 선택합니다.
- 별도의 TIFF 파일로 각 채널을 저장 : ImageJ>파일 >저장 As>Tiff....
- 두 채널 병합: ImageJ>이미지>컬러>채널 병합...; 채널을 선택합니다. 새 스택을 새 TIFF 파일로 저장합니다(6.1.8 단계 참조).
- 스팟 감지 및 추적
- 얼음으로 다시 변환: ImageJ>Tools>얼음으로 변환합니다.
- 스케일 바 플러그인이 설치된 경우, 눈금 막대가 자동으로 얼음으로 변환시 스택에 오버레이됩니다 [플러그인을 사용하여 검색>설치>온라인 플러그인]. 필요한 경우 검사기 창(화면 오른쪽)을 통해 배율 표시줄을 편집합니다.>레이어 탭>Name>배율 표시줄.
- 레이어 탭>이름에서 배율 막대의 '눈' 아이콘을 선택 해제/비활성화하여 원래 스택에서 배율 막대를 제거합니다. 최종 스택에서 다시 활성화할 수 있습니다.
- 이미지 창의 메뉴 모음에서 "카메라"아이콘을 사용하여 스크린 샷을 복용하여 새로 처리 된 스택을 저장, "현재보기의 스크린 샷을 가져 가라"와 File>저장 as>Tiff....
- 스폿 감도 매개변수가 이미 결정된 경우 스폿 감도를 6.2.7단계로 이동하여 결정합니다.
- 스팟 감지: 분석할 이미지 또는 스택이 있는 창을 선택하고, 감지 및 추적 및 검색>스팟 감지기를 선택하고 설정 매개변수를 채웁니다.
- 입력의 경우 "현재시퀀스 입력 검색"(기본값)을 선택합니다.
- 사전 처리의 경우 Inspector window>시퀀스 탭의 숫자를 상호 참조하여 "채널 0"(기본값) 또는 원하는 채널을 선택합니다.
- 검출기의 경우 스택에 Z 슬라이스가 충분하지 않은 경우에만 "어두운 배경위에 밝은 지점 감지"를 선택합니다. 각 축척에 대해 "배율 조정"과 "감도"를 선택합니다(더 큰 점에 대해 더 많은 축척 추가). 규모와 감도 (숫자가 클수록 감지가 많을수록 최대 140개는 Icy에서 제안됨)는 시행 착오 변수이며, 나중에 시각적으로 확인하고 결정해야 합니다.
- 관심 지역의 경우 "ROIfromSequence"(기본값)를 사용합니다.
- 필터링의 경우 "NoFiltering"(기본값)을 사용하거나 "SizeFiltering"을 선택하여 "허용된 개체의 범위(픽셀)"를 정의합니다.
- 출력: XLS 또는 XML 출력 설정을 선택합니다(2007 MS Excel 또는 이전 을 사용할 때 XML 형식을 선택하면 >65,000 스팟이 있습니다). 스폿 검출기 결과가 추적 분석에 사용되는 경우 "수영장으로내보내기"도 선택합니다.
- 스팟의 전부 또는 대부분이 감지될 때까지 다양한 축척/감도 값을 사용하여 반점을 반복적으로 감지합니다. 모든 최종 매개 변수를 기록합니다.
- 공동 지역화 분석의 경우 다른 채널에 대한 스폿 감지를 반복합니다.
- 스팟을 추적하려면 탐지 및 추적 및 추적>추적>스팟 추적>6.2.6.의 매개 변수로 스팟 검출기를 실행하거나 "여기에서 감지 결과 선택" 풀다운 메뉴를 사용하여 기존 데이터 집합을 선택합니다(이를 위해 스팟 검출기 창 유지 6.2.5단계에서 열립니다) "매개 변수 추정" 버튼을 누르고 매개변수 추정 팝업 창에서 원하는 대상 모션을 선택합니다(예: "분산 및 방향 모두"). "추적 실행" 버튼을 누릅니다.
