ヒト肺組織におけるZW10相互作用タンパク質の免疫染色のデジタル解析
1Department of Hematology,Zhongnan Hospital of Wuhan University, 2Department of Thoracic Surgery,Renmin Hospital of Wuhan University, 3Department of Human Anatomy, Histology and Embryology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences, School of Basic Medicine,Peking Union Medical College, 4Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences,Wuhan University, 5Department of Gastroenterology,Central Hospital of Wuhan, 6Department of Transfusion,Zhongnan Hospital of Wuhan University
Summary
ZW10相互作用タンパク質(ZWINT)は、人工スピンドルチェックポイントおよび癌の病因に関与する。ここでは、ヒト肺癌組織におけるZWINTの免疫染色の方法論を紹介し、続いてスライド全体のデジタルスキャンと画像解析を行う。この方法論は、高品質のデジタル画像と信頼性の高い結果を提供することができます。
Abstract
本研究の目的は、ヒト肺組織の免疫染色の方法論を導入し、その後にスライド全体のデジタルスキャンと画像解析を行うことを目的とする。デジタルスキャンは、スライドのスタックをスキャンし、高品質でデジタル画像を生成するための迅速な方法です。それは病理学者によって従来の軽い顕微鏡ー(CLM)と一致した結果を作り出すことができる。さらに、デジタル画像の可用性により、同じスライドを複数の人が同時に観察することが可能になります。また、スライドのデジタル画像をデータベースに保存できるため、ガラススライドの長期的な劣化を回避できます。この手法の制限事項は次のとおりです。まず、それは良質の準備されたティッシュおよび元の免疫組織化学(IHC)の損傷または余分なシーラント残渣なしで滑る必要がある。第二に、腫瘍または非腫瘍領域は、スコアリング中に腫瘍または非腫瘍領域に関する混乱を避けるために、ソフトウェアを使用して分析する前に経験豊富な病理学者によって指定されるべきである。第三に、オペレータは、全スライドイメージングにおけるデジタル化プロセス全体の色再現を制御する必要があります。
Introduction
ZW10相互作用タンパク質(ZWINT)は、有糸性スピンドルチェックポイント1、2、3に関与するキネトコレ複合体の必要な成分である。ZWINTの枯渇は異常な早期染色体分離1、2、3につながることが報告されている。最近の研究は、ZWINTが腫瘍細胞4、5の増殖を促進することによって複数の腫瘍の病因に関与していることを示唆している。我々は以前に肺癌5におけるZWINTの過剰発現を報告した。CLMを用いる病理学者によるスライドの分析は時間がかかり、定量的な6、7、8ではないことが広く受け入れられている。また、保存されたガラススライドの劣化は、以前に作成したスライドを撤回することが不可能になる場合があります。コンピュータベースのデジタル全スライドイメージング(WSI)の新しい方法は、これらの制限を克服することができます 6,7,8.
