Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

قطب الصغير-أجار ملح جسر لتحليل معدل دوران بروتون بروتينات الغشاء المؤتلف

doi: 10.3791/58552 Published: January 7, 2019

Summary

في القياسات الكهربية، تزعج وجود انتشار محتمل القياس الدقيق لاحتمال عكس بتغيير مسرى المحتملة. استخدام جسر ملح الصغرى-أجار، يتم تصغير أثر نشر المحتملة، التي تتيح قياس أكثر دقة من الركازة دوران أرقام من البروتينات الغشاء المؤتلف المعاد تشكيلها.

Abstract

وحتى الآن، تستهدف أكثر من 50 في المائة من جميع العقاقير الدوائية حركية النقل من غشاء بروتينات. توصيف الكهربية من البروتينات الناقل غشاء تشكيلها في الأغشية الدهنية بلير وسيلة قوية ولكن حساسة لتقييم الخصائص الفيزيائية الكيميائية والصيدلانية الخاصة بهم. عدد دوران الركيزة هو معلمة فريدة من نوعها تتيح المقارنة بين نشاط البروتينات الغشاء مختلفة. في نقل وآﻻت، يخلق تدرج الركازة ذوبانها غشاء محتملة الذي يرتبط مباشرة بمعدل دوران الركيزة من البروتين. باستخدام أقطاب كلوريد الفضة، هو فعل إمكانية نشرها، كما دعا تقاطع السائل المحتملة،، الذي يغير إمكانات القطب وتزعج القياسات المحتملة غشاء دقيق إلى حد كبير. يمكن التقليل من انتشار محتمل عن طريق جسر ملح، الذي يوازن بين الإمكانات قطب كهربائي. في هذه المقالة، جسر ملح الصغرى-أجار تهدف إلى تحسين البنية الكهربية، الذي يستخدم ميكروبيبيتيس لتشكيل الغشاء. الحل الملح يتم ملؤها في تلميح ماصة ميكروكابيلاري، استقرت بالإضافة [اغروس]، ويمكن تركيبة بسهولة على قطب قياسية. إمكانات القطب القطب الجسر الصغير-الملح أكثر استقرارا مقارنة قطب قياسية. تنفيذ هذا النظام استقرار القطب المحتملة ويسمح قياسات أكثر دقة لغشاء المحتملة الناتجة عن تدرج درجة حموضة. باستخدام هذا النظام، بإغﻻقها معدلات دوران بروتون الناقلين المتقدرية UCP1 و UCP3 ومقارنة بالقياسات السابقة.

Introduction

وتستهدف بروتينات الغشاء تصل إلى 60 في المائة من جميع العقاقير الصيدلانية المعروفة1. القياسات الكهربية من البروتينات الغشاء أداة قوية ولكن حساسة لتحليل النقل وآﻻت من ركائز توسط بروتينات الغشاء الناقل. يسمح التعديل الحالي ترانسميمبراني من تطبيق الفولتية ثابتة أو سلالم الجهد تقييم الخصائص الدوائية والفيزيائية من شركات النقل، وعلى سبيل المثال، تفعيل وتثبيط من ركائز أو النقل حركية. الاهتمام الخاص هو عدد دوران الركازة، الذي يعرض مقدار الركيزة التي يتم ذوبانها بروتين غشاء كل وحدة وقت. أنها معلمة رئيسية عند مقارنة حركية مختلف البروتينات الغشاء. إنشاء تدرج تركيز من الركازة المشحونة عبر الغشاء يولد قوة الدافعة الكهربائية يستخلص منها عدد دوران الركازة.

استخدام قطب AgCl، وجود منطقة عازلة خالية من كلوريد يخلق إمكانية نشرها أن يغير مسرى المحتملة ويؤدي إلى تحول في قياسات الجهد الحالي2. على الرغم من أن هذا دائماً، فإنه لا يكاد يذكر الموصلية القياسية وقياس القدرات منذ هذه المعلمات أما تعتمد على المنحدر من الجهد الحالي تسجيل (الموصلية) أو هي الفرق بين تسجيل واحد (القدرات)، التي يلغي إمكانية. بيد تسجيل إمكانية عكس، الذي يتم إنشاؤه بواسطة نقل الركازة، يمكن أن تكون إلى حد كبير انزعاج نشر المحتملة. وهكذا، للحصول على قياسات دقيقة لإمكانية عكس، إمكانات قطب كهربائي يجب أن تبقى ثابتة.

