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Neuroscience

रिकॉमबिनेंट झिल्ली प्रोटीन की प्रोटॉन कारोबार दर का विश्लेषण करने के लिए एक सूक्ष्म आगर नमक पुल इलेक्ट्रोड

doi: 10.3791/58552 Published: January 7, 2019

Summary

electrophysiological माप में, एक प्रसार क्षमता की उपस्थिति इलेक्ट्रोड क्षमता में फेरबदल करके रिवर्स क्षमता की सटीक माप परेशान करता है । एक सूक्ष्म-आगर नमक पुल का उपयोग करना, प्रसार क्षमता के प्रभाव को कम किया गया है, जो पुनर्गठन रिकॉमबिनेंट झिल्ली प्रोटीन का सब्सट्रेट कारोबार संख्या की एक और सटीक माप की अनुमति देता है ।

Abstract

तारीख करने के लिए, सभी औषधीय दवाओं के ५०% से अधिक झिल्ली प्रोटीन के परिवहन कैनेटीक्स लक्ष्य । झिल्ली वाहक प्रोटीन लिपिड bilayer झिल्ली में पुनर्गठन के electrophysiological लक्षण वर्णन उनके भौतिक और औषधीय गुणों के आकलन के लिए एक शक्तिशाली लेकिन नाजुक तरीका है । सब्सट्रेट कारोबार संख्या अलग झिल्ली प्रोटीन की गतिविधि की तुलना की अनुमति देता है कि एक अद्वितीय पैरामीटर है. एक electrogenic परिवहन में, translocated सब्सट्रेट के ढाल एक झिल्ली क्षमता है कि सीधे प्रोटीन के सब्सट्रेट कारोबार दर को संबद्ध बनाता है । चांदी क्लोराइड इलेक्ट्रोड का उपयोग करके, एक प्रसार क्षमता, भी कहा जाता है तरल जंक्शन क्षमता, प्रेरित है, जो बदल जाता है इलेक्ट्रोड क्षमता और काफी सटीक झिल्ली संभावित माप परेशान करता है. प्रसार क्षमता एक नमक पुल है, जो इलेक्ट्रोड क्षमता संतुलन से कम किया जा सकता है । इस अनुच्छेद में, एक माइक्रो-आगर नमक पुल electrophysiological सेट-अप में सुधार करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो झिल्ली गठन के लिए micropipettes का उपयोग करता है । नमक समाधान एक microcapillary पिपेट टिप में भरा है, agarose के अलावा द्वारा स्थिर है, और आसानी से एक मानक इलेक्ट्रोड के लिए मुहिम शुरू कर सकते हैं । एक सूक्ष्म नमक पुल इलेक्ट्रोड की इलेक्ट्रोड क्षमता एक मानक इलेक्ट्रोड की तुलना में अधिक स्थिर है. इस प्रणाली के कार्यांवयन इलेक्ट्रोड क्षमता स्थिर और झिल्ली की क्षमता का अधिक सटीक माप एक पीएच ढाल द्वारा उत्पंन की अनुमति देता है । इस प्रणाली का उपयोग करना, mitochondrial वाहक UCP1 और UCP3 के प्रोटॉन कारोबार दर फिर से जांच कर रहे है और पहले माप की तुलना में ।

Introduction

झिल्ली प्रोटीन अप करने के लिए सभी ज्ञात दवा दवाओं के ६०% द्वारा लक्षित कर रहे हैं1. झिल्ली प्रोटीन की Electrophysiological माप झिल्ली वाहक प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता सब्सट्रेट के electrogenic परिवहन का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली लेकिन नाजुक उपकरण हैं । लगातार वोल्टेज या वोल्टेज रैंप के आवेदन द्वारा transmembrane वर्तमान का मॉडुलन वाहक के औषधीय और भौतिक गुणों का आकलन करने की अनुमति देता है, उदाहरण के लिए, सक्रियण और सब्सट्रेट या परिवहन द्वारा निषेध कैनेटीक्स. विशेष ब्याज की सब्सट्रेट कारोबार संख्या है, जो कि समय इकाई प्रति एक झिल्ली प्रोटीन द्वारा translocated है सब्सट्रेट की राशि प्रदर्शित करता है । यह एक प्रमुख पैरामीटर जब विभिंन झिल्ली प्रोटीन के कैनेटीक्स की तुलना है । झिल्ली भर में आरोपित सब्सट्रेट की एकाग्रता ढाल की स्थापना एक विद्युतवाहक बल सब्सट्रेट की कारोबार संख्या मुजे है जो उत्पन्न करता है ।

