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Neuroscience

Un elettrodo di Micro-agar sale Bridge per analizzare il tasso di Turnover del protone delle proteine di membrana ricombinante

doi: 10.3791/58552 Published: January 7, 2019

Summary

Nelle misurazioni elettrofisiologiche, la presenza di una potenziale di diffusione disturba la misurazione precisa del potenziale inverso alterando il potenziale di elettrodo. Utilizzando un ponte salino di micro-agar, è minimizzato l'impatto della diffusione potenziale, che permette una misurazione più precisa dei numeri di fatturato di substrato delle proteine di membrana ricombinante ricostituita.

Abstract

Ad oggi, più del 50% di tutte le droghe farmacologiche destinazione la cinetica del trasporto delle proteine di membrana. La caratterizzazione elettrofisiologica delle proteine di trasportatore di membrana ricostituito in membrane bilayer del lipido è un metodo potente ma delicato per la valutazione delle loro proprietà fisico-chimiche e farmacologiche. Il numero di fatturato del substrato è un parametro univoco che consente il confronto dell'attività delle proteine di membrana diversi. In un trasporto elettrogenico, la pendenza del substrato spostato crea un potenziale di membrana che correla direttamente per il tasso di turnover del substrato della proteina. Utilizzando elettrodi di cloruro d'argento, un potenziale di diffusione, anche chiamato giunzione liquida potenziali, è indotta, che altera il potenziale di elettrodo e disturba notevolmente misure di potenziale di membrana precisa. Potenziale di diffusione può essere minimizzato da un ponticello del sale, che equilibra il potenziale di elettrodo. In questo articolo, un ponte salino di micro-agar è progettato per migliorare il set-up elettrofisiologico, che utilizza Micropipette per la formazione della membrana. La soluzione salina è riempita in un puntale microcapillary, stabilizzato tramite l'aggiunta di agarosio e può essere facilmente montata su un elettrodo standard. Il potenziale di elettrodo di un elettrodo di micro-sale ponte è più stabile rispetto ad un elettrodo standard. L'implementazione di questo sistema si stabilizza il potenziale di elettrodo e consente di effettuare misurazioni più precise di potenziale di membrana generato da un gradiente di pH. Utilizzando questo sistema, i tassi di fatturato del protone dei carrier mitocondriali UCP1 e UCP3 sono soppresse e rispetto alle misurazioni precedenti.

Introduction

Proteine di membrana sono mirati fino al 60% di tutte le droghe farmaceutiche noto1. Misure elettrofisiologiche delle proteine di membrana sono uno strumento potente ma delicato per analizzare il trasporto elettrogenico di substrati mediata da proteine carrier di membrana. La modulazione della corrente transmembrana mediante l'applicazione di tensioni costante o tensione rampe consente di valutare le proprietà farmacologiche e fisiche degli elementi portanti, per esempio, l'attivazione e l'inibizione di substrati o il trasporto cinetica. Di particolare interesse è il numero di fatturato del substrato, che visualizza la quantità di substrato che è spostata da una proteina di membrana per unità di tempo. È un parametro importante quando si confrontano la cinetica di varie proteine di membrana. Che istituisce un gradiente di concentrazione del substrato caricato attraverso la membrana genera una forza elettromotrice, da cui si evince il numero di fatturato del substrato.

Utilizzando un elettrodo di AgCl, la presenza di un tampone privo di cloruro crea un potenziale di diffusione che altera il potenziale di elettrodo e conduce ad una variazione nelle misure di corrente-tensione2. Pur essendo sempre presente, è trascurabile per le misure di capacità e conduttanza standard poiché questi parametri sono sia dipendente sul versante della registrazione corrente-tensione (conduttanza) o sono la differenza di una singola registrazione (capacità), che Annulla il potenziale. Tuttavia, la registrazione del potenziale d'inversa, che è creato dal trasporto del substrato, può essere notevolmente disturbata dalla diffusione potenziale. Così, per misure esatte del potenziale d'inversa, i potenziali di elettrodo devono essere mantenuta costante.