- 6.2.6 단계 및 6.2.7 단계에 따라 6.2.7 단계에서 생성된 스택을 시작으로 다중 채널 스택의 지점을 추적할 때 다른 채널에 대한 스팟 감지 및 추적을 반복합니다.
- 트랙을 시각화하려면 감지 및 추적 및 추적 및 추적 및 추적 관리자를 선택합니다. "컬러 트랙 프로세서"의 경우 "사용"을 선택하고 트랙에 대해 원하는 색상 표현을 선택합니다. 관련 트랙 프로세서는 "트랙 프로세서 추가..."를 통해 액세스할 수 있습니다. 풀다운 메뉴(예: "프로세서 시간 클립 추적"을 선택하고"추적 클리퍼" 창을 활성화하고 현재 시점 전후에 표시할 원하는 검색 수를 선택합니다.)
- XML 트랙 파일로 추적 정보를 저장: 감지 및 추적 > 추적>추적 관리자>File>로 저장....
- 이미지 창의 메뉴 모음인 "현재 보기의 스크린샷 찍기"에서 "카메라" 아이콘을 사용하여 스크린샷을 촬영하여 결과를 저장합니다. 스크린 샷은 단순히 활성화 / 관리자 창에서 있는 해당 눈 아이콘을 비활성화하여 감지 된 반점 및 / 또는 트랙으로 촬영 할 수 있습니다 > 레이어 탭>이름>오버레이 래퍼.
- 타임스탬프 오버레이 플러그인 설치: 플러그인>설치>온라인 플러그인>타임스탬프 오버레이>설치.
- 타임스탬프 추가: 플러그인>타임스탬프 오버레이(신규). 타임스탬프를 배치하고 포맷하는 방법에 대한 지침은 팝업 창(화면 오른쪽 아래 모서리)의 지침을 따릅니다. 시간 간격은 Inspector 창>시퀀스 탭>시퀀스 속성>편집에서 추가/변경할 수 있습니다.
- 다른 스크린샷을 촬영하여 결과를 저장합니다. 이미지를 1) Tiff 형식으로 저장하고 2) AVI 형식으로 저장합니다. AVI 형식의 경우 먼저 RGB 렌더링(이미지/시퀀스>렌더링>RGB 이미지)으로 변환합니다.
- 이미지를 원하는 방향으로 회전: 검사기 창>시퀀스 탭>캔버스>회전.
- "현재 뷰의 스크린샷 찍기"로 회전된 이미지를 저장합니다. 또한 이미지와 함께 회전하므로 배율 표시줄의 "눈" 아이콘이 선택 해제되었는지 확인합니다.
- ROI 선택 및 자르기: 관심 영역>2D ROI>ROI 쉐이프를 선택한 다음 이미지에 ROI를 생성/그립니다. 이미지/시퀀스>평면(XY)>빠른 자르기.
- 공동 지역화 분석
- 공동 지역화 프로토콜을 준비합니다. 몇 가지 예는 Icy 웹 사이트 (http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/List)에 제공됩니다 (보충 자료참조).
- 부하 공동 지역화 프로토콜: Tools>스크립팅>프로토콜>로드및 상호 작용 블록의 파라미터를 조정합니다(예: 단계 6.2.6에서 결정된 "웨이블릿 스팟 감지" 블록 사용 매개변수).
- 픽셀 단위로 파티클의 크기를 측정하고, 공동 지역화 거리를 결정하고, "최대 거리"로 "지역화" 블록에 입력합니다.
참고: 픽셀 단위로 파티클의 크기는 감지 시스템에 따라 다릅니다. 크기를 측정하려면 단일 파티클을 확대하고 신호 너비에 걸쳐 있는 픽셀을 수동으로 계산합니다. 세 개 이상의 입자에서 측정을 평균합니다. 공동 지역화에 대해 설정할 최대 거리는 픽셀 단위로 파티클의 크기입니다(두 파티클이 닿는 반지름의 최대 합계를 나타냅니다). - 원하는 경우 공동 지역화 분석을 위해 하나 이상의 ROI를 선택합니다.