एक AgCl इलेक्ट्रोड का उपयोग करना, एक क्लोराइड मुक्त बफर की उपस्थिति एक प्रसार क्षमता है कि परिवर्तन इलेक्ट्रोड क्षमता बनाता है और वर्तमान वोल्टेज माप2में एक बदलाव की ओर जाता है. हालांकि हमेशा वर्तमान, यह मानक कंडक्टर और क्षमता माप के लिए नगण्य है क्योंकि इन मापदंडों या तो वर्तमान वोल्टेज रिकॉर्डिंग (कंडक्टर) की ढलान पर निर्भर कर रहे हैं या एक एकल रिकॉर्डिंग (क्षमता) का अंतर है, जो क्षमता रद्द करता है । हालांकि, रिवर्स क्षमता है, जो सब्सट्रेट के परिवहन के द्वारा बनाई गई है की रिकॉर्डिंग काफी प्रसार क्षमता से परेशान किया जा सकता है । इस प्रकार, रिवर्स क्षमता की सटीक माप के लिए, इलेक्ट्रोड क्षमता लगातार रखा जाना है ।

प्रसार क्षमता दो तरीकों से कम किया जा सकता है: (i) एक bilayer झिल्ली की उपस्थिति में, एक सब्सट्रेट एकाग्रता के लिए झिल्ली3,4, या (ii) एक नमक पुल के एक तरफ वृद्धि हुई है इलेक्ट्रोड संभावित संतुलन 5. पहली विधि माप की स्थिरता पर अत्यधिक निर्भर है । झिल्ली सब्सट्रेट लगभग समान रूप से समाधान में वितरित किया जाता है जब तक क्रियाशीलता के तहत सब्सट्रेट के अलावा से, कई मिनट के लिए जीवित है । अगर झिल्ली के बीच में टूटना, सब्सट्रेट ढाल आरोपित अणुओं के मुक्त विनिमय द्वारा बदल दिया है, और माप गलत बारी । उत्तरार्द्ध विधि प्रसार क्षमता को संतुलित करता है, लेकिन सेट-अप के आकार तक सीमित है । एक electrophysiological सेट अप करने के लिए एक सूक्ष्म रेंज में एक छोटी लेकिन कार्य नमक पुल को लागू करने6चुनौती दे रहा है । बाद विधि के लिए, नमक समाधान एक microcapillary टिप में भर जाता है और agarose के अलावा द्वारा स्थिर करने के लिए बफर समाधान के लिए नमक समाधान के प्रसार को रोकने के ।

इस प्रोटोकॉल में, एक सूक्ष्म आगर नमक पुल और कार्यांवयन के एक electrophysiological सेट अप में पिपेट सेट अप7 के आधार पर का एक सीधा उत्पादन वर्णित है । एक microcapillary टिप दोनों 1 मॉल% के साथ एक 3 मीटर KCl समाधान शामिल करने के लिए समायोजित किया जाता है (डब्ल्यू/वी) agarose और एक AgCl इलेक्ट्रोड और बफर समाधान पुल । सूक्ष्म नमक पुल का लाभ इलेक्ट्रोड संभावित बदलाव की समय रिकॉर्डिंग और विभिन्न पीएच ढाल पर झिल्ली की क्षमता का अधिक सटीक माप द्वारा प्रदर्शित किया जाता है । रिकॉमबिनेंट प्रोटीन के मॉडल प्रणाली में liposomes में पुनर्गठन, mitochondrial वाहक UCP1 और UCP3 समान परिस्थितियों में उत्पादित की टर्नओवर दरों की जांच कर रहे है और पिछले परिणामों की तुलना में3,8

Protocol

1. रिकॉमबिनेंट युग्मन प्रोटीन (UCPs) और Planar Bilayer झिल्ली के गठन का उत्पादन

  1. रिकॉमबिनेंट UCP1 और UCP3 के रूप में Rupprecht एट अल द्वारा वर्णित उत्पादन । 9 और Hilse एट अल. 10
  2. फार्म बैक एट अल द्वारा बताए गए पारंपरिक औषधालय प्लास्टिक पिपेट के सुझावों पर planar bilayer झिल्ली । 7