يمكن التقليل من انتشار محتمل بطريقتين: (ط) بحضور كل من غشاء بلير، تركيز الركيزة يجب أن يزاد على جانب واحد من3،الغشاء4، أو أرصدة (ثانيا) جسر ملح مسرى المحتملة 5. الطريقة الأولى تعتمد اعتماداً كبيرا على استقرار القياسات. وقد الغشاء البقاء على قيد الحياة لعدة دقائق، من إضافة الركازة تحت إثارة حتى الركيزة هي موزعة بالتساوي تقريبا في الحل. إذا كان الغشاء تصدعات في بين، هو تغيير التدرج الركيزة بالتبادل الحر للجزيئات المشحونة، وتحويل القياسات غير دقيقة. الأسلوب الأخير أرصدة نشر المحتملة غير محدودة الحجم للإنشاء. تحدي تنفيذ صغيرة ولكن عمل جسر الملح في طائفة الجزئي لإعداد الكهربية6. للأسلوب الأخير، هو الحل الملح شغلها في تلميح ميكروكابيلاري واستقرت بالإضافة [اغروس] لمنع نشر الحل الملح إلى الحل المخزن المؤقت.

ويرد في هذا البروتوكول، إنتاج مباشرة الجسر الصغير-أجار ملح والتنفيذ في إعداد الكهربية استناداً إلى إعداد ماصة7 . يتم ضبط نصيحة ميكروكابيلاري لاحتواء حل بوكل م 3 مع جزئ 1% (w/v) [اغروس] ولسد حلاً AgCl القطب والمخزن المؤقت. يتم عرض في استفادة الجسر الصغير-الملح بتسجيلات وقت التحول المحتملة القطب وقياسات أكثر دقة لغشاء المحتملة في مختلف الأس الهيدروجيني التدرجات. في النظام النموذجي للبروتينات التوليفية التي أعيد تشكيلها في الدهنية، بإغﻻقها معدلات دوران الناقلين المتقدرية UCP1 و UCP3 المنتجة في ظروف مماثلة ومقارنة بالنتائج السابقة3،8.

Protocol

1-إنتاج البروتينات فصل المؤتلف (أوكبس)، وتشكيل أغشية بلير مستو

  1. إنتاج UCP1 المؤتلف و UCP3 كما وصفها روبريشت et al. 9 وهيلس et al. 10
  2. تشكل الأغشية بلير مستو على نصائح الماصات البلاستيكية يمكن الاستغناء عنها التقليدية كما وصفها بيك et al. 7