- 자르기 ROI(들): 이미지/시퀀스>평면(XY)>빠른 자르기.
- 공동 지역화 수행: 프로토콜 편집기 창>선택한 프로토콜 탭>실행. 프로토콜 편집기 창의 마지막 블록에는 스팟 감지를 기반으로 하는 전체 공동 지역화 비율이 포함되며 각 시점의 정보는 Inspector 창> 출력 탭에서 찾을 수 있습니다.
- 6.2.7 단계 (트랙 스팟)를 따라 동지역화 및 단일 입자를 추적합니다.
- 6.2.16 단계에서 설명한 대로 저장합니다.
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Representative Results
PinMol을사용하여, 여러 MB는 하나의 mRNA 표적을 위해 설계될 수 있다(도 1B-C). 합성 및 정제 후, 선택된 MB는 시험관내 분석을 사용하여 특징화되고 비교된다.
도 1: 내인성 mRNA의 살아있는 세포 화상 진찰을 위한 기술 및 조직 설명. (A) 미세 주입에 사용되는 중간 단계 의 초파리 계란 챔버의 묘사. 미세 주입 바늘 (녹색)은 오스카 mRNA에 특이적인 분자 비콘의 칵테일을 제공합니다. 간호사 세포에 빠른 주사는 난모세포로 이동하는 mRNAs의 검출을 가능하게하고, 후방 피질에 이미 국한 된 mRNA의 시각화뿐만 아니라. (B) 분자 비콘에 의해 표적화된 오스카 mRNA(C) 이차 구조 영역을 표적화하기 위한 분자 비콘 의 PinMol 소프트웨어 출력. (C') 오스카르-특이적 분자 비콘, osk2216의 서열 및 접기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
MBs의 최적 성능이 시험관 내 특성화를 통해 확인된 후, 프로브는 내인성 표적 mRNA(들)의 실시간 시각화에 사용된다. oskar mRNA 수송 및 국소화의 패턴을 다양한 단계의 난소 발생, 특히 중난성(7-10) (도 2A-B)에서 및 그 이후의 유화의 패턴을 시각화할 수 있다. 크기가 작기 때문에 초기 단계 (1-4)에 계란 챔버를 주입하는 것이 어렵습니다. 동일한 단계의 계란 챔버에 개별적으로 주입할 때, oskar-특이적 MBs는 동일한 국소화 패턴을 제시한다(그림2,osk1236 vs osk2216).
도 2: 획득 개시 후 t=0, 10 및 30분 시점에서 야생형 계란 챔버에서 의 오스카 mRNA의 시간 서열. 간호사 세포 주사2 개의 오스카-특이적 분자 비콘(osk1236 및 osk2216)에서 (A) 단계 6-7 계란 챔버 및 (B) 단계 9 계란 챔버. 배율 표시줄 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
상이한 mRNA 표적은 스펙트럼적으로 뚜렷한 형광표지된 MBs를사용하여 공동 시각화될 수 있다(그림 3). MB 용액은 간호사 세포 내로 마이크로인분주입될 수 있다(도3A)또는 난모세포 내로(도3B). 간호사 세포의 세포질에 주입된 MB는 난모세포뿐만 아니라 다른 간호사 세포로 자유롭게 확산되어 표적을 찾아 미세 주입 부위가 아닌 다른 부위에서 형광 신호를 생성할 수 있습니다. 예를 들어, 후기 난족단계(9-10) 난자챔버의 간호사 세포에서 미세주사를 수행할 때, 난모세포 내에서 가시화된 형광 신호의 대부분은 이미 국소화된 오스카르 mRNA에 의해 생성되고, 적극적으로 수송함으로써 적게 초기 단계 (7-8)에서 더 널리 퍼진 성적 증명서. 고전 적 MBs는 핵 내의 비특이적 신호를 야기할 것이므로 분석을 계란 챔버의 세포질 영역으로 제한합니다. NeutrAvidin 또는 금 나노입자와 같은 추가적인 변형은 이러한 비특이적신호(28,29)를감소 또는 제거하기 위해 채택되었다. 이러한 핵 비특이적 신호에도 불구하고, 오스카 mRNA의 생체 내 검출을 위한 MB의 특이성은 FRET 접근법8을사용하여 확립되었으며, MB는 시험관내 전사 오스카 mRNA를 이용한 공동 주입을 이용하여 확립되었다. MB의 라벨23과구별되는 불소로 표기되어 있다.