2. माइक्रो-आगर नमक पुल इलेक्ट्रोड की तैयारी

  1. उचित लंबाई के लिए एक microcapillary पिपेट टिप ( सामग्री की तालिकादेखें) समायोजित करें ।
    1. एक खाली टिप जिस पर बफर युक्त टिप से जुड़ी होगी और माइक्रो-आगर नमक पुल इलेक्ट्रोड की लंबाई को मापने के लिए एक रपट कैलिपर का उपयोग करने पर स्थिति चिह्नित करें ।
      चेतावनी: microcapillary टिप माप के लिए बफ़र समाधान दर्ज करने के लिए पर्याप्त लंबा होना चाहिए ।
    2. एक तेज चाकू या ब्लेड के साथ microcapillary टिप कट और इथेनॉल और पानी के साथ कटौती की सतह को साफ ।
  2. AgCl-लेपित इलेक्ट्रोड तैयार करें ।
    1. लंबाई में लगभग 8 सेमी की एक एजी तार कट और इथेनॉल और पानी के साथ यह साफ है ।
    2. एक टुकड़ा ले सैड और तार के अंत में 1 सेमी लंबाई की सतह के नीचे चिकनी, जो नमक समाधान के साथ संपर्क में होना चाहिए ।
    3. एक 3 मीटर KCl समाधान में चिकनी अंत डुबकी और कोट यह क्लोराइड के साथ electrochemically 10 एस के लिए १.५ वी में एक डीसी की आपूर्ति का उपयोग करके ।
    4. पानी के साथ इलेक्ट्रोड साफ, यह सूखी, और AgCl इलेक्ट्रोड की लंबाई को अनकोट की ओर से समायोजित करें ताकि यह microcapillary टिप के रूप में गहरी संभव के रूप में प्रवेश.
      नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है ।
  3. 1% (v/v) agarose के साथ एक 3 मीटर KCl नमक समाधान तैयार करें ।
    1. KCl के ४.४७ ग्राम बाहर वजन और यह एक कुप्पी में सरगर्मी से 20 मिलीलीटर पानी में घुल ।
    2. चमचे से निकाल लीजिये, agarose का ०.२ ग्राम बाहर से तौल लीजिये, और इसे कुप्पी में डालें ।
    3. १०० डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान गर्मी agarose पिघल और थक्के से रोकने के लिए ।
      सावधानी: कुप्पी बहुत गर्म हो जाएगा । इसे नंगे हाथों से न स्पर्श करें । हैंडलिंग के लिए दस्ताने का प्रयोग करें ।
  4. agarose नमक समाधान के साथ microcapillary टिप भरें ।
    सावधानी: समाधान गर्म है । हाथ की रक्षा और बौछार से बचने के लिए सावधानी से काम करते हैं ।
    1. agarose थक्के शुरू होता है, तो पूरी तरह से agarose फिर से पिघला करने के लिए नमक समाधान गर्मी ।
    2. microcapillary टिप में आगर नमक समाधान के 10 µ एल सोख । यह धीरे से सोख और ध्यान से टिप में हवा के बुलबुले से बचने के लिए ।
    3. पिपेट से टिप निकालें और टिप के व्यापक पक्ष से AgCl इलेक्ट्रोड में धक्का. सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड नमक समाधान में प्रवेश ।
    4. कमरे के तापमान के लिए इलेक्ट्रोड शांत और एम्पलीफायर में प्लग.
  5. माप के लिए बफ़र तैयार करें ।
    1. बाहर ना2के ०.७१० जी तो4, एमईएस के ०.१९५ जी, TRIS के ०.१२१ ग्राम, और EGTA के ०.०२३ जी, तो एक चोंच के लिए आसुत पानी की १०० मिलीलीटर जोड़ने और समाधान हलचल ।
    2. एक पीएच इलेक्ट्रोड का उपयोग कर बफ़र का पीएच मान के लिए जाँच करें और ७.३२ करने के लिए पीएच मान को समायोजित ।
    3. जांच करें कि संदर्भ इलेक्ट्रोड और आगर नमक पुल इलेक्ट्रोड विद्युत संपर्क में हैं.
      1. एक प्लास्टिक कंटेनर के लिए बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
      2. संदर्भ इलेक्ट्रोड और आगर नमक पुल इलेक्ट्रोड में डुबकी और एक संकेत प्रतिक्रिया के लिए जाँच करें. संकेत प्रतिक्रिया सही है, तो चरण २.७ के लिए आगे बढ़ें ।
  6. यदि कोई गलत संकेत प्रतिक्रिया या सभी पर कोई विद्युत संपर्क है, तो निंन समस्या निवारण करें ।
    1. इलेक्ट्रोड नमक समाधान के साथ संपर्क में है और समाधान में इलेक्ट्रोड धक्का है, तो जाँच करें.
      नोट: यदि समाधान पहले से ही बहुत चिपचिपा है, माइक्रो-आगर नमक पुल को निकालें और एक नया microcapillary टिप तैयार करें ।
    2. जांचें कि क्या नमक समाधान के भीतर हवा के बुलबुले हैं । यदि हाँ, तो एक नया microcapillary टिप तैयार करें ।
    3. जांचें कि क्या नमक समाधान बफ़र समाधान के साथ संपर्क में है । यदि नहीं, तो बंद टिप के ट्यूब अंत के एक और 1 मिमी काट ।
      चेतावनी: सुनिश्चित करें कि टिप अभी भी लंबे समय के लिए बफर-टिप युक्त घुसना काफी है । यदि अभी भी कोई संपर्क नहीं है, तो एक नया microcapillary टिप तैयार करें ।
    4. यदि इनमें से कोई भी चरण मदद नहीं करता है, तो एक नया microcapillary टिप तैयार करें ।
  7. भंडारण के लिए, एक 3 मीटर KCl समाधान में आगर नमक पुल इलेक्ट्रोड डुबकी ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । एक रात के ठहराव के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मीटर KCl नमक समाधान में इलेक्ट्रोड की दुकान ।
  8. बफर युक्त प्लास्टिक टिप तैयार करते हैं ।
    नोट: इलेक्ट्रोड रातोंरात संग्रहीत किया गया था, तो इसे बाहर ले जाओ और इसे 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान को गर्मी ।
    1. एक microcapillary टिप ले लो और ट्यूब मोड़, संकीर्ण भाग के किनारे से 2 सेमी, लगभग ९० डिग्री एक हीटिंग वायर का उपयोग कर ।
    2. एक बहुत तेज चाकू या ब्लेड का प्रयोग करें और मोड़ से 5 मिमी के आसपास ट्यूब काट ।
    3. इथेनॉल और पानी के साथ अंत में सतह को साफ और टिप के छेद के व्यास को मापने । इस से, सतह के क्षेत्र की गणना ।
    4. कोट 85:15 (v:v) hexane: hexadecane के साथ टिप की सतह ।
      1. पिपेट विलायक के 3 µ एल और यह टिप से हटा दें ।
      2. 1 मिनट रुको ताकि टिप में अवशिष्ट विलायक के सभी काफूर हो गया है ।
    5. बफर के 3 µ एल के साथ माप टिप भरें और यह नमक पुल इलेक्ट्रोड पर प्लग ।
      नोट: यदि नमक पुल इलेक्ट्रोड और संदर्भ इलेक्ट्रोड 2.5.3 चरण प्रदर्शन द्वारा बिजली के संपर्क में हैं फिर से जाँच करें.
    6. यदि कोई विद्युत संपर्क नहीं है, तो निंन के लिए जांच करें:
      1. जांच करें कि क्या नमक ब्रिज इलेक्ट्रोड बफ़र समाधान के साथ संपर्क में है । यदि नहीं, तो या तो टिप में बफर की मात्रा में वृद्धि या एक लंबा microcapillary टिप तैयार करते हैं ।
      2. अगर वहाँ एक हवा बुलबुला है, सूक्ष्म नमक पुल इलेक्ट्रोड से टिप निकालें, टिप में बफर फिर से भरना, और इलेक्ट्रोड में फिर से प्लग.