2-إعداد مسرى جسر الملح الصغرى-أجار

  1. ضبط ماصة ميكروكابيلاري نصيحة (انظر الجدول للمواد) للطول المناسب.
    1. وضع علامة على موضع على تلميح فارغ الذي سيلحق بالتلميح الذي يحتوي على المخزن المؤقت واستخدام انزلاق قدمه ذات الورنيّة لقياس طول مسرى الجسر الصغير-أجار ملح.
      تنبيه: تلميح ميكروكابيلاري يجب أن تكون طويلة بما يكفي لإدخال الحل المخزن المؤقت للقياسات.
    2. نصيحة ميكروكابيلاري بسكين حادة أو شفرة قطع وتنظيف سطح قطع مع الإيثانول والمياه.
  2. إعداد مسرى المغلفة أجكل.
    1. قطع سلك Ag حوالي 8 سم في الطول وتنظيفه مع الإيثانول والماء.
    2. يأخذ قطعة من الصنفرة وأسفل سطح طول 1 سم في نهاية السلك، التي ينبغي أن تكون على اتصال مع الحل الملح على نحو سلس.
    3. تراجع نهاية متجانسة في حل بوكل 3 أمتار ومعطف اليكتروتشيميكالي الكلوريد باستخدام إمدادات العاصمة 1.5 V 10 s.
    4. مسرى مع المياه النظيفة والجافة وضبط طول مسرى AgCl من الجانب غير المصقول حيث أنها تخترق نصيحة ميكروكابيلاري العميق قدر الإمكان.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
  3. إعداد حل ملح بوكل م 3 مع [اغروس] 1% (v/v).
    1. تزن بها ز 4.47 من بوكل وتذوب في 20 مل الماء بإثارة ذلك في قارورة.
    2. إزالة محرض وزن إلى 0.2 جم من [اغروس]، وإضافة إلى قارورة.
    3. تصل الحل إلى 100 درجة مئوية الحرارة تذوب في [اغروس] وتمنع تخثر الدم.
      تنبيه: سوف يكون قارورة حار جداً. لا تلمس ذلك بأيديهم العارية. استخدام قفازات للمناولة.
  4. ملء نصيحة ميكروكابيلاري مع الحل الملح [اغروس].
    تنبيه: أن الحل الساخنة. حماية الأيدي والعمل بعناية لتجنب البقع.
    1. إذا كان [اغروس] يبدأ تخثر، تسخين حل الملح تذوب تماما [اغروس] مرة أخرى.
    2. ينقع 10 ميليلتر من الحل الملح أجار إلى نصيحة ميكروكابيلاري. نقع عليه ببطء بعناية لتجنب الهواء فقاعات في التلميح.
    3. إزالة التلميح من ماصة ودفع في مسرى AgCl من الجانب الأوسع نطاقا للتلميح. التأكد من أن تخترق مسرى الحل الملح.
    4. تهدئة الكهربائي بدرجة حرارة الغرفة وتوصيله إلى مكبر للصوت.
  5. إعداد المخزن المؤقت للقياسات.
    1. تزن بها ز 0.710 نا2هكذا4، ز 0.195 من مس، ز 0.121 من تريس، 0.023 ز لعطا، ثم إضافة 100 مل ماء المقطر إلى كوب وآثاره الحل.
    2. التحقق من وجود قيمة pH من المخزن المؤقت باستخدام قطب درجة حموضة وقم بضبط قيمة pH إلى 7.32.
    3. تحقق من مسرى المرجعية ومسرى جسر الملح أجار في تماس كهربائي.
      1. أضف 1 مل من المخزن المؤقت إلى وعاء من بلاستيك.
      2. وتراجع في مسرى المرجعية ومسرى جسر الملح أجار وتحقق استجابة إشارات. وإذا كانت الاستجابة إشارة صحيحة، انتقل إلى الخطوة 2.7.
  6. إذا كان هناك استجابة إشارة خاطئة أو لا تماس كهربائي على الإطلاق، القيام استكشاف الأخطاء وإصلاحها التالية.
    1. التحقق مما إذا كان مسرى على اتصال مع الحل الملح ودفع مسرى إلى الحل.
      ملاحظة: إذا كان الحل بالفعل جداً لزجة، إزالة الجسر الصغير-أجار ملح وإعداد تلميح ميكروكابيلاري جديدة.
    2. التحقق من ما إذا كان هناك فقاعات الهواء داخل الحل الملح. إذا كان الجواب نعم، تعد نصيحة ميكروكابيلاري جديدة.
    3. معرفة ما إذا كان الحل الملح على اتصال مع الحل المخزن المؤقت. إذا لم يكن كذلك، ثم قطع آخر 1 مم من نهاية أنبوب التلميح.
      تنبيه: يجب التأكد من أن هذه المعلومة لا تزال طويلة بما يكفي لاختراق التلميح الذي يحتوي على المخزن المؤقت. إذا كان لا يزال هناك أي اتصال، تعد نصيحة ميكروكابيلاري جديدة.
    4. إذا كان أي من هذه الخطوات، تعد نصيحة ميكروكابيلاري جديدة.
  7. للتخزين، وتراجع مسرى جسر الملح أجار إلى حل بوكل م 3.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا. للإيقاف مؤقت بين عشية وضحاها، تخزين مسرى في 3 م بوكل الحل الملح في 4 درجات مئوية.
  8. يعد طرف البلاستيك المحتوية على المخزن المؤقت.
    ملاحظة: إذا تم تخزين الكهربائي بين عشية وضحاها، أخذ بها والسماح لها بحرارة تصل إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    1. نصيحة ميكروكابيلاري وينحني الأنبوب، 2 سم من حافة الجزء الضيق، ما يقرب من 90 درجة استخدام سلك تدفئة.
    2. استخدام سكين حادة جداً أو شفرة وقطع الأنبوب حوالي 5 مم من الانحناء.
    3. تنظيف السطح في النهاية مع الإيثانول والمياه وقياس قطر الثقب للحافة. من ذلك، حساب مساحة السطح.
    4. معطف سطح غيض مع 85:15 (الخامس: الخامس) الهكسين: هيكساديكان.
      1. "الماصة؛" 3 ميليلتر من المذيب وإزالته من الحافة.
      2. انتظر 1 دقيقة بحيث أن كل من المذيبات المتبقية في التلميح قد تبخرت.
    5. ملء معلومات القياس مع 3 ميليلتر من المخزن المؤقت وتوصيله إلى مسرى جسر الملح.
      ملاحظة: التحقق مرة أخرى إذا مسرى جسر الملح ومسرى مرجع في الاتصال الكهربائية عن طريق إجراء خطوة 2.5.3.
    6. إذا لم يكن هناك لا تماس كهربائي، تحقق ما يلي:
      1. التحقق مما إذا كان مسرى الملح جسر اتصال مع الحل المخزن المؤقت. إذا لم يكن كذلك، ثم زيادة حجم المخزن المؤقت في التلميح أو إعداد تلميح ميكروكابيلاري أطول.
      2. إذا كان هناك فقاعة هواء، إزالة التلميح من مسرى الجسر الصغير-الملح وإعادة ملء المخزن المؤقت في التلميح وتوصيله الكهربائي مرة أخرى.