La diffusione potenziale può essere minimizzata con due metodi: (i) in presenza di una membrana a doppio strato, una concentrazione di substrato deve essere aumentato su un lato della membrana3,4, o (ii) un ponte salino equilibra il potenziale di elettrodo 5. il primo metodo è altamente dipendente sulla stabilità delle misurazioni. La membrana deve sopravvivere per diversi minuti, dall'aggiunta di substrato sotto agitazione fino a quando il substrato è quasi equamente distribuito nella soluzione. Se la membrana si rompe in mezzo, il gradiente di substrato è alterato dal libero scambio di molecole caricate e girare a misurazioni imprecise. Quest'ultimo metodo Saldi la diffusione potenziale ma è limitato dalle dimensioni dell'allestimento. Implementazione di un piccolo ma funzionamento ponte salino in una gamma micro a un set-up elettrofisiologico è impegnativo6. Per il secondo metodo, la soluzione salina è riempita in un suggerimento di microcapillary e stabilizzata tramite l'aggiunta di agarosio per prevenire la diffusione della soluzione salina per la soluzione tampone.

In questo protocollo, è descritto un semplice produzione di un micro-agar ponte salino e l'implementazione in un set-up elettrofisiologico basato sulla pipetta set-up7 . Una punta di microcapillary viene regolata sia per contenere una soluzione di KCl 3M con agarosio % (p/v) 1 mol e per colmare una soluzione di AgCl elettrodi e buffer. Il vantaggio del ponte micro-sale per visualizzare registrazioni di tempo dello spostamento di potenziali di elettrodo e le misure più precise della membrana potenziale presso vari gradienti di pH. Nel sistema modello di proteine ricombinanti ricostituiti nei liposomi, i tassi di fatturato dei carrier mitocondriali UCP1 e UCP3 prodotta in condizioni simili sono soppresse e rispetto ai precedenti risultati3,8.

Protocol

1. produzione di proteine ricombinanti disgiungere (UCPs) e la formazione delle membrane Bilayer planare

  1. Produzione di UCP1 ricombinante e UCP3 come descritto da Rupprecht et al. 9 e Hilse et al. 10
  2. Formare le membrane bilayer planare sulle punte delle pipette di plastica superflua convenzionali come descritto da Beck et al. 7