그림 3: 살아있는 계란 챔버에서 2개의 mRNA 종의 공동 시각화. 오스카르-및 드론고-특이적 분자 비콘(A) 간호사세포 및 (B) 단계 8-9 난자의 난자 비콘의 공동 주사. 오스카 ()오스카 ()의 (적색) 및 드론고(녹색) mRNAs는 난모세포(asterix)의 후방 말단에서 동국화되고, 드론고는 또한 도르소 전방 축적(화살촉)을 나타낸다. 배율 표시줄 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
낮은 발현 수준을 보이는 mRNA 표적의 경우, mRNA 분자당 형광 신호는 적어도 2개의 MBs를 함유하는 칵테일 용액을 주입함으로써 증가되고, 각각상이 다른 표적 영역에 결합한다(도4 및5).
그림 4: MB 및 MS2-GFP 시스템을 모두 갖춘 오스카 mRNA의 시각화. OSK-MS2를 표현하는 계란 챔버에서 MB 칵테일 용액 (MB)의 미세 주사::MCP-GFP30 (GFP). 간호사 세포의 미세 주입 후, 이미지는 20 분 동안 30 초마다 획득되었습니다. 관심 영역 2개가 선택되었으며, 하나는 간호사 세포에서 ROI가, 하나는 난모세포에 있습니다. 각 ROI에 대해 서로 다른 감도가 사용되어 반점을 감지했습니다. ROI 간호사 셀: GFP 및 MB에 대한 척도 2, 민감도 100. ROI oocyte: 배율 2, GFP에 대 한 감도 50 MB에 대 한 110. 동지역화 거리는 두 ROI모두에 대해 4픽셀입니다. 전체 계란 챔버와 간호사 세포의 확대는 12 분 시점에서 표시되고, oocyte의 확대는 14 분 시점에서 표시됩니다. MB 반점(빨간 원) 및 GFP 반점(녹색 원)은 각 접근법에 의해 검출된 오스카 mRNA 입자를 식별하고, 국소화된 입자(노란색)는 MB와 GFP 반점이 최대 4픽셀 떨어져 있는 위치를 나타냅니다. 0.3 μm 단계에서 14 Z 광학 슬라이스의 XY 프로젝션. 63x 목표(오일, NA = 1.4)로 16비트 데이터로 획득한 XY = 0.24 μm, 노출 시간 500ms, 각각 641 nm 및 491 nm 레이저에 대한 5.23 및 5.39 mW 레이저 전력. 배율 표시줄 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 발진기 에서의 추적 분석, 발진기 mRNA 특이적 MBs를 가진 간호사 세포 미세 주입 후. MB 입자는 감도 110으로 Scale 2에서 감지되었으며 현재 시간 프레임 전후에 8개의 타임 포인트가 표시됩니다. MB 반점(빨간 원)은 난모세포의 부피에서 추적된다; 트랙은 표시된 12분 시점 전후의 8개의 시점의 감지 정보를 나타냅니다. 각 색상은 개별 트랙을 나타냅니다. 0.3 μm 단계에서 14 Z 광학 슬라이스의 XY 프로젝션. 배율 표시줄 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