3-قياس البارامترات الكهربائية للغشاء تشكيلها مع البروتين المؤتلف

  1. تطبيق إشارة جهد ثلاثي متناوبة مع الجهد القصوى يوماكس = 50 أم و ΔTمنحدر = 50 مللي ثانية، مما يخلق استجابة تيار المتردد مستطيلة. من متوسط قيم التيارات الإيجابية والسلبية (+ وأنا)، حساب قدرة الغشاء وفقا للصيغة التالية:
    Equation 1
  2. تطبيق منحدر جهد تتراوح بين-50 أم أم + 50 والسجل الحالي. تناسب دالة خطية للبيانات-المنحدر هو الموصلية-ونقطة تقاطع المحور السيني يصلح لحساب.
  3. الاضطلاع بالحل في تلميح البلاستيكية وتعبئة واحدة جديدة مع مخزن مؤقت يتضمن بتركيز زيادة الركازة.
    1. إذا تم تشكيل لا غشاء داخل s 20-30 الأولى، أداء وحدة التخزين وإعادة شحنة. وهذا يضمن أن التدرج التركيز عبر الغشاء لا تتغير كثيرا أثناء تكوين غشاء.
    2. بعد تكوين غشاء، نفذ الخطوات 3.1 و 3.2 مرة أخرى للتحقق من تكوين غشاء سليم والحصول على نقطة تقاطع المحور س.

4-حساب معدل دوران الركيزة

ملاحظة: انظر الأعمال السابقة لتفاصيل3،7.