3. रिकॉमबिनेंट प्रोटीन के साथ गठित झिल्ली के विद्युत मापदंडों की माप

  1. एक त्रिकोणीय बारी वोल्टेज यूमैक्स = ५० एमवी और ΔTरैंप = ५० ms, जो एक आयताकार बारी वर्तमान प्रतिक्रिया बनाता है के साथ एक बार वोल्ट संकेत लागू करें । सकारात्मक और नकारात्मक धाराओं (i+ और मैं-) के अर्थ मूल्यों से, निम्नलिखित सूत्र के अनुसार झिल्ली की क्षमता की गणना:
    Equation 1
  2. लागू करें एक वोल्टेज से लेकर रैंप-५० mv करने के लिए + ५० एमवी और वर्तमान रिकॉर्ड. किसी रेखीय फ़ंक्शन को डेटा में फ़िट करें-ढलान कंडक्टर है-और फिट के x-अक्ष प्रतिच्छेदन बिंदु की गणना करें ।
  3. प्लास्टिक टिप में समाधान का निर्वहन और एक एक वृद्धि सब्सट्रेट एकाग्रता युक्त बफर के साथ एक नया एक भरें ।
    1. यदि कोई झिल्ली पहले 20-30 एस के भीतर बना है, मात्रा का निर्वहन और यह फिर से भरना । यह गारंटी देता है कि झिल्ली के पार एकाग्रता ढाल काफी झिल्ली गठन के दौरान परिवर्तन नहीं करता है ।
    2. एक झिल्ली के गठन के बाद, चरण ३.१ और ३.२ फिर से उचित झिल्ली गठन की पुष्टि करने के लिए और एक्स-अक्ष चौराहे बिंदु प्राप्त करने के लिए प्रदर्शन करते हैं ।