MBs 대 MS2/MCP로 검출된 오스카 mRNA의 트래피싱을 비교할 때, 10 GFP로 표시된 형질전환 오스카 mRNA의 수송 및 국소화에 대한 oskar-specific MBs에 의해 생성된 형광 신호는 충실하게 문서화됩니다. MS2/MCP 시스템을 통해 분자를 입력합니다(그림 4). 중간 난소에서 oskar-MS2/MCP-GFP 형질전환 난자 챔버에서, 수집 데이터 분석은 유전자 조작 된오스카의 형광 신호 사이의 광범위한 공동 국소화를 보여 주었다 -MS2 mRNA는 MBs와 GFP 태그를 사용하여 검출 . 주사 후 12분 및 14분, 57%(7MB-개체 및 13GFP-객체, 4개의 동지역화된 물체) 및 93%(30MB-개체 및 51GFP-객체, 28개의 동지역화된 물체) 간호사 세포 및 난모세포에서 GFP 입자와 동자화된 검출된 MB 입자, 각각. 우리의 분석은 각각 간호사 세포와 난모세포의 세포질 내의 MBs로 검출된 oskar mRNA를 가진 oskar-MS2 mRNA의 31% 및 55% 동국화 백분율을 산출합니다. 더욱이, 5D-스택은 간호사 세포 및 난모세포질 둘 다에서 장거리 수송을 위한 오스카 mRNA 궤적을 결정하기 위해 추가로 분석될 수 있다(도 5).
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Discussion
Drosophila 계란 챔버에서 내인성 mRNA 인신 매매의 라이브 시각화는 이제 PinMol 소프트웨어로 쉽게 설계 할 수있는 특정, 효율적이고 뉴클레아제 내성 MBs의 사용에 의존합니다. MB는 표적 mRNA(바람직하게는 이차 구조가 없는 영역) 내에서 고유한 서열을 검출하도록 설계된 특정 프로브로서, 전사체의 고도로 해결된 검출이 가능하다. 다른 조직/세포 유형에 대해 이 기술/프로토콜을 채택할 때 유일한 제한사항은 관심 있는 표본에 대한 MB 전달의 효율성입니다. 다른 접근법은 하나의 표적 mRNA(예를 들어 MS2/MCP 시스템)를 시각화하기 위해 형광 단백질로 태그된 aptamer 및 RNA 결합 단백질을 발현하기 위해 조직의 유전자 조작을 필요로 하지만, 다중화는 최대 2개의 전사체에 대해 가능하다. MB 기술은 살아있는 세포에 있는 내인성 mRNAs를 검출하기 위한 단독으로 서 있고, 2개 이상의 mRNA 종의 공동 시각화를 허용하는 유일한 기술입니다.
MB는 광범위한 형광 모이티로 표지될 수 있으며 2'-O-메틸리보뉴클레오티드 또는 잠긴 핵산26,31과같은 변형된 뉴클레오티드로부터 합성될 때 세포 환경 내에서 안정하다. 이러한 백본 수정은 또한 대상에 대한 MB의 친화력을 증가시게 됩니다. 여러 개의 MB는 평균 길이의 대상 mRNA를 위해 쉽게 설계할 수 있습니다. 그러나 짧거나 구조화된 대상에 대해 몇 가지 제한사항이 발생할 수 있습니다. 이것은 프로브 영역이 고전적인 MB 프로브(31)의길이의 약 절반인 우리의 작은 분자 비콘을 채택하여 극복 할 수 있습니다. 표본 유형에 따라, MBs는 세포 관통 펩티드, lipofection, 또는 미세 주입23,32,33,34에연결, 전기 천공을 통해 세포로 전달됩니다. 살아있는 세포 화상 진찰 실험에서 MB의 성능 효율성은 표적 구조에 의해 결정되는 mRNA 표적 내의 상응하는 상보성 서열로 혼성화하는 프로브 서열의 능력에 의지한다. in 시험관내 측정 열역학 파라미터를 사용하여 얻은 예측된 MFE RNA 이차 구조는 표적 접근성을 평가하는 데 유용하지만 궁극적으로 는 생체 내 표적 구조 및 다른 세포와의 표적 상호작용이다. 