  1. تقدير كمية البروتين في الغشاء من الكتلة الجزيئية للدهن والبروتين (مالدهن ومالبروتين) ومنطقة الغشاء والدهن واحد رئيس الفريق (غشاء والمادة الدهنية) ونسبة البروتين الواحد الشامل دهن (r).
    Equation 2
  2. حساب المحتملة للركيزة المنقولة] [نرنست]. R هو ثابت الغازات، T درجة الحرارة, z المسؤول عن الركيزة المنقولة، و فاراداي ثابتة، وج1 وجيم2 تركيزات الركيزة من كلا الجانبين من الغشاء.
    Equation 3
  3. من التسجيلات الحالية الفولت، تأخذ العكس المحتملة المحسوبة مع اختلاف نقاط تقاطع المحور السيني من يناسب الخطي في وجود وغياب التدرج الركازة.
  4. حساب نسبة الموصلية الركازة، زالركازة، إلى الموصلية غشاء المجموع، زالإجمالي، بنسبة إمكانية عكس المحتملة] [نرنست]11.
    Equation 4
  5. حساب الركازة دوران ΔN رقمالركيزة الواحدة مرة وحدة ΔT من الموصلية الركازة (زالركيزة)، والجهد التطبيقية يو، والمسؤول عن ي الركيزة
    Equation 5
  6. من نسبة الركازة تنقل كل مرة إلى عدد البروتينات، حساب κ معدل دوران.
    Equation 6

Representative Results

للتحقق من حد انتشار محتمل، وتم قياس استقرار قياسات الجهد الحالي الغشاء سليمة. في الشكل 2أ، يصور تسجيلات الجهد الحالي الممثل في الوجود (النقاط البيضاء) وغياب التدرج الأس الهيدروجيني (النقاط السوداء). طبقاً للمعادلة [نرنست]، يستحث التدرج درجة الحموضة تحولاً في الجهد. من نقطة تقاطع المحور السيني لنوبة الخطي للبيانات، يتم حساب التحول المحتملة. من أجل اختبار الأقطاب على حد سواء، وقد تم تحليل التحول في نقطة تقاطع المحور س AgCl قياسية قطب كهربائي (الشكل 2ب؛ النقاط البيضاء) وجسر ملح الصغرى-أجار (الشكل 2ب؛ النقاط السوداء). منحدر جهد سجلت عشر مرات في صف واحد وهو يصور التحول يعني في المحور س ضد الوقت. بينما كان مسرى جسر الملح أجار تحولاً الحد أقصى من أقل من 5 mV حتى بعد 300 ثانية للقياس، ومسرى القياسية متنوعة تصل إلى 30 أم في سلوك لا يمكن التنبؤ بها، وعشوائي.

بعد ذلك، جرى اختبارها كلا أقطاب في تدرجات مختلفة من الأس الهيدروجيني (الشكل 3أ). من أجله مسرى القياسية، الانحدار درجة حموضة من 0.35 و 1.0 (النقاط البيضاء)؛ أجار ملح جسر القطب، والتدرجات الأس الهيدروجيني من 0.35 و 0.7 و 1.0 (النقاط السوداء). وقد تم تحليل هذا التحول في الإمكانات في ثلاثة مقاييس مستقلة. على عكس رج 0.35، حيث تحول يقاس فقط يختلف قليلاً، يغير التحول الجهد إلى حد كبير في التدرج درجة الحموضة من 1.0 في غياب الجسر الصغير-أجار ملح. من نوبة خطي للبيانات، هو منحدر الدالة 26.4 ± 2.3 mV/ΔpH للقطب القياسية و 50.1 ± 4.6 السيارات/ΔpH لمسرى الجسر الصغير-أجار ملح. طبقاً للمعادلة [نرنست]، هو التحول المحتملة المحسوبة 60.7 mV/ΔpH في T = 32 درجة مئوية.

استخدام الجسر الصغير-أجار الملح، عدد دوران بروتون، κ، UCP1 الميتوكوندريا و UCP3 كان قياس ومقارنة بالقياسات السابقة (الشكل 3ب). مشابه ل الرقم 3ألف، ΔpH = 1.0 تم إنشاؤها، وتم قياس إمكانية عكس. وقدرت كمية البروتين في الغشاء وفقا للصيغة الواردة في المادة 4 من البروتوكول، مع بروتين إلى نسبة الدهن 4 ميكروغرام/(مغ من المادة الدهنية)، كتلة جزيئية دا 33,000، و 750 للبروتين والدهن، غشاء مساحة 3.53 × 10 -4 سم2، ومساحة كل الدهن 7.8 × 10-15 سم2. الحصول على κwas 5.56 ± 0.38 s-1 و 4.10 ± 0.71 s-1 UCP1 و UCP3، على التوالي (الشكل 3ب).