2. preparazione dell'elettrodo Micro-agar sale Bridge

  1. Regolare una pipetta microcapillary tip (Vedi Tabella materiali) per la lunghezza appropriata.
    1. Segnare la posizione su una punta vuota in cui la punta del tampone contenente sarà allegata al e utilizzare una pinza scorrevole per misurare la lunghezza dell'elettrodo micro-agar ponte salino.
      Attenzione: La punta di microcapillary deve essere abbastanza a lungo per immettere la soluzione tampone per le misurazioni.
    2. Tagliare la punta di microcapillary con una lama o un coltello affilato e pulire la superficie di taglio con etanolo e acqua.
  2. Preparare l'elettrodo rivestito di AgCl.
    1. Tagliare un filo di Ag di circa 8 cm di lunghezza e pulirlo con acqua ed etanolo.
    2. Prendete un pezzo di carta vetrata e levigare la superficie di 1 cm di lunghezza all'estremità del filo, che dovrebbe essere a contatto con la soluzione salina.
    3. Immergere l'estremità smussata in una soluzione di KCl 3M e ricoprirlo elettrochimicamente con cloruro utilizzando un'alimentazione CC a 1,5 V per 10 s.
    4. Pulire l'elettrodo con acqua, asciugarlo e regolare la lunghezza dell'elettrodo AgCl dal lato non rivestito, in modo che penetra la punta microcapillary profonda come possibile.
      Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
  3. Preparare una soluzione di sale di KCl 3M con agarosio all'1% (v/v).
    1. Pesare 4,47 g di KCl e dissolverlo in 20 mL di acqua da mescolando in un fiasco.
    2. Rimuovere l'agitatore, pesare 0,2 g di agarosio e aggiungerlo al pallone.
    3. Riscaldare la soluzione a 100 ° C per sciogliere l'agarosio e impedire la coagulazione.
      Attenzione: Il pallone sarà molto caldo. Non toccarlo a mani nude. Utilizzare guanti per la manipolazione.
  4. Riempire la punta microcapillary con la soluzione salina di agarosio.
    Attenzione: La soluzione è molto calda. Proteggere le mani e lavorare con attenzione per evitare spruzzi.
    1. Se l'agarosio inizia la coagulazione, scaldare la soluzione salina per completamente sciogliere l'agarosio nuovamente.
    2. Penetrare la punta microcapillary a 10 µ l di soluzione di sale di agar. Immergerlo lentamente e con attenzione per evitare che l'aria bolle nella punta.
    3. Rimuovere la punta dalla pipetta e spingere l'elettrodo di AgCl dal lato più ampio della punta. Assicurarsi che l'elettrodo penetri la soluzione salina.
    4. Raffreddare l'elettrodo a temperatura ambiente e collegarlo all'amplificatore.
  5. Preparare il tampone per le misurazioni.
    1. Pesare 0,710 g di Na2SO4, 0,195 g di MES, 0,121 g di TRIS e 0,023 g di EGTA, poi aggiungere 100 mL di acqua distillata in un becher e agitare la soluzione.
    2. Controllare il valore pH del buffer utilizzando un elettrodo di pH e regolare il pH a 7,32.
    3. Verificare che l'elettrodo di riferimento e l'elettrodo di ponte salino agar siano in contatto elettrico.
      1. Aggiungere 1 mL di tampone a un contenitore di plastica.
      2. Immergere l'elettrodo di riferimento e l'elettrodo di ponte salino di agar e controllare per un segnale di risposta. Se la risposta del segnale è corretta, procedere al punto 2.7.
  6. Se c'è una risposta falso segnale o nessun contatto elettrico a tutti, è necessario eseguire la risoluzione dei problemi seguenti.
    1. Controllare se l'elettrodo è a contatto con la soluzione salina e spingere l'elettrodo nella soluzione.
      Nota: Se la soluzione è già troppo appiccicosa, rimuovere il ponticello del sale di micro-agar e preparare una nuova punta di microcapillary.
    2. Controllare se ci sono bolle d'aria all'interno della soluzione di sale. Se sì, preparare una nuova punta di microcapillary.
    3. Controllare se la soluzione salina è a contatto con la soluzione tampone. In caso contrario, quindi tagliare un altro 1 mm dell'estremità del tubo della punta.
      Attenzione: Accertarsi che la punta è ancora abbastanza a lungo per penetrare la punta del tampone-contenente. Se non c'è ancora nessun contatto, preparare una nuova punta di microcapillary.
    4. Se nessuno di questi passaggi aiuta, preparare una nuova punta di microcapillary.
  7. Per deposito, immergere l'elettrodo di ponte salino di agar in una soluzione di KCl 3M.
    Nota: Il protocollo può essere fermato qui. Per una pausa durante la notte, conservare l'elettrodo nella soluzione salina di KCl 3 M a 4 ° C.
  8. Preparare la punta di plastica contenenti tampone.
    Nota: Se l'elettrodo è stata memorizzata durante la notte, tirarla fuori e lasciarlo calore fino a temperatura ambiente per 30 min.
    1. Prendere una punta di microcapillary e piegare il tubo, 2 cm dal bordo della parte più stretta, circa 90 gradi utilizzando un filo di riscaldamento.
    2. Utilizzare un coltello molto affilato o la lama e tagliare il tubo di circa 5 mm dal bend.
    3. Pulire la superficie alla fine con etanolo e acqua e misurare il diametro del foro della punta. Da questo, calcolare l'area della superficie.
    4. Rivestire la superficie della punta con 85: 15 (v: v) esano: esadecano.
      1. 3 µ l di solvente e rimuoverlo dalla punta.
      2. Aspettare 1 min in modo che tutto il solvente residuo nella punta è evaporata.
    5. Riempire la punta di misurazione con 3 µ l di tampone e inserirlo sull'elettrodo ponte salino.
      Nota: Controllare nuovamente se l'elettrodo ponte salino e l'elettrodo di riferimento sono in contatto elettrico eseguendo passo 2.5.3.
    6. Se non c'è nessun contatto elettrico, verificare quanto segue:
      1. Verifica se l'elettrodo ponte salino è a contatto con la soluzione tampone. In caso contrario, aumentare il volume del buffer nella punta o preparare una punta di microcapillary più a lungo.
      2. Se c'è una bolla d'aria, rimuovere la punta dell'elettrodo di micro-sale ponte, riempire il buffer nella punta e inserirlo nuovamente l'elettrodo.