라이브 세포 이미징에 대한 MB의 적합성을 결정하는 요인. RNA 이차 구조의 게놈 전체 분석은 많은 RNA가 시험관내35보다생체 내에서 덜 구조화되었음을 시사한다. MB를 이용한 생체 내 표적 검출의 효율은 주로 결합 부위의 접근성에 의존하지만, 특정 MB 특징을 최적화하면 mRNA 표적의 향상된 시각화가 보장된다. 구체적으로, 다음 파라미터의 신중한 선택이 수행되어야 한다: 1) 프로브 길이는 18과 26 사이에서 변화할 수 있고, 프로브의 뉴클레오티드 조성물은 타겟에서 31~55% GC 쌍 사이일 수 있다:MB 하이브리드, 2) 5bp 스템 서열은 G/C이어야 한다. 풍부, mRNA 대상이없는 헤어 핀 모양을 유지하고 불일치 차별을 제공하기 위해, 3) 수정 된 백본은 MB와 대상 모두의 핵에 대한 보호를 위해 사용되어야한다 : MB 하이브리드, 4) 형광 부 / quencher 쌍은 추가를 제공 할 수 있습니다 MB의 줄기에 적당한 안정성, 그리고 5) 형광포는 긴 이미징 시간 간격 동안 안정되어야한다. 또한, 고전적인 MB는 일반적으로 핵 비특이적 신호(34)를생성하며, 이는 우리의 경우 데이터 처리 및 분석에 적당히 영향을 미칩니다. 그러나, 세포 수준에서 mRNA 인신 매매 시각화를 위해, 이 비특이적 신호는 문제가 될 수 있습니다. 몇몇 그룹은 tRNA, 펩티드 및 나노입자와 같은 변형 또는 태그를 제안하였고, 이는 핵내로의 MBs의 전달을 방지하고, 따라서 이러한 가능한 비특이적신호(33,36)를제거한다.
이 접근법의 가장 큰 단점은 라이브 셀 이미징을 위한 MB의 수동 설계였습니다. 이 문제를 해결하기 위해 MFE 이외에최적이 아닌 보조 구조를 고려하여 mRNA 내에서 액세스 가능한 대상 사이트를 쉽게 식별하는 Python 기반 프로그램 (PinMol)을 작성하고 가장 적합한 헤어 핀 프로브를 디자인했습니다. 살아있는세포24에서mRNA검출에 적합. PinMol은 에너지 최소화 접근법을 통해 예측된 표적 RNA의 이차 구조로부터의 구조 정보를 사용하며, 최적이 아닌 구조로부터의 정보를 포함함으로써, 특정 표적 영역의 유연성 또는 강성 MB를 설계할 때 평가됩니다. 대상 영역의 접근성뿐만 아니라 선택한 각 프로브의 분자 간 상호 작용도 고려합니다. 추가적으로, RNA의 높게 통제된 뻗어 (예를 들면 microRNAs 또는 RNA 결합 단백질을 위한 결합 사이트)는 이 지구가 MBs의 비효율적인 결합 귀착될 수 있기 때문에, 프로브를 선택할 때 표적 사이트로 고려되어서는 안 됩니다. 사용자는 이러한 사이트를 대상으로 하는 프로브를 평가하고 제거하거나 PinMol에서 프로브를 설계하는 데 사용하는 대상 영역을 제한하여 이러한 사이트를 포함하지 않도록 할 수 있습니다. PinMol의 상대적 능력은 수동으로 설계된 MBs24의실험 결과와 PinMol 설계 MB의 순위를 비교하여 입증되었습니다. 핀몰은 mRNA에서 확인된 새로운 접근 가능한 부위뿐만 아니라 유사한 표적 영역에 대해 MB를 선택하고 설계했다. 이는 형광 신호가 배경 보다 증가해야 하는 낮은 카피 수 전사체의 검출에 필수적입니다. 표적 mRNA에서 여러 접근 가능한 부위에 효과적으로 혼성화하는 MB 수를 확장함으로써 신호 증폭을 달성할 수 있습니다. 따라서, 이 프로그램은 표적 mRNA당 다중 MB를 설계하고, 동시에 살아있는 세포에서 수많은 mRNA를 시각화하는 빠른 접근법을 용이하게 한다.