Figure 1
الشكل 1 : تركيب الكهربية بالجسر الصغير-أجار ملح. (أ) هذا الفريق يظهر الرسم التقريبي للإنشاء. نصيحة ميكروكابيلاري التي تحتوي على الحل الملح أجار (المبينة باللون البرتقالي) يوضع بين مسرى (أسود) والذي يحتوي على المخزن المؤقت (أزرق). ويتكون الغشاء على السطح في نهاية الحافة الذي يحتوي على المخزن المؤقت (المشار إليها بالسهم). (ب) هذا الفريق يظهر صورة لطريقة إعداد الكهربية مع تنفيذ الجسر الصغير-أجار ملح. الأسهم تشير إلى مسرى والجسر الصغير-أجار ملح ومسرى مرجعية والحاوية مع المخزن المؤقت للحل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : مقارنة جسر ملح أجار الصغرى ومسرى AgCl قياسية. (أ) هذا الفريق قياس يظهر الفولت الحالي ممثل في الوجود (النقاط الرمادية) وغياب (النقاط البيضاء) التدرج درجة الحموضة من 1. تمثل الخطوط نوبة خطي للبيانات، ويتم الحصول عليها من الموصلية والمحور السيني التي تقاطع القيم. يتم تقييم التحول الجهد بالفرق بين قيم تقاطع كل التسجيلات. (ب) هذا الفريق يظهر التحول في غشاء المحتملة للقطب AgCl القياسية (النقاط البيضاء) إلى قطب جسر الصغير-أجار ملح (النقاط السوداء) في الوقت المناسب. وسجلت قياسات الجهد الحالي عشرة في صف والمرسومة التحول الجهد يعني بنشر المحتملة ضد الوقت. وفي جميع التجارب، قدم الغشاء 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL تشكيلها مع حمض اراسيدونيك % مول 15 بتركيز 1.5 ملغ/مل. المخزن المؤقت الوارد 50 مم نا2هكذا4، 10 مس، 10 مم تريس، و 0.6 ملم عطا في درجة الحموضة = 7.34 و T = 32 درجة مئوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : حساب عدد دوران بروتون UCP1 و UCP3 من إمكانية عكس حضور تدرج pH. (أ) هذا الفريق يظهر التحول في إمكانات غشاء المحتوية على UCP1 مختلف التدرجات الأس الهيدروجيني قطب AgCl قياسية (النقاط البيضاء) وجسر ملح الصغرى-أجار قطب (النقاط السوداء). تمثل الخطوط نوبة خطي للبيانات. (ب) هذا الفريق ويبين عدد دوران بروتون UCP1 (مجموعة البيانات الأولى) و UCP3 (مجموعة البيانات الثانية) كما محسوبة من نسبة الجهد العالي لإمكانات] [نرنست] وفقا للصيغ الموجودة في القسم 4 من البروتوكول. أول شريط لكل مجموعة تمثل معدلات الدوران يقاس بالجسر الصغير-أجار ملح. يمثل شريط الثاني لكل مجموعة بيانات القياسات السابقة استخدام قطب AgCl قياسية. وقد أخذت القيم UCP1 و UCP3 من أوربانكوفاet al. 3 وماخر et al. 8-في كل القياسات، جرى الغشاء 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL تشكيلها مع مول 15% AA و UCP1/UCP3. وكان تركيز الدهن والبروتين 1.5 ملغ/مل و 4 ميكروغرام/ملغ من الدهن، على التوالي. المخزن المؤقت الوارد 50 مم نا2هكذا4، 10 مس، 10 مم تريس، و 0.6 ملم عطا في درجة الحموضة = 7.34 و T = 32 درجة مئوية. الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت للقياسات التدرج زاد إلى 7.66 أو 8.00 8.33 بإضافة تريس وتم تغيير في ماصة المحتوية على الحل. أن القيم هي ± متوسط الانحراف المعياري للقياسات المستقلة الثلاثة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