この目的のために、ヒト肺癌組織におけるZWINTの免疫染色の方法論を、スライド全体のデジタルスキャンとソフトウェアベースの画像解析と組み合わせて説明する。この方法論の主な利点は、CLM との一致した結果の生産です。この技術は、ヘマトキシリン-エオシン染色(H&E)およびIHC、その場ハイブリダイゼーションにおける蛍光(FISH)、組織マイクロアレイ(TMA)、および創薬および開発の病理学的スコアリングの分野で広く使用することができる。
Protocol
ここに記載されているすべての方法は、武漢大学の中南病院と武漢大学の人民病院の倫理委員会によって承認されています. 1. IHCスライドの作成 リン酸緩衝生理食べ物(PBS)に4%のパラホルムアルデヒドにヒト肺組織断片(約3x3cm)を室温(RT)で24時間浸漬して肺組織サンプルを固定する。 80%、95%、100%エタノールを室温でそれぞれ15分、20分、20分間脱水します。最…
Representative Results
ZWINTの発現レベルは、14の扁平上皮癌(ScC)および14の腺癌(ADC)を含む28組の非小細胞肺癌(NSCLC)検体(腫瘍および隣接する非腫瘍組織)で、IHCによって測定された。スライドの全スライドデジタルスキャンは、高品質のデジタル画像を提供しました(図1A)。その結果、肺癌のHスコアは、隣接する非癌組織(P< 0.0001、両尾t-test)よりも有意に高かった(<strong cla…
Discussion
全体スライドスキャンは、臨床および研究目的のためのその堅牢なスキャンと高品質の画像の生産のためのホットな話題になりつつあります11,12,13.画像は分11、12、13の分以内にスライドスキャン顕微鏡によって作り出すことができる。この方法論を応?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、中国国家自然財団(No. 81500151、81400121、81270607、81541027、81501352)と湖北省自然財団(2017CFB631号)によって支援されました。著者らは、グオ・チン、チャン・ミン、李ホイ、武漢グーグル・バイオリティ・テクノロジー社の同僚たちに対し、技術サポートに感謝の意を表明した。著者はまた、言語編集のためのムハンマド・ジャマールに感謝します。
Materials
| Pannoramic MIDI | 3D HISTECH | Cat: PMIDI-040709 | An automated digital slide scanner with a remarkable feature set :12-slide capacity, fluorescence scanning, and many more. |
| QuantCenter | 3D HISTECH | Downloaded from the official website of the company | The framework for 3DHISTCH's image analysis applications. |
| LEICA RM2235 | Leica Microsystems | Cat: 14050038604 | The enhanced precision of the new accessories will add convenience to block to knife approach as well as specimen orientation. |
| Rabbit anti-human Anti-ZWINT antibody | Abcam | Cat: ab197794 | Immunohistochemical analysis of ZWINT in human lung tissue. |
| Anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Goodbio Technology | Cat:GB23303-1 | Secondary antibody for IHC staining. |
| Phosphate-buffered saline | Wuhan Goodbio Technology | Cat:G0002 | A solution containing a phosphate buffer. |
| OLYMPUS CX23 | OLYMPUS | Cat:6M87620 | Microscope for detection of H&E or IHC slides. |
| Dimethylbenzene | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent | Cat:1330-20-7 | A colorless, flammable fluid used as a solvent and clarifying agent in the preparation of tissue sections for microscopic study. |
| Hematoxylin Staining Solution | Wuhan Servicebio technology | Cat:G1039 | It is commonly used for histologic studies, oftern colors the nuclei of cells blue. |
| Tween 20 | Baitg | Cat:2005-64-5 | It is a polysorbate-type nonionic surfactant formed by the ethoxylation of sorbitan before the addition of lauric acid. It is used as a deterent and emulsifier in pharmacological applications. |
| Citric acid repair liquid | Wuhan Servicebio technology | Cat:G1202 | Is is used to repair antigen after fixation during IHC procedure. |
| LEICA ASP200s | Leica | Cat: 14048043626 | It was designed for routine and research histopathology of up to 200 cassettes. |
| LEICA Arcadia H | Leica | Cat: 14039354103 | It is a heated paraffin embedding station and allows for simple operation and precise control, resulting in improved quality, a smooth workflow and reliability. |
| LEICA Arcadia C | Leica | Cat: 14039354102 | It is a cold plate holding more than 60/65 cassettes on its large working surface. It was designed with an environment adaptive control module to make sure the operating temperature is always stabilized at -6°C. |
| CaseViewer Software | 3DHISTECH |
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Cite This Article
Wen, Y., Song-ping, X., Pan, L., Xiao-yan, L., Shan, P., Qian, Y., Meng, S., Xiao-xing, H., Rui-jing, X., Jie, X., Qiu-ping, Z., Liang, S. Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues. J. Vis. Exp. (147), e58551, doi:10.3791/58551 (2019).