계란 챔버 내에서 수송 된 mRNAs의 고품질 5D (XYZCt) 수집 데이터를 얻으려면 개별 계란 챔버의 적절한 해부와 간호사 세포로의 효과적인 미세 주입이 중요합니다. 발달의 초기 단계 도중 연구 결과를 위해, 미세 주사는 계란 약실의 생존에 유해할 수 있고 따라서 살아있는 세포 화상 진찰 실험의 길이는 단축됩니다 (<20 분). 시판되는 초미세 바늘을 사용하여 미세 주입 실험의 성공률을 높일 수 있습니다. 또한 주입 후 초기 지점을 캡처할 수 있도록 수집 설정을 빠르게 설정하는 것이 중요합니다. 스팟 감지 및 추적 데이터의 품질은 획득한 이미지의 품질만큼이나 우수합니다.
이미지 수집 시 후속 분석 단계도 신중하고 정확하게 완료해야 합니다. 수집 후 처리 및 분석은 자체적인 어려움을 제공하지만 특정 실험 또는 샘플에 적합한 소프트웨어를 선택하여 간소화할 수 있습니다. 현재 기존 프로그램은 볼로시티 (PerkinElmer), 이마리스 (비트 플레인), ImageJ / 피지와 얼음37을포함한다. 세 가지 중 Icy는 ImageJ를 통해 처리 및 이미징 데이터 분석을 모두 허용하는 개방형 커뮤니티 플랫폼이기 때문에 여러 가지 이점을 제공합니다. 여기에서 우리는 Icy를 사용하여 RNA 화상 진찰 데이터의 능률적인 처리 그리고 분석을 위해 필요한 단계를 기술합니다. 우리의 결과는 전체 계란 챔버에 있는 2개의 mRNA 종을 공동 시각화하고 MB 기술 및 MS2/MCP 시스템을 통해 mRNA를 추적하여 얻은 데이터를 대표합니다.
Icy 소프트웨어를 사용하는 수집 후 처리는 이미지 처리(예: 밝기, 대비) 및 분석(예: 형광 입자를 스폿으로 감지하는 민감도에 대한 임계값/컷오프 설정)에서 사용자 유연성을 제공합니다. . 또한 Icy는 프로토콜 편집기 실행의 각 블록 내에서 제어 관련 매개 변수를 활성화합니다(예: 공동 지역화 거리를 결정하고 "Colocalizer" 블록에 "최대 거리"로 사용). Icy 소프트웨어는 출시 시 업데이트되며 모든 문제를 해결하기 위해 신뢰할 수있는 온라인 지원을 제공합니다. 기재된 프로토콜은 oskar mRNA를 검출하기 위해 설계되었으며, 대표적인 결과는 검출 및 추적되는 mRNA 입자의 종류에 최적화된 파라미터를 사용하여 얻어졌다. 예를 들어, 오스카 mRNA는 난소 발생의 중간 단계 동안 우세하게 수송되는 풍부한 전사체이며, 미세소관 네트워크를 활용하고 난모세포의 발달 전반에 걸쳐 다양한 단백질 인자와 동적으로 연관된다. 우리는 이전에 oskar mRNP가 난모세포23로간호세포에서 수송도중 광대한 개조를 겪는다는 것을 보고했습니다. 또한, MB를 사용하여 내인성 발진기 mRNA 인신 매매의 시간적 및 공간적 특성을 특성화하고, 수백 개의 고오스카 전사체 사본이 큰 고오스카 mRNPs를 형성하기 위해 통합될 수 있음을 발견하였다.
공동 지역화 및 추적을 위한 수집 후 분석은 Imaris, ImageJ/Fiji 및 Volocity와 같은 다른 소프트웨어를 사용하여 수행할 수도 있습니다. Icy는 높은 감도 및 추적 기능을 갖춘 형광 입자를 임계값으로 임계값및 비할 데 없는 기능으로 선택했습니다. 여기서, 우리는 객체 기반 의 공동 지역화를 설명하지만, 추적하지 않고이기는하지만, 또한 얼음과 ImageJ 플러그인을 사용하여 PCC (Costes) 분석을 사용하여 공동 지역화의 중복 및 정도를 결정하여 정량화 할 수있다 (공동 지역화 스튜디오, JACoP) 38세 , 39.
미래에, 확장된 계란 약실 생존을 보장하기 위하여 최적화된, 장기 화상 진찰 프로토콜이 요구됩니다. 이것은 장거리 mRNA 인신 매매 연구와 관련된 데이터를 분석하기 위해 더 긴 수집을 제공 할 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 합성, 라벨링 및 분자 비콘의 정화에 대한 살바토레 A.E. 마라스 (공중 보건 연구소 센터, 럿거스 대학) 감사, 다니엘 세인트 존스턴 (거든 연구소, 케임브리지 대학) 오스카-MS2 / MCP-GFP 형질 전환 플라이 스톡. 이 작품은 국립 과학 재단 경력 상 1149738 및 DPB에 전문 직원 의회 - CUNY 상에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectrofluorometer | Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon | n/a | Photon counting spectrofluorometer |
| Quartz cuvette | Fireflysci (former Precision Cells Inc.) | 701MFL | |
| Dumont #5 tweezer | World Precision Instruments | 501985 | Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Cover slip No.1 22 mm x 40 mm | VWR | 48393-048 | |
| Dissecting microscope | Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. | n/a | |
| CO2 fruit fly anesthesia pad | Genesee Scienific | 59-114 | |
| Tris-HCL pH 7.5 | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Spinning disc confocal microscope | Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. | n/a | |
| Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera | Hamamatsu | n/a | |
| PatchMan NP 2 Micromanipulator | Eppendorf Inc. | 920000037 | |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf Inc. | 920010504 | |
| Injection needle: Femtotips II | Eppendorf Inc. | 930000043 | |
| Loading tip: 20 μL Microloader | Eppendorf Inc. | 930001007 | |
| Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm | VWR | 48393-026; 48393-172 | |
| Dry yeast | Any grocery store | n/a | |
| Computer, > 20 GB RAM | Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing |
References
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
- Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).
- Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. Current techniques for visualizing RNA in cells. F1000Research. 5, (2016).
- Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
- Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
- Garcia, J. F., Parker, R. MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system. RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).
- Bratu, D. P. Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells. Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).
- Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).
- Tyagi, S., Kramer, F. R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).
- Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).
- Liu, Y., et al. Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).
- Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Research. 40 (2), e13 (2012).
- Ko, H. Y., et al. A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis. Scientific Reports. 4, 4626 (2014).
- Vet, J. A., et al. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).
- Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. Molecular beacons for protein-DNA interaction studies. Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).
- Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).
- Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells. Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).
- Ban, K., et al. Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4. Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).
- Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples. BMC Microbiology. 9, 97 (2009).
- McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).
- Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
- Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein. Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).
- Mhlanga, M. M., et al. In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte. PLoS One. 4 (7), e6241 (2009).
- Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs. bioRxiv. , (2018).
- Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. Nucleic Acids Research. 30 (21), e122 (2002).
- Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection. Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).
- Dean, D. A. Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection. Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).
- Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
- Jackson, S. R., et al. Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells. Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).
- Zimyanin, V. L., et al. In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization. Cell. 134 (5), 843-853 (2008).
- Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells. ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), e69 (2008).
- Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Research. 32 (6), e58 (2004).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Research. 35 (16), e105 (2007).
- Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).
- Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
- Trcek, T., et al. Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters. Nature Commununications. 6, 7962 (2015).