تنفيذ الجسر الصغير-أجار الملح مع مسرى يقلل نشر المحتملة ويسمح قياسات أكثر دقة لغشاء المحتملة الناتجة عن تدرج درجة حموضة. حضور مختلف الأس الهيدروجيني transmembrane التدرجات، التحول المحتملة لكل أقطاب مقبول في ΔpH = 0.35 عند مقارنة بالقيمة النظرية للتوازن] [نرنست] المحتملة (Φ] [نرنست] = 23.8 mV ل ΔpH = 0.4). ومع ذلك، في الأس الهيدروجيني الفسيولوجي تدرجات إضافية، كما لفشل مثيل في الميتوكوندريا بين المصفوفة والفضاء intermembrane، مسرى AgCl القياسية دقة قياس التحول المحتملة في ΔpH = 1 (الشكل 3أ). وألقى مسرى سدها بالملح الصغرى-أجار القيم التي أكثر بكثير مماثلة للنظرية.

نشر محتملة قد تحدث أيضا في مسرى مرجع AgCl إذا تم تغيير الحل المخزن المؤقت أثناء التجربة. الحل عازلة خالية من كلوريد استخدمت في التجارب حيث يفصل البروتينات واقترح نقل أيونات الكلوريد، وتم ضبط درجة الحموضة استخدام تريس أو مس. مسرى المحتملة، نظراً لعدم وجود تركيز كبير من الكلوريد، أساسا يعتمد على شوائب كلوريد في الحل المخزن المؤقت. كما لم يتغير تشكيلها خلال التجارب، أنه سيؤدي ببساطة إلى إمكانية إزاحة ثابتة. ومع ذلك، لقياس مطلقة الاختلاف المحتملة قطبين، نظام ملح-جسر أجار بسيط (Ag/AgCl 3 م بوكل) أيضا يمكن لمسرى مرجع.

جسر ملح الصغرى-أجار أرصدة نشر المحتملة بالموازنة القطب المحتملة. بغية تثبيت الحل الملح، تمت إضافة 1% (w/v) [اغروس] لمنع اختلاط الحل الملح مع الحل المخزن المؤقت. أيونات الملح ك+ و Cl موبيليتيس مماثلة في السائل والتوازن الكهربائي المحتملة. تثبيت الجسر الملح بشكل صحيح، لا الحل الملح أجار يمكن تسخينه بما فيه الكفاية لملء نصيحة ميكروكابيلاري دون أي فقاعات الهواء وتغطية مسرى AgCl. قبل مواصلة الاستخدام، قد تماس كهربائي بين مسرى جسر الملح ومسرى مرجع لفحصها. وقد حل الملح حسب الوقت الذي يستخدم الجسر الملح، أن تبلور بما فيه الكفاية لمنع أي خلط الحل الملح مع المخزن المؤقت. هذا أمر بالغ الأهمية خاصة إذا كان يتم التحقيق ك+ أو الناقلين Cl . واستخدمت الجسر الملح لفترة زمنية قصيرة جداً وشطف من [اغروس] لا يكاد يذكر في هذا النطاق الزمني. تركيز أعلى من [اغروس] ليصل إلى 5 في المائة، أو أجار (3 ٪-5 ٪)، يسمح باستخدام جسر الملح لفترة أطول من الوقت6،12.

يسمح هذا الأسلوب تحديد حركية النقل الناقل غشاء (ط) مع معدلات دوران منخفضة و (ثانيا) mitochondrial البروتينات الغشاء الداخلي، الذي لا يمكن أن يحقق في التصحيح القياسي المشبك التكوينات13. دقتها تعتمد أساسا على قياس إمكانية عكس، يتناقص فيه دقة الموصلية غشاء إجمالي منخفض والتدرجات تركيز الصغيرة التي تحفز غشاء محتملة أدناه ضوضاء تسجيل.