3. misurazione dei parametri elettrici della membrana ricostituito con proteina ricombinante

  1. Applicare un segnale di tensione alternata triangolare con tensione massima Umax = 50 mV e ΔTrampa = 50 ms, che crea una risposta rettangolare corrente alternata. I valori medi delle correnti positive e negative (+ e io), calcolare la capacità della membrana secondo la seguente formula:
    Equation 1
  2. Applicare una rampa di tensione che va da -50 mV a + 50 mV e record corrente. Inserire una funzione lineare per i dati - la pendenza è la conduttanza - e calcolare il punto di intersezione dell'asse x della fit.
  3. La soluzione alla punta di plastica di scarico e riempire uno nuovo con un buffer contenente una concentrazione di substrato maggiore.
    1. Se nessuna membrana viene formata all'interno il primo 20-30 s, il volume di scarico e riempirlo. Questo garantisce che il gradiente di concentrazione attraverso la membrana non sono cambiato significativamente durante la formazione della membrana.
    2. Dopo la formazione di una membrana, eseguire i passaggi 3.1 e 3.2 per verificare la formazione adeguata della membrana e per ottenere il punto di intersezione dell'asse x.

4. calcolo del tasso di Turnover del substrato

Nota: Vedere il lavoro precedente per dettagli3,7.

  1. Stimare la quantità di proteine nella membrana dalla massa molecolare del lipido e della proteina (Mlipidica e Mproteine), l'area della membrana e del gruppo testa uno dei lipidi (unamembrana e unlipido) e il rapporto di massa di proteine per lipidi (r).
    Equation 2
  2. Calcolare il potenziale per il substrato trasportato di Nernst. R è la costante dei gas, T la temperatura, z la carica del substrato trasportato, F di Faraday costante e c1 e c2 le concentrazioni di substrato di entrambi i lati della membrana.
    Equation 3
  3. Dalle registrazioni corrente-tensione, prendere il contrario potenziale calcolato con la differenza dei punti di intersezione dell'asse x dal lineare si adatta in presenza ed assenza della sfumatura substrato.
  4. Calcolare la percentuale di conduttanza di substrato, Gsubstrato, per la conduttanza totale della membrana, Gtotale, dal rapporto di inversione potenziale di Nernst potenziali11.
    Equation 4
  5. Calcolare il ΔN numero di fatturato di substratosubstrato al tempo unità ΔT dalla conduttanza di substrato (Gsubstrato), la tensione applicata U e la carica del substrato z:
    Equation 5
  6. Dal rapporto del substrato trasportato per tempo al numero di proteine, calcolare il fatturato tasso κ.
    Equation 6

Representative Results

Per verificare la minimizzazione della diffusione potenziale, la stabilità delle misure tensione-corrente di una membrana intatta è stata misurata. In Figura 2A, registrazioni di rappresentante-corrente tensione sono raffigurate in presenza (puntini bianchi) ed assenza (punti neri) di un gradiente di pH. Secondo l'equazione di Nernst, il gradiente di pH induce un cambiamento nella tensione. Dal punto di intersezione dell'asse x di un fit lineare per i dati, viene calcolato il turno di potenziale. Al fine di testare entrambi gli elettrodi, lo spostamento nel punto di intersezione dell'asse x è stato analizzato per un elettrodo standard di AgCl (Figura 2B; puntini bianchi) e un ponticello del sale di micro-agar (Figura 2B; punti neri). Una rampa di tensione è stata registrata dieci volte di fila e lo spostamento medio nell'asse x è raffigurato contro il tempo. Mentre l'elettrodo di ponte salino agar ha avuto uno spostamento massimo di meno di 5 mV anche dopo 300 secondi di misurazione, l'elettrodo standard varia fino a 30 mV nel comportamento imprevedibile, random,.

Successivamente, entrambi gli elettrodi sono stati testati a gradienti di pH differenti (Figura 3A). Per l'elettrodo standard, è stato generato un gradiente di pH di 0,35 e 1.0 (puntini bianchi); per l'agar ponte salino elettrodo, gradienti di pH di 0.35, 0,7 e 1,0 (punti neri). Lo spostamento nel potenziale è stato analizzato in tre misure indipendenti. In contrasto con una sfumatura di 0,35, dove lo spostamento misurato varia solo leggermente, il passaggio di tensione altera significativamente al gradiente pH pari a 1,0 in assenza del ponte sale micro-agar. Da una misura lineare per i dati, la pendenza della funzione è 26,4 ± 2.3 mV/ΔpH per l'elettrodo standard e 50,1 ± 4.6 mV/ΔpH per l'elettrodo di micro-agar ponte salino. Secondo l'equazione di Nernst, lo spostamento di potenziale calcolato è 60,7 mV/ΔpH a T = 32 ° C.

Utilizzando il micro-agar sale bridge, il numero di fatturato del protone, κ, di UCP1 mitocondriale e UCP3 è stato misurato e confrontato alle misure precedenti (Figura 3B). Simile alla Figura 3A, ΔpH = 1.0 è stato generato e il potenziale d'inverso è stato misurato. La quantità di proteine nella membrana è stata stimata secondo la formula fornita nella sezione 4 del protocollo, con una proteina al rapporto del lipido di 4 µ g / (mg di lipidi), una massa molecolare di 33.000 e 750 Da per la proteina e del lipido, una superficie di membrana di 3,53 x 10 -4 cm2e un'area per lipido 7.8 x 10-15 cm2. L'ottenuti κwas 5,56 ± 0.38 s-1 e 4.10 ± 0.71 s-1 per UCP1 e UCP3, rispettivamente (Figura 3B).

Figure 1
Figura 1 : Il set-up elettrofisiologico con il ponticello del micro-agar sale. (A), questo pannello mostra un abbozzo di set-up. La punta di microcapillary contenente la soluzione salina agar (raffigurata in arancione) è posizionata tra l'elettrodo (nero) e la punta del tampone contenente (blu). La membrana è formata sulla superficie all'estremità della punta del tampone contenente (indicata dalla freccia). (B), questo pannello mostra un'immagine dell'allestimento elettrofisiologico con l'implementazione del micro-agar sale ponte. Le frecce indicano verso l'elettrodo, il ponticello del sale di micro-agar, l'elettrodo di riferimento e il contenitore con soluzione tampone. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Il confronto di un ponticello del sale di micro-agar e un elettrodo standard di AgCl. (A), questo pannello misura spettacoli un rappresentante corrente-tensione in presenza (punti grigi) e in assenza (puntini bianchi) di un gradiente di pH di 1. Le linee rappresentano una misura lineare per i dati, da cui conduttanza e l'asse x si ottengono valori di intersezione. Il passaggio di tensione viene valutato tramite la differenza dei valori di intersezione di entrambe le registrazioni. (B), questo pannello mostra lo spostamento della membrana potenziale di un elettrodo standard di AgCl (puntini bianchi) ad un elettrodo di micro-agar ponte salino (punti neri) in tempo. Dieci misure di corrente-tensione sono state registrate in una riga e lo spostamento di tensione media di diffusione potenziale è tracciato contro il tempo. In tutti gli esperimenti, la membrana è stata realizzata 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL ricostituito con 15 mol % acido arachidonico ad una concentrazione di 1,5 mg/mL. Il buffer contenuto Na2SO4, MES di 10 mM, 10 mM TRIS e 0,6 mM EGTA a pH = 7,34 e T = 32 ° C. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Numero di fatturato del protone di UCP1 e UCP3 calcolato dal potenziale inverso in presenza di un gradiente di pH. (A), questo pannello mostra il cambiamento nel potenziale di membrana UCP1-contenente di vari gradienti di pH di un elettrodo standard di AgCl (puntini bianchi) e da un elettrodo di micro-agar ponte salino (punti neri). Le linee rappresentano una misura lineare per i dati. (B), questo pannello mostra il numero di fatturato del protone di UCP1 (primo set di dati) e UCP3 (secondo set di dati) come calcolato dal rapporto di cambio tensione al potenziale di Nernst secondo le formule nella sezione 4 del protocollo. Il primo bar di ogni set rappresenta tassi di fatturato misurati con il ponticello del sale di micro-agar. La seconda barra di ogni set di dati rappresenta misurazioni precedenti utilizzando un elettrodo standard di AgCl. I valori di UCP1 e UCP3 sono state prese da Urbankovaet al. 3 e Macher et al. 8. in tutte le misure, la membrana è stata realizzata 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL ricostituito con 15 mol % AA e UCP1/UCP3. La concentrazione di lipidi e di proteine era 1,5 mg/mL e 4 µ g/mg di lipidi, rispettivamente. Il buffer contenuto Na2SO4, MES di 10 mM, 10 mM TRIS e 0,6 mM EGTA a pH = 7,34 e T = 32 ° C. Il pH del buffer per le misurazioni di gradiente è stato aumentato a 7,66, 8.00 o 8,33 aggiungendo TRIS e fu cambiato in soluzione contenente pipetta. I valori sono la media ± deviazione standard di tre misurazioni indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

L'implementazione del micro-agar sale ponte con l'elettrodo riduce al minimo la diffusione potenziale e consente di effettuare misurazioni più precise di potenziale di membrana generato da un gradiente di pH. In presenza di vari gradienti di pH transmembrana, il potenziale cambiamento di entrambi gli elettrodi era accettabile alle ΔpH = 0,35 quando si confrontano per il valore teorico di potenziale di equilibrio di Nernst (ΦNernst = 23,8 mV per ΔpH = 0,4). Tuttavia, alle altre pendenze di pH fisiologico, come per istanza in mitocondri tra la matrice e nello spazio intermembrana, l'elettrodo di AgCl standard non è riuscito a misurare con precisione il potenziale turno presso ΔpH = 1 (Figura 3A). L'elettrodo colmato con micro-agar sale consegnato i valori che erano molto più paragonabili alla teoria.

Potenziale di diffusione può verificarsi anche presso l'elettrodo di riferimento di AgCl se la soluzione tampone è cambiata durante l'esperimento. Soluzione tampone privo di cloruro è stato usato negli esperimenti poiché disgiungere proteine sono stati suggeriti per il trasporto di ioni cloruro, e il pH è stato regolato con Tris o MES. L'elettrodo potenziale, in assenza di una notevole concentrazione di cloruro, dipende principalmente dalle impurità di cloruro nella soluzione tampone. Come la sua composizione è invariato durante gli esperimenti, il risultato sarà semplicemente in un potenziale costante offset. Tuttavia, per la misurazione del potenziale differenza assoluta fra i due elettrodi, un sistema di sale-ponte semplice agar (Ag/AgCl 3 M KCl) potrebbe essere utilizzato anche per l'elettrodo di riferimento.

Un ponticello del sale di micro-agar equilibra la diffusione potenziale di un'equilibratura del potenziale di elettrodo. Al fine di stabilizzare la soluzione salina, agarosio all'1% (p/v) è stato aggiunto per evitare la miscelazione della soluzione salina con la soluzione tampone. Gli ioni di sale K+ e Cl hanno simile mobilità in liquido e bilanciare il potenziale di elettrodo. Per installare correttamente il ponte salino, la soluzione salina agar deve essere sufficientemente riscaldato per riempire la punta microcapillary senza bolle d'aria e per coprire l'elettrodo di AgCl. Prima di continuare a usarlo, contatto elettrico fra l'elettrodo di ponte salino e l'elettrodo di riferimento deve essere verificata. A seconda dell'ora che viene utilizzato il ponte salino, la soluzione salina deve essere sufficientemente gelificato per impedire qualsiasi miscelazione della soluzione salina con il buffer. Ciò è particolarmente importante se K+ o Cl trasportatori sono indagati. Il ponticello del sale è stato utilizzato per un tempo molto breve e l'eluizione di agarosio è trascurabile in questo intervallo di tempo. Una maggiore concentrazione di agarosio fino al 5%, o dell'agar (3% - 5%), permette di utilizzare il ponte salino per un lungo periodo di tempo6,12.

Questo metodo permette di determinare la cinetica del trasporto di un trasportatore di membrana (i) con tassi di giro d'affari basso e (ii) delle proteine mitocondriali della membrana interna, che difficilmente possono essere studiati in patch standard morsetto messe a punto13. La sua precisione dipende principalmente la misura del potenziale inversa, quale precisione è diminuito a una conduttanza di membrana totale basso e piccoli gradienti di concentrazione che inducono una membrana potenziale sotto il rumore della registrazione.

Utilizzando questo set-up, sono stati misurati i tassi di fatturato di UCP1 e UCP3 come prodotto nelle stesse condizioni. Dovuto la pendenza di pH più alta, i tassi ottenuti sembrano essere più preciso e imperturbabile di manufatti derivanti dallo spostamento del potenziale di elettrodo minori. Può essere utilizzato per più ulteriormente analizzare e confrontare i trasportatori di membrana mitocondriale prodotti in condizioni simili.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dal fondo di ricerca austriaco (P31559-B20 per E.E.P.). Gli autori ringraziano Sarah Bardakji per l'eccellente assistenza tecnica nella produzione e ricostituzione del mouse UCP1 e UCP3 in proteoliposomi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microloader tips Eppendorf 5242956.003 Microcapillary pipette tip
Ethanol 99% AustrAlco Österr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H AAAH-5020-07025-230317
Kaliumchlorid Carl Roth GmbH + Co. Kg 6781.3
DC supply Voltcraft V10/CPG 1940 -01
Agarose Standard Carl Roth GmbH + Co. Kg 3810.2
Patch Clamp Amplifier Heka
Sample tube Carl Roth GmbH + Co. Kg 5863.1
Na2SO4 Carl Roth GmbH + Co. Kg 8560.3
MES Carl Roth GmbH + Co. Kg 4256.2
TRIS Carl Roth GmbH + Co. Kg AE15.2
EGTA Carl Roth GmbH + Co. Kg 3054.1
Hexane Sigma-Aldrich 296090-100ML
Hexadecane Sigma-Aldrich 296317-100ML
Heating wire Voltcraft USPS-2250

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References

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Un elettrodo di Micro-agar sale Bridge per analizzare il tasso di Turnover del protone delle proteine di membrana ricombinante
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Cite this Article

Kreiter, J., Pohl, E. E. A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58552, doi:10.3791/58552 (2019).More

Kreiter, J., Pohl, E. E. A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58552, doi:10.3791/58552 (2019).

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