4. सब्सट्रेट कारोबार दर की गणना

नोट: विवरण3,7के लिए पिछले काम देखें ।

  1. झिल्ली में प्रोटीन की मात्रा का अनुमान लिपिड और प्रोटीन के आणविक द्रव्यमान (एमलिपिड और एमप्रोटीन), झिल्ली के क्षेत्र और एक लिपिड सिर समूह (एकझिल्ली और एकलिपिड), और प्रति प्रोटीन का द्रव्यमान अनुपात लिपिड (आर) ।
    Equation 2
  2. परिवहन सब्सट्रेट के लिए ताकि नेर्ंस्ट क्षमता की गणना. आर गैस निरंतर है, तापमान टी, जेड के परिवहन सब्सट्रेट के प्रभारी, एफ फैराडे के निरंतर, और सी1 और सी2 झिल्ली के दोनों किनारों के सब्सट्रेट की सांद्रता है ।
    Equation 3
  3. वर्तमान वोल्टेज रिकॉर्डिंग से, रिवर्स क्षमता x के अंतर के साथ गणना लेने के रेखीय से अक्ष चौराहे अंक की उपस्थिति और सब्सट्रेट ढाल की अनुपस्थिति में फिट बैठता है.
  4. सब्सट्रेट कंडक्टर, जीसब्सट्रेटके अनुपात की गणना, कुल झिल्ली कंडक्टर के लिए, जीकुल, संभावित11ताकि नेर्ंस्ट करने के लिए रिवर्स क्षमता के अनुपात से.
    Equation 4
  5. सब्सट्रेट (जीसब्सट्रेट), लागू वोल्टेज यू, और सब्सट्रेट जेड के प्रभारी इकाई ΔT से प्रति समय सब्सट्रेट कारोबार संख्या ΔNसब्सट्रेट की गणना:
    Equation 5
  6. प्रोटीन की संख्या के लिए प्रति समय उत्पात सब्सट्रेट के अनुपात से, कारोबार दर κ की गणना ।
    Equation 6

Representative Results

प्रसार क्षमता की ंयूनतम पुष्टि करने के लिए, एक बरकरार झिल्ली की वर्तमान वोल्टेज माप की स्थिरता मापा गया था । चित्रा 2में, प्रतिनिधि-वर्तमान वोल्टेज रिकॉर्डिंग उपस्थिति (सफेद डॉट्स) और एक पीएच ढाल के अभाव (काले डॉट्स) में चित्रित कर रहे हैं । ताकि नेर्ंस्ट समीकरण के अनुसार, पीएच ढाल वोल्टेज में बदलाव लाती है । डेटा के लिए एक रेखीय फ़िट के x-अक्ष प्रतिच्छेदन बिंदु से, संभावित shift परिकलित की जाती है । आदेश में दोनों इलेक्ट्रोड का परीक्षण करने के लिए, x-अक्ष चौराहे बिंदु में बदलाव एक मानक AgCl इलेक्ट्रोड के लिए विश्लेषण किया गया था (चित्रा 2; सफेद डॉट्स) और एक माइक्रो-आगर नमक पुल (चित्रा 2b; काले डॉट्स). एक वोल्टेज रैंप दस बार एक पंक्ति में दर्ज किया गया था और x-अक्ष में मतलब बदलाव समय के खिलाफ दिखाया गया है । जबकि आगर नमक पुल इलेक्ट्रोड भी माप के ३०० सेकंड के बाद से कम 5 एमवी की एक अधिकतम बदलाव था, मानक इलेक्ट्रोड अप्रत्याशित, यादृच्छिक, व्यवहार में 30 एमवी करने के लिए विविध.

अगले, दोनों इलेक्ट्रोड अलग पीएच ढाल पर परीक्षण किया गया (चित्रा 3). मानक इलेक्ट्रोड के लिए, ०.३५ और १.० (सफेद डॉट्स) के एक पीएच ढाल उत्पन्न किया गया था; आगर नमक पुल इलेक्ट्रोड के लिए, ०.३५, ०.७ और १.० (काले डॉट्स) के पीएच ढाल. क्षमता में बदलाव तीन स्वतंत्र माप में विश्लेषण किया गया था । ०.३५ के एक ढाल के विपरीत, जहां मापा बदलाव केवल थोड़ा बदलता है, वोल्टेज काफी माइक्रो-आगर नमक पुल के अभाव में १.० के पीएच ढाल पर बदल जाता है । एक रैखिक फिट से डेटा के लिए, समारोह की ढलान है २६.४ ± २.३ एमवी/ΔpH के लिए मानक इलेक्ट्रोड और ५०.१ ± ४.६ एमवी/ΔpH माइक्रो-आगर नमक पुल इलेक्ट्रोड के लिए. ताकि नेर्ंस्ट समीकरण के अनुसार, परिकलित संभावित shift T = ३२ ° c पर ६०.७ mV/ΔpH है ।

माइक्रो-आगर नमक पुल का उपयोग कर, प्रोटॉन कारोबार संख्या, κ, mitochondrial UCP1 और UCP3 मापा गया था और पिछले माप की तुलना में (चित्रा 3बी). चित्रा 3के समान, ΔpH = १.० उत्पंन किया गया था और रिवर्स क्षमता मापा गया था । झिल्ली में प्रोटीन की मात्रा का अनुमान प्रोटोकॉल के सेक्शन 4 में दिए गए फार्मूले के अनुसार था, के साथ एक प्रोटीन के लिपिड अनुपात के लिए 4 µ g/(मिलीग्राम की लिपिड), ३३,००० की एक आणविक द्रव्यमान, और ७५० दा के लिए प्रोटीन और लिपिड, एक झिल्ली सतह क्षेत्र के ३.५३ x 10 -4 सेमी2, और ७.८ x 10 के लिपिड प्रति एक क्षेत्र-15 सेमी2. प्राप्त κwas ५.५६ ± ०.३८ एस-1 और ४.१० ± ०.७१ एस-1 के लिए UCP1 और UCP3, क्रमशः (चित्रा 3बी) ।

Figure 1
चित्रा 1 : electrophysiological सेट-अप माइक्रो आगार नमक पुल के साथ । () इस पैनल के सेट अप का एक संक्षिप्त वर्णन दिखाता है । microcapillary टिप युक्त आगर नमक समाधान (नारंगी में चित्रित) इलेक्ट्रोड (काला) और बफर युक्त टिप (नीला) के बीच रखा गया है. झिल्ली बफर युक्त टिप के अंत में सतह पर बना है (तीर से संकेत) । () यह पैनल माइक्रो-आगर नमक पुल के कार्यांवयन के साथ electrophysiological सेट-अप की एक छवि दिखाता है । इलेक्ट्रोड के लिए तीर बिंदु, माइक्रो-आगर नमक पुल, संदर्भ इलेक्ट्रोड, और कंटेनर बफ़र समाधान के साथ. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : एक माइक्रो-आगर नमक पुल और एक मानक AgCl इलेक्ट्रोड की तुलना. () इस पैनल की उपस्थिति (ग्रे डॉट्स) और अनुपस्थिति में एक प्रतिनिधि वर्तमान वोल्टेज माप से पता चलता है 1 की एक पीएच ढाल के (सफेद डॉट्स) । पंक्तियाँ डेटा, जिसमें से कंडक्टर और x-अक्ष प्रतिच्छेदन मान प्राप्त कर रहे हैं करने के लिए एक रेखीय फ़िट का प्रतिनिधित्व करते हैं । वोल्टेज शिफ्ट दोनों रिकॉर्डिंग के प्रतिच्छेदन मूल्यों के अंतर से मूल्यांकन किया है. () यह पैनल एक मानक AgCl इलेक्ट्रोड (सफेद डॉट्स) के एक सूक्ष्म-आगर नमक पुल इलेक्ट्रोड (काले डॉट्स) के लिए समय में झिल्ली की क्षमता की पारी से पता चलता है. दस वर्तमान वोल्टेज मापन एक पंक्ति में दर्ज किया गया और प्रसार क्षमता द्वारा मतलब वोल्टेज बदलाव समय के खिलाफ साजिश रची है । सभी प्रयोगों में, झिल्ली 45:45:10 मॉल% DOPC का बना था: डोप: सीएल १.५ मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता में 15 मॉल% arachidonic एसिड के साथ पुनर्गठन किया गया । बफर ५० मिमी ना2तो4, 10 मिमी एमईएस, 10 मिमी TRIS, और ०.६ मिमी EGTA पीएच = ७.३४ और टी = ३२ डिग्री सेल्सियस पर निहित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : UCP1 और UCP3 की प्रोटॉन कारोबार संख्या एक पीएच ढाल की उपस्थिति में रिवर्स क्षमता से गणना की । () इस पैनल के एक मानक AgCl इलेक्ट्रोड (सफेद डॉट्स) और एक माइक्रो-आगर नमक पुल इलेक्ट्रोड (काले डॉट्स) के विभिन्न पीएच ढाल की एक UCP1-युक्त झिल्ली की क्षमता में बदलाव से पता चलता है. पंक्तियाँ डेटा के लिए एक रेखीय फ़िट का प्रतिनिधित्व करती हैं. () यह पैनल UCP1 की प्रोटॉन टर्नओवर संख्या से पता चलता है (पहला डाटा सेट) और UCP3 (दूसरा डाटा सेट) के रूप में वोल्टेज शिफ्ट के अनुपात से ताकि नेर्ंस्ट संभावित प्रोटोकॉल की धारा 4 में फार्मूले के अनुसार गणना । प्रत्येक सेट का पहला बार माइक्रो-आगर नमक पुल के साथ मापा कारोबार दरों का प्रतिनिधित्व करता है । प्रत्येक डेटा सेट की दूसरी बार एक मानक AgCl इलेक्ट्रोड का उपयोग कर पिछले माप का प्रतिनिधित्व करता है. UCP1 और UCP3 के लिए मान Urbankovaएट अल से लिया गया था । 3 और मच एट अल । 8. सभी माप में, झिल्ली 45:45:10 मॉल के बने थे% DOPC: डोप: सीएल 15 मॉल के साथ पुनर्गठन% ए. ए. और UCP1/UCP3 । लिपिड और प्रोटीन की एकाग्रता था १.५ मिलीग्राम/एमएल और 4 µ g/मिलीग्राम लिपिड के क्रमशः । बफर ५० मिमी ना2तो4, 10 मिमी एमईएस, 10 मिमी TRIS, और ०.६ मिमी EGTA पीएच = ७.३४ और टी = ३२ डिग्री सेल्सियस पर निहित । ग्रैडिएंट मापन के लिए बफ़र का पीएच TRIS जोड़कर ७.६६, ८.०० या ८.३३ तक बढ़ गया था और समाधान-युक्त पिपेट में परिवर्तित किया गया था । मान तीन स्वतंत्र माप का अर्थ ± मानक विचलन कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

इलेक्ट्रोड के साथ माइक्रो-आगर नमक पुल के कार्यांवयन अपनी प्रसार क्षमता को कम करता है और एक पीएच ढाल द्वारा उत्पंन झिल्ली की क्षमता के और अधिक सटीक माप की अनुमति देता है । विभिंन transmembrane पीएच ढाल की उपस्थिति में, दोनों इलेक्ट्रोड के संभावित बदलाव ΔpH पर स्वीकार्य था = ०.३५ जब ताकि नेर्ंस्ट संतुलन क्षमता (Φताकि नेर्ंस्ट = २३.८ एमवी के लिए ΔpH = ०.४) के सैद्धांतिक मूल्य की तुलना । हालांकि, अधिक शारीरिक पीएच ग्रैडिएंट में, उदाहरण के लिए के रूप में मैट्रिक्स और झिल्ली के बीच अंतरिक्ष mitochondria में, मानक AgCl इलेक्ट्रोड ठीक ΔpH पर संभावित shift मापने के लिए विफल = 1 (चित्रा 3A) । इलेक्ट्रोड माइक्रो के साथ पाटने-आगर नमक मूल्यों जो बहुत अधिक सिद्धांत के बराबर थे दिया ।

प्रसार संभावित प्रयोग के दौरान बफर समाधान बदल जाता है, तो AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड पर भी हो सकता है । क्लोराइड-मुक्त बफर समाधान प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया था के बाद से युग्मन प्रोटीन क्लोराइड आयनों के परिवहन के लिए सुझाव दिया गया था, और पीएच Tris या एमईएस का उपयोग कर समायोजित किया गया था । इलेक्ट्रोड क्षमता, क्लोराइड की एक पर्याप्त एकाग्रता के अभाव में, मुख्य रूप से बफर समाधान में क्लोराइड दोष पर निर्भर करता है. के रूप में अपनी संरचना प्रयोग के दौरान अपरिवर्तित है, यह सिर्फ एक निरंतर ऑफसेट क्षमता में परिणाम होगा । हालांकि, दो इलेक्ट्रोड के बीच एक निरपेक्ष संभावित अंतर की माप के लिए, एक साधारण आगार नमक-पुल सिस्टम (Ag/AgCl 3 M KCl) भी संदर्भ इलेक्ट्रोड के लिए उपयोग किया जा सकता है ।

एक माइक्रो-आगर नमक पुल इलेक्ट्रोड क्षमता के एक equilibration द्वारा प्रसार क्षमता को संतुलित करता है । आदेश में नमक समाधान को स्थिर करने के लिए, 1% (डब्ल्यू/वी) agarose बफर समाधान के साथ नमक समाधान के मिश्रण को रोकने के लिए जोड़ा गया था । नमक आयनों K+ और सीएल- तरल में समान मोबिल है और इलेक्ट्रोड क्षमता संतुलन । नमक पुल ठीक से स्थापित करने के लिए, आगर नमक समाधान के लिए पर्याप्त रूप से किसी भी हवा के बुलबुले के बिना microcapillary टिप को भरने के लिए और AgCl इलेक्ट्रोड को कवर करने के लिए गर्म हो गया है । आगे उपयोग करने से पहले, नमक पुल इलेक्ट्रोड और संदर्भ इलेक्ट्रोड के बीच बिजली के संपर्क की जाँच की जा करने के लिए है. नमक पुल प्रयोग किया जाता है समय पर निर्भर करता है, नमक समाधान के लिए पर्याप्त बफर के साथ नमक समाधान के किसी भी मिश्रण को रोकने के लिए gelled हो गया है । यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है यदि K+ या Cl- ट्रांसपोर्टरों की जांच की जाती है । नमक पुल का इस्तेमाल बहुत कम समय के लिए किया गया और agarose का रेफरेंस इस समय रेंज में नगण्य है । 5%, या आगर (3%-5%), के agarose के एक उच्च एकाग्रता समय की एक लंबी अवधि के लिए नमक पुल का उपयोग कर की अनुमति देता है6,12

इस विधि की अनुमति देता है एक झिल्ली ट्रांसपोर्टर के परिवहन कैनेटीक्स का निर्धारण कम कारोबार दरों के साथ (i) और भीतरी झिल्ली, जो शायद ही मानक पैच दबाना सेट-अप13में जांच की जा सकती है की mitochondrial प्रोटीन की (ii) । इसकी परिशुद्धता मुख्य रूप से रिवर्स संभावित माप है, जो सटीकता कम कुल झिल्ली कंडक्टर और छोटे एकाग्रता ढाल जो रिकॉर्डिंग के शोर से नीचे एक झिल्ली की क्षमता पैदा पर कम है पर निर्भर है ।

इस सेट का उपयोग करना, UCP1 और UCP3 के कारोबार की दर के रूप में एक ही शर्तों के तहत उत्पादित मापा गया । कारण उच्च पीएच ढाल, प्राप्त दरों को और अधिक सटीक और छोटी इलेक्ट्रोड संभावित बदलाव से उत्पंन कलाकृतियों से बेफिक्र लग रहे हैं । यह आगे का विश्लेषण और इसी तरह की शर्तों के तहत उत्पादित mitochondrial झिल्ली ट्रांसपोर्टरों की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को ऑस्ट्रिया के रिसर्च फंड (P31559-B20 to E.E.P.) ने सपोर्ट किया था । लेखकों proteoliposomes में उत्पादन और माउस UCP1 और UCP3 के पुनर्गठन में उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए सारा Bardakji धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microloader tips Eppendorf 5242956.003 Microcapillary pipette tip
Ethanol 99% AustrAlco Österr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H AAAH-5020-07025-230317
Kaliumchlorid Carl Roth GmbH + Co. Kg 6781.3
DC supply Voltcraft V10/CPG 1940 -01
Agarose Standard Carl Roth GmbH + Co. Kg 3810.2
Patch Clamp Amplifier Heka
Sample tube Carl Roth GmbH + Co. Kg 5863.1
Na2SO4 Carl Roth GmbH + Co. Kg 8560.3
MES Carl Roth GmbH + Co. Kg 4256.2
TRIS Carl Roth GmbH + Co. Kg AE15.2
EGTA Carl Roth GmbH + Co. Kg 3054.1
Hexane Sigma-Aldrich 296090-100ML
Hexadecane Sigma-Aldrich 296317-100ML
Heating wire Voltcraft USPS-2250

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References

  1. Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22, (1), 23-26 (2001).
  2. Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. The silver-silver chloride electrode: A possible generator of offset voltages and currents. Journal of Neuroscience Methods. 19, (3), 249-255 (1987).
  3. Urbankova, E., Voltchenko, A., Pohl, P., Jezek, P., Pohl, E. E. Transport kinetics of uncoupling proteins. Analysis of UCP1 reconstituted in planar lipid bilayers. Journal of Biological Chemistry. 278, (35), 32497-32500 (2003).
  4. Beck, V., et al. Polyunsaturated fatty acids activate human uncoupling proteins 1 and 2 in planar lipid bilayers. The FASEB Journal. 21, (4), 1137-1144 (2007).
  5. Shao, X. M., Feldman, J. L. Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials. Journal of Neuroscience Methods. 159, (1), 108-115 (2007).
  6. Kleene, S. J. A simple intrapipette salt bridge. Journal of Neuroscience Methods. 46, (1), 11-16 (1993).
  7. Beck, V., et al. A new automated technique for the reconstitution of hydrophobic proteins into planar bilayer membranes. Studies of human recombinant uncoupling protein 1. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757, (5-6), 474-479 (2006).
  8. Macher, G., et al. Inhibition of mitochondrial UCP1 and UCP3 by purine nucleotides and phosphate. Biochimica et Biophysica Acta. 1860, (3), 664-672 (2018).
  9. Rupprecht, A., et al. Role of the transmembrane potential in the membrane proton leak. Biophysical Journal. 98, (8), 1503-1511 (2010).
  10. Hilse, K. E., et al. The expression of UCP3 directly correlates to UCP1 abundance in brown adipose tissue. Biochimica et Biophysica Acta. 1857, (1), 72-78 (2016).
  11. Fuks, B., Homble, F. Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids. Biophysical Journal. 66, (5), 1404-1414 (1994).
  12. Barry, P. H., Lewis, T. M., Moorhouse, A. J. An optimised 3 M KCl salt-bridge technique used to measure and validate theoretical liquid junction potential values in patch-clamping and electrophysiology. European Biophysics Journal. 42, (8), 631-646 (2013).
  13. Huang, D., Li, J. The feasibility and limitation of patch-clamp recordings from neonatal rat cardiac ventricular slices. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 47, (4), 269-272 (2011).
रिकॉमबिनेंट झिल्ली प्रोटीन की प्रोटॉन कारोबार दर का विश्लेषण करने के लिए एक सूक्ष्म आगर नमक पुल इलेक्ट्रोड
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Kreiter, J., Pohl, E. E. A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58552, doi:10.3791/58552 (2019).More

Kreiter, J., Pohl, E. E. A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58552, doi:10.3791/58552 (2019).

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