باستخدام هذا الإعداد، تم قياس معدلات دوران UCP1 و UCP3 كما أنتجت في نفس الظروف. بسبب ارتفاع درجة الحموضة التدرج، تبدو المعدلات التي تم الحصول عليها تكون أكثر دقة ودونما قلاقل بالآثار الناجمة عن التحول المحتملة طفيفة القطب. يمكن استخدامه لزيادة تحليل ومقارنة الناقلين غشاء الميتوكوندريا المنتجة في ظروف مماثلة.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

هذا العمل كان يدعمها "الصندوق البحوث النمساوية" (P31559-B20 إلى E.E.P.). يشكر المؤلفون بارداكجي سارة للمساعدة التقنية الممتازة في الإنتاج وإعادة تشكيل للماوس UCP1 و UCP3 في بروتيوليبوسوميس.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microloader tips Eppendorf 5242956.003 Microcapillary pipette tip
Ethanol 99% AustrAlco Österr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H AAAH-5020-07025-230317
Kaliumchlorid Carl Roth GmbH + Co. Kg 6781.3
DC supply Voltcraft V10/CPG 1940 -01
Agarose Standard Carl Roth GmbH + Co. Kg 3810.2
Patch Clamp Amplifier Heka
Sample tube Carl Roth GmbH + Co. Kg 5863.1
Na2SO4 Carl Roth GmbH + Co. Kg 8560.3
MES Carl Roth GmbH + Co. Kg 4256.2
TRIS Carl Roth GmbH + Co. Kg AE15.2
EGTA Carl Roth GmbH + Co. Kg 3054.1
Hexane Sigma-Aldrich 296090-100ML
Hexadecane Sigma-Aldrich 296317-100ML
Heating wire Voltcraft USPS-2250

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22, (1), 23-26 (2001).
  2. Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. The silver-silver chloride electrode: A possible generator of offset voltages and currents. Journal of Neuroscience Methods. 19, (3), 249-255 (1987).
  3. Urbankova, E., Voltchenko, A., Pohl, P., Jezek, P., Pohl, E. E. Transport kinetics of uncoupling proteins. Analysis of UCP1 reconstituted in planar lipid bilayers. Journal of Biological Chemistry. 278, (35), 32497-32500 (2003).
  4. Beck, V., et al. Polyunsaturated fatty acids activate human uncoupling proteins 1 and 2 in planar lipid bilayers. The FASEB Journal. 21, (4), 1137-1144 (2007).
  5. Shao, X. M., Feldman, J. L. Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials. Journal of Neuroscience Methods. 159, (1), 108-115 (2007).
  6. Kleene, S. J. A simple intrapipette salt bridge. Journal of Neuroscience Methods. 46, (1), 11-16 (1993).
  7. Beck, V., et al. A new automated technique for the reconstitution of hydrophobic proteins into planar bilayer membranes. Studies of human recombinant uncoupling protein 1. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757, (5-6), 474-479 (2006).
  8. Macher, G., et al. Inhibition of mitochondrial UCP1 and UCP3 by purine nucleotides and phosphate. Biochimica et Biophysica Acta. 1860, (3), 664-672 (2018).
  9. Rupprecht, A., et al. Role of the transmembrane potential in the membrane proton leak. Biophysical Journal. 98, (8), 1503-1511 (2010).
  10. Hilse, K. E., et al. The expression of UCP3 directly correlates to UCP1 abundance in brown adipose tissue. Biochimica et Biophysica Acta. 1857, (1), 72-78 (2016).
  11. Fuks, B., Homble, F. Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids. Biophysical Journal. 66, (5), 1404-1414 (1994).
  12. Barry, P. H., Lewis, T. M., Moorhouse, A. J. An optimised 3 M KCl salt-bridge technique used to measure and validate theoretical liquid junction potential values in patch-clamping and electrophysiology. European Biophysics Journal. 42, (8), 631-646 (2013).
  13. Huang, D., Li, J. The feasibility and limitation of patch-clamp recordings from neonatal rat cardiac ventricular slices. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 47, (4), 269-272 (2011).
قطب الصغير-أجار ملح جسر لتحليل معدل دوران بروتون بروتينات الغشاء المؤتلف
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kreiter, J., Pohl, E. E. A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58552, doi:10.3791/58552 (2019).More

Kreiter, J., Pohl, E. E. A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58552, doi:10.3791/58